專利名稱：表達至少兩種可變表面蛋白(vsp)的修飾原生動物,其疫苗及純化方法、應用和免疫方法
表達至少兩種可變表面蛋白(VSP)的修飾原生動物，其疫苗及純化方法、應用和免疫方法本發(fā)明涉及表達多于一種可變表面蛋白(VSP)的修飾原生動物，包含所述修飾原生動物的疫苗、雜交瘤系、識別蛋白的單克隆抗體，及其步驟、應用和方法。更具體地，本發(fā)明涉及包括同時表面表達多于一種可變表面蛋白(VSP)的經(jīng)修飾的寄生性原生動物。修飾原生動物還可同時表達可變表面蛋白的所有種類(complete r印ertoire)。原生動物顯示出切丁酶(Dicer)和/或RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的表達下降，其中RdRP基因和/ 或切丁酶基因被沉默。所述原生動物可以是具有抗原變異機制的任何原生動物，并可通過調控此機制的分子沉默其表達。
背景技術：
抗原變異是含有暴露于表面的抗原決定簇的病原微生物發(fā)生的克隆表型變化。 這些生物使用不同的機制改變其表面抗原表達，從而能夠在宿主產(chǎn)生的持續(xù)免疫壓力下維持慢性感染(Deitsch, K. W.，Moxon, E. R.以及 ffellems, Τ. E. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61,281-293(1997)) ο 藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia，又名 runwayd 腸賈第鞭毛蟲(runwayd Giardia intestinalis)或十二指腸賈第鞭毛蟲(Giardia duodenal is))是最常見的人腸寄生蟲之一。原生動物藍氏賈第鞭毛蟲也在使寄生蟲能夠發(fā)展成慢性和/或復發(fā)感染的過程中顯示出抗原變異(Adam, R. D. Clin. Microbiol. Rev. 14,447-475(2001) 和 Nash，Τ. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352,1369-1375 (1997)) 在編碼可變表面蛋白 (VSP)的所有約190個基因，在特定時間，賈第鞭毛蟲僅在每只寄生蟲表面上表達一種VSP， 但通過未知的機制自發(fā)轉化成不同的VSP。在賈第鞭毛蟲中，抗原變異是導致某些可變和/或長期感染過程，以及多種感染傾向的原因，并且涉及已知為VSP的蛋白家族(Adam， R. D. Clin. Microbiol. Rev. 14, 447-475 (2001)和 Nash, Τ. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352，1369-1375(1997)。VSP位于完全滋養(yǎng)體(complete trophozoite)表面，并且是宿主免疫反應識別的主要抗原。VSP的大小范圍在30kDa至200kDa之間；其具有可變的富半胱氨酸氨基末端區(qū)域和保守的羧基末端區(qū)域，所述羧基末端區(qū)域包括疏水的跨膜結構域和僅包含5個氨基酸(CRGKA)的短胞質尾。寄生蟲基因組編碼總計約190個編碼VSP的基因(Morrison， H.G.等，Science 317，1921-19^^2007))，但在任何給定時間點，在每個滋養(yǎng)體表面上僅表達一種VSP。向表達另一種VSP的轉換每6-13代發(fā)生一次，即便沒有任何免疫壓力也是如此(Nash, Τ. Ε. ，Ailing, D. W. ，Merritt, J. W. Jr 以及 Conrad, J. Τ. Exp. Parasito 1. 71， 415-421(1990))。與其他藍氏賈第鞭毛蟲基因類似，編碼VSP的基因沒有內含子，并且其上游區(qū)域相對較短，并且發(fā)現(xiàn)其序列保守性有限或沒有序列保守性。此外，在這些區(qū)域中不存在典型的真核啟動子。包含賈第鞭毛蟲VSP基因的信使RNA的3'非翻譯區(qū)也往往較短， 通常長度為0-30個核苷酸。迄今為止，已經(jīng)證明基因重排過程和依賴啟動子的開/關機制都沒有參與賈第鞭毛蟲的抗原轉換(Adam, R. D.Clin. Microbiol. Rev. 14，447-475 (2001)； Nash, Τ. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352，1369—1375 (1997)和 Nash, Τ. Ε.，Ailing, D. W.，Merritt, J. W. Jr 以及 Conrad，J. Τ. Exp. Parasito 1. 71，415-421 (1990))。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了包括同時表面表達多于一種可變表面蛋白(VSP)的修飾寄生性原生動物。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述原生動物包括同時表面表達的可變表面蛋白的所有種類。原生動物顯示出切丁酶和/或RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的表達下降，其中 RdRP基因和/或切丁酶基因已被沉默。所述原生動物可以是顯示抗原變異機制的任何原生動物，其中其抗原變異機制可不受其任何組件沉默的調控。本發(fā)明提供了一種對抗原生動物產(chǎn)生的感染的疫苗，其至少包含在其表面表達至少兩種可變表面蛋白(VSP)的修飾原生動物。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述原生動物包括在其表面同時表達的可變表面蛋白的所有種類。原生動物顯示出切丁酶和/或RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的表達下降，其中RdRP基因和/或切丁酶基因被沉默。所述原生動物可以是顯示抗原變異機制的任何原生動物。所述疫苗還可包含賦形劑和/或助劑。本發(fā)明提供了用于純化原生動物所有種類的可變表面蛋白(VSP)的方法，所述方法包括a)將識別VSP CRKGA氨基酸序列的抗體連接到固體支持物；b)使所述固體支持物接觸原生動物；和c)分離所有種類的可變表面蛋白(VSP)種類。所述原生動物可以是野生原生動物克隆的混合物，其中每個克隆表達不同的可變表面蛋白，或者所述原生動物也可以是表達所有種類VSP的克隆。本發(fā)明提供了包含多于一種原生動物可變表面蛋白以及賦形劑和/或助劑的疫苗，其中每種所述蛋白是不同的。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述疫苗包含原生動物可變表面蛋白的所有種類，其中每種所述蛋白是不同的。本發(fā)明提供了一種免疫方法，其包括向哺乳動物施用一定量包含修飾原生動物的疫苗，所述修飾原生動物表達至少兩種可變表面蛋白(VSP)或同時表達原生動物VSP的所有種類。所述方法用于免疫哺乳動物以對抗原生動物產(chǎn)生的感染，其中所述原生動物具有抗原變異機制。此外，本發(fā)明還提供了免疫方法，其包括向哺乳動物施用一定量的包含原生動物可變表面蛋白的組合的疫苗，其中所述可變表面蛋白的組合分離自包含沉默的RdRP基因和/或切丁酶基因的修飾原生動物。所述方法用于免疫哺乳動物以對抗原生動物產(chǎn)生的感染，其中所述原生動物具有抗原變異機制。在一種實施方式中，施用的疫苗劑量包括50至 500 μ g的原生動物可變表面蛋白。本發(fā)明提供了核苷酸序列，其中所述序列可選自序列SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 112的任一條，其中所述序列為ARNdc。本發(fā)明提供了選自序列SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 112的至少一條序列的應用， 其用于沉默RdRP基因或沉默切丁酶基因。


圖1顯示了賈第鞭毛蟲中的多個VSP基因同時轉錄；其中a:使用在[32P]UTP存在下誘導體外轉錄的新分離的賈第鞭毛蟲細胞核進行核連綴分析(nuclear run-on assay)； b 使用包含存在于所有VSP的保守區(qū)的探針，對從克隆WB9B10和WB1267提取的總RNA進行 RNA印跡(Northern blot)檢測；c 將體外產(chǎn)生的正義和反義轉錄本(vsp9B10、vspl267, vspA6、vspH7、cwp2和⑶H)印跡并與在如圖Ia相同條件下的核連綴分析產(chǎn)物雜交；d 對使用特異引物(9B10F/9B10R和1267F/1267R)從克隆WB9B10滋養(yǎng)體基因組DNA上產(chǎn)生的 PCR產(chǎn)物(1道和5道)，或使用反向探針R2Q道和6道)或正義探針Sl(3道和7道)產(chǎn)生的cDNA進行比較，第4道是不含RT的反應對照，白色箭頭指向vsp9B10片段，其存在于基因組DNA和正義cDNA，但不存在于反義cDNA中；黑色箭頭指向vspl267片段，其存在于基因組DNA、正義cDNA和反義cDNA中。M表示分子量標記。圖2顯示了用于研究藍氏賈第鞭毛蟲中抗原變異的新工具。a 產(chǎn)生有待于通過 PCR擴增成大量VSP編碼基因的適合的寡核苷酸；選擇從(VSPU67、VSP9B10和VSPA6)和 GS(VSPH7)分離的四種藍氏賈第鞭毛蟲VSP的序列，比對這四條序列，并使用四個保守區(qū)設計引物；寡核苷酸序列下的箭頭指明了用于設計VSP通用引物(S1-S4和R1-R2)的序列；b 在對賈第鞭毛蟲WB9B10克隆(在其表面僅表達VSP9B10)的基因組DNA的PCR檢測中，使用四種正義引物(S1-S4)和兩種反義引物(R1、R2)的組合；不依賴于所用的引物組合擴增多個DNA片段，并且分離、克隆并測序了這些反應的59個主要產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其均為編碼VSP的片段；隨后使用這些產(chǎn)物中的多個(白色標記1-8)作為探針來檢測基因組DNA文庫，這樣可以鑒定編碼具有賈第鞭毛蟲VSP典型特征的新蛋白(VSPS1-S8，GenBank登錄號AY142122 至AY142U9)的ORF(可讀框)；左側顯示了以nt (核苷酸)計的分子量標記。c 為了核實賈第鞭毛蟲VSP轉錄本沉默是否涉及VSP反義ARN，在從表達單一 VSP的滋養(yǎng)體分離的ARN 制備物中檢索這些分子；使用與此前用于基因組DNA相同的VSP引物組合但在反轉錄反應 (RT)期間使用正義引物來進行RT-PCR ；上側顯示了正義引物(Si至S4)；泳道(a)至(h)表明了用于每個 PCR 反應的引物組合(a)Sl-Rl，(b)S2-Rl，(c)S3-Rl, (d) S4-R1, (e)Sl-R2, (f)S2-R2，(g)S3-R2和(h) S4-R2 ；此外，還顯示了沒有反轉錄的陰性對照(RT-)。在這些條件下，分離、克隆并測序了 38個擴增產(chǎn)物，證明反義編碼VSP，這些產(chǎn)物中的12個(靶標標記為1至12)還作為探針用于基因組文庫中，這樣可以獲得新VSP基因(VSPAS1-VSPAS12， GenBank登錄號AY143130-AY142141)的完整序列，表明了 VSP基因反義轉錄本的功能靶標。圖3顯示a 使用WB9B10克隆滋養(yǎng)體表達的HA表位標記的gRdRP變體的免疫定位；所述酶(紅色)位于兩個寄生蟲細胞核周邊的區(qū)域；如與伴侶蛋白ER-BiP(Mab 9C9， 綠色)的免疫共定位所示，該區(qū)域主要涉及粗面內質網(wǎng)(黃色)；b:RdRP活性，其中在沒有引物(A-C)或存在引物Rl (D)或R2(E)的情況下，使用不同的RNA底物組合(A、B和D vsp9B10 和 vspl267 ；C 和 E :vsp9B10, vspl267 和 vspH7)，A 是不含純化 RdRP 的對照。c 使用WB9B10克隆滋養(yǎng)體表達的HA表位標記的g切丁酶的免疫定位；所述酶(綠色)位于細胞胞質中，細胞核由DAPI染色(藍色)；d:使用WB9B10克隆滋養(yǎng)體中表達的HA表位進行信號標記的gAgo的免疫定位；所述酶(綠色)位于細胞胞質中，細胞核由DAPI染色(藍色)；e 使用用于gRdRP、gAgo、g切丁酶、⑶H和CWPl的探針對從誘導形成包囊4、6或12 小時期間的WB9B10克隆滋養(yǎng)體(且所述滋養(yǎng)體保持在一個正常培養(yǎng)基(NT)中12個小時) 提取的總RNA進行RNA印跡，結果顯示這些PTGS組分(轉錄后基因沉默)的組成型表達。圖4顯示了賈第鞭毛蟲中的切丁酶活性和小VSP RNA的檢測。a 從賈第鞭毛蟲提取物的dsRNA產(chǎn)生小RNA，表明切丁酶型活性。對于Vspl267dsRNA，對其雙鏈(1道)、僅正義RNA鏈O道)或僅反義鏈(3道)進行放射性標記。對于VSp9B10和gdh，進行雙鏈標記。將雙鏈RNA與WB9B10克隆的賈第鞭毛蟲提取物一起在37°C溫育1小時，隨后，分離總 RNA并用于電泳。在所有情況下均獲得小RNA ；b 賈第鞭毛蟲dsRNA加工中存在ATP的作用，1道和2道顯示未處理的對照將VspU67dsRNA與賈第鞭毛蟲胞質裂解物一起溫育而不浪費ATP (分別溫育1小時和3小時)，通過添加2mM葡萄糖和0. IU/ μ L己糖激酶來減少 ΑΤΡ(3道)。使用磷酸肌酸(CP，4道)、肌酸激酶(CK，5道)或這二者(6道)產(chǎn)生ATP;c: 通過將VSP核糖核酸探針(VSP riboprobe)與來自賈第鞭毛蟲WB9B10克隆的提取物溫育來產(chǎn)生小RNA。將一種、兩種或三種不同的VSP RNAm(vsp9B10, vspl267, vspH7)與賈第鞭毛蟲提取物一起混合。在存在多于一種轉錄本的情況下形成小RNA。使用gdh作為無關基因對照。左側為按核苷酸計的RNA分子量標記；d 對WB9B10克隆和WB1267克隆滋養(yǎng)體的總RNA，以及低分子量WB1267克隆RNA(LMW_低分子量)進行電泳、印跡并使用部分降解的體外轉錄vsp9B10 RNA探針進行雜交。在WB9B10克隆中沒有發(fā)現(xiàn)小RNA ；與此不同，不表達VSP9B0的WB1267克隆中存在小vsp9B10 RNA (箭頭所示處)。意外地發(fā)現(xiàn)了長度為70 個核苷酸的RNA (星號標記)，其可代表部分降解的RNAm。圖5顯示了通過將VSP核糖核酸探針與賈第鞭毛蟲WB1267克隆提取物一起溫育而產(chǎn)生小RNA ；將不同VSP(vsp9B10，vspl267, vspH7)的一種、兩種或三種RNAm混合，并使之接觸賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體提取物，在存在多于一種轉錄本時產(chǎn)生了 [32P]標記的小RNA;左側為按核苷酸計的RNA分子量標記。圖6顯示了過表達VSPH7的WB9B10滋養(yǎng)體中的抗原轉換(antigenic commutation)。a 使用 pTubCWPl. Pac 載體或 pTubH7. Pac 載體轉染 WB9B10 克隆滋養(yǎng)體， 在α-微管蛋白啟動子的控制下指導CWPl或VSPH7表達，將使用對照載體(pTubCWPl. I^c) 轉染的表達VSP H7的GS株滋養(yǎng)體作為對照(由倒三角表示)，方塊顯示使用對照載體轉染的WB9B10滋養(yǎng)體，由于表面蛋白的自發(fā)轉換，VSP 9B10表達隨時間下降，而組成型地表達vspH7的WB9B10滋養(yǎng)體顯示VSP9B10 (圓形)或VSPH7 (三角形)的表達下降速度快于各自的對照。結果表示為3個獨立試驗的平均百分數(shù)士標準差。b:在時間0，表達VSPH7 的WB9B10滋養(yǎng)體的典型圖像，所有細胞同時在其表面表達VSP9B10和VSPH7 ；c 培養(yǎng)15天后，表達VSPH7的WB9B10滋養(yǎng)體的典型圖像，一些細胞在其表面表達VSP9B10和VSPH7，另外一些細胞僅表達VSP9B10或VSPH7，其余細胞二者均不表達；使用DAPI將細胞核標記為藍角·
JUL，圖7顯示了表達vsp9B10反義片段的WB9B10滋養(yǎng)體的抗原轉換。a:使用 pTubCWPl.Pac載體(方形)或包含vsp9B10基因5'(圓形)或3'(三角)一半序列的反義序列的PTubPac載體轉染W(wǎng)B9B10克隆滋養(yǎng)體；結果表示為3個獨立試驗的平均百分數(shù)士標準差，并且表明VSP 9B10陽性滋養(yǎng)體量的下降速度快于對照；b 使用不同VSP基因轉染的WB9B10滋養(yǎng)體的典型圖像，所有細胞均在其表面表達VSP9B10 ；c 培養(yǎng)15天后，表達 vsp9B10反義片段3'的WB9B10滋養(yǎng)體的典型圖像，VSP9B10占群體的約50%，使用DAPI 將細胞核標記為藍色。圖8顯示了不同轉錄本濃度的變化可決定哪一種轉錄本逃脫沉默系統(tǒng)。在 pGEM-T-easy載體中克隆編碼VSP的1267、vsp9B10和cwpl基因，并在存在或不存在32P-UTP的情況下進行體外轉錄；在長短不同的時間段中，使用包含固定濃度的放射性標記vsp^67 RNA的WB1267胞質提取物產(chǎn)生不同濃度的無標記vsp9B10和CWPl轉錄本，1道多個核苷酸標記(Decade-Ambion) ；2、3 和 4 道將 750ng vsp9B10 和 250ng vspl267(比例 3 1) 分別溫育1、5和24小時；5、6和7道將等量vsp9B10和vspl267(# 250ng,比例1 1) 分別溫育1、5和M小時；8和9道將750ng CffPl和250ng vspl267分別溫育5和24小時；10道250ng vspl267轉錄本的溫育，短溫育期(1小時)內，WB1267克隆中幾乎沒有 vspU67降解，這與添加到混合物中vsp9B10的量無關O道和5道)。與此不同，在溫育較長時間(5小時)后，vsp9B10的存在使放射標記的小vspU67 RNA出現(xiàn)增加(將10道與 3、6和8道比較)，而CWPl轉錄本(無關)的存在則沒有影響，包括在高濃度下(8道)。在溫育M小時時，大多數(shù)放射標記的轉錄本被完全降解；圖9顯示了賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體中切丁酶和RdRP基因的沉默結果，其中通過對 RT-PCR獲得的條帶的密度分析，以及5次RNA印跡測定，與未轉染的WB9B10滋養(yǎng)體相比，賈第鞭毛蟲切丁酶-AS和RdRP-AS克隆顯示出65%至75%之間的信使RNA下降水平，其中結果表示為平均值士標準差。圖10顯示了具有沉默的RdRP和切丁酶的轉基因賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體中不同VSP的表達，a 使用共軛有TRITC的5C1單克隆抗體(VSP1267 ；右圖)和共軛有FITC的9B10單克隆抗體(VSP9B10 ；左圖)在切丁酶-AS轉染的滋養(yǎng)體(下圖)或空載體(上圖)中的直接免疫熒光分析；賈第鞭毛蟲中的切丁酶表達被沉默時，表達表面VSP9B10的滋養(yǎng)體還表達VSPU67(合成圖；中圖)；b 使用特異單克隆抗體(VSP9B10，9B10單克隆抗體；VSP1267, 5C1單克隆抗體；VSPA6，6E7單克隆抗體)，通過流式細胞術分析測定9B10、1267克隆以及使用針對賈第鞭毛蟲RdRP(RdRP-AS)或切丁酶(切丁酶-AS)的反義構建體轉染的細胞克隆中表達特定VSP的賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體百分數(shù)，使用抗大鼠的山羊免疫球蛋白作為陰性對照；c 其中切丁酶基因被敲除的野生型WB9B10和滋養(yǎng)體WB9B10的蛋白提取物的蛋白質印跡(Western blot)測試，在電泳并轉移到硝酸纖維素后，將濾膜(filter)與以下雜交(1) 本發(fā)明的G3克隆12F1單克隆抗體(針對所有VSP中的CRGKA保守結構域產(chǎn)生)或(2) 9B10 單克隆抗體(VSP9B10特異性)。圖11顯示了野生型賈第鞭毛蟲克隆和經(jīng)過抗原變異脫調節(jié)(deregulation)修飾的賈第鞭毛蟲中的VSP表達；顯示了滋養(yǎng)體的共焦免疫熒光圖像，其中切丁酶(a)或 RdRP (b)已被沉默；使用DAPI (藍色)復染，使用抗VSP單克隆抗體(綠色)的間接免疫熒光分析的典型圖像，WB9B10(d)，WB1267(e)和GS/M-H7 (f)，以及(c)使用本發(fā)明的抗CRGKA 12F1單克隆抗體(綠色)染色并使用DAPI (藍色)復染的分離的非克隆WB群體的免疫熒光圖像。圖12顯示在由野生型和轉基因滋養(yǎng)體的不同群體感染并使用WB9B10和WB1267 進行攻擊的沙鼠的保存樣品中，賈第鞭毛蟲包囊的檢測和定量。(a)首先使用WB9B10、 WB1267克隆群或切丁酶(DAS)或RdRP(RAS)表達被沉默的轉基因滋養(yǎng)體以及二者1 1的混合物感染沙鼠。(b-e)對先前被賈第鞭毛蟲WB9B10 (b)、WB1267 (c)、DAS (d)和RAS (e)感染的沙鼠，在初次感染2個月后，使用WB9B10和WB1267的克隆群進行攻擊；計數(shù)動物釋放的包囊量。該圖顯示了 5個不同試驗的平均值。圖13顯示了在使用表達所有種類的VSP的賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體初次感染后，繼續(xù)使用表達特定VSP的滋養(yǎng)體對沙鼠進行攻擊的結果。使用WB9B10(e-h)、WB1267克隆(i_l) 或純化的包囊(m-p)對先前被WB9B10、WB1267, DAS或RAS克隆(a_d)感染的沙鼠進行攻擊。該圖顯示了使用與共軛有抗CWP2 FITC的單克隆抗體(綠色)在沙鼠糞便中的免疫熒光分析的典型圖像。圖14顯示了由表達所有種類的VSP的轉基因滋養(yǎng)體感染的沙鼠的血清和腸內容物能夠在體外凝集不同的賈第鞭毛蟲克隆。顯示了使用WB9B10克隆感染的動物的血清 (lb，3f和5f)或腸內容物Qb，4f和6f) ；WB1267克隆感染的動物的血清(2b和If)或腸內容物CBb和2f) ；GS/M-H7克隆感染的動物的血清或腸內容物( 和6b) ；VSP9B10特異性Mab (Ic和2c)、VSP1267特異性Mab (3c和4c)、VSPH7特異性Mab (5c和6c)、未感染動物的血清(la，2a，3a，4a，5a和6a)、敲除DAS的滋養(yǎng)體感染的動物的血清(Id, 2d, 3d, 4d, 5d和6d)以及RAS感染的動物的血清(le，2e，3e，4eje和6e)進行攻擊的WB9B10 (1-2)、 WB1267(3-4)和GS/M H7克隆(5-6)的相差顯微鏡典型圖像；圖15顯示了在先前使用來自野生型和/或本發(fā)明轉基因賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體的不同克隆群的純化VSP免疫的沙鼠的糞便樣品中，賈第鞭毛蟲包囊的檢測和定量。在一個月內，每天使用抗CWP2單克隆抗體監(jiān)測免疫沙鼠的糞便，以檢驗包囊釋放。使用WB9B10或 WB1267滋養(yǎng)體的克隆群感染沙鼠。使用來自本發(fā)明轉基因滋養(yǎng)體DAS、RAS (及其混合物) 的純化VSP進行免疫；動物先前接受純化DAS (a)、RAS(b)VSP或其混合物(c)的免疫；這些動物得到保護而免于WB9B10或WB1267克隆的后續(xù)感染；對照動物(d)或用細胞內蛋白免疫的那些動物(e)沒有得到對抗后續(xù)感染的保護。該圖顯示了 5次獨立試驗的平均值。圖16顯示了在感染和攻擊期間沙鼠小腸形態(tài)的照片；上圖顯示了試驗動物的小腸(a)使用接種后15天表達所有種類的VSP的滋養(yǎng)體(DAS)初次感染的沙鼠小腸；與對照動物(b)相比，發(fā)現(xiàn)淋巴集結(Peyer patch)的大小增加(箭頭)。(c)是對使用DAS滋養(yǎng)體的純化VSP免疫的沙鼠進行攻擊期間的小腸；下圖顯示了實驗動物的小腸顯微檢測 (d)感染的沙鼠顯示淋巴集結膨大以及粘膜和粘膜下層中的中度浸潤性炎癥。在腸腔中可見一些賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體(星標；400X) ； (e)未感染的對照/未免疫的沙鼠G00X) ； (f) 是顯示組織學上正常的腸粘膜的免疫沙鼠G00X)；插圖顯示小腸大體形態(tài)Q50X)。
具體實施例方式在本申請中，滋養(yǎng)體是指單細胞寄生蟲(例如原生動物)在特定階段的細胞?？紤]到本申請的效果，應理解術語滋養(yǎng)體、寄生蟲、寄生蟲細胞或原生動物具有相同的含義并可互換。在本申請中，本發(fā)明的轉基因或修飾寄生蟲、滋養(yǎng)體或原生動物可以是其轉基因原生動物的切丁酶基因和/或RdRP基因被沉默的原生動物。在本申請中，這些原生動物也可替換為轉基因、轉染或修飾的滋養(yǎng)體、原生動物或寄生蟲。在被沉默時，本發(fā)明的滋養(yǎng)體或原生動物切丁酶基因也可被稱作切丁酶-AS或DAS。在被沉默時，本發(fā)明的滋養(yǎng)體或原生動物RdRP基因也可被稱作RdRP-AS或RAS。在使用轉基因滋養(yǎng)體或原生動物的混合物時， 可將其稱為切丁酶-AS+RdRP-AS或DAS+RAS。在本申請中，表達所有種類的可變表面蛋白的滋養(yǎng)體或原生動物可以是抗原變異機制失活的任何原生動物寄生蟲或病原體。
發(fā)現(xiàn)賈第鞭毛蟲中的VSP表達調控包括包含RNA依賴性的RNA聚合酶、切丁酶和 RNA干擾裝置(RNA interference machinery)組件Argonaute的系統(tǒng)。在表面表達單個表面抗原(蛋白)的克隆有效地轉錄多個VSP編碼基因，但在細胞表面僅積累編碼待表達 VSP的轉錄本。檢測對應于沉默VSP基因的反義RNA以及來自沉默蛋白silenciadas但不用于表達VSP的小RNA表明抗原變異調控中存在RNA干擾途徑。明顯地，切丁酶和RNA依賴性RNA 聚合酶的沉默導致寄生蟲個體中單種到多種VSP表達的變化。進行核連綴分析以測定VSP表達是否受到轉錄或轉錄后水平的調控。隨后，通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)研究滋養(yǎng)體中是否存在編碼VSP的正義和反義RNA，并研究參與高等真核生物中雙鏈(dsRNA)合成和降解的酶(例如RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)、 切丁酶和Argonaute)的活性。表征包括克隆并表達這些基因，并分析由編碼VSP的dsRNA 產(chǎn)生的小RNA。此外，在沉默賈第鞭毛蟲RNA干擾(RNAi)途徑的組分后，評估不同VSP的表達。此前從未描述過破壞抗原變異機制，從而產(chǎn)生在病原生物內表達所有種類的可變表面蛋白的細胞。在病原生物中表達表面蛋白的所有種類，從而產(chǎn)生可用作疫苗的寄生蟲， 或者純化可變表面蛋白的所有種類以用于免疫預防由這些病原導致的疾病，都還不可能。VSP在賈第鞭毛蟲中的轉錄使用從WB9B10克隆滋養(yǎng)體的細胞核分離的RNA，通過核連綴分析來分析VSP基因的轉錄(圖la)；所述克隆在其表面僅表達VSP9B10 (GenBank登錄號AAK97086)。所得結果表明大部分編碼VSP的基因同時轉錄。與此不同，將從兩種不同賈第鞭毛蟲克隆(WB9B10 和WB1267)提取的總RNA與作為對應于VSP基因保守性3'末端的探針使用的寡核苷酸一起溫育時，只檢測到分子量大小對應于在這些克隆表面上表達的VSP的一個轉錄本(圖 lb)。此外，還發(fā)現(xiàn)了疑似降解產(chǎn)物的極低分子量條帶。使用VSP特異性探針，發(fā)現(xiàn)在不同賈第鞭毛蟲克隆中僅積累一種VSP轉錄本(參見Nash，T. Ε. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 352, 1369-1375(1997)。這證明僅積累一種VSP轉錄本，但在寄生蟲細胞核中轉錄多于一種VSP。賈第鞭毛蟲中的轉錄后基因沉默(PTGS)PTGS的關鍵步驟是產(chǎn)生與沉默基因同源的dsRNA。通過設計用于特異性擴增正義或反義VSP產(chǎn)物的RT-PCR測試發(fā)現(xiàn)，在克隆并測序這些片段后，兩條鏈的RNA均存在于滋生體中(圖2)。為了評價針對VSP編碼基因的正義和反義RNA的可能的同時轉錄，使用特異的正義和反義探針進行第二輪的核連綴實驗(圖Ic)。在此分析中，不能檢測到VSP-反義 RNA，表明這些分子是轉錄后產(chǎn)生的。還分析了使用特異引物vsp9B10和vspU67由WB9B10 克隆PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物(圖Id)。對應于vsp9B10的條帶存在于基因組DNA和正義的互補DNA 中，但很少出現(xiàn)在反義cDNA中。與此不同，可以從基因組DNA擴增并且同樣也在正義和反義cDNA中擴增出沒有在WB9B10克隆表面表達的vspU67。這些結果證明VSP被同時轉錄 (進一步支持了核連綴實驗的結果)，并且所表達的反義VSP轉錄本的豐度低，并且存在被轉錄但沒有翻譯的反義VSP RNA。賈第鞭毛蟲RNAi裝置的組件由RdRP介導無引物地從異常mRNA產(chǎn)生dsRNA，以及通過短干擾RNA (siRNA)指導有引物/無引物地產(chǎn)生dsRNA，對于一些生物中RNAi觸發(fā)是必需的。鑒定了 RdRP的賈第鞭毛蟲同源物。此RdRP基因編碼155，257Da的堿性蛋白，該堿性蛋白與其他真核RdRP共享高同源性并與賈第鞭毛蟲病毒16編碼的一種蛋白明顯不同，這表明了所鑒定的基因的原生動物性質。通過RT-PCR和RNA印跡檢驗賈第鞭毛蟲RdRP轉錄，并通過血凝素標記的表達 (HA)確定其定位。賈第鞭毛蟲RdRP可能與存在于內質網(wǎng)胞質側的核糖體結合。另外，所述酶在滋養(yǎng)體中具有活性，這是因為其能夠在同源VSP RNA的存在下，在體外形成高分子量 RNA (圖3)。RNAi的特征是通過dsRNA特異性切丁酶RNA酶將dsRNA降解成21-25核苷酸的siRNA。此前鑒定出賈第鞭毛蟲切丁酶同源物，確定了其結構，并且證明了重組蛋白的體外切丁酶活性(Macrae, I. J. Science 311,195-198(2006) 通過使用果蠅切丁酶-1序列檢索賈第鞭毛蟲基因組數(shù)據(jù)庫中的同源基因，鑒定出與切丁酶結構域具有高度同源性的多個克隆。通過PCR以及隨后與基因組文庫的比較， 發(fā)現(xiàn)了兩個獨立的0RF，其包含存在于已知切丁酶的結構域帶有PIWI和PAZ結構域的 Argonaute 蛋白(gAgo，GenBank 登錄號 AY142142)和雙齒 RNase III (g 切丁酶，GenBank 登錄號AY142144)，其包含可能分別參與酶與RISC其他組件及RNA相互作用的PAZ結構域和亮氨酸拉鏈基序。根據(jù)圖3所示，切丁酶在整個賈第鞭毛蟲生活周期中組成型表達，并具有胞質定位(圖幻。為了評估賈第鞭毛蟲切丁酶活性，進行了體外分析，其中將放射標記的dsRNA 暴露于核后(post-nuclear)賈第鞭毛蟲提取物。結果(圖4a)證明，無論基因和標記的鏈 (正義、反義或二者)，dsRNA都被加工成20-30個核苷酸的小RNA片段，與在高等真核生物中類似，ATP的存在有利于此加工(圖4b)。由這些實驗獲得的小RNA能夠被克隆成類似于具有5' -P和3' -OH末端的siRNA。這些siRNA的測序表明，其源自輸入的VSP基因，并且具有22-25個核苷酸的長度(表1)。表1
權利要求
1.修飾的原生動物寄生蟲，其特征在于，所述原生動物寄生蟲包含在其表面同時表達的多于一種的可變表面蛋白。
2.如權利要求1所述的原生動物，其特征在于，所述原生動物包含在其表面同時表達的可變表面蛋白的所有種類。
3.如權利要求1所述的原生動物，其特征在于，選自切丁酶和/或RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的酶的表達降低。
4.如權利要求1所述的原生動物，其特征在于，RdRP基因已被沉默。
5.如權利要求1所述的原生動物，其特征在于，切丁酶基因已被沉默。
6.如權利要求1所述的原生動物，其特征在于，RdRP基因和切丁酶都已被沉默。
7.如權利要求1所述的原生動物，其特征在于，所述原生動物包含抗原變異機制。
8.如權利要求1所述的原生動物，其特征在于，所述原生動物選自賈第鞭毛蟲 (Giardia)、瘧原蟲(Plasmodium)、巴貝西蟲(Babesia)和錐蟲(Trypanosoma)
9.針對原生動物產(chǎn)生的感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗至少包含在其表面表達多于一種的可變表面蛋白的修飾原生動物。
10.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物在其表面表達可變表面蛋白的所有種類。
11.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物中選自切丁酶和/或RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的酶的表達下降。
12.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物的RdRP基因已被沉默。
13.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物的切丁酶基因已被沉默。
14.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物的RdRP基因和切丁酶都已被沉默。
15.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物包含抗原變異機制。
16.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物選自賈第鞭毛蟲、瘧原蟲、巴貝西蟲和錐蟲。
17.如權利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗還包含賦形劑和/或助劑。
18.一種用于純化原生動物所有種類的可變表面蛋白(VSP)的方法，其特征在于，所述方法包括a)將識別VSPCRKGA氨基酸序列的抗體連接到固體支持物；b)使所述固體支持物接觸原生動物；和c)分離所有種類的可變表面蛋白(VSP)。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生動物是野生原生動物克隆的混合物，其中每種克隆均表達不同的可變表面蛋白。
20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生動物是表達多于一種不同VSP的克隆，其中所述克隆是修飾原生動物的克隆，所述修飾原生動物克隆的選自RdRP和/或切丁酶的基因被沉默。
21.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生動物是表達所有種類的VSP的克隆，其中所述克隆是修飾原生動物的克隆，所述修飾原生動物克隆的選自RdRP和/或切丁酶的基因被沉默。
22.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述原生動物選自賈第鞭毛蟲、瘧原蟲、 巴貝西蟲和錐蟲。
23.一種疫苗，其特征在于，所述疫苗包含多于一種的原生動物可變表面蛋白、賦形劑和/或助劑，其中每種所述蛋白是不同的。
24.如權利要求23所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含原生動物所有種類的可變表面蛋白，其中每種所述蛋白是不同的
25.如權利要求23所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物選自賈第鞭毛蟲、瘧原蟲、 巴貝西蟲和錐蟲。
26.一種疫苗，其特征在于，所述疫苗包含所有種類的可變表面蛋白(VSP)，其中所述蛋白是采用權利要求18的方法獲得的。
27.一種免疫方法，其特征在于，所述方法包括向哺乳動物施用一定量的疫苗，所述疫苗包含表達至少兩種可變表面蛋白(VSP)的修飾原生動物。
28.如權利要求27所述的疫苗，其特征在于，所述原生動物表達所有種類的VSP。
29.如權利要求27所述的方法，其特征在于，施用形式選自口服、皮下施用、靜脈內施用和肌內施用。
30.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述原生動物是選自RdRP和/或切丁酶的基因被沉默的修飾原生動物。
31.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法包括免疫哺乳動物以抵抗原生動物感染，其中所述原生動物具有抗原變異機制。
32.一種免疫方法，其特征在于，所述方法包括向哺乳動物施用一定量的疫苗，所述疫苗包含原生動物可變表面蛋白的組合。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，施用形式選自口服、皮下施用、靜脈內施用和肌內施用。
34.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述可變表面蛋白的組合分離自選自 RdRP和/或切丁酶的基因被沉默的修飾原生動物。
35.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法包括免疫哺乳動物以抵抗原生動物感染，其中所述原生動物具有抗原變異機制。
36.如權利要求32所述的方法，其特征在于，施用至少一個包含50至500μ g可變表面蛋白的劑量。
37.一種核苷酸序列，其特征在于，所述序列為選自SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 112的序列。
38.如權利要求37所述的序列，其特征在于，所述序列為dsRNA的序列。
39.選自SEQID No. 1至SEQ ID No. 112的至少一個序列用于沉默RdRP基因的用途。
40.選自SEQID No. 1至SEQ ID No. 112的至少一個序列用于沉默切丁酶基因的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含在其表面同時表達的至少兩種可變表面蛋白(VSP)的修飾原生動物寄生蟲。所述修飾原生動物還同時表達可變表面蛋白的所有種類。原生動物顯示出切丁酶和/或RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的表達下降，其中RdRP基因和/或切丁酶基因被沉默。所述原生動物可以是顯示抗原變異機制的任何原生動物。
文檔編號A61K39/002GK102281884SQ200980148055
公開日2011年12月14日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權日2008年12月2日
發(fā)明者胡戈·丹尼爾·盧延 申請人:國家科學和技術研究委員會(Conicet), 阿根廷科爾多瓦天主教大學