專利名稱：：呈現(xiàn)非天然表面蛋白的嵌合病毒及其應(yīng)用的制作方法呈現(xiàn)非天然表面蛋白的嵌合病毒及其應(yīng)用1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了嵌合負鏈RNA病毒，通過使用本發(fā)明的單個嵌合病毒，該RNA病毒使得個體例如鳥類對兩種傳染性物質(zhì)產(chǎn)生免疫。特別地，本發(fā)明提供了經(jīng)工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進病毒顆粒的嵌合流感病毒，該融合蛋白包含傳染性物質(zhì)的蛋白胞外結(jié)構(gòu)域和流感病毒蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這樣的嵌合病毒誘導(dǎo)針對流感病毒和傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了經(jīng)工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進病毒顆粒的嵌合新城疫病毒(NDV)，該融合蛋白包含傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和NDV蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這樣的嵌合病毒誘導(dǎo)針對NDV和傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答。2.
背景技術(shù)：
：許多DNA病毒已經(jīng)經(jīng)過基因工程改造以引導(dǎo)異源蛋白在宿主細胞系統(tǒng)(如牛痘病毒、桿狀病毒等)中的表達。最近,在正鏈RNA病毒(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒)中也取得了類似進展。這些構(gòu)建體的表達產(chǎn)物，即異源基因產(chǎn)物或表達異源基因產(chǎn)物的嵌合病毒被認為可潛在地用于疫苗制劑(亞基或整個病毒疫苗)。使用病毒如牛痘構(gòu)建用于疫苗的重組或嵌合病毒的一個缺點是其主要抗原決定簇缺乏變化。病毒抹中這種變化的缺乏導(dǎo)致嵌合牛痘疫苗的重復(fù)使用受到嚴格的局限性，因為多次疫苗接種將對該病毒抹產(chǎn)生宿主抗性從而使接種的病毒無法感染宿主。因此，用嵌合牛痘接種抗性個體將無法誘導(dǎo)免疫刺激。相反，負鏈RNA病毒是構(gòu)建用作疫苗的嵌合病毒的有吸引力的候選者。負鏈RNA病毒例如流感病毒是理想的，因為其廣泛的遺傳變異性可以允許構(gòu)建疫苗制劑的龐大目錄，這些制劑引起免疫刺激的同時不會有產(chǎn)生耐受性的風(fēng)險。2.1負鏈RNA病毒含有負鏈基因組的包膜單鏈RNA的病毒家族被分為兩組具有非節(jié)段基因組的組(副粘病毒科、彈狀病毒科)或具有節(jié)段基因組的組(正粘病毒科、本雅病毒科和沙粒病毒科)。下文具體i兌明副粘病毒科和正粘病毒科家族并將其用在本文的實施例中。副粘病毒科家族包括新城疫病毒(NDV)、副流感病毒、仙臺病毒、猿猴病毒5和腮4泉炎病毒。正粘病毒科家族包括流感病毒、A、B和C型病毒，還有索戈托(Thogoto)和托里(Dhori)病毒，以及傳染性鮭魚貧血病毒。2.11流感病毒流感病毒顆粒包含內(nèi)部的核糖蛋白核(螺旋核衣殼)和外部的脂蛋白包膜，該核糖蛋白核包含單鏈RNA基因組，該脂蛋白包膜內(nèi)襯基質(zhì)蛋白(Ml)。A型流感病毒的節(jié)段基因組由8個線性的、負極性的、單鏈RNA分子組成(C型流感病毒為7個)，這些RNA編碼IO個多肽，包括RNA依賴性RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)以及形成核衣殼的核蛋白(NP);基質(zhì)膜蛋白(M1，M2);兩個從含脂包膜中伸出的表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA);非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)和核輸出蛋白(NEP)。基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制在核中進行，并通過在質(zhì)膜上出芽來發(fā)生裝配。在混合感染中病毒可以重排基因。流感病毒通過HA與細胞膜糖蛋白和糖脂上的唾液酸寡糖的結(jié)合作用吸附在細胞上。在病毒顆粒的內(nèi)吞后，細胞內(nèi)體中的HA分子發(fā)生構(gòu)象變化，該變化促進膜融合，由此引發(fā)病毒的脫殼。核衣殼轉(zhuǎn)移至核，在這里病毒mRNA進行轉(zhuǎn)錄。病毒mRNA遵從獨特的機制進行轉(zhuǎn)錄，其中病毒核酸內(nèi)切酶將細胞異源性mRNAs的5'末端帽子結(jié)構(gòu)切斷，該結(jié)構(gòu)成為通過病毒轉(zhuǎn)錄酶進行的病毒RNA模板轉(zhuǎn)錄的引物。轉(zhuǎn)錄終止于距離模板末端15到22個堿基位點處，在這里低聚(U)序列作為附加多聚(A)序列的信號。然后，病毒RNA的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)移至細胞膜，并與新轉(zhuǎn)錄的跨膜病毒蛋白結(jié)合。然后NA從膜結(jié)合糖蛋白的石友水化合物部分切下唾液酸殘基，從而引起后代病毒的包嚢作用和細胞釋放。在8個如此生成的病毒RNA分子中，有6個是直接被翻譯成HA、NA、NP蛋白和病毒多聚酶蛋白PB2、PB1及PA的單順反子信息。其它2個轉(zhuǎn)錄物經(jīng)歷剪切，各自生成2個mRNA，它們在不同的閱讀框內(nèi)被翻譯生成Ml、M2、NS1和NEP。換句話說，8個病毒RNA片段編碼IO個蛋白9個結(jié)構(gòu)蛋白和1個非結(jié)構(gòu)蛋白。一有關(guān)于流感病毒的基因以及其蛋白產(chǎn)物的總結(jié)如下文表1所示。表l:流感病毒基因組RNA片段和編碼功能片段長度b編碼的長度a每病毒顆粒(核苷酸)多肽e(氨基酸)的分子數(shù)評論123423412341223317781565PB2PB1PAHANP75975771656649830-6030-6030-605001000RNA轉(zhuǎn)錄酶組分；結(jié)合宿主細胞RNA帽子RNA轉(zhuǎn)錄酶組分；起始轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)錄酶組分；血凝素；三聚體；包膜糖蛋白；介導(dǎo)與細胞的連接核蛋白；與RNA連接；6141310278890NAM！M2NSNEP454252962301211003000■RNA轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)組分神經(jīng)氨酸酶；四聚體；包膜糖蛋白基質(zhì)蛋白；排列于包膜內(nèi)側(cè)質(zhì)膜中的結(jié)構(gòu)蛋白；剪切的mRNA非結(jié)構(gòu)蛋白核輸出蛋白；剪切的mRNA<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>流感病毒的致病性由多個病毒和宿主因子調(diào)節(jié)。在抗病毒感染的宿主因子中，I型干擾素(IFNo/p)系統(tǒng)代表了強大的抗病毒先天防御機制，此機制在真核生物進化中建立地相對較早(Garcia-Sastre，2002,MicrobesInfect4:647-55)。抗病毒IFNo/p系統(tǒng)包括三個主要步驟(i)檢測病毒感染和分泌IFNo/|3,(ii)IFNo/p與其受體結(jié)合并且轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)受IFNo/(3刺激的基因，(iii)合成抗病毒蛋白和酶。然而，大多數(shù)病毒已經(jīng)獲得了編碼IFNo/p拮抗劑分子的特異性遺傳信息，這些分子有效地阻斷抗病毒IFNo/p系統(tǒng)的一個或多個步驟。流感A型病毒在感染細胞中表達非結(jié)構(gòu)性蛋白，NS1蛋白(下文中將有詳細描述)，其可以阻礙細胞的IFNo/|3應(yīng)答。(Garda-Sastre等，1998，Virology252:324-30)2.1.1.1高致病性禽流感近些年來，亞洲和歐洲都已報道了高致病性禽流感(HPAI)的爆發(fā)(Kawaoka等，2005,Natl.Rev.Microbiol.3:591-600;Koopmans等，2004，Lancet363:587-593)。涉及流感A，H5N1或H7N7病毒亞型的爆發(fā)導(dǎo)致家禽的致死性感染，并引起有限數(shù)量的人類死亡病例(Tweed等，2004，Emerg.Infec.Dis.10:2196-2199)。近年來，在中國，目前的H5N1型病毒已經(jīng)在家禽間傳播(Chen等，2005,Nature436:191-192)，雖然候鳥被認為是這些病毒的原始宿主，但被認為，這些病毒從感染的家禽再傳染回候鳥導(dǎo)致了這些病毒地理分布的增加。當(dāng)前，H5N1型病毒已經(jīng)在亞洲出現(xiàn)，并傳播至歐洲和非洲(Enserink,2006,Science,311:932)。在1997年的香港和2003年的荷蘭，大規(guī)模捕殺受感染家禽已被證明是消除H5N1病毒爆發(fā)的成功策略(Lipatov等，2004，J.Virol.78:8951-8959)。由于最近HPAI爆發(fā)所造成的人類受害者曾經(jīng)與受感染家禽有過密切接觸，接下來可能通過屠宰來根除家禽中的AIV，從而預(yù)防禽流感病毒(AIV)的種間傳播。然而，由于經(jīng)濟和可行性方面的原因，單靠捕殺受感染家禽已不再被認為是控制這種疾病的選擇方法。此外，考慮到道德及生態(tài)方面的原因，捕殺候鳥野禽被認為是不可接受的行為。最近，OIE(世界動物衛(wèi)生組織)和FAO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織)建議應(yīng)當(dāng)考慮對家禽接種疫苗來控制AIV。此外，據(jù)報道，在實地研究中，給雞注射滅活H5疫苗可以成功的控制該病毒的傳^f(Ems等，2004，AvianPathol.33:405-412)。最近，中國已將疫苗接種納入作為其AIV控制計劃的一部分。高致病性H5N1病毒抹可以在人之間引起傳播的可能性被稱為全球性的流行病，WHO不愿意評估一旦H5N1病毒與人類形式重組將引起的全球死亡率。因此，明顯需要用于控制H5N1在農(nóng)畜間感染的方法，通過這些農(nóng)畜到人類的絕大多數(shù)傳播被認為已經(jīng)增加。2.1.2新城疫病毒新城疫病毒是含有線性、單鏈、非片段負義RNA基因組的包膜病毒。該基因組RNA的基因包含順序為3，-N-P-M-F-HN-L的基因，將在下文詳細闡述。該基因組RNA還包含3'端的前導(dǎo)序列。病毒顆粒的結(jié)構(gòu)元件包括病毒包膜，其是來自細胞質(zhì)膜的脂雙層。糖蛋白，血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)從包膜突出，提供血凝素(如受體結(jié)合/融合)和神經(jīng)氨酸酶活性。融合糖蛋白(F)(也與病毒包膜相互作用)，首先生成無活性的前體，然后進行翻譯后剪切產(chǎn)生兩個二疏鍵連接的多肽?；钚訤蛋白通過協(xié)助病毒包膜與宿主細胞質(zhì)膜的融合參與NDV進入宿主細胞的穿透過程?；|(zhì)蛋白(M)參與病毒的裝配，同時它與病毒膜以及核衣殼蛋白之間有相互作用。核衣殼的主要蛋白質(zhì)亞單位是核衣殼蛋白(N)，其賦于衣殼螺旋對稱性。與核衣殼相關(guān)的是P和L蛋白。受磷酸化作用支配的磷蛋白(P)被認為在轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用，且可能參與甲基化、磷酸化和多腺苷酸化。L基因編碼RNA依賴性RNA聚合酶，在病毒RNA合成中，它和P蛋白都是必需的。L蛋白占據(jù)了將近一半的病毒基因組編碼容量，它是最大的病毒蛋白，在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起重要作用。包括NDV在內(nèi)的所有負鏈RNA病毒的復(fù)制由于缺乏復(fù)制RNA所需的細胞結(jié)構(gòu)而變得復(fù)雜。另外，負鏈RNA基因組不能被直接翻譯成蛋白質(zhì)，而必須首先被轉(zhuǎn)錄成正鏈(mRNA)拷貝。因此，在進入宿主細胞后，病毒不能合成所需的RNA依賴性RNA聚合酶。L、P和N蛋白必須與基因組一起通過感染進入細胞。據(jù)假設(shè)，轉(zhuǎn)錄NDVmRNA的大多數(shù)或全部的病毒蛋白同樣進行其復(fù)制。調(diào)控蛋白的相同補體的不同作用(即轉(zhuǎn)錄或復(fù)制)的機制還未被清楚闡明，但是似乎涉及游離形式的一個或多個核衣殼蛋白的豐度，特別是N。在病毒穿透之后，L蛋白以核衣殼中的負義RNA為模板直接啟動轉(zhuǎn)錄。病毒RNA合成也被調(diào)控，由此在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生單順反子mRNA。轉(zhuǎn)錄后，病毒基因組的復(fù)制是負鏈RNA病毒感染的第二個必要步驟。與其它負鏈RNA病毒一樣，新城疫病毒(NDV)的病毒基因組復(fù)制也是由病毒特異性蛋白介導(dǎo)的。復(fù)制型RNA合成的最初產(chǎn)物是NDV基因組RNA的互補拷貝(即，正-極性)(cRNA)。這些正鏈的拷貝(反基因組)與正鏈mRNA轉(zhuǎn)錄物的末端結(jié)構(gòu)不同。與mRNA轉(zhuǎn)錄物不同，反基因組cRNA的5'末端沒有帽子結(jié)構(gòu)且未被甲基化，3'末端沒有被截斷且未被多(聚)腺苷酸化。cRNA與它們的負鏈模板具有共同末端，并且以互補形式包含每一個基因組RNA片段中全部的遺傳信息。cRNA作為NDV負鏈病毒基因組(vRNA)合成的模板。NDV負鏈基因組(vRNA)和互補基因組(cRNA)均被核衣殼蛋白包裹(encapsidated);唯一未^皮包裹的RNA種類是病毒mRNA。對于NDV,胞質(zhì)是病毒RNA復(fù)制的場所，正如它也是轉(zhuǎn)錄的場所一樣。病毒各組分的裝配似乎發(fā)生在宿主細胞的質(zhì)膜，成熟病毒通過出芽方式進行釋放。2.2免疫原性制劑重組DNA技術(shù)和"反向遺傳學(xué)"工程技術(shù)提供了制備用于免疫原性制劑的重組病毒的獨特方法。特別地，本發(fā)明提供了構(gòu)建負鏈RNA病毒使其不僅表達或顯示天然病毒抗原，而且表達或顯示任何被設(shè)計結(jié)合進病毒蛋白包被的抗原的方法。尤其感興趣的是，來自除流感外的傳染性生物體的抗原。以這種方式，單個病毒可被工程改造為可用于激活或引起免疫應(yīng)答的免疫原性化合物，這將可以提供抗至少兩種病原體的保護。必要時可進一步工程改造這樣的嵌合病毒來調(diào)節(jié)它們的毒性，即由此減輕或進一步減輕它們的毒性。減弱的流感病毒是有益的，因為它們可以是免疫原性的并且可以復(fù)制，但它們不具有致病性?；钜呙绫徽J為可引起改良的、可交叉反應(yīng)的、細胞介導(dǎo)的細胞毒性以及體液抗體反應(yīng)，比滅活的疫苗提供更好的保護(Gorse和Belshe，1990，J.Clin.Microbiol.28:2539-2550;Gorse等，1995，J.Infect.Dis.172:1-10)。第二，對病毒病的保護性免疫可能涉及粘膜的IgA反應(yīng)，用傳統(tǒng)的肌注給藥方式注射疫苗時未觀察到此類情況(Nelson等，1998，Vaccine16:1306-1313)。最后，活疫苗還具有可鼻內(nèi)給藥的優(yōu)勢，這可避免滅活佐劑疫苗的肌注給藥時有時會出現(xiàn)的胂脹和肌痛。已有報道，這些活疫苗不僅可以引起抗同型流感病毒的體液反應(yīng)，還可引起可交叉反應(yīng)的細胞介導(dǎo)細胞毒性。因此，本發(fā)明提供了發(fā)展新的和更有效的用于診斷、預(yù)防、控制或治療病毒和非病毒性病原體的免疫制劑例如疫苗制劑的可能性。3.發(fā)明綜述本發(fā)明提供了經(jīng)工程改造以表達可結(jié)合進病毒顆粒的融合蛋白的嵌合負鏈RNA病毒，制備這些嵌合病毒的方法和這些病毒例如作為免疫原在免疫原性制劑或體外試驗中的應(yīng)用。本發(fā)明嵌合病毒其特征在于在病毒顆粒的表面不僅顯示與病毒相關(guān)的抗原，還顯示融合蛋白。本發(fā)明提供了嵌合流感病毒和嵌合NDV,通過施用嵌合流感病毒或嵌合NDV,這些病毒可使個體，例如鳥或人，對兩種傳染性物質(zhì)產(chǎn)生免疫。一方面，用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的單個病毒的應(yīng)用可減少免疫制劑的給藥頻率。另一方面，用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的單個病毒的應(yīng)用可降低免疫個體的費用。免疫個體更低的費用增加了更多個體能夠負擔(dān)免疫費用的可能性，由此降低了與治療被感染個體相關(guān)的健康費用。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的嵌合病毒在用于人或動物的組合物(例如免疫原性制劑)中的應(yīng)用。特別地，本發(fā)明的嵌合病毒可作為抗多種病毒和/或抗原的廣譜疫苗。由于該嵌合病毒經(jīng)工程改造可在病毒顆粒中表達外源抗原決定簇，包含本發(fā)明嵌合病毒的組合物(例如，疫苗制劑)可被設(shè)計用來針對多種變異抹、不同病毒或完全不同的傳染物或疾病抗原(例如，細菌、寄生蟲、真菌或腫瘤特異性抗原)進行免疫。很多方法可以用來將活的減毒病毒制劑引入人類或動物個體中以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或適當(dāng)?shù)募毎蜃臃磻?yīng)。這些方法包括但不限于鼻內(nèi)、腦脊髓膜內(nèi)、口服、皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下途徑。通過施用嵌合病毒，本發(fā)明的嵌合病毒可以使個體(例如鳥)對兩種傳染性疾病產(chǎn)生免疫。在具體實施方式中，通過施用本發(fā)明的嵌合病毒，本發(fā)明的嵌合病毒可以使鳥類對禽流感病毒和新城疫病毒產(chǎn)生免疫。通過用嵌合病毒對鳥進行噴霧或以水溶液形式，例如鳥的飲用水來施用嵌合病毒，可以方便地使鳥類獲得免疫。本發(fā)明部分基于申請人的發(fā)現(xiàn)，即通過工程改造流感病毒以表達融合蛋白并將該融合蛋白結(jié)合進其病毒顆?？梢詫崿F(xiàn)對兩種傳染性物質(zhì)的有效免疫應(yīng)答，該融合蛋白包含該病毒的至少一個必需糖蛋白的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)以及第二傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，其中該融合蛋白功能性取代必需糖蛋白。一方面，該融合蛋白結(jié)合進病毒顆粒導(dǎo)致對第二傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答的增強。將病毒的必需糖蛋白的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)工程改造入融合蛋白中可以使融合蛋白結(jié)合進病毒顆粒。在具體實施方式中，必需糖蛋白是流感病毒HA蛋白和/或NA蛋白中的一個或兩個。在另一實施方式中，必需糖蛋白是NDV的HN蛋白或F蛋白中的一個或兩個。病毒的至少一個必需糖蛋白的功能性置換消除了對于病毒基因組容量限制的擔(dān)憂(例如流感病毒基因組)。在某些實施方式中，用融合蛋白對病毒的至少一個必需糖蛋白的功能性置換減弱了病毒在個體中的復(fù)制。本發(fā)明提供了包含融合蛋白的嵌合禽流感病毒，該融合蛋白具有(i)非流感病毒的傳染性物質(zhì)的保護性抗原的胞外結(jié)構(gòu)域，其與(ii)流感病毒的必需基因編碼的糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合，其中該融合蛋白結(jié)合進禽流感病毒中，在該病毒中，必需基因的功能由融合蛋白或禽流感病毒天然糖蛋白來提供。在某些實施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它實施方式中，流感病毒的必需基因是神經(jīng)氨酸酶(NA)基因。在某些實施方式中，嵌合禽流感病毒被減弱。根據(jù)這些實施方式，通過NS1基因的突變，可減弱嵌合禽流感病毒。本發(fā)明"^供了包含融合蛋白的嵌合流感病毒，該融合蛋白具有(i)NDV的HN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，其與(ii)流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合，其中該融合蛋白結(jié)合進禽流感病毒中，在該病毒中，NA蛋白的功能由融合蛋白或禽流感病毒天然糖蛋白來提供。在某些實施方式中，嵌合禽流感病毒被減弱。根據(jù)這些實施方式，通過NS1基因的突變，可減弱嵌合禽流感病毒。根據(jù)本發(fā)明，可使用任何類型、亞型或病毒抹的禽流感病毒。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含編碼神經(jīng)氨酸融合蛋白的被包裝的流感病毒NA片段，其中NA開放閱讀框被修飾，由此編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感的傳染性物質(zhì)的通過N末端錨定的神經(jīng)氨酸酶抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，由此該神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并且可被結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含編碼血凝素融合蛋白的被包裝的流感病毒HA片段，其中HA開放閱讀框被修飾，由此編碼HA胞外結(jié)構(gòu)域的核普酸被編碼非流感的傳染性物質(zhì)的通過C末端錨定的受體結(jié)合/融合抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，由此血凝素融合蛋白被表達并被結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含被包裝的雙順反子流感病毒HA片段，其包含(a)編碼禽流感病毒血凝素蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼血凝素融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼血凝素胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感病毒的傳染性物質(zhì)的保護性抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸，或編碼由C末端錨定的疾病抗原的核苷酸所代替，由此流感病毒血凝素和融合蛋白都被表達并且被結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。在某些實施方式中，嵌合禽流感病毒的HA片段的第一開放閱讀框被修飾以去除血凝素多元切割位點。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含被包裝的雙順反子流感病毒NA片段，其包含(a)編碼禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感病毒的傳染性物質(zhì)的保護性抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸，或編碼N末端^皮錨定的疾病抗原的核苷酸所代替，由此流感病毒神經(jīng)氨酸酶和融合蛋白都被表達并且被結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。在某些實施方式中，嵌合禽流感病毒包含HA片段，該片段具有經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點的開放閱讀框。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含被包裝的編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的流感病毒的NA片段，其中該NA開放閱讀框被修飾，使得編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼NDV的HN抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所代替，由此該神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并且被結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。神經(jīng)氨酸酶融合蛋白為嵌合禽流感病毒提供了神經(jīng)氨酸酶的活性。在某些實施方式中，本發(fā)明的嵌合禽流感病毒包含被包裝的編碼經(jīng)修飾的NS1蛋白的NS1基因片段，該蛋白降低病毒的細胞干擾素拮抗物的活性。在下文5丄2節(jié)中，提供了生成經(jīng)修飾的NS1蛋白的NS1基因的突變的非限制性例子。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的嵌合禽流感病毒的NA片段的重組核酸分子(如重組DNA分子)。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的嵌合禽流感病毒的HA片段的重組核酸分子(如重組DNA分子)。本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的嵌合禽流感病毒的NA片段或HA片段的重組核酸分子(如重組RNA分子)。本發(fā)明提供了增殖本發(fā)明的嵌合禽流感病毒的方法，包括在易受禽流感病毒感染的胚蛋或細胞系中培養(yǎng)嵌合禽流感病毒。本發(fā)明還提供了制備免疫原性制劑的方法，該方法包括(a)在胚蛋或易受禽流感病毒感染的細胞系中，培養(yǎng)該嵌合流感病毒；和(b)收集增殖的病毒，其中病毒生長到足夠的量，并且在足以使病毒免受污染的條件下生長，這樣，增殖的病毒就可以用于免疫原性制劑，例如，疫苗制劑。本發(fā)明提供了包含融合蛋白的減毒嵌合流感病毒，該融合蛋白具有(i)非流感病毒的傳染性物質(zhì)的保護性抗原的胞外結(jié)構(gòu)域，其與(ii)由流感病毒的必需基因編碼的糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合，其中該融和蛋白結(jié)合到減毒流感病毒中，在該病毒中，必需基因的功能由融和蛋白或該減毒流感病毒的天然糖蛋白來提供。在某些實施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它實施方式中，流感病毒的必需基因是神經(jīng)氨酸酶(NA)基因。該減毒嵌合流感病毒可能是任何型、亞型或流感病毒抹。例如，該減毒嵌合流感病毒可以是流感A病毒、流感B病毒或流感C病毒。本發(fā)明提供了減毒嵌合流感病毒，包含被包裝的編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的流感病毒NA片段，其中該NA開放閱讀框被修飾從而編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感的傳染性物質(zhì)的由N末端錨定的神經(jīng)氨酸酶抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，從而神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并結(jié)合進減毒嵌合禽流感病毒中。在某些實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒包含HA片段，該片段具有經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點的開放閱讀框。本發(fā)明提供了減毒嵌合流感病毒，包含被包裝的編碼血凝素融合蛋白的流感病毒HA片段，其中該HA開放閱讀框被修飾從而編碼HA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感的傳染性物質(zhì)的由C末端錨定的血凝素抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，從而血凝素融合蛋白被表達并結(jié)合進減毒嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了減毒嵌合流感病毒，包含被包裝的雙順反子流感病毒HA片段，包含(a)編碼流感血凝素蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼血凝素融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼血凝素胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感的傳染性物質(zhì)的保護性抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸，或編碼由C末端錨定的疾病抗原的核苷酸所代替，因此該流感病毒血凝素和該融合蛋白都^皮表達并結(jié)合到減毒嵌合流感病毒中。在某些實施方式中，該減毒嵌合流感病毒的HA片段的第一開放閱讀框被修飾以去除血凝素多元切割位點。本發(fā)明提供了減毒嵌合流感病毒，包含被包裝的雙順反子流感病毒NA片段，包括(a)編碼流感神經(jīng)氨酸酶蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域的核普酸被編碼非流感的傳染性物質(zhì)的保護性抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸或編碼由N末端錨定的疾病抗原的核苷酸替代，由此流感神經(jīng)氨酸酶和融合蛋白被表達并結(jié)合進減毒嵌合流感病毒中。在某些實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒包含HA片段，該片段具有經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點的開放閱讀框。在某些實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒包含經(jīng)包裝的編碼被修飾的NS1蛋白的NS1基因片段，該蛋白降低病毒的細胞干擾素拮抗劑活性。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒NA片段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒HA片段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒的NA片段或HA片段的重組核酸分子(例如，重組RNA分子)。本發(fā)明提供了本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒的增殖方法，包括在對流感病毒易感的胚蛋中或細胞系中培養(yǎng)該減毒嵌合流感病毒。本發(fā)明還提供了制備免疫原性制劑的方法，該方法包含(a)在對減毒流感病毒易感的胚蛋中或細胞系中增殖本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒；和(b)收集后代病毒，其中病毒生長到足夠的量，并且在足以使病毒免受污染的條件下生長，由此后代病毒適用于免疫原性制劑，例如疫苗制劑。本發(fā)明還提供了嵌合NDV病毒。特別地，本發(fā)明提供了包含融合蛋白的嵌合NDV,該融合蛋白具有(i)非NDV的傳染性物質(zhì)的保護性抗原的胞外結(jié)構(gòu)域，其與(ii)由NDV的必需基因編碼的糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合，其中該融合蛋白結(jié)合進NDV中，在該NDV中，必需基因的功能由融合蛋白或NDV天然糖蛋白提供。在某些實施方式中，NDV的NDV必需基因是編碼F蛋白的基因。在其它實施方式中，NDV的NDV必需基因是編碼HN蛋白的基因。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何類型、亞型或病毒抹的NDV。本發(fā)明提供了嵌合NDV,包含被包裝的基因組，該基因組包含編碼F蛋白-融合蛋白的核苷酸序列，該蛋白具有F蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以及非NDV的傳染性物質(zhì)的抗原的胞外結(jié)構(gòu)域或由C末端錨定的疾病抗原，因此F蛋白-融合蛋白被表達并被結(jié)合進嵌合NDV中。在某些實施方式中，嵌合NDV的基因組包含編碼F蛋白的核苷酸序列，由此除了NDVF蛋白-融合蛋白外，F(xiàn)蛋白被表達并被結(jié)合進嵌合NDV中。在其它實施方式中，編碼NDVF蛋白-融合蛋白的核苷酸序列代替了編碼NDVF蛋白的核苷酸序列，并且F蛋白-融合蛋白為嵌合NDV提供了F蛋白的功能。本發(fā)明提供了嵌合NDV,包含被包裝的基因組，該基因組包含編碼HN融合蛋白的核苷酸序列，該蛋白具有HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和由N末端錨定的非NDV的傳染性物質(zhì)的抗原或疾病抗原的胞外結(jié)構(gòu)域，因此該HN融合蛋白被表達并被插入到嵌合NDV中。在某些實施方式中，嵌合NDV的基因組包含編碼HN蛋白的核苷酸序列，因此，除形成NDVHN融合蛋白外，該HN融合蛋白被表達并被插入到嵌合NDV中。在其它實施方式中，編碼HN融合蛋白的核普酸序列代替了編碼NDVHN蛋白的核苷酸序列，并且HN融合蛋白為嵌合NDV提供了HN蛋白的功能。本發(fā)明提供了編碼和/或被編碼NDVHN蛋白或F蛋白的重組核酸分子。本發(fā)明提供了本發(fā)明的嵌合NDV的增殖方法，包括在對NDV易感的胚蛋或細胞系中培養(yǎng)嵌合NDV。本發(fā)明還提供制備免疫原性制劑的方法，該方法包含(a)在對NDV易感的胚蛋或細胞系中增殖本發(fā)明的嵌合NDV;和(b)收集后代病毒，其中該病毒生長到足夠的量，并且足以使病毒免受污染的條件下生長，由此，后代病毒適用于免疫原性制劑，例如疫苗制劑。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的嵌合病毒的胚蛋。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的嵌合病毒的細胞系。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的嵌合病毒的免疫原性制劑。本發(fā)明提供了在個體中誘導(dǎo)對一種、兩種或更多種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的本發(fā)明的嵌合流感病毒。在某些實施方式中，個體是人類個體。在其它實施方式中，個體是非人類哺乳動物(例如，豬、馬、狗或貓)。在其它實施方式中，個體是鳥類個體。在具體實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥體內(nèi)誘導(dǎo)對一種、兩種或更多種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的本發(fā)明的嵌合禽流感病毒。本發(fā)明提供了在個體中誘導(dǎo)對一種、兩種或更多種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的本發(fā)明的嵌合NDV。在某些實施方式中，個體是人類個體。在其它實施方式中，個體是非人類哺乳動物(例如，豬、馬、狗或貓)。在其它實施方式中，個體是鳥類個體。在具體實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥體內(nèi)誘導(dǎo)對一種、兩種或更多種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的本發(fā)明的嵌合NDV。本發(fā)明提供了在個體中誘導(dǎo)對一種、兩種或更多種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒。在某些實施方式中，個體是人類個體。在其它實施方式中，個體是非人類哺乳動物(例如，豬、馬、狗或貓)。在其它實施方式中，個體是鳥類個體。在具體實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥體內(nèi)誘導(dǎo)對一種、兩種或更多種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含對有此需要的人施用有效量的本發(fā)明的嵌合病毒。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)對疾病抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含對個體施用有效量的本發(fā)明的嵌合病毒。在某些實施方式中，個體是人類。在其它實施方式中，個體是鳥。3.1術(shù)語本文所用的術(shù)語"動物"包括但不限于伴侶動物(如狗和貓)、動物園動物、農(nóng)場動物(如反芻動物、非反芻動物、家畜和家禽)、野生動物、還有實驗室動物(如嚙齒類，例如大鼠、小鼠、豚鼠以及兔子)，以及被克隆或者經(jīng)過遺傳學(xué)或其它手段改造的動物(如轉(zhuǎn)基因動物)。本文中，當(dāng)術(shù)語"大約"或"近似地"與數(shù)字連用時，指所指數(shù)字的1%、5%或10%之內(nèi)的任何數(shù)字。本文中，NS1的"氨基末端"指流感病毒NS1蛋白的氨基末端氨基酸殘基(氨基酸殘基l)到氨基酸殘基115、氨基酸殘基1到100、氨基酸殘基1到75、氨基酸殘基1到50、氨基酸殘基1到25、或氨基酸殘基1到10的氨基酸。氨基末端的缺失包括由NS1的氨基末端的5個氨基酸殘基，優(yōu)選地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175個氨基酸殘基組成的缺失。本文中，NS1的"羧基末端"指馬流感病毒NS1蛋白的氨基酸殘基116到羧基末端氨基酸殘基，氨基酸殘基101到羧基末端氨基酸殘基，氨基酸殘基76到羧基末端氨基酸殘基，氨基酸殘基51到羧基末端氨基酸殘基，或氨基酸殘基26到羧基末端氨基酸殘基，當(dāng)NS1的氨基末端分別是流感病毒NS1蛋白的氨基酸殘基1到115，氨基酸殘基1到100,氨基酸殘基1到75，氨基酸殘基1到50,或氨基酸殘基1到25時。羧基末端的缺失可包括由NS1的羧基末端的5個氨基酸殘基，優(yōu)選地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、73、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175個氨基酸殘基組成的缺失。本文中，術(shù)語"疾病"和"紊亂"可互換地用于指個體的病癥，且包括但不限于增殖紊亂(例如，白血病、纖維癥、腫瘤(包括惡性腫瘤、非惡性腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤和非轉(zhuǎn)移性腫瘤)、和淋巴瘤)，以及傳染性物質(zhì)引起的感染(例如，病毒、細菌、寄生蟲)，或與其相關(guān)的病癥或癥狀。本文中，術(shù)語"抗原決定簇"指個體中就有抗原活性或免疫原活性的分子(例如，多肽或蛋白質(zhì))的位點、片段或區(qū)域。具有免疫原活性的抗原決定簇是激發(fā)個體內(nèi)抗體應(yīng)答的分子(例如，多肽或蛋白)的位點、片段或區(qū)域。具有抗原活性的抗原決定簇是通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法例如免疫分析法確定的抗體能與之特異性結(jié)合的分子位點、片段或區(qū)域。本文中，蛋白物質(zhì)的"片段"指肽或多肽，其包含肽、多肽或蛋白的氨基酸序列的至少2個連續(xù)的氨基酸殘基、至少5個連續(xù)的氨基酸殘基、至少IO個連續(xù)的氨基酸殘基、至少15個連續(xù)的氨基酸殘基、至少20個連續(xù)的氨基酸殘基、至少25個連續(xù)的氨基酸殘基、至少40個連續(xù)的氨基酸殘基、至少50個連續(xù)的氨基酸殘基、至少60個連續(xù)的氨基酸殘基、至少70個連續(xù)的氨基酸殘基、至少80個連續(xù)的氨基酸殘基、至少90個連續(xù)的氨基酸殘基、至少100個連續(xù)的氨基酸殘基、至少125個連續(xù)的氨基酸殘基、至少150個連續(xù)的氨基酸殘基、至少175個連續(xù)的氨基酸殘基、至少200個連續(xù)的氨基酸殘基、或至少250個連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列。在一實施方式中，全長蛋白的片段保留全長蛋白的活性。在另一實施方式中，全長蛋白的片舉不保留全長蛋白的活性。本文中，編碼多肽或蛋白的核酸的"片段"指核酸，其包含編碼肽、多肽或蛋白的核酸序列的至少2個連續(xù)核苷酸、至少5個連續(xù)核苷酸、至少10個連續(xù)核苷酸、至少15個連續(xù)核苷酸、至少20個連續(xù)核苷酸、至少25個連續(xù)核苦酸、至少30個連續(xù)核苷酸、至少35個連續(xù)核苷酸、至少40個連續(xù)核苷酸、至少50個連續(xù)核苷酸、至少60個連續(xù)核苷酸、至少70個連續(xù)核苷酸、至少80個連續(xù)核苷酸、至少90個連續(xù)核苷酸、至少100個連續(xù)核苷酸、至少125個連續(xù)核苷酸、至少150個連續(xù)核苷酸、至少175個連續(xù)核苷酸、至少200個連續(xù)核苷酸、至少250個連續(xù)核苷酸、至少300個連續(xù)核苷酸、至少350個連續(xù)核苷酸、或至少380個連續(xù)核苷酸的核酸序列。在優(yōu)選實施方式中，核酸片段編碼保留全長蛋白活性的肽或多肽。在另一實施方式中，全長蛋白的片^L不保留全長蛋白的活性。本文中，蛋白物質(zhì)的"異源序列"指在自然界中未發(fā)現(xiàn)與嵌合病毒骨架或特別是嵌合病毒糖蛋白相關(guān)聯(lián)的分子。核酸序列或核酸分子的"異源序列"指在自然界中未發(fā)現(xiàn)與嵌合病毒骨架基因組相關(guān)聯(lián)的分子。本文中，術(shù)語"免疫特異性結(jié)合抗原"以及類似術(shù)語，指特異性結(jié)合抗原而不會特異性結(jié)合另一個分子的分子(例如，抗原特異性抗體包括被修飾的抗體(即含有^^皮修飾的IgG(例如IgGl)的恒定結(jié)構(gòu)域，或其FcRn-結(jié)合片段(例如Fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域))和未被修飾的抗體(即不包括被修飾的IgG(例如IgGl)的恒定結(jié)構(gòu)域，或其FcRn-結(jié)合片段(例如Fc結(jié)構(gòu)域或鉸鏈-Fc結(jié)構(gòu)域))。特異性的結(jié)合一種抗原的分子可與相關(guān)抗原交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，特異性結(jié)合一種抗原的分子不與其它抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。可通過免疫分析、BIAcore、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已如的其它技術(shù)識別特異性結(jié)合抗原的分子。當(dāng)通過實驗技術(shù)(例如放射免疫分析法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))確定分子與所述抗原比與其它交叉反應(yīng)抗原以更高的親和力結(jié)合時，該分子特異性地結(jié)合抗原。關(guān)于抗體特異性的討論，參見例如，Paul編，1989,FundamentalImmunology第2版，RavenPress,NewYork第332-336頁。本文中，在對個體施用治療的上下文中，術(shù)語"聯(lián)合"指多于一種治療的使用(例如，多于一種的預(yù)防劑和/或治療劑)。使用術(shù)語"聯(lián)合"并不限制對個體(例如，被流感病毒感染或NDV感染或具有與其相關(guān)的病癥或癥狀的個體，或具有其它感染(例如另一種病毒感染)的個體)施用治療(例如，預(yù)防劑和/或治療劑)的順序?？稍趯€體(例如，被流感病毒感染或NDV感染或具有與其相關(guān)的病癥或癥狀的個體，或具有其它感染(例如另一種病毒感染)的個體)施用第二治療(例如第二預(yù)防劑和/或治療劑)之前(例如之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同時或之后(例如之后5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、l周、2周、3周、4周。5周、6周、8周或12周)施用第一治療(例如第一預(yù)防劑和/或治療劑)。本文中，蛋白試劑的"干擾素拮抗劑活性"指降低或抑制細胞干擾素免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或多肽，或其片段、衍生物或類似物。尤其是，具有干擾素拮抗劑活性的蛋白質(zhì)或多肽，或其片段、衍生物或類似物(例如流感病毒NS1)降低或抑制干擾素的表達和/或活性。在具體實施方式中，短語"干擾素拮抗劑活性"指降低或抑制細胞干擾素免疫應(yīng)答的病毒蛋白或多肽，或其片段、衍生物或類似物(例如流感病毒蛋白)。具有干擾素拮抗劑活性的病毒蛋白或多肽可優(yōu)先影響一種或兩種干擾素(IFN)的表達和/或活性。在一個實施方式中，IFN-a的表達和/或活性受到影響。在另一實施方式中，IFN-p的表達和/或活性受到影響。在另一具體實施方式中，IFN-y的表達和/或活性受到影響。在某些實施方式中，如本文所述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)所測量的，相比于沒有表達或接觸這種蛋白試劑的對照胚蛋或細胞中IFN-oc、IFN-卩和/或IFN-Y的表達和/或活性，胚蛋或細胞中的IFN-a、IFN-(3和/或IFN-y的表達和/或活性被具有干擾素拮抗劑活性的蛋白試劑降低大約l到ioo倍、大約5到80倍、大約20到80倍、大約1到10倍、大約1到5倍、大約40到80倍，或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。本文中，短語"IFN缺陷系統(tǒng)"或"IFN缺陷底物"指系統(tǒng)，例如細胞、細胞系和動物如小鼠、雞、火雞、兔、大鼠、馬等，它們不能生成一種、兩種或更多種類型的IFN，或不能生成任何類型的IFN,或生成低水平的一種、兩種或更多類型的IFN，或生成低水平的任何IFN(例如，與相同情況下的IFN完全系統(tǒng)相比，任何IFN表達降低5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%或更多)，對一種、兩種、或更多種類型的IFN無應(yīng)答或不能有效應(yīng)答，或?qū)θ魏晤愋虸FN不應(yīng)答，和/或在由一種、兩種、或更多類型的IFN或任何類型的IFN引起的抗病毒基因的活性上存在缺陷。本文中，術(shù)語"感染"、"流感感染"、"禽流感感染"和"NDV感染"指流感病毒、禽流感病毒、NDV、或另一種傳染性物質(zhì)(例如，另一種病毒或細菌感染)在個體內(nèi)的生命周期的所有階段(包括但不限于流感病毒、禽流感病毒、NDV或其它傳染性物質(zhì)侵入細胞或個體組織并在其中復(fù)制)，以及流感病毒、禽流感病毒、NDV或其它傳染性物質(zhì)侵入并復(fù)制而引起的病理狀態(tài)。流感病毒、禽流感病毒、NDV或其它傳染性物質(zhì)的侵入和復(fù)制，包括但不限于以下步驟病4"(例如流感病毒、禽流感病毒或NDV顆粒)到細胞的對接；病毒與細胞膜的融合；病毒基因信息向細胞的導(dǎo)入；病毒蛋白的表達(例如流感病毒、禽流感病毒或NDV蛋白)；新的病毒顆粒的產(chǎn)生(例如，流感病毒、禽流感病毒、或NDV顆粒)和病毒(例如，流感病毒、禽流感病毒、或NDV顆粒)從細胞的釋放。呼吸道感染(例如，流感病毒或NDV感染)可能是上呼吸道感染(URI)、下呼吸道感染(LRI)，或其組合。在具體實施方式中，感染是繼發(fā)于原發(fā)感染(例如病毒性肺炎)的繼發(fā)感染(例如繼發(fā)性肺炎)。繼發(fā)感染是由于使感染個體易于產(chǎn)生繼發(fā)感染的原發(fā)感染或者與其相關(guān)聯(lián)的癥狀或者病癥而引起的。在具體實施方式中，流感病毒、禽流感病毒或NDV的侵入和復(fù)制引發(fā)的病理狀態(tài)為急性流感病毒、禽流感病毒或NDV病。呼吸道感染的急性期表現(xiàn)為肺炎和/或支氣管炎，其癥狀可包括缺氧、呼吸暫停、呼吸窘迫、呼吸急促、哮喘、紫紺等。呼吸道感染的急性期(例如，流感病毒和NDV感染)要求受影響的個體接受醫(yī)療干預(yù)，例如入院治療、輸氧、插管和/或通氣。本文中，關(guān)于病毒的術(shù)語"分離的"指獲自單親本病毒的病毒?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法分離病毒，包括但不限于基于噬斑純化和有限稀釋的方法。本文中，關(guān)于核酸分子的術(shù)語"分離的"指從存在于核酸分子的天然來源中的其它核酸分子中分離出的核酸分子。此外，"分離的"核酸分子如cDNA分子，可基本不含其它細胞材料，或當(dāng)它通過重組技術(shù)制備時，基本不含培養(yǎng)基，或當(dāng)它由化學(xué)方法合成時，基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。在優(yōu)選實施方式中，編碼病毒蛋白的核酸分子是分離的。本文中，術(shù)語"控制"指個體從治療(例如預(yù)防劑或治療劑)中得到的有益效果，該效果不導(dǎo)致疾病(例如感染)的治愈。在某些實施方式中，對個體施用一種或更多種治療(例如，預(yù)防劑或治療劑，如本發(fā)明的抗體)來"控制"流感病毒感染、禽流感病毒或NDV感染、或其它傳染性物質(zhì)的感染，或其一種或多種癥狀，或與流感病毒感染、禽流感病毒、NDV感染或其它傳染性物質(zhì)的感染相關(guān)聯(lián)的、因其嚴重化的病癥、或使流感病毒感染、禽流感病毒、NDV感染或其它傳染性物質(zhì)的感染嚴重化的病癥，由此防止感染的進展或惡化。本文中，短語"感染復(fù)數(shù)"或"MOI"指每個受感染細胞的病毒平均數(shù)。MOI由加入的病毒數(shù)(加入的ml數(shù)XPfti)除以加入的細胞數(shù)(加入的ml數(shù)X細胞/ml)確定。本文中，短語"NS1基因"指編碼流感非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)的基因。NS1是由流感病毒A和其它病毒的節(jié)段基因組編碼的八個分子中的一個。"NS1基因產(chǎn)物"指NS1基因編碼的基因產(chǎn)物(例如，RNA或蛋白)。關(guān)于蛋白，NS1基因產(chǎn)物是全長產(chǎn)物并有野生型NS1活性(例如，來自毒抹A/WSN/33)。本文中，術(shù)語"核酸"、"核苷酸序列"和"核酸分子"包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的組合或雜交DNA/RNA分子，和DNA或RNA分子的類似物。這樣的類似物可通過使用例如核苷酸類似物制備，包括但不限于肌苷或三苯甲基化堿基(tritylatedbase)。這樣的類似物還可以包含DNA或RNA分子，這些分子包含被修飾的骨架，其賦予分子有益的性質(zhì)，例如核酸酶抗性或穿越細胞膜的提高的能力。核酸或核苷酸序列可以是單鏈的、雙鏈的，可以既包含單鏈部分又包含雙鏈部分，并且可以包含三鏈部分，但優(yōu)選雙鏈DNA。本文中，術(shù)語"預(yù)防"指通過施用治療(例如，預(yù)防劑或治療劑)對個體疾病(例如，病毒感染或其它傳染性疾病)一或多種癥狀的復(fù)發(fā)或發(fā)作的預(yù)防或減輕。例如，就因為感染對個體施用治療而言，"預(yù)防"指由于治療(例如，預(yù)防劑或治療劑)的施用、或治療的聯(lián)合施用(例如預(yù)防劑或治療劑的聯(lián)合施用)，對個體的感染(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥)的發(fā)展或發(fā)作的抑制或降低，或?qū)Ω腥?例如，禽流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或除流感病毒、NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥)的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)、發(fā)作或發(fā)展的預(yù)防。本文中，就傳染性物質(zhì)而言的術(shù)語"保護性抗原"包括在施用于個體時能夠引起保護性免疫應(yīng)答的任何分子，這種免疫應(yīng)答是針對該傳染性病原體。本文中，術(shù)語"預(yù)防劑"指可用于疾病(例如感染)或其癥狀(例如流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥或癥狀，或流感病毒、或NDV病毒以外的感染或與其相關(guān)的病癥或癥狀)的預(yù)防的任何試劑。優(yōu)選地，預(yù)防劑是已知可用于、已^L用于、或正在被用于預(yù)防或防止疾病或其癥狀(例如，感染或其相關(guān)的病癥或癥狀)的發(fā)作、發(fā)展、進展和/或嚴重化的試劑。本文中，關(guān)于病毒的短語"純化的"指基本不含從其中獲取病毒的細胞或組織來源的細胞材料和培養(yǎng)基的病毒。"基本不含細胞材料"包括病毒制劑，其中病毒由從其中分離或重組制備該病毒的細胞的細胞組分中分離。這樣，基本不含細胞材料的病毒包括具有少于約30%、20%、10%或5%(干重)細胞蛋白(本文中也稱為"污染蛋白")的蛋白制劑。病毒也基本不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基少于病毒制劑體積的大約20%、10%或5%。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法純化病毒，包括但不限于層析和離心。本文中，術(shù)語"個體"或"患者"可互換使用。本文中，術(shù)語"個體"指動物(例如，鳥類、爬行動物和哺乳動物)。在某些實施方式中，個體是包括非靈長類(例如，駱駝、驢、斑馬、母牛、馬、貓、狗、大鼠和小鼠)和靈長類(例如，猴、黑猩猩、人)的哺乳動物。在某些實施方式中，個體是非人類哺乳動物。在其它實施方式中，個體是人。在某些實施方式中，哺乳動物(例如人)為0到6個月大、6到12個月大、1到5歲大、5到10歲大、10到15歲大、15到20歲大、20到25歲大、25到30歲大、30到35歲大、35到40歲大、40到45歲大、45到50歲大、50到55歲大、55到60歲大、60到65歲大、65到70歲大、70到75歲大、75到80歲大、80到85歲大、85到90歲大、90到95歲大或95到100歲大。在具體實施方式中，個體或患者是鳥。在某些實施方式中，鳥為0到3個月大、3到6個月大、6到9個月大、9到12個月大、12到15個月大、15到18個月大、或18到24個月大。本文中，關(guān)于治療的施用或結(jié)果的術(shù)語"協(xié)同的"指比任何兩種或更多種單獨治療(例如，一種或更多種預(yù)防劑或治療劑)的加成效果更有效的治療(例如，預(yù)防劑或治療劑)的聯(lián)合。聯(lián)合治療(例如，預(yù)防劑和治療劑的聯(lián)合)的協(xié)同效應(yīng)可以對患有疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥)的個體使用更低劑量的一種或多種治療(例如，一種或多種預(yù)防劑或治療劑)和/或以更低的頻率施用所述治療。使用更低劑量的治療(例如，預(yù)防劑或治療劑)和/或以更低頻率使用所述治療的能力降低了與對個體施用所述治療相關(guān)聯(lián)的毒性而不降低所述治療在疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥)的預(yù)防或治療中的功效。此外，-沐同效應(yīng)可在疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感'染或與其相關(guān)的病癥)的預(yù)防、控制或治療中帶來改進的治療(例如，預(yù)防劑或治療劑)功效。最后，聯(lián)合治療(例如，預(yù)防劑或治療劑)的協(xié)同效應(yīng)可避免或降低與任何單個治療的使用相關(guān)聯(lián)的不良副作用或有害副作用。本文中，術(shù)語"治療"可指能夠用于疾病(例如，癌癥，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥)的預(yù)防、治療、控制、或改善的任何方案、方法、和/或試劑。在某些實施方式中，術(shù)語"治療"指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于疾病、感染或與其相關(guān)的病癥或癥狀的治療、控制、預(yù)防或改善的生物治療、支持治療和/或其它治療。本文中，術(shù)語"治療劑"指可用于疾病(例如，感染或其相關(guān)癥狀(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥))的預(yù)防、治療、控制或改善的任何試劑。優(yōu)選地，治療劑是已知可用于、已被用于、或正在被用于預(yù)防、治療、控制、或改善疾病或與其相關(guān)癥狀(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥)的試劑。本文中，就為了疾病對個體施用治療而言，術(shù)語"治療"指根除、減少或改善所述疾病的癥狀。關(guān)于感染(例如，流感病毒或NDV病毒)，治療指根除或控制傳染性物質(zhì)(例如病毒)的復(fù)制，減少傳染性物質(zhì)(例如降低病毒滴度)的數(shù)量，降低或改善感染(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關(guān)的病癥，或流感病毒或NDV感染以外的其它感染或與其相關(guān)的病癥)的進展、嚴重度和/或持續(xù)時間，或施用一種或多種治療(包括但不限于一種或多種預(yù)防劑或治療劑的施用)產(chǎn)生的一種或多種癥狀的改善。關(guān)于癌癥，治療指由于施用本發(fā)明的一種或多種治療劑對原發(fā)性、區(qū)域性、或轉(zhuǎn)移性癌組織的根除、去除、改造、或控制。在某些實施方式中，該術(shù)語指對患有該病的個體施用本發(fā)明的一種或多種治療劑來最小化或延遲癌癥的擴散。在其它實施方式中，該術(shù)語指清除可引起疾病的細胞。4.圖1.雜交NAf-HN構(gòu)建物的圖示該構(gòu)建物編碼WSNNAvRNA的3'非編碼區(qū)的核苷酸，對應(yīng)于NA蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)和跨膜區(qū)加上NA胞外結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸的NA編碼區(qū)，NDVBlHN蛋白的編碼區(qū)(只有胞外結(jié)構(gòu)域)，兩個連續(xù)終止密碼子，WSNNA閱讀框的不翻譯的核苷酸和WSNvRNA的5'非編碼區(qū)。圖2.HA的多元氨基酸序列中的變化的圖示鑒定為H5N1HA的核苷酸序列代表流感A/越南/1203/04(H5Nl)的HA表面糖蛋白的開放閱讀框的核苷酸1013-1045(SEQIDNO:13;氨基酸序列SEQIDNO:14)。通過切除PCR和定點突變使用單核苷酸胞嘧啶代替核苷酸1026-1038,產(chǎn)生無毒性HA核苷酸序列(SEQIDNO:15;氨基酸序列SEQIDNO:16)。該序列變化對應(yīng)于用單個氨基酸蘇氨酸替代5個氨基酸的多元序列。圖3.HA核酸序列的改變的圖示鑒定為無毒HA的序列代表基于與無毒性流感A/越南/1203/04(H5N1)(SEQIDNO:15;氨基酸序列SEQIDNO:16)的HA蛋白一致的序列的HA表面糖蛋白的開放閱讀框的核苷酸1013-1033。加下劃線的腺苷殘基被代替，由此突變?yōu)橥x的，生成核苷酸序列SEQIDNO:17和氨基酸序列SEQIDNO:16。圖4A-D.pPollVN1203NS截斷突變體的圖示A.H5N1的NS基因片段的編碼區(qū)為833個核脊酸。B.pPollVN1203NSl-126構(gòu)建體在NS基因中具有從編碼區(qū)核苷酸379-456的缺失，3個終止密碼子和BglII限制性位點的插入。C.pPollVN1203NS1-99構(gòu)建體在NS基因中具有從編碼區(qū)核苷酸298-456的缺失，4個終止密碼子、BglII限制性位點和Pad限制性位點的插入。D.pPollVN1203NS1-73構(gòu)建體在NS基因中具有從編碼區(qū)核苷酸219-456的缺失、4個終止密碼子、BglII限制性位點和Pad限制性位點的插入。圖5.pNDV/Bl的圖示圖示的序列3'端側(cè)翼為T7啟動子，5'端側(cè)翼為HDV核酶和T7終止子。在P和M基因之間的插入位點包含特有的Xbal限制性位點。圖6.嵌合rNDV病毒的KGFR表達的Western印跡分析將嵌合病毒rNDV(泳道1)、rNDV-KGFR(泳道2)和rNDV-KGFR/F-CT(泳道3)在10天大的胚雞蛋中培育。分別使用鼠抗-KGFR和抗-鼠HRPO作為一抗和二抗，對純化的病毒進行Western印跡分柝。圖7.嵌合rNDV病毒中H7HA表達的Western印跡分析將嵌合病毒rNDV(泳道1)、rNDV-KGFR(泳道2)和rNDV-KGFR/F-CT(泳道3)在10天大的胚雞蛋中培育。分別使用鼠抗-KGFR和抗-鼠HRPO作為一抗和二抗，對純化的病毒進行Western印跡分析。圖8.rNDV的F蛋白切割位點的修飾(A)rNDV/Bl基因組的圖示，該基因組在F蛋白的切割位點具有兩或三個氨基酸的改變。F蛋白中被切割的肽鍵用斜杠標(biāo)示。(B)被帶有修飾的F蛋白的rNDV感染的CEF細胞中的合胞體形成。CEF細胞被rNDV/Bl、rNDV/F2aa和rNDV/F3aa病毒感染的感染復(fù)數(shù)為0.001。通過免疫熒光分析每24小時監(jiān)視病毒的擴散。圖9.表達HPAIH7HA蛋白的融合rNVD載體的構(gòu)建和特征(A)帶有GE/GS、Kozak和部分H7HA序列(SEQIDNO:36)的rNDV/F3aa嵌合H7cDNA構(gòu)建體的圖示。(B)病毒生長動力學(xué)比較，LogTCIDvs接種后時間(小時)。正方形，rNDV/Bl;三角形，rNDV/F3aa;粗體星號，rNDV/Bl-H7;星號，rNDV/F3aa-嵌合H7。(C)在被rNDV感染的細胞中WTH7HA蛋白或嵌合H7HA蛋白的表達。泳道1，假感染；泳道2，rNDV/F3aa;泳道3,rNDV/Bl-H7;泳道4，rNDV/F3aa-嵌合H7。第1排a-鳥類H7;第2排，a-NDV。(D)與WTH7HA蛋白相比，嵌合H7HA蛋白在rNDV病毒顆粒中的結(jié)合被增強。泳道l，rNDV/Bl-H7;rNDV/F3aa-嵌合H7。第1排，a-鳥類H7;第2排，a-NDV。5.本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明提供了經(jīng)工程改造以表達結(jié)合進病毒顆粒的融合蛋白的嵌合負鏈RNA病毒，制備這些嵌合病毒的方法和這些病毒的應(yīng)用，例如作為免疫原、在免疫原性制劑、或在體外分析中的應(yīng)用。本發(fā)明的嵌合病毒的特征為其病毒顆粒表面不僅顯示病毒相關(guān)抗原還顯示融合蛋白。按照本發(fā)明的方法被工程改造的病毒可以是任何包膜病毒。在具體實施方式中，可按照本發(fā)明的方法被工程改造的病毒具有片段或非節(jié)段基因組，單鏈或雙鏈基因組，且表達至少一種結(jié)合進病毒包膜的必需糖蛋白(例如NA、HA、HN或F)。用于本發(fā)明的方法的病毒可選自天然存在的病毒抹、變體或突變體；經(jīng)誘變的病毒(例如，通過暴露于紫外線輻射、誘變劑和/或傳代)；重組病毒(對于帶有節(jié)段基因組的病毒)；和/或基因工程改造病毒。例如，突變病毒可通過自然變異、暴露在紫外線輻射中、暴露在化學(xué)誘變劑中、通過在非許可性宿主中傳代、通過重新組合(即通過減毒片段性病毒與另一具有所需抗原的病毒抹的同時感染)、和/或通過基因工程(例如，使用"反向遺傳學(xué)")來產(chǎn)生。用于本發(fā)明的方法中的具有節(jié)段基因組的病毒的非限制性例子包括來自正粘病毒科(例如，流感病毒)、本揚病毒科(例如，布尼奧羅病毒)、呼腸孤病毒科和沙粒病毒科(例如，拉沙熱)家族的病毒。用于本發(fā)明的方法的具有非節(jié)段基因組的病毒的非限制性例子包括冠狀病毒科(例如，人類冠狀病毒(SARS))、肝脫氧核糖核酸病毒科(例如，A、B、C型肝炎病毒)、皰滲病毒科(例如，單純性皰滲病毒)、痘病毒科(例如，天花)、彈狀病毒科(例如，水泡口腔炎病毒(VSV)、仙臺病毒和狂犬病)、副粘病毒科(例如，麻滲和呼吸道合胞病毒)以及纖絲病毒科(馬爾堡病毒和依波拉病毒)。在某些實施方式中，片段性病毒是流感病毒。在其它實施方式中，非片段性病毒是NDV。在某些實施方式中，選擇用于本發(fā)明的病毒是被減毒的和/或具有缺陷性IFN拮抗活性的；即，它們具有感染性并且可在體內(nèi)復(fù)制，但只具有低滴度，導(dǎo)致非致病性的亞臨床水平感染。病毒可通過本領(lǐng)域已知的和/或在此例舉的任何方法被減毒，例如，通過工程改造病毒以在NS1基因中包含突變或在HA蛋白的切割位點之前的多元氨基酸序列中包含修飾。因此，根據(jù)本發(fā)明工程改造的這種減毒病毒是免疫原性制劑的理想候選物，例如，活病毒疫苗。當(dāng)對個體給藥時，本發(fā)明的減毒、嵌合病毒能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答并引起對病毒和非天然或融合蛋白的免疫性。在某些實施方式中，非天然蛋白來自病原體。展開地說，對個體施用這樣的嵌合病毒產(chǎn)生對病毒以及所迷病原體的免疫應(yīng)答和/或免疫性。本發(fā)明還涉及本發(fā)明中的嵌合病毒在用于人類或動物(例如鳥類)的組合物(例如，免疫原性制劑)中的應(yīng)用。尤其是，減毒嵌合病毒可被用作廣譜抗病毒和/或疾病的疫苗。因為嵌合病毒被工程改造以表達作為病毒顆粒外源抗原決定簇的異源性基因序列，可設(shè)計包含本發(fā)明的嵌合病毒的組合物(例如疫苗制劑)來對從中獲得異源性基因序列的多種變體抹、不同病毒、或完全不同的傳染性物質(zhì)或疾病抗原(例如，細菌、寄生蟲、真菌或腫瘤特異性抗原)產(chǎn)生免疫?？赏ㄟ^^:多種方法將活減毒病毒制劑引入人類或動物個體以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或恰當(dāng)?shù)募毎蜃討?yīng)答。這些方法包括但不限于鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、口服、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下途徑。5.1嵌合j;危感病毒5丄1包含結(jié)合進病毒顆粒的融合蛋白的嵌合禽流感病毒本發(fā)明包括對禽流感病毒的工程改造，由此融合蛋白被基因組編碼且當(dāng)被表達時結(jié)合進病毒顆粒?？杀还こ谈脑煲员磉_融合蛋白并將其結(jié)合進禽流感病毒顆粒的任何類型、亞型或病毒抹的禽流感病毒可被選擇并用于本發(fā)明，包括但不局限于天然存在的病毒抹、變異抹或突變體、經(jīng)誘變的病毒、重組和/或基因工程改造病毒。在特定實施方式中，本發(fā)明的禽流感病毒不是天然發(fā)生的病毒。在另一實施方式中，本發(fā)明的禽流感病毒是基因工程改造病毒。禽流感病毒的非限制性例子包括流感A亞型H5N1、H6N2、H7N3、H9N2和H畫7。流感病毒的基因操作需要將組成病毒基因組的8個病毒RNA片段的至少l個工程改造?；蚪M誘變可通過"反向工程"技術(shù)實現(xiàn)(參照5.4節(jié))。然而，流感基因組的可塑性在可被穩(wěn)定整合進病毒的片段數(shù)量和片段長度方面都是有限的。長插入片段的整體穩(wěn)定性是未知的，且包含這些插入片段的片段或其部分可能在幾次傳代后由于病毒重組而丟失。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，禽流感病毒被工程改造，由此兩個主要表面蛋白中的一個凈皮融合蛋白代替。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了包含至少一個融合蛋白的嵌合禽流感病毒，該蛋白包含非流感病毒的傳染性物質(zhì)的蛋白胞外結(jié)構(gòu)域(ED)和至少一個必需流感病毒糖蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CT)和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)或跨膜結(jié)構(gòu)域(TM),其中至少一個融合蛋白功能性代替至少一個必需禽流感病毒糖蛋白。換句話說，禽流感病毒作為"骨架"，該骨架被工程改造以表達代替禽流感病毒必需糖蛋白的融合蛋白并將其結(jié)合進其病毒顆粒。包含對應(yīng)于被融合蛋白功能性替代的禽流感病毒必需糖蛋白的流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域使得融合蛋白能夠結(jié)合進禽流感病毒的病毒顆粒。融合蛋白的TM和CT域或TM域可對應(yīng)于或來自于允許融合蛋白結(jié)合到禽流感病毒骨架的病毒顆粒的任何流感病毒。在某些實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域?qū)?yīng)于與骨架禽流感病毒不同的禽流感病毒的類型、亞型或病毒抹的TM和CT域或TM域。在其它實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域?qū)?yīng)于非禽流感病毒的流感病毒的TM和CT域或TM域。在其它實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域?qū)?yīng)于禽流感病毒骨架的TM和CT域或TM域。禽流感病毒顆粒包含兩個主要表面糖蛋白，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，它們都包含胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域。因此，在某些實施方式中，融合蛋白的TM和CT域?qū)?yīng)于流感病毒的HA蛋白或NA蛋白的TM和CT域。由于HA或NA的CT域?qū)θ诤系鞍捉Y(jié)合到禽流感病毒顆粒來說不是必需的，在一些實施方式中，融合蛋白經(jīng)工程改造只包含HA或NA的TM域。例如，已顯示NA的CT域?qū)@種蛋白適當(dāng)包裝進入流感A病毒包膜來說不是必需的(Garcia-Sastre等，1995，VirusRes.37:37-47,該文獻完整引入本文作為參考)。因此，當(dāng)對應(yīng)于NA蛋白的結(jié)構(gòu)性區(qū)域被用于構(gòu)建融合蛋白時，本發(fā)明包含工程改造融合蛋白以只包含對應(yīng)于流感病毒NA蛋白的TM域。相應(yīng)地，在本發(fā)明的一個實施方式中，工程改造融合蛋白從而只包含TM域，該TM域?qū)?yīng)于流感病毒NA蛋白的TM域。流感病毒HA和NA蛋白的TM和CT域結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在于這些結(jié)構(gòu)域位于HA蛋白的C末端和NA蛋白的N末端。除了兩個結(jié)構(gòu)域在各類表面糖蛋白中的定向不同外，依據(jù)它們在多肽鏈中的相對位置，HA和CT結(jié)構(gòu)性區(qū)域可能包含未知的功能差異。因此，當(dāng)設(shè)計將被工程改造進禽流感病毒的融合蛋白時，將被融合進流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域的方向?qū)⒅笇?dǎo)TM和CT域或TM域的選擇。例如，當(dāng)傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域被N末端錨定時，可用流感病毒NA蛋白的TM和CT域。就細胞融合和釋放而言，HA和NA顯示了對病毒的傳染和繁殖所必需的彼此相當(dāng)?shù)幕钚浴A結(jié)合到細胞表面的N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuNAc;唾液酸)，導(dǎo)致宿主細胞對病毒的攝取，而NA將唾液酸部分從細胞表面切割，使后代病毒從被感染的細胞釋放。這些活動中無論哪一個被破壞都會導(dǎo)致形成無功能病毒。因此，為維持病毒的完整性，在表面糖蛋白被代替時，它在嵌合病毒中的功能必須由融合蛋白提供。在本發(fā)明的一個實施方式中，嵌合禽流感病毒包含表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性的融合蛋白。在本發(fā)明的另一實施方式中，嵌合禽流感病毒包含表現(xiàn)出受體結(jié)合活性的融合蛋白。在本發(fā)明的另一實施方式中，嵌合禽流感病毒包含兩個融合蛋白，其中一個表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性，另一個表現(xiàn)出受體結(jié)合活性。在本發(fā)明的其它實施方式中，嵌合禽流感病毒包含融合蛋白，該融合蛋白包含異源性傳染性物質(zhì)的抗原決定簇，該融合蛋白表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性或受體結(jié)合活性。在本發(fā)明的另一實施方式中，嵌合禽流感病毒包含表現(xiàn)出受體結(jié)合活性的融合蛋白。在具體實施方式中，嵌合禽流感病毒包含表面蛋白，其包含新城疫病毒(NDV)的HN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，和流感A/WSN/33的NA蛋白的TM和CT域，該HN胞外結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性。在其它實施方式中，嵌合禽流感病毒包含表面蛋白，該表面蛋白包含異源流感病毒的HA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，H7HA蛋白或H9HA蛋白)。HA和NA被病毒基因組的分開的片段編碼，且天然蛋白的整個編碼區(qū)的替代消除了對編碼被引入蛋白的序列的絕大部分長度限制。在某些實施方式中，融合蛋白包含跨膜結(jié)構(gòu)域外加1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1個直接相鄰的流感病毒必需糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域殘基。例如，在具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個直接相鄰的流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域殘基，和非流感病毒的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白的功能。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，與流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，以及非流感病毒的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白。在另一實施方式中，融合蛋白包含NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，位于球狀頭部之前的NA蛋白的完整的主干結(jié)構(gòu)域或其片段，和非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白能夠功能性替代NA蛋白的功能。在另一實施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個直接相鄰的流感病毒HA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，和非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或者其片段，由此融合蛋白能夠功能性替代HA蛋白的功能。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，與流感病毒HA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個流感病毒HA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，和非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代HA蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明的嵌合流感病毒的至少一個融合蛋白不包含異源蛋白的完整胞外結(jié)構(gòu)域(例如，包含異源傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原片段)，而且可能或者可能不進一步包含天然必需糖蛋白的一個或者幾個胞外結(jié)構(gòu)域的片段。相應(yīng)地，在某些實施方式中，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可包含異源傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的片段。在其它實施方式中，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可同時包含天然必需糖蛋白片段和異源傳染性物質(zhì)蛋白片段。在融合蛋白取代必需表面糖蛋白的實施方式中，表面糖蛋白的功能必須由融合蛋白提供，即融合蛋白必須展現(xiàn)出它替代的表面糖蛋白的功能。本發(fā)明包含編碼本章節(jié)5.11所描迷的融合蛋白的核苷酸序列(即重組片段)。在優(yōu)選實施方式中，含有編碼5.11章節(jié)描述的融合蛋白的核酸的重組片段包含3'和5'結(jié)合信號，這些信號是vRNA正確復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝所需要的(Fujii等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:2002-2007;Zheng等，1996，Virology217:242-251,兩者內(nèi)容均完整引入本文作為參考)。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的重組片段因此使用與骨架禽流感病毒相同類型或者病毒抹的病毒片段的3'和5'非編碼和/或非翻譯序列。在具體實施方式中，重組片段包含本章(5.1.1)描述的融合蛋白的編碼核酸，該核酸包含流感病毒NAvRNA的3'非編碼區(qū)，對應(yīng)于NA蛋白的CT和TM域的NA編碼區(qū)，與流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1個殘基，NAvRNA的NA蛋白閱讀框的非翻譯區(qū)和5'非編碼區(qū)。作為替代禽流感病毒的NA或者HA蛋白的一種選擇，"反向遺傳學(xué)"和雙順反子技術(shù)可^皮用來制備嵌合流感病毒，該病毒包括非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段和流感病毒的TM和/或CT域。參見如美國專利號6,887,699、美國專利號6,001,634、美國專利號5,854,037和美國專利號5,820,871，各專利內(nèi)容均完整引入本文作為參考。雙順反子法將融合蛋白的編碼區(qū)插入到病毒的必需蛋白的開放閱讀框和其終止密碼子中。插入序列的兩側(cè)為IRES和必需蛋白的任何非翻譯信號序列，在該蛋白中，插入不破壞必需病毒蛋白的開放閱讀框、包裝信號、多聚腺苷酸化或者轉(zhuǎn)錄啟動子。任何本領(lǐng)域已知的或在本文中描述的IRES可被用于本發(fā)明(例如，BiP基因的IRES,GenBank數(shù)據(jù)庫錄入條HUMGRP78的372到592核苷酸；或者腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES,GenBank數(shù)據(jù)庫錄入條CQ867238的1430-2115核苷酸)。由于在使用雙順反子法時，HA或NA的功能不被取代，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域部分不限于提供被替代的HA或者NA蛋白的功能的蛋白。這樣的融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可以對應(yīng)于任何異源分子，或者包含任意異源分子的片段，包括但不限于抗原、疾病抗原和來自傳染性物質(zhì)的任何蛋白的抗原(例如，與病毒、細菌或者寄生蟲性傳染性物質(zhì)相關(guān)的任何保護性抗原)。從用于本發(fā)明的方法的子在下文5.3章節(jié)提供。替代骨架病毒的必需表面蛋白或者在病毒基因組引入重組片段可能會減弱生成的嵌合病毒，即相比野生型，嵌合病毒會展現(xiàn)出受損的復(fù)制能力。在本發(fā)明的某些實施方式中，嵌合病毒的減毒是需要的，由此嵌合病毒至少部分保留了感染性并且可以在體內(nèi)復(fù)制，但是只產(chǎn)生低滴度，導(dǎo)致非致病性的亞臨床水平感染。這樣的減毒嵌合病毒特別適用于本發(fā)明的實施方式，其中病毒作為免疫原如活體疫苗施用于個體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的和/或在此例舉的任何方法將病毒減毒，如，將病毒工程改造以在NS1基因中包含突變或在HA蛋白的切割位點前的多元氨基酸序列中包含改變。(參見美國專利號6,468,544;美國專利號6,669,943;Li等，1999,J.Infect.Dis179:1132-1138,各文獻內(nèi)容均完整引入本文作為參考)。在一實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合禽流感病毒包含基因組，其包含在禽流感骨架病毒的NS1基周中的突變，已知該突變在其它流感病毒中降低NS1基因產(chǎn)物拮抗細胞干擾素應(yīng)答的能力。在另一實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合禽流感病毒包含基因組，其包含在禽流感骨架病毒的HA基因中的突變，已知該突變在其它流感病毒中降低或者消除細胞蛋白酶將蛋白剪切成活性形式的能力，從而減毒或者消除HA誘導(dǎo)的融合或者感染。在另一實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合禽流感病毒包含基因組，其同時包含在禽流感骨架病毒的HA基因和NS1基因中的突變，已知這些突變在其它流感病毒中分別地或聯(lián)合地誘導(dǎo)或者減弱病毒活性。使用本領(lǐng)域已知的或本文所迷的任何技術(shù)可確定減毒的嵌合和野生型禽流感病毒的滴度(例如，血凝素分析、空斑分析、雞胚半數(shù)感染量(EID50)、半數(shù)細胞培養(yǎng)感染量(TCID50)等)，病毒可以在本文所述的或本領(lǐng)域已知的條件下培射如在CEF細胞、MDCK細胞(如在MEM,10。/。v/v胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素在37°C,5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中)或胚雞卵中(例如恒溫培養(yǎng)箱中，37°C，55%相對濕度)。或者，病毒可以在生長在無血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培養(yǎng)基的細胞中(如，CEF細胞、MDCK細胞等)增殖。5.1.2包含結(jié)合進其病毒顆粒的融合蛋白的嵌合減毒流感病毒本發(fā)明包含對減毒流感病毒工程改造，由此融合蛋白^皮基因組編碼且在被表達時結(jié)合進病毒顆粒。換句話說，本發(fā)明包含減毒流感病毒(親本病毒)作為"骨架"的應(yīng)用，該骨架經(jīng)工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合入病毒顆粒中。任何減毒流感病毒類型或者病毒抹(包括但不僅限于天然存在的毒抹、變異體或者突變抹、經(jīng)誘變的病毒、重組和/或遺傳改造病毒)可被用作經(jīng)工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合入病毒顆粒的的骨架。在具體實施方式中，用于本發(fā)明的親本流感病毒不是天然存在的病毒。在另一具體實施方式中，用于本發(fā)明的親本病毒是經(jīng)遺傳工程改造的病毒。用作本發(fā)明的骨架病毒的流感病毒可天然具有減毒的表型或者可被工程改造而包含與減毒表型相關(guān)的突變，該突變是本領(lǐng)域已知的或在本文中說明(如，位于病毒NS1蛋白或者病毒HA蛋白的突變)。在其它實施方式中，減毒病毒是流感A。在其它實施方式中，減毒病毒是流感B。在其它實施方式中，減毒病毒是流感C。根據(jù)本發(fā)明可以被工程改造的流感病毒的非限定性例子包括流感A亞型H10N4、亞型H10N5、亞型H10N7、亞型H10N8、亞型H10N9、亞型H11N1、亞型H11N13、亞型H11N2、亞型H11N4、亞型H11N6、亞型H11N8、亞型H11N9、亞型H12N1、亞型H12N4、亞型H12N5、亞型H12N8、亞型H13N2、亞型H13N3、亞型H13N6、亞型H13N7、亞型H14N5、亞型H14N6、亞型H15N8、亞型H15N9、亞型H16N3、亞型H1N1、亞型H1N2、亞型H1N3、亞型H1N6、亞型H1N9、亞型H2N1、亞型H2N2、亞型H2N3、亞型H2N5、亞型H2N7、亞型H2N8、亞型H2N9、亞型H3N1、亞型H3N2、亞型H3N3、亞型H3N4、亞型H3N5、亞型H3N6、亞型H3N8、亞型H3N9、亞型H4N6、亞型H4N8、亞型H4N9、亞型H5N1、亞型H5N2、亞型H5N3、亞型H5N4、亞型H5N6、亞型H5N7、亞型H5N8、亞型H5N9、亞型H6N1、亞型H6N2、亞型H6N3、亞型H6N4、亞型H6N5、亞型H6N6、亞型H6N7、亞型H6N8、亞型H6N9、亞型H7N1、亞型H7N2、亞型H7N3、亞型H7N4、亞型H7N5、亞型H7N7、亞型H7N8、亞型H7N9、亞型H8N4、亞型H8N5、亞型H9N1、亞型H9N2、亞型H9N3、亞型H9N5、亞型H9N6、亞型H9N7、亞型H9N8、或亞型H9N9;流感B愛知抹/5/88、秋田抹/27/2001、秋田抹/5/2001、阿拉斯加林/16/2000、阿拉斯加抹/1777/2005、阿根廷抹/69/2001、亞利桑那抹/146/2005、亞利桑那抹/148/2005、曼谷抹/163/90、曼谷抹/34/99、曼谷抹/460/03、曼谷抹/54/99、巴塞羅那抹/215/03、北京抹/15/84、北京抹/184/93、北京抹/243/97、北京椒43/75、北京抹/5/76、北京抹/76/98、比利時抹/WVl06/2002、比利時抹/WV107/2002、比利時抹/WV109/2002、比利時抹/WV114/2002、比利時抹AVV122/2002、波恩抹/43、巴西抹/952/2001、布加勒斯特抹/795/03、布宜諾斯艾利斯抹/161/00、布宜諾斯艾利斯抹/9/95、布宜諾斯艾利斯抹/SW16/97、布宜諾斯艾利斯抹/VL518/99、加拿大抹/464/2001、加拿大抹/464/2002、查科抹/366/00、查科抹/R113/00、濟州林/303/03、千葉抹/447/98、重慶/3/2000抹、泰國臨床分離抹SA1/2002、泰國臨床分離抹SA10/2002、菲律賓臨床分離抹SA100/2002、菲律賓臨床分離抹SA110/2002、菲律賓臨床分離抹SA112/2002、菲律賓臨床分離林SA113/2002、菲律賓臨床分離林SA114/2002、泰國臨床分離抹SA2/2002、泰國臨床分離抹SA20/2002、菲律賓臨床分離抹SA38/2002、泰國臨床分離抹SA39/2002、菲律賓臨床分離抹SA99/2002、CNIC#/27/2001、科羅拉多抹/2597/2004、科多巴抹/VA418/99,捷克斯洛伐克抹/16/89、捷克斯洛伐克抹/69/90、大邱抹/10/97、大邱抹/45/97、大邱擬9/97、B抹/Du/4/78、B抹/德班/39/98、德班抹/43/98、德班抹/44/98、B抹/德班/52/98、德班抹/55/98、德班抹/55/98、德班抹/56/98、英格蘭抹/1716/2005、英格蘭抹/2054/2005、英格蘭抹/23/04、芬蘭抹/154/2002、芬蘭抹/159/2002、芬蘭抹/160/2002、芬蘭株/154/2002、芬蘭抹/159/2002、芬蘭抹/160/2002、芬蘭抹/161/2002、芬蘭抹/162/03、芬蘭抹/162/2002、芬蘭抹/162/91、芬蘭抹/164/2003、芬蘭抹/172/91、芬蘭抹/173/2003、芬蘭抹/176/2003、芬蘭抹/184/91、芬蘭抹/188/2003、芬蘭抹/190/2003、芬蘭抹/220/2003、芬蘭抹/WV5/2002、富士抹/36/82、日內(nèi)瓦抹/5079/03、熱那亞抹/11/02、熱那亞抹/2/02、熱那亞抹/21/02、熱那亞抹/54/02、熱那亞抹/55/02、廣東抹/05/94、廣東抹/08/93、廣東抹/5/94、廣東抹/55/89、廣東抹/8/93、廣州椒7/97、廣州才i/86/92、廣州抹/87/92、京畿道抹/592/2005、漢諾威抹/2/90/、哈爾濱抹/07/94、夏威夷抹/10/2001、夏威夷抹1990/2004、夏威夷抹/38/2001、夏威夷抹/9/2001、河北抹/19/94、河北抹/3/94、河南抹/22/97、廣島抹/23/2001、香港抹/110/99、香港抹/1115/2002、香港抹112/2001、香港擬123/2001、香港^/1351/2002、香港抹/1434/2002、香港抹/147/99、香港林/156/99、香港抹/157/99、香港抹/22/2001、香港抹/22/89、香港抹/336/2001、香港#/666/2001、香港抹/9/89、休斯頓抹/1/91、休斯頓抹/1/96，休斯頓抹/2/96，湖南抹/4/72、茨城抹/2/85、仁川/297/2005、印度抹/3/89、印度抹/77276/2001、以色列抹/95/03、以色列抹/WV187/2002,日本抹/1224/2005、江蘇林/10/03、約翰內(nèi)斯堡抹/1/99、約翰內(nèi)斯堡抹/96/01、卡杜納抹/1076/99、卡杜納抹/122/99、鹿兒島抹/15/94、堪薩斯抹/22992/99、哈爾科夫抹/224/91、神戶抹/1/2002、小內(nèi)抹/193/99、拉齊奧抹/1/02、李抹/40、列寧格勒抹/129/91、里斯本林/2/90、洛杉磯抹/1/02、盧薩卡抹/270/99、里昂抹/1271/96、馬來群島抹/83077/2002、馬普托株/1/99、馬德普拉塔抹/595/99、馬里蘭抹/1/01、孟菲斯抹/1/01、孟菲斯抹/12/97-MA、密歇根抹/22572/99、三重抹/1/93、米蘭抹/1/01、明斯克抹/318/90、莫斯科抹/3/03、名古屋株/20/99、南昌抹/1/100、那什維爾抹/107/93、那什維爾林/45/91、內(nèi)布拉斯加抹/2/01、荷蘭抹/801/90、荷蘭抹/429/98、紐約抹/1/2002、NIB擬48/90、寧夏#/45/83、挪威抹/1/84、阿曼抹/16299/2001、大阪林/1059/97、大阪珠/983/97-V2、奧斯陸抹/1329/2002、奧斯陸抹/1846/2002、巴拿馬抹/45/90、巴黎抹/329/90、帕爾馬林/23/02、佩思抹/211/2001、秘魯擬1364/2004、菲律賓抹/5072/2001、釜山抹/270/99、魁北克抹/173/98、魁北克抹/465/98、魁北克抹/7/01、羅馬抹/1/03、薩迦抹/S172/99、首爾抹/13/95、首爾抹/37/91、山東抹/7/97、上海抹/361/2002、志賀抹/T30/98、四川抹/379/99、新加坡抹/222/79、西班牙抹/WV27/2002、斯德哥爾摩抹/10/90、瑞士林/5441/90、臺灣抹/0409/00、臺灣抹/0722/02、臺灣抹/97271/2001、德黑蘭^/80/02、東京#/6/98、的里雅斯特抹/28/02、烏蘭巴托林/4/02、不列顛抹/34304/99、USSR抹/100/83、維多利亞抹/103/89、維也納抹/1/99、武漢抹/356/2000、WV194抹/2002、宣武抹/23/82、山形抹/1311/2003、山形抹/K500/2001、阿拉斯加抹/12/96、GA抹/86、NAGASAKI擬1/87、東京擬942/96、或者羅徹斯特抹/02/2001;流感C愛知抹/1/81、安阿伯?dāng)M1/50、青森抹/74、加利福尼亞抹/78、英格蘭抹/83、希臘擬79、廣島林/246/2000、廣島抹/252/2000、兵庫抹/1/83、約翰內(nèi)斯堡抹/66、神奈川抹/1/76、京都抹/1/79、密西西比抹/80、宮崎抹/1/97、宮崎抹/5/2000、宮崎株/9/96、奈良抹/2/85、新澤西抹/76、豬抹/北京/115/81、扎晃林/3/2000、靜岡抹/79、山形抹/2/98、山形抹/6/2000、山形抹/9/96、柏林抹/1/85、英格蘭抹/892/8、五大湖抹/1167/54、JJ抹/50、豬抹/北京/10/81、豬抹/北京/439/82、泰勒^/1233/47、或者C擬山形/10/81。在一個實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒具有受損的拮抗細胞干擾素(IFN)的能力。在具體實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒(親本病毒)是在NS1基因中包含突變的流感病毒型或者毒抹，該突變導(dǎo)致病毒拮抗細胞干擾素應(yīng)答能力受損。可^1引入流感病毒NS1基因中的突變類型的例子包括刪除、替換、插入和它們的組合。一個或者多個突變可以引入到NS1基因的任何位置(例如，N末端、C末端或者兩者之間的某個地方)和/或NS1基因的調(diào)控元件中。在具體實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒(親本病毒)包含基因組，該基因組在流感病毒NS1基因的N末端具有突變。在另一實施方式中，減毒流感病毒(親本病毒)包含基因組，該基因組在流感病毒NS1基因的C末端具有突變。在另一實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒(親本病毒)包含在流感病毒NS1基因中具有突變的基因組，該突變會導(dǎo)致由自NS1基因C末端的5個，優(yōu)選地10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、75個、80個、85個、90個、95個、99個、100個、105個、110個、115個、120個、125個、126個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個或者175個氨基酸組成的缺失，或者自C末端的5-170個、25-170個、50-170個、100-170個、100-160個或者105-160氨基酸殘基之間的缺失。在另一實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒(親本病毒)包含在流感病毒NS1基因中具有突變的基因組，導(dǎo)致除1-126氨基酸殘基、l-120氨基酸殘基、1-115氨基酸殘基、1-110氨基酸殘基、1-100氨基酸殘基、1-99氨基酸殘基、1-95氨基酸殘基、1-85氨基酸殘基、1-80氨基酸殘基、1-75氨基酸殘基、1-73氨基酸殘基、l-70氨基酸殘基、l-65氨基酸殘基、l-60氨基酸殘基之外的所有氨基酸殘基的缺失，其中N末端氨基酸為編號1。在一實施方式中，本發(fā)明的減毒流感病毒包含在流感病毒骨架的NS1基因中具有突變的基因組，該突變減弱了NS1基因產(chǎn)物拮抗細胞干擾素應(yīng)答的能力，并且4吏減毒病毒在介于0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、或者0.1和1之間的感染復(fù)數(shù)(MOI)，或者在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的MOI下生長至細胞(如，人類、小鼠、大鼠、豬、狗、馬、或者禽類的細胞(例如，Hep-2、A549、293T、Madin-Darby狗腎細胞(MDCK)或者雞胚成纖維細胞(CEF))內(nèi)的滴度低于野生型流感病毒約1到約100倍、約5到約80倍、約20到約80倍、或者約40到約80倍、約1到約10倍、約1到約5倍、約1到約4倍、約1到約3倍、約1到約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這是通過在相同的環(huán)境下增殖時感染后約2到10天、3到7天、3到5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天測定的。減毒和野生型流感病毒可以通過任何本領(lǐng)域熟知的或者此處描述的技術(shù)來測定(例如，血凝素測試、空斑測試、雞胚半數(shù)感染量(EID50)、半數(shù)細胞培養(yǎng)感染量(TCID50)等)，病毒可以在此處描述或者本領(lǐng)域熟知的環(huán)境下增殖(如在CEF細胞、MDCK細胞(如在MEM,10%v/v胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素在37°C,5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中)或胚雞卵中(例如恒溫培養(yǎng)箱中，37°C，55%相對濕度)?；蛘?，病毒可以在生長在無血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培養(yǎng)基的細胞(如，CEF細胞、MDCK細胞)中增殖。在另一實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒(親本病毒)包含在流感骨架病毒的HA基因中具有突變的基因組，該突變減弱或者消除了細胞蛋白酶剪切蛋白成為其活性形式的能力?？杀灰肓鞲胁《綡A基因的突變類型的例子包括刪除、替換、插入和它們的組合。一個或者多個突變被優(yōu)選地引入到HA的切割位點(例如，GenBank登陸號為AY818135的核苷酸1013-1039)。一般情況下，在CEF中被標(biāo)準(zhǔn)方法測定為可以減弱HA蛋白裂解性的突變與體內(nèi)測試中毒性的降低相關(guān)(Horimoto和Kawaoka,1994，68:3120-3128;全文引入本文作為參考)。在具體實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒(親本病毒)包含在流感病毒的HA基因具有突變的基因組，該突變導(dǎo)致1026-1038位點的核苷酸被胸腺嘧啶替代。在另一實施方式中，本發(fā)明的減毒流感病毒包含在流感骨架病毒的HA基因具有突變的基因組，該突變減弱或者消除細胞蛋白酶剪切蛋白成為其活性形式的能力，并且使減毒病毒在介于0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、或者0.1和1之間的感染復(fù)數(shù)(MOI)，或者在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的MOI下生長至細胞(如，人類、小鼠、大鼠、豬、狗、馬、或者禽類的細胞(例如，Hep-2、A549、293T、Madin-Darby狗腎細胞(MDCK)或者雞胚成纖維細胞(CEF))內(nèi)的滴度低于野生型流感病毒約1到約100倍、約5到約80倍、約20到約80倍、或者約40到約80倍、約1到約10倍、約1到約5倍、約1到約4倍、約l到約3倍、約l到約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這是通過在相同的環(huán)境下增殖時感染后約2到10天、3到7天、3到5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天測定的。包含這樣的突變的HA蛋白并不是抗原性地區(qū)別于野生型親本HA蛋白，即所有針對野生型HA蛋白產(chǎn)生的抗體會與突變的HA蛋白相互作用且所有針對突變HA蛋白產(chǎn)生的抗體會與野生型HA蛋白相互作用。減毒的和野生型流感病毒的滴度可以利用本領(lǐng)域熟知的或者此處描述的任何技術(shù)測定(例如，血凝素分析、空斑分析、雞胚半數(shù)感染量(EID50)等)，并且病毒可以在此處提到的或者本領(lǐng)域熟知的條件下增殖(如在CEF細胞、MDCK細胞(如在MEM,10%v/v胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素在37°C，5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中)或胚雞卵中(例如恒溫培養(yǎng)箱中，37°C，55%相對濕度)?；蛘?，病毒可以在生長在無血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培養(yǎng)基的細胞(如，CEF細胞、MDCK細胞)中增殖。在另一實施方式中，用于本發(fā)明的減毒流感病毒(親本病毒)包含基因組，其包含(i)位于流感骨架病毒的HA基因中的突變，該突變可以減弱或者消除細胞蛋白酶剪切蛋白成為其活性形式的能力，和(ii)位于NS1基因中的突變，該突變導(dǎo)致病毒拮抗細胞干擾素能力受損。在另一實施方式中，本發(fā)明的減毒流感病毒包含在流感骨架病毒的HA基因和NS1基因中均有突變的基因組，使減毒病毒在介于0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、或者0.1和1之間的感染復(fù)數(shù)(MOI)，或者在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0的MOI下生長至細胞(如，人類、小鼠、大鼠、豬、狗、馬、或者禽類的細胞(例如，Hep-2、A549、293T、Madin-Darby狗腎細胞(MDCK)或者雞胚成纖維細胞(CEF))內(nèi)的滴度低于野生型流感病毒約1到約100倍、約5到約80倍、約20到約80倍、或者約40到約80倍、約1到約10倍、約1到約5倍、約1到約4倍、約1到約3倍、約1到約2倍、或者約1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，這是通過在相同的環(huán)境下增殖時感染后約2到10天、3到7天、3到5天、或者2、3、4、5、6、7、8、9、10天測定的。本發(fā)明提供了包含至少一個融合蛋白的嵌合減毒流感病毒，該蛋白具有非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域(ED)或其片段以及流感病毒必需糖蛋白的胞質(zhì)(CT)和跨膜(TM)域或者跨膜(TM)域，其中至少一個融合蛋白功能性替代至少一個流感病毒必需糖蛋白。換句話說，減毒流感病毒作為"骨架"，該骨架被工程改造以表達代替流感病毒必需糖蛋白的至少一個融合蛋白并將其結(jié)合進其病毒顆粒。包含對應(yīng)于被融合蛋白功能性替代的流感病毒必需糖蛋白的流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域使得融合蛋白能夠結(jié)合進減毒流感病毒的病毒顆粒。融合蛋白的TM和CT域或TM域可對應(yīng)于或來自于允許融合蛋白結(jié)合到減毒流感病毒骨架的病毒顆粒的任何流感病毒。在某些實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域?qū)?yīng)于與骨架減毒流感病毒不同的流感病毒的類型、亞型或病毒抹的TM和CT域或TM域。在其它實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域?qū)?yīng)于非骨架減毒流感病毒的流感病毒種的TM和CT域或TM域。在優(yōu)選實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或TM域?qū)?yīng)于減毒流感病毒骨架的TM和CT域或TM域。在某些實施方式中，融合蛋白的TM和CT域?qū)?yīng)于流感病毒的HA或者NA蛋白的TM和CT域。由于HA或者NA的CT域?qū)τ谌诤系鞍捉Y(jié)合入流感病毒病毒粒并不是必需的，在某些實施方式中，融合蛋白經(jīng)工程改造以僅包含HA或者NA的TM域。流感病毒HA和NA蛋白的TM和CT域結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在于這些結(jié)構(gòu)域位于HA蛋白的C末端和NA蛋白的N末端。除了兩個結(jié)構(gòu)域在各類表面糖蛋白中的定向不同外，依據(jù)它們在多肽鏈中的相對位置，HA和CT結(jié)構(gòu)性區(qū)域可能包含未知的功能差異。因此，當(dāng)設(shè)計將被工程改造進減毒流感病毒的融合蛋白時，將被融合進流感病毒糖蛋白的TM和CT域或TM域的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段的方向?qū)⒅笇?dǎo)TM和CT域或TM域的選擇。為維持病毒的完整性，在表面糖蛋白被代替時，它在嵌合病毒中的功能必須由融合蛋白提供。在本發(fā)明的一個實施方式中，嵌合減毒流感病毒包含表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性的融合蛋白。在本發(fā)明的另一實施方式中，嵌合減毒流感病毒包含表現(xiàn)出受體結(jié)合活性的融合蛋白。在本發(fā)明的另一實施方式中，嵌合減毒流感病毒包含兩個融合蛋白，其中一個表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性，另一個表現(xiàn)出受體結(jié)合活性。在本發(fā)明的其它實施方式中，嵌合減毒流感病毒包含融合蛋白，該融合蛋白包含異源傳染性物質(zhì)的抗原決定簇，該融合蛋白表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性或受體結(jié)合活性。在具體實施方式中，嵌合減毒流感病毒包含表面蛋白，其包含新城疫病毒(NDV)的HN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，和流感A/WSN/33的NA蛋白的TM和CT域，該HN胞外結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出神經(jīng)氨酸酶活性。在其它實施方式中，嵌合減毒流感病毒包含表面蛋白，該表面蛋白包含異源流感病毒亞型或毒抹的HA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，H7HA蛋白或H9HA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域)。在某些實施方式中，本發(fā)明的嵌合減毒流感病毒的至少一個融合蛋白不包含異源蛋白的完整胞外結(jié)構(gòu)域(例如，包含異源傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原性或保護性片段)，而且可能或者可能不進一步包含天然必需糖蛋白的一個或者幾個胞外結(jié)構(gòu)域的片段。相應(yīng)地，在某些實施方式中，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可包含異源傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的片段。在其它實施方式中，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可同時包含天然必需糖蛋白片段和異源傳染性物質(zhì)蛋白片段。在融合蛋白取代必需表面糖蛋白的實施方式中，表面糖蛋白的功能必須由融合蛋白提供，即融合蛋白必須展現(xiàn)出它替代的表面糖蛋白的功能。本章5丄2描述的融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可對應(yīng)于或者源自傳染性物質(zhì)(包括，病毒、細菌和寄生蟲傳染性物質(zhì))的任何糖蛋白或者其片段。傳染性物質(zhì)糖蛋白的非限定性例子將在下文5.3章提供。在某些實施方式中，融合蛋白包含跨膜結(jié)構(gòu)域外加1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1個直接相鄰的流感病毒必需糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域殘基。在具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個直接相鄰的流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域殘基，和非流感病毒的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白的功能。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，與流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，以及非流感病毒的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代NA蛋白。在另一實施方式中，融合蛋白包含NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，位于球狀頭部之前的NA蛋白的完整的主干結(jié)構(gòu)域或其片段，和非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白能夠功能性替代NA蛋白的功能。在另一實施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個直接相鄰的流感病毒HA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，和非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或者其片段，由此融合蛋白能夠功能性替代HA蛋白的功能。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒HA蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，與流感病毒HA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個流感病毒HA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，和非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代HA蛋白。本發(fā)明包含編碼本章節(jié)5.1.2所描述的融合蛋白的核苷酸序列(即重組片段)。在優(yōu)選實施方式中，含有編碼5.1.2章節(jié)描迷的融合蛋白的核酸的重組片段包含3'和5'結(jié)合信號，這些信號是vRNA正確復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝所需要的(Fujii等，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:2002-2007;Zheng等，1996，Virology217:242-251,兩者內(nèi)容均完整引入本文作為參考)。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的重組片段因此使用與骨架減毒流感病毒相同類型或者病毒抹的病毒片段的3'和5，非編碼和/或非翻譯序列。在具體實施方式中，重組片段包含5.1.2章描述的融合蛋白的編碼核酸，該核酸包含流感病毒NAvRNA的3'非編碼區(qū)，對應(yīng)于NA蛋白的CT和TM域的NA編碼區(qū)，與流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1個殘基，NAvRNA的NA蛋白閱讀框的非翻譯區(qū)和5，非編碼區(qū)。在某些實施方式中，重組片段包含5.1.2章描迷的融合蛋白編碼核酸，該融合蛋白包含球狀頭部之前的NA蛋白完整的主干結(jié)構(gòu)域或者其片段。作為替代減毒流感病毒的NA或者HA蛋白的一種選擇，"反向遺傳學(xué)"和雙順反子技術(shù)可被用來制備嵌合流感病毒，該病毒包括非流感病毒傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或疾病抗原和流感病毒的TM和/或CT域。參見如美國專利號6,887,699、美國專利號6,001,634、美國專利號5,854,037和美國專利號5,820,871，各專利內(nèi)容均完整引入本文作為參考。可用于本發(fā)明的方法的異病毒蛋白相關(guān)的抗原)在下文5.3章節(jié)提供。5.1.3包含新城疫病毒HN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的嵌合禽流感病毒本發(fā)明包括禽流感病毒的工程改造，由此包含新城疫病毒HN蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白被基因組編碼且當(dāng)被表達時結(jié)合進病毒顆粒?？杀还こ谈脑煲员磉_融合蛋白并將其結(jié)合進禽流感病毒顆粒的任何類型、亞型或病毒抹的禽流感病毒可被選擇并用于本發(fā)明，包括但不局限于天然存在的病毒抹、變異抹或突變體、經(jīng)誘變的病毒、重組和/或基因工程改造病毒。禽流感病毒的非限制性例子包括流感A亞型H5N1、H6N2、H7N3、H9N2和H10N7。本發(fā)明提供了包含融合蛋白的嵌合禽流感病毒，該蛋白具有新城疫病毒(NDV)HN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(ED)和流感病毒NA蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CT)和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)或跨膜結(jié)構(gòu)域(TM),其中融合蛋白功能性代替至少禽流感病毒NA蛋白。換句話說，禽流感病毒作為"骨架"，該骨架被工程改造以表達代替禽流感病毒NA蛋白的融合蛋白并將其結(jié)合進其病毒顆粒。在融合蛋白中包含流感病毒NA蛋白的TM和CT域或TM域使得融合蛋白能夠結(jié)合進禽流感病毒的病毒顆粒。融合蛋白的TM和CT域或TM域可對應(yīng)于或來自于允許融合蛋白結(jié)合到禽流感病毒骨架的病毒顆粒的任何流感病毒?？捎糜诒景l(fā)明的TM和CT域的編碼序列可獲自或者源自任何流感病毒抹或者亞型的任何NA蛋白的已公開的序列(例如，GenBank登錄號AY651447，來自A/越南/1203/2004(H5Nl)抹；GenBank登錄號AY96877，來自A/火雞/加拿大/63(H6N2)抹；GenBank登錄號AY706954，來自A/鴨/海南/4/2004(H6N2)抹；GenBank登錄號DQ646080,來自A/雞/英屬哥倫比亞/GSC_人—B/04(H7N3)抹；GenBank登錄號DQ064434，來自A/雞/北京/8/98(H9N2)抹)。在某些具體李子中，融合蛋白的TM和CT域或者TM域?qū)?yīng)于不同于骨架禽流感病毒的禽流感病毒類型或毒抹的TM和CT域或者TM域。在其它實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或者TM域?qū)?yīng)于非禽流感病毒的流感病毒的TM和CT域或者TM域。在優(yōu)選實施方式中，融合蛋白的TM和CT域或者TM域?qū)?yīng)于禽流感病毒骨架的TM和CT域或者TM域。在具體實施方式中，融合蛋白的TM和CT域?qū)?yīng)于流感病毒A/WSN/33的NA蛋白的TM和CT結(jié)構(gòu)域。在某些實施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個直接相鄰的流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域殘基，和NDVHN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒NA蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，與流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，以及NDVHN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含位于球狀頭部之前的NA蛋白的完整的主干結(jié)構(gòu)域或其片段，和NDVHN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。在另一實施方式中，融合蛋白包含NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，且進一步包含位于球狀頭部之前的NA蛋白的完整的主干結(jié)構(gòu)域或其片段，和NDVHN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。作為替代禽流感病毒的NA蛋白的一種選擇，"反向遺傳學(xué)"和雙順反子技術(shù)可被用來制備嵌合禽流感病毒，該病毒包括NDVHN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和流感病毒的TM和/或CT域。參見如美國專利號6,887,699、美國專利號6,001,634、美國專利號5,854,037和美國專利號5,820,871，各專利內(nèi)容均完整引入本文作為參考。本發(fā)明包含編碼本章節(jié)5.1.3所描述的融合蛋白的核苷酸序列(即重組片段)。在優(yōu)選實施方式中，含有編碼5丄3章節(jié)描述的融合蛋白的核酸的重組片段包含3，和5'結(jié)合信號，這些信號是vRNA正確復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝所需要的(Fujii等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:2002-2007;Zheng等，1996，Virology217:242-251，兩者內(nèi)容均完整引入本文作為參考)。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的重組片段因此使用與骨架禽流感病毒相同類型或者病毒抹的病毒片段的3，和5'非編碼和/或非翻譯序列。在具體實施方式中，重組片段包含5.1.3章描述的融合蛋白的編碼核酸，該核酸包含流感病毒NAvRNA的3，非編碼區(qū)，對應(yīng)于NA蛋白的CT和TM域的NA編碼區(qū)，與流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的流感病毒NA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1個殘基，NAvRNA的NA蛋白閱讀框的非翻譯區(qū)和5，非編碼區(qū)。在另一具體實施方式中，重組片段以3，到5，的順序包含WSNNAvRNA的3，非編碼區(qū)(19個核苷酸)、編碼NA編碼區(qū)的氨基酸殘基1-36的核苷酸(108個核苷酸)、編碼NDVBlHN蛋白的氨基酸殘基51-568的核苷酸、2個連續(xù)的終止密碼子、WSNNA非翻譯閱讀框的157個核苷酸、WSNvRNA的5'非編碼區(qū)(28個核苷酸)。見圖1。替代骨架流感病毒的NA蛋白或者在病毒基因組引入重組片段可能減弱生成的嵌合病毒，即相比野生型，嵌合病毒會展現(xiàn)出受損的復(fù)制能力。在本發(fā)明的某些實施方式中，嵌合病毒的減弱是需要的，由此嵌合病毒至少部分保留了感染性并且可以在體內(nèi)復(fù)制，但是只產(chǎn)生低滴度，導(dǎo)致非致病性的亞臨床水平感染。這樣的減毒嵌合病毒特別適用于本發(fā)明的實施方式，其中病毒作為免疫原如活體疫苗施用于個體。可以通過本領(lǐng)域已知的和/或在此例舉的任何方法將病毒減弱，如，將病毒工程改造以在NS1基因中包含突變或在HA蛋白的切割位點前的多元氨基酸序列中包含改變。(參見美國專利號6,468,544;美國專利號6,669,943;Li等，1999，J.Infect.Dis179:1132-1138,各文獻內(nèi)容均完整引入本文作為參考)。在一實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合禽流感病毒包含基因組，其包含在禽流感骨架病毒的NS1基因中的突變，已知該突變在其它流感病毒中降低NS1基因產(chǎn)物拮抗細胞干擾素應(yīng)答的能力。在另一實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合禽流感病毒包含基因組，其包含在禽流感骨架病毒的HA基因中的突變，已知該突變在其它流感病毒中降低或者消除細胞蛋白酶將蛋白剪切成其活性形式的能力，從而減弱或者消除HA誘導(dǎo)的融合和感染。在另一實施方式中，本發(fā)明的減毒嵌合禽流感病毒包含基因組，其同時包含在禽流感骨架病毒的HA基因和NS1基因中的突變，已知這些突變在其它流感病毒中分別地或聯(lián)合地誘導(dǎo)或者減弱病毒活性。使用本領(lǐng)域已知的或本文所述的任何技術(shù)可確定減毒的嵌合和野生型禽流感病毒的滴度(例如，血凝素分析、空斑分析、雞胚半數(shù)感染量(EID50)、半數(shù)細胞培養(yǎng)感染量(TCID50)等)，病毒可以在本文所述的或本領(lǐng)域已知的條件下培養(yǎng)(如在CEF細胞、MDCK細胞(如在MEM,10。/()v/v胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素在37°C,5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中)或胚雞卵中(例如恒溫培養(yǎng)箱中，37°C，55%相對濕度)?；蛘?，病毒可以在生長在無血清或者低血清(如，TPCK胰蛋白酶)培養(yǎng)基的細胞中(如，CEF細胞、MDCK細胞等)增殖。5.2嵌合新城疫病毒本發(fā)明包含新城疫病毒("NSV")的工程改造，由此至少一個融合蛋白被基因組編碼并在^皮表達時結(jié)合進入病毒顆粒?？蓛羝すこ谈脑煲员磉_至少一個融合蛋白并將其結(jié)合進NDV病毒顆粒的任何NDV類型或病毒抹可被選擇并用于本發(fā)明，包括但不局限于天然存在的病毒抹、變異抹或突變體、經(jīng)誘變的病毒、重組和/或基因工程改造病毒。在具體實施方式中，NDV是天然存在的病毒。在另一具體實施方式中，NDV是經(jīng)遺傳工程改造的病毒。例如，如本文所述，重組NDV、rNDV/F2aa和rNDV/F3aa的變異株可用于本發(fā)明的方法，在這些突變抹中，F(xiàn)蛋白的切割位點被包含一個或兩個額外精氨酸殘基的切割位點替代，從而使突變體切割位點被普遍表達的弗林家族蛋白酶激活。可以用于本發(fā)明的方法的NDV的非限定性例子包括Bl、LaSota、YG97、MET95和F48E9。在具體實施方式中，本發(fā)明的嵌合NDV或者rNDV包含含有流感病毒HA蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白；在根據(jù)該實施方式的具體實施方式中，流感HA蛋白是來自流感H7的HA蛋白。本發(fā)明提供了包含至少一個融合蛋白的嵌合NDV，該蛋白具有非NDV蛋白的傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(ED)或其片段以及NDV必需糖蛋白的胞質(zhì)(CT)和/或跨膜(TM)域。本發(fā)明也提供了包含至少一個融合蛋白的嵌合NDV，該蛋白具有非NDV糖蛋白的傳染性物質(zhì)的蛋白的ED或其片段以及TM域，和NDV必需糖蛋白的CT域。換句話說，NDV病毒作為"骨架"，該骨架被工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進其病毒顆粒。在融合蛋白中包含NDV必需糖蛋白的TM和/或CT域使得融合蛋白能夠結(jié)合進NDV的病毒顆粒。融合蛋白的TM和/或CT域可對應(yīng)于或來自于允許融合蛋白結(jié)合到NDV骨架的病毒顆粒的任何NDV。在某些實施方式中，融合蛋白的TM和/或CT域?qū)?yīng)于不同于骨架NDV的NDV類型或者毒抹的TM和/或CT域。在優(yōu)選實施方式中，融合蛋白的TM和/或CT域?qū)?yīng)于NDV骨架的TM和/或CT域。NDV病毒顆粒包含兩個主要表面糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)，他們都包含胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域。相應(yīng)地，在某些實施方式中，融合蛋白的TM和/或CT域?qū)?yīng)于NDV的F蛋白或者HN蛋白的TM和/或CT域。NDVF和HN蛋白的TM和CT域在結(jié)構(gòu)上的差異在于該結(jié)構(gòu)域位于F蛋白的C末端和HN蛋白的N末端。因此，當(dāng)設(shè)計將被工程改造進NDV的融合蛋白時，將被融合入NDV糖蛋白的TM和/或CT域的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域的方向?qū)龑?dǎo)TM和/或CT域的選擇。在某些實施方式中，嵌合NDV的至少一個融合蛋白包含TM域和1到15、1到10、1到5、1到3、2或者1個直接相鄰的NDV必需糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域殘基。例如，在具體實施方式中，融合蛋白包含NDVF蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個直接相鄰的NDVF蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域殘基，和NDV的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代F蛋白的功能。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含NDVF蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，與NDVF蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個NDVF蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，以及非NDV的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代F蛋白。在另一實施方式中，融合蛋白包含NDVHN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個直接相鄰的NDVHN蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，和非NDV的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或者其片段，由此融合蛋白能夠功能性替代HN蛋白的功能。在另一具體實施方式中，融合蛋白包含流感病毒NDVHN蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，與NDVHN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域直接相鄰的1到15、1到10、1到5、1到3、2或1個NDVHN蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的殘基，和NDV的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段，由此融合蛋白可以功能性替代HN蛋白。在某些實施方式中，NDV表面糖蛋白(即HN或者F蛋白)被提供NDV糖蛋白所需功能的融合蛋白所替代。根據(jù)這些實施方式，選擇融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域由此其將提供替代的NDV糖蛋白的所需功能。在另一實施方式中，除天然NDV表面糖蛋白以外，融合蛋白表達并被結(jié)合入NDV病毒顆粒中。在某些實施方式中，本發(fā)明的嵌合NDV的至少一個融合蛋白不包含異源蛋白的完整胞外結(jié)構(gòu)域(例如，包含異源傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原性片段)，而且可能或者可能不進一步包含天然必需糖蛋白的一個或者多個胞外結(jié)構(gòu)域的片段。相應(yīng)地，在某些實施方式中，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可包含異源傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的片段。在其它實施方式中，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可同時包含天然必需糖蛋白片段和異源傳染性物質(zhì)蛋白片段。在融合蛋白取代必需表面糖蛋白的實施方式中，表面糖蛋白的功能必須由融合蛋白提供，即融合蛋白必須展現(xiàn)出它替代的表面糖蛋白的功能。如果無需用本章5.2描述的融合蛋白替代乂、需病毒糖蛋白的功能，融合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可對應(yīng)于或者源自任何異源分子，包括但不僅限于，任何傳染性物質(zhì)抗原(包括，病毒、細菌和寄生蟲傳染性物質(zhì)抗原)，以及任何疾病抗原。傳染性物質(zhì)抗原和疾病抗原的非限定性例子在下文5.3章提供。本發(fā)明包含編碼本章5.2描述的融合蛋白的核苷酸序列。在具體實施方式中，核苷酸序列包含編碼Kozak序列的核酸，接著是基因末端、順反子間區(qū)核苷酸(T)和NDVF蛋白基因起始序列，接著是H7N2的HA蛋白的5'非翻譯區(qū)和ORF。在優(yōu)選實施方式中，用于本發(fā)明的NDV抹是緩發(fā)型毒抹，即這些病毒抹典型地表現(xiàn)出低毒性或者對禽類感染后無征兆，例如，Bl抹、LaSota抹或者Met95抹。本發(fā)明還包含NDV的高毒性抹的應(yīng)用，例如，YG97或者F48E9或者已使用本領(lǐng)域已知的或本文例舉的方法通過遺傳重組改造的NDV抹。在具體實施方式中，發(fā)明包含NDV的應(yīng)用，其中NDVF蛋白已經(jīng)在切割位點被遺傳修飾從而提高了融合活性。在本發(fā)明的具體實施例中，經(jīng)修飾的F蛋白包含位于F切割位點的兩個或者三個氨基酸突變。替代骨架病毒的必需表面蛋白或者在病毒基因組引入編碼融合蛋白的核苷酸序列可能減弱或進一步減弱生成的嵌合病毒，即相比野生型，嵌合病毒會展現(xiàn)出受損的復(fù)制能力。在本發(fā)明的某些實施方式中，嵌合病毒的減弱或進一步減弱是需要的，由此嵌合病毒至少部分保留了感染性并且可以在體內(nèi)復(fù)制，但是只產(chǎn)生低滴度，導(dǎo)致非致病性的亞臨床水平感染。這樣的減毒嵌合病毒特別適用于本發(fā)明的實施方式，其中病毒作為免疫原如活體疫苗施用于個體。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法將病毒減毒。5.3可被工程改造進本發(fā)明的嵌合病毒的抗原根據(jù)本發(fā)明，任何異源分子可以被工程改造進病毒骨架從而引發(fā)對所述分子的免疫應(yīng)答。在具體實施方式中，任何傳染性病原體的任何抗原或與能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的疾病相關(guān)聯(lián)的抗原可被工程改造進NDV和/或流感骨架病毒。在具體實施方式中，抗原是糖蛋白。在某些優(yōu)選實施方式中，抗原能夠功能性替代流感病毒和/或NDV的必需糖蛋白。在具體實施方式中，抗原展示神經(jīng)氨酸酶或血凝素(例如，受體結(jié)合/融合性)活性。在選擇表達抗原的病毒骨架時，考慮編碼抗原的核苷酸的方向。例如，當(dāng)抗原天然地通過其氨基末端錨定時，用來將融合蛋白工程改造的TM和CT域或者TM域就對應(yīng)于骨架病毒或相關(guān)病毒的必需病毒蛋白的TM和CT域或TM域，它們也是天然通過氨基末端錨定的，例如，流感病毒N蛋白或者NDV的HN蛋白。在具體實施方式中，病毒抗原被工程改造進NDV或者流感病毒骨架。病毒抗原的非限定性例子包括來自腺病毒科(如哺乳動物腺病毒屬和禽腺病毒屬)、皰珍病毒科(如單純皰滲病毒1、單純皰療病毒2、單純皰滲病毒5、單純皰滲病毒6、愛潑斯坦-巴爾病毒、HHV6-HHV8和細胞巨化病毒)、光滑病毒科(如光滑病毒、腸桿菌相MS2、別光滑病毒)、痘病毒科(如脊推動物痘病毒亞科、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬、軟體動物痘病毒屬、和昆蟲痘病毒屬)、乳多空病毒科(如多瘤病毒和乳頭瘤病毒)、副粘病毒科(如副粘病毒屬、副流感病毒1、運動病毒(如麻滲病毒)、腮腺炎病毒屬(如腮腺炎病毒))肺炎病毒科(如肺炎病毒屬、人類呼吸多核體病毒)、人類呼吸多核體病毒和多元肺炎病毒(如禽類肺炎病毒和人類多元肺炎病毒))、細小核糖核酸病毒(如腸道病毒、鼻病毒、肝病毒(如人類甲肝病毒)、心臟病毒、和?？谔阋卟《?、呼腸孤病毒科(如正呼腸孤病毒屬、環(huán)狀病毒屬、輪狀病毒屬、質(zhì)型多角體病毒屬、矮縮病毒屬、水稻病毒屬、植物呼腸孤病毒屬)、反向病毒科(例如哺乳動物B型反向病毒、哺乳動物C型反向病毒、禽類C型反向病毒、D型反向病毒組、BLV-HTLV反向病毒、慢病毒屬(如人類免疫缺陷病毒1和人類免疫缺陷病毒2(例如HIVgpl60)、泡沫病毒屬)、黃病毒科(如丙肝病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒)、嗜肝DNA病毒科(如乙肝病毒)、披膜病毒科(如甲病毒(如油棉病毒)和風(fēng)滲病毒(如風(fēng)濕滲病毒))、棒4史病毒科(如水皰病毒屬、狂犬病毒屬、彈狀病毒屬、植物棒狀病毒A亞種、壞死棒狀病毒)、沙礫病毒科(如沙礫病毒、淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、愛皮病毒、和拉沙病毒)、冠狀病毒考+(如冠狀病毒和念狀病毒)的抗原。在具體實施方式中，病毒抗原是HIVp120、HIVnef、RSVF糖蛋白、RSVG糖蛋白、流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素、HTLVtax、單純皰滲病毒糖蛋白(如gB、gC、gD和gE)或者乙肝表面抗原、丙肝病毒E蛋白或者冠狀病毒刺突蛋白。在某些實施方式中，病毒抗原不是gp41。在某些實施方式中，病毒抗原來自副粘病毒。在其它實施方式中，病毒抗原不來自副粘病毒。在某些實施方式中，病毒抗原來自人類帕拉丁流感病毒1、人類帕拉丁流感病毒3、RSV或者來自仙臺病毒。在其它實施方式中，病毒抗原不來自人類帕拉丁流感病毒1、人類帕拉丁流感病毒3、RSV或者來自仙臺病毒。在具體實施方式中，病毒骨架是流感病毒且被工程改造進流感病毒骨架的抗原不是流感抗原。在其它具體實施方式中，病毒骨架是NDV且被工程改造進NDV骨架的抗原不是NDV抗原。在另一實施方式中，細菌抗原(如，細菌外殼蛋白或者所述細菌相關(guān)的保護性抗原)被工程改造進NDV或者流感病毒骨架。細菌抗原的非限定性例子包括來自水螺菌家族、固氮螺菌家族、固氮菌科家族、擬桿菌科家族、巴爾通體家族、蛭孤菌體家族、彎曲桿菌種、衣原體種(如肺炎衣原體)、梭菌、腸桿菌科家族(如檸檬酸桿菌種、愛德華氏菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌、歐文氏菌屬、大腸桿菌、蜂窩哈夫尼亞菌種、克雷白氏菌噬菌體種、摩爾根氏菌種、尋常變形桿菌、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌、靈桿菌、弗累克斯訥氏桿菌)、嘉丁氏菌家族、流感嗜血桿菌、嗜鹽菌科家族、螺旋菌家族、軍團菌科家族、李氏桿菌種、甲基球菌科家族、分枝菌(如結(jié)核桿菌)、奈瑟氏菌科家族、海洋螺旋菌家族、巴斯德氏菌科家族、肺炎球菌種、假單孢菌種、根瘤菌家族、螺旋菌家族、螺旋小體科家族、葡萄球菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和檸檬色釀膿葡萄球菌)、鏈球菌(如腸炎鏈球菌、糞鏈球菌、鏈球菌肺炎)、蝙蝠弧螺旋菌家族、耶爾森氏菌家族、戴文氏桿菌和蝙蝠弧菌家族的細菌的抗原。在其它實施方式中，寄生蟲(如原生動物)相關(guān)保護性抗原被工程改造進NDV或者流感病毒骨架。任何寄生蟲相關(guān)抗原或者寄生蟲(如原生動物)保護性抗原可被用于本發(fā)明的方法。寄生蟲抗原的非限定性例子包括來自寄生蟲如阿米巴蟲、癥原蟲、變形體、克氏錐蟲的抗原。在另一實施方式中，真菌抗原被工程改造進NDV或者流感病毒骨架。真菌抗原的非限定性例子包括來自舉頭霉菌種(如傘支犁頭霉和分支犁頭霉)、曲霉種(如黃曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、土曲霉)蛙糞霉、皮炎芽生菌、假絲酵母種(如白色念珠菌、光滑假絲酵母、科爾假絲酵母、克魯斯假絲酵母、近平滑假絲酵母、假熱帶念珠菌、季也蒙假絲酵母、皺落假絲酵母、類星形念珠菌、熱帶假絲酵母)、粗球孢子菌、耳霉屬、新生隱球菌、小克銀漢霉菌種、皮霉褲菌、莢膜組織胞漿菌、石膏樣小孢子菌、';吵小毛霉菌、巴西芽生菌、波氏假阿利什霉、鼻孢子菌、卡氏肺囊蟲、酒曲菌屬種(如少根根霉、米根霉、小孢根霉菌)、酵母菌種、孢子絲菌屬、接合菌亞綱、和綱例如接合菌亞綱、子囊菌類、擔(dān)子菌類、知菌綱和卵菌綱的真菌的抗原。在另一實施方式中，胂瘤相關(guān)抗原被工程改造進NDV或者流感病毒骨架。本領(lǐng)域熟知的任何腫瘤相關(guān)抗原可被用于根據(jù)本發(fā)明的方法。肺瘤相關(guān)抗原的非限定性例子包括MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰葡萄糖胺-V、p-15、MART-l/MelanA、TRP-l(gp75)、酪氨酸酶、細胞周期蛋白依賴性激酶4、p-連接素、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人類乳頭瘤病毒-E6、人類乳頭瘤病毒-E7、半胱氨酸蛋白酶-8、CD5、CD20、CEA、凈占蛋白-1、Lewisx、CA-125、表皮生長因子受體、p18511012、IL-2R、Fap-a、肌糖蛋白、金屬蛋白酶相關(guān)抗原、和CAMPATH-1。5.4本發(fā)明嵌合病毒的構(gòu)建和增殖可以使用反向遺傳技術(shù)生成本發(fā)明的嵌合病毒。反向遺傳技術(shù)涉及合成重組病毒RNA的制備，該RNA包含負鏈的非編碼區(qū)，對病毒聚合酶識別和生成成熟病毒顆粒所需的包裝信號而言必需的病毒RNA。重組RNA從重組DNA模板合成并在體外使用純化的病毒聚合酶復(fù)合體重新構(gòu)建從而形成可被用于轉(zhuǎn)染細胞的重組核糖核蛋白(RNP)。如果在合成RNA的體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄中存在病毒聚合酶蛋白，將實現(xiàn)更有效的轉(zhuǎn)染。合成的重組RNP可被捕獲進傳染病毒顆粒。前述技術(shù)描述于1992年11月24日授權(quán)的美國專利號5,166,057;1998年12月29日授權(quán)的美國專利號5,854,037;1996年2月20日公開的歐洲專利公開文本EP0702085A1;美國專利申請序列號09/152，845;1997年4月3日公開的國際專利公開本文PCTWO97/12032;1996年11月7日公開的W096/34625;歐洲專利公開文本EPA780475;1999年l月21日公開的WO99/12032;1998年11月26日公開的WO98/53078;1998年1月22日公開的WO98/02530;1999年4月1日公開的W099/15672;1998年4月2日公開的WO98/13501;1997年2月20日公開的WO97/06270;和1997年6月25日公開的EPO780475A1,各文獻的內(nèi)容均完整引入本文作為參考。無輔助質(zhì)粒技術(shù)也可被用來工程改造本發(fā)明的嵌合病毒。簡單說，相對于流感病毒，病毒片段全長cDNA通過使用具有獨特酶切位點的引物通過PCR擴增，可以使PCR產(chǎn)物插入到到質(zhì)粒載體中(Flandorfer等，2003,J.Virol.77:9116-9123;Nakaya等，2001，J.Virol.75:11868-11873;兩者均完整引入本文作為參考)。設(shè)計質(zhì)粒載體以將PCR產(chǎn)物置于截斷的人RNA聚合酶I啟動子和丁型肝炎核酶序列之間，由此從聚合酶I啟動子生成準(zhǔn)確的負性(vRNA義)轉(zhuǎn)錄物。包含各病毒片段的獨立質(zhì)粒載體和包含必需病毒蛋白的表達載體被轉(zhuǎn)染到細胞中，導(dǎo)致重組病毒顆粒的生成。無輔助質(zhì)粒技術(shù)的詳細描述參見，例如國際公開號WO01/04333;美國專利號6,649,372;Fodor等，1999,J.Virol.73:9679-9682;Hoffinann等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.96:9345-9350，各文獻均完整引入本文作為參考。相似地，關(guān)于NDV的單個節(jié)段基因組，完整的希契納Bl抹cDNA被構(gòu)建，插入到質(zhì)粒載體并工程改造以在P和M基因之間包含獨特酶切位點。根據(jù)本發(fā)明工程改造的融合蛋白可在獨特酶切位點被插入病毒基因組。單個片段被置于T7啟動子和丁型肝炎核酶之間由此從T7聚合酶生成精確的負轉(zhuǎn)錄物。質(zhì)粒載體和包含必需病毒蛋白的表達載體被轉(zhuǎn)染入細胞中從而產(chǎn)生重組病毒顆粒(參見，Swayne等，2003，AvianDis.47:1047-1050和Swayne等，2001，J.Virol.11868-11873,各文獻均完整引入本文作為參考)。本發(fā)明的嵌合流感病毒可經(jīng)工程改造以包含是雙順反子的RNA片段。雙順反子技術(shù)通過使用IRES序列使得多個蛋白的編碼序列可被工程改造進單個mRNA中。IRES序列指引核糖體向RNA分子的內(nèi)部募集并使以帽非依賴性方式進行下游翻譯。簡單說，一個蛋白的編碼區(qū)插入到第二個蛋白的ORF中。插入物兩側(cè)是IRES和任何實現(xiàn)正常表達和/或功能的所需的非翻譯信號序列。插入必須不破壞開放閱讀框、多聚腺苷酸化或者第二個蛋白的轉(zhuǎn)錄啟動子(參見，如，Garcia-Sastre等，1994,J.Virol.68:6254-6261和Garcia-Sastre等，1994Dev.Biol.Stand.82:237-246),各文獻均被完整引入本文作為參考。5.4.1嵌合病毒的增殖本發(fā)明的嵌合流感病毒可以在任何基質(zhì)中增殖，該基質(zhì)允許病毒生長到實現(xiàn)本文所述的嵌合病毒的用途的滴度。在一實施方式中，基質(zhì)允許嵌合病毒生長到可與相應(yīng)的野生型病毒確定的滴度相當(dāng)?shù)牡味?。在具體實施例方式中，本發(fā)明的減毒嵌合病毒在IFN缺陷型基質(zhì)中增殖。本發(fā)明的嵌合病毒可以生長在細胞中(如，鳥類細胞、雞細胞等)，此類細胞易于被病毒、胚卵或者動物(如鳥)感染。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在具體實施方式中，用于增殖具有減弱的拮抗干擾素活性的減毒流感病毒的細胞是IFN-缺陷型。在一實施方式中，本發(fā)明的嵌合禽病毒在雞細胞或者胚卵中增殖。代表性雞細胞包括但不僅限于雞胚纖維細胞或者雞胚腎細胞。本發(fā)明嵌合病毒可以在胚卵中增殖，如6到14天大的胚卵。初期或者未成熟的胚卵可被用于增殖本發(fā)明的減毒嵌合流感病毒。未成熟胚卵包括小于十天卵齡的卵，如6到9天的卵，其是INF缺陷型。未成熟的胚卵還包含人工模擬的未成熟卵，其直至但小于十天卵齡，通過生長環(huán)境的改變產(chǎn)生，如，孵卵溫度的改變；藥物處理；或者任何其它能導(dǎo)致卵發(fā)育遲緩的方法，從而使IFN系統(tǒng)相比十天或者十二天卵齡的卵沒有發(fā)育完全。本發(fā)明的嵌合病毒可以在不同的胚卵區(qū)域增殖，如尿囊腔。關(guān)于病毒生長和增殖的詳細討論，尤其是具有減弱的拮抗干擾素活性的減毒流感病毒，參見，如美國專利號6,852,522和美國專利號6,852,522，兩者均被完整引入本文作為參考。關(guān)于病毒分離，典型地通過已知的純化方法，如梯度離心和柱層析法，將嵌合病毒從細胞培養(yǎng)物中移出并從細胞組分中分離，且根據(jù)需要通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法如空斑分析進一步純化。5.5嵌合病毒的應(yīng)用本發(fā)明的嵌合病毒可以用于個體的自動免疫。在一方面，本發(fā)明嵌合病毒可以用來預(yù)防、控制或治療一或者多種疾病。在具體的方面，本發(fā)明的嵌合病毒可以用來預(yù)防、控制和/或治療兩種傳染性物質(zhì)造成的感染。關(guān)于免疫原性制劑和這些制劑在誘導(dǎo)個體免疫應(yīng)答中的應(yīng)用的描述參見5.5.1章。本發(fā)明的嵌合病毒還可以用來制備抗體，其可被用于診斷免疫分析、被動免疫療法和產(chǎn)生抗獨特型抗體。例如，包含具有非流感病毒的傳染性物質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的嵌合病毒可被施用給個體(如小鼠、大鼠、豬、馬、驢、鳥或者人)來產(chǎn)生針對流感骨架和傳染性物質(zhì)的抗體，這些抗體隨后可被分離并應(yīng)用于診斷免疫分析、被動免疫療法和產(chǎn)生抗獨特型抗體。產(chǎn)生的抗原可以使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離(如免疫親和層析法、離心法、沉淀法等)并被用于診斷免疫分析、被動免疫療法和產(chǎn)生抗獨特型抗體。分離的抗體在被應(yīng)用于被動免疫療法之前可以被修飾，如抗體可以被嵌合或者人源化。關(guān)于生成嵌合和人源化抗體的綜述，參見如美國專利號4,444,887和4,716,111;和國際公開號W098/46645、WO98/50433、W098/24893、W098/16654、WO96/34096、W096/33735和WO91/10741，各文獻均被完整引入本為作為參考。關(guān)于由嵌合病毒產(chǎn)生的用于被動免疫療法的抗體，施用給個體的劑量通常為0.0001mg/kg到100mg/kg患者體重。優(yōu)選地，施用給患者的劑量為0.0001mg/kg到20mg/kg、0.0001mg/kg到10mg/kg、0.0001mg/kg到5mg/kg、0.0001mg/kg多J2mg/kg、0.0001mg/kg多1mg/kg、0.0001mg/kg多J0.75mg/kg、0.0001mg/kg到0.5mg/kg、0.0001mg/kg到0.25mg/kg、0.0001mg/kg到0.15mg/kg、0.0001mg/kg到0.10mg/kg、0.001mg/kg到0.5mg/kg、0.01到0.25mg/kg或者0.01到0.10mg/kg個體體重。本發(fā)明包含的預(yù)防的預(yù)防性或者治療性組合物一同施用。施用本發(fā)明的抗體劑量可以通過彈丸注射或者更慢地通過IV提供(如經(jīng)過約5分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約2小時、約4小時、或者約6小時)。本發(fā)明的抗體劑量也可以在療程中(如2周、l個月、2個月、4個月、6個月、8個月、IO個月、12個月、16個月、20個月、或者24個月或者更長)重復(fù)(如每天、每2天、每3天、每周、每2周、每3周、每6周、每9周、每12周、每4個月、每6個月、每12個月、每18個月、或每2年)。在某些實施方式中，本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體通過腸道外施用，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或者皮下施用，或者通過口服或者鼻內(nèi)施用。本發(fā)明包含的抗體還可以作為緩稀制劑施用。從施用了本發(fā)明嵌合病毒的個體中分離的抗體還可被用于監(jiān)控治療和/或疾病進展。本領(lǐng)域已知的任何免疫分析系統(tǒng)可以被用于此目的，包括但不限于竟?fàn)幮曰蛘叻蔷範(fàn)幮苑治鱿到y(tǒng)，其使用技術(shù)如放射免疫分析、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、"三明治"免疫分析、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散分析、凝集分析、補體結(jié)合分析、免疫放射分析、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析和免疫電泳分析等。本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體還可被用來產(chǎn)生抗獨特型抗體?？躬毺匦涂贵w可隨后用于免疫，從而產(chǎn)生結(jié)合嵌合病毒初始抗原的抗體亞群(Jeme,1974,Ann.Immunol.(Paris)125c:373;Jerne等，1982，EMBOJ.l:234)。在免疫過程中，將被使用的免疫原量和免疫程序表由本領(lǐng)域熟練的醫(yī)師決定并且參考個體免疫應(yīng)答和抗體滴度施用。5.5.1免疫原性制劑本發(fā)明還包含本發(fā)明嵌合病毒在免疫原性制劑中的應(yīng)用，如疫苗制劑。當(dāng)免疫原性制劑包含嵌合流感病毒時，該制劑可被用于預(yù)防、控制、中和、治療和/或改良流感病毒感染和/或由其它傳染性物質(zhì)和/或者疾病引發(fā)的感染的方法。當(dāng)免疫原性制劑包含嵌合NDV時，該制劑可被用于預(yù)防、控制、中和、治療和/或改良NDV感染、由其它傳染性物質(zhì)和/或疾病引發(fā)的感染。免疫原性制劑可以包含活的或者失活的本發(fā)明的嵌合病毒。嵌合病毒可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法滅活。一般方法使用福爾馬林或者加熱來滅活。參見如美國專利號6,635,246,其內(nèi)容完整引入本文作為參考。其它方法包含在美國專利號5,891,705;5,106,619和4,693,981中描述的方法，這些文獻均完整引入本文作為參考。生的相似種類和量級的延長的刺激，因此產(chǎn)生實質(zhì)性的、持久的免疫性。這些活的重組免疫原性制劑的制備可以通過使用傳統(tǒng)方法完成，方法包括嵌合病毒在細胞培養(yǎng)或者胚卵(如雞胚卵)中增殖并隨后純化。此外，嵌合病毒可以誘發(fā)強有力的IFN應(yīng)答，會在體內(nèi)導(dǎo)致其它的生物學(xué)結(jié)果，即產(chǎn)生抗后續(xù)感染的保護作用。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的免疫原性制劑包含有效量的本發(fā)明的嵌合病毒和藥學(xué)可接受的載體。術(shù)語"藥學(xué)可接受的"指被聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)批準(zhǔn)或被美國藥典或者其它普通公認的藥典列為可用于動物，甚至尤其是人類。術(shù)語"載體"指與藥物組合物(如免疫原性或者疫苗制劑)一同施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載體。鹽溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可以作為液體載體，尤其是作為可注射性溶液。合適的賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、米、面粉、白堊、硅膠、^J旨酸納、單硬脂酸甘油酯、云母、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合適的藥學(xué)載體的例子在E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences中有描迷。制劑應(yīng)當(dāng)適合施用的方式。具體制劑可能還取決于嵌合病毒是否是活的或被滅活的。本發(fā)明免疫原性制劑可以施用于樸素個體(naivesubject)，即無病或以前沒有且現(xiàn)在也沒有被一或者兩種傳染性物質(zhì)感染的個體。在一實施方式中，將免疫原性制劑施用于樸素個體，即無病或者以前沒有且現(xiàn)在也沒被一或兩種傳染性物質(zhì)感染，但是有獲得這種疾病(如病毒感染)的風(fēng)險的個體。在一實施方式中，本發(fā)明的免疫原性制劑被施用給個體，該個體沒有患病，或者以前且現(xiàn)在都沒有被傳染性物質(zhì)之一感染，嵌合病毒誘導(dǎo)針對該傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答。在另一實施方式中，本發(fā)明的免疫制劑被施用給個體，該個體以前且現(xiàn)在都沒有被兩種傳染性物質(zhì)感染，嵌合病毒誘導(dǎo)針對這兩種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性制劑還可以施用給個體，該個體正在或已經(jīng)被傳染性物質(zhì)的一種或者兩者或者另一類型、亞型或抹的物質(zhì)感染，嵌合病毒誘發(fā)針對它們的免疫應(yīng)答。很多方法可被用于引入免疫原性制劑，如上文描述的疫苗制劑，它們包括但不限于鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、口服、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、結(jié)膜和皮下途徑。在鳥中，方法可進一步包括鼻后孔接種法。作為腸胃外給藥的替換，本發(fā)明還包括用于農(nóng)業(yè)目的的大量施用途徑如通過飲用水或者噴霧。通過野生型病毒感染的天然途徑引入嵌合流感病毒免疫原性制劑可能是優(yōu)選的?；蛘撸ㄟ^獲得融合蛋白的物質(zhì)的感染天然途徑引入本發(fā)明的嵌合病毒可能是優(yōu)選的。嵌合病毒引發(fā)強分泌和細胞免疫應(yīng)答的能力可被有利地利用。例如，嵌合病毒通過呼吸道的感染可引發(fā)強烈的分泌免疫應(yīng)答，如泌尿系統(tǒng)，伴隨抗特定致病物質(zhì)的保護作用。此外，在優(yōu)選實施方式中，希望通過任何合適途徑將本發(fā)明的藥物制劑引入肺中。肺部施用也可以被采用，例如使用吸入器或者噴霧器，且具有霧化劑的制劑用作噴霧。在某些實施方式中，本發(fā)明的免疫原性制劑不導(dǎo)致對感染(如病毒感染或者非病毒傳染性物質(zhì)的感染)的完全保護，但相對于未經(jīng)治療的個體可以導(dǎo)致病原體(如病毒)較低的滴度或減少的數(shù)量。在某些實施方式中，相對于未經(jīng)治療的個體，本發(fā)明的免疫原性制劑的施用導(dǎo)致0.5倍、l倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、或者1000倍或者更大程度的病原體滴度的降低。病原體滴度、數(shù)量或者總負荷減低的益處包括但不限于感染癥狀的嚴重程度降低和與感染相關(guān)的疾病或病癥期的長度縮短。在某些實施方式中，本發(fā)明的免疫原性制劑被用于在樸素個體中針對疾病(如感染)進行保護。在具體實施方式中，本發(fā)明的免疫原性抗體被用于針對流感病毒或者至少一種不是流感病毒的其它傳染性物質(zhì)引發(fā)的感染進行保護或者針對在樸素個體中感染相關(guān)的疾病或癥狀進行保護。在其它實施方式中，本發(fā)明的免疫原性制劑被用來針對NDV和/或至少一個其它傳染性物質(zhì)的傳染性物質(zhì)的非限定性例子是乳頭狀瘤病毒、皰滲病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV)、肝炎病毒、鼻病毒、呼吸性合胞病毒、NDV、細胞巨化病毒、腺病毒、梭菌屬、沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、弧菌屬、大腸桿菌、馬鏈球菌、肺炎支原體、肺炎克雷白桿菌、和綠膿假單胞菌、和剛果嗜皮菌或者原生動物如阿米巴蟲、疾原蟲或錐體蟲。本發(fā)明的免疫原性制劑的預(yù)防和、或治療效果部分基于獲得或者引發(fā)免疫應(yīng)答(如體液免疫應(yīng)答)。一方面，在個體或者其動物模型中(如，小鼠、大鼠或者犬科模型)，免疫原性制劑針對嵌合病毒抗原引發(fā)可檢測的抗體血清滴度?？贵w血清滴度可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)確定，如免疫分析法例如ELISA。在一實施方式中，抗體特異性地結(jié)合至少一個融合蛋白的抗原，即與傳染性物質(zhì)或疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原。在具體實施方式中，通過施用本發(fā)明的免疫原性制劑產(chǎn)生的抗體是中和抗體。在一實施方式中，本發(fā)明的嵌合病毒向個體或者其動物模型的施用導(dǎo)致特異性結(jié)合嵌合病毒骨架的抗原的抗體的血清滴度為約l微克/毫升、約2微克/毫升、約5微克/毫升、約6微克/毫升、約10微克/毫升、約15微克/毫升、約20微克/毫升、約25微克/毫升、約50微克/毫升、約75微克/毫升、約100微克/毫升、約125微克/毫升、約150微克/毫升、約175微克/毫升、約200微克/毫升、約225微克/毫升、約250微克/毫升、約275微克/毫升、或約300微克/毫升或更多。在其它實施方式中，本發(fā)明嵌合病毒向個體或者其動物模型的施用導(dǎo)致特異性結(jié)合融合蛋白抗原(即與傳染性物質(zhì)或疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原)的抗體血清滴度為約1微克/毫升、約2微克/毫升、約5微克/毫升、約6微克/毫升、約10微克/毫升、約15微克/毫升、約20微克/毫升、約25微克/毫升、約50微克/毫升、約75微克/毫升、約100微克/毫升、約125微克/毫升、約150微克/毫升、約175微克/毫升、約200微克/毫升、約225微克/毫升、約250微克/毫升、約275徵克/毫升、或約300微克/毫升或更多。優(yōu)選地，在施用本發(fā)明的免疫原性制劑的第一劑后約20天(優(yōu)選25、30、35或40天)且不再施用任何其它劑量的制劑時實現(xiàn)這些抗體的約1微克/毫升、約2微克/毫升、約5微克/毫升、約6微克/毫升、約10微克/毫升、約15微克/毫升、約20微克/毫升、約25微克/毫升、約50微克/毫升、約75微克/毫升、約100微克/毫升、約125微克/毫升、約150微克/毫升、約175微克/毫升、約200微克/毫升、約225微克/毫升、約250微克/毫升、約275微克/毫升、或約300微克/毫升或更多的血清滴度?？梢栽趥€體或者動物模型中確定免疫應(yīng)答，該應(yīng)答隨后與在個體(如人)中預(yù)期的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)或外推出預(yù)期應(yīng)答。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中預(yù)防至少一種疾病(如流感感染和/或非流感的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所迷個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合流感病毒，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中預(yù)防至少一種疾病(如流感感染和/或非流感的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合流感病毒，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合融合蛋白的抗原(即與疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原)的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20^:克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量?？梢栽趥€體或者動物模型中確定免疫應(yīng)答，該應(yīng)答隨后與在個體(如人)中預(yù)期的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)或外推出預(yù)期應(yīng)答。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥類中預(yù)防禽流感感染和/或非禽流感的另一傳染性物質(zhì)的感染的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的本發(fā)明的嵌合鳥類病毒的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合禽流感病毒，該嵌合禽病毒包含含有異源蛋白序列的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒的抗原的抗體和/或特異性結(jié)合融合蛋白的抗原的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在一些實施方式中，施用給個體或動物模型的嵌合流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5xl06、107、5X107、108、5X108、lx109、5X109、lx1010、5X1010、lx1011、5Xl011、1012pfU。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中治療至少一種疾病(如流感感染和/或非流感的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合流感病毒，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中治療至少一種疾病(如流感感染和/或非流感的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合流感病毒，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合融合蛋白的抗原(即與疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原)的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60徵克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量?？梢栽趥€體或者動物模型中確定免疫應(yīng)答，該應(yīng)答隨后與在個體(如人)中預(yù)期的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)或外推出預(yù)期應(yīng)答。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥類中治療禽流感感染和/或非禽流感的另一傳染性物質(zhì)的感染的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的本發(fā)明的嵌合鳥類病毒的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合禽流感病毒，該嵌合禽病毒包含含有異源蛋白序列的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒的抗原的抗體和/或特異性結(jié)合融合蛋白的抗原的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在一些實施方式中，施用給個體或動物模型的嵌合流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5Xl06、107、5X107、108、5X108、lx109、5Xl09、lx1010、5X1010、lx1011、5Xl011、10>。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中控制和/或緩解至少一種疾病(如流感感染和/或非流感的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合流感病毒，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中控制和/或緩解至少一種疾病(如流感感染和/或非流感的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合流感病毒，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合融合蛋白的抗原(即與疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原)的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量?？梢栽趥€體或者動物模型中確定免疫應(yīng)答，該應(yīng)答隨后與在個體(如人)中預(yù)期的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)或外推出預(yù)期應(yīng)答。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥類中控制和/或緩解禽流感感染和/或非禽流感的另一傳染性物質(zhì)的感染的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的本發(fā)明的嵌合鳥類病毒的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合禽流感病毒，該嵌合禽病毒包含含有異源蛋白序列的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒的抗原的抗體和/或特異性結(jié)合融合蛋白的抗原的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在一些實施方式中，施用給個體或動物模型的嵌合流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5Xl05、106、5X106、107、5X107、108、5Xl08、lx109、5Xl09、lx1010、5X1010、lx1011、5X1011、1012pfii。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中預(yù)防至少一種疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中預(yù)防至少一種疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合融合蛋白的抗原(即與疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原)的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。可以在個體或者動物模型中確定免疫應(yīng)答，該應(yīng)答隨后與在個體(如人)中預(yù)期的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)或外推出預(yù)期應(yīng)答。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥類中預(yù)防NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染的方法，該方法包含對所迷個體施用第一劑有效量的本發(fā)明的嵌合病毒的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV，該嵌合NDV包含含有異源蛋白序列的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒的抗原的抗體和/或特異性結(jié)合融合蛋白的抗原的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在一些實施方式中，施用給個體或動物模型的嵌合流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5X106、107、5X107、108、5Xl08、lx109、5X109、lxl010、5X1010、lx1011、5X1011、1012pfti。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中治療至少一種疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所迷個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中治療至少一種疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合融合蛋白的抗原(即與疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原)的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量?？梢栽趥€體或者動物模型中確定免疫應(yīng)答，該應(yīng)答隨后與在個體(如人)中預(yù)期的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)或外推出預(yù)期應(yīng)答。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥類中治療NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的本發(fā)明的嵌合病毒的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV,該嵌合NDV包含含有異源蛋白序列的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒的抗原的抗體和/或特異性結(jié)合融合蛋白的抗原的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在一些實施方式中，施用給個體或動物模型的嵌合流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5X106、107、5X107、108、5Xl08、lx109、5X109、lx1010、5X1010、lx1011、5X1011、1012pfli。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中控制和/或緩解至少一種疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV，該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40徵克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100孩t克/毫升或者更多的量。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中控制和/或緩解至少一種疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV,該嵌合病毒包含異源序列(如疾病抗原)的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合融合蛋白的抗原(即與疾病相關(guān)的引入蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原)的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約IO微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量?？梢栽趥€體或者動物模型中確定免疫應(yīng)答，該應(yīng)答隨后與在個體(如人)中預(yù)期的應(yīng)答相關(guān)聯(lián)或外推出預(yù)期應(yīng)答。在一實施方式中，本發(fā)明提供了在鳥類中控制和/或緩解NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染的方法，該方法包含對所述個體施用第一劑有效量的本發(fā)明的嵌合病毒的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV，該嵌合NDV包含含有異源蛋白序列的融合蛋白，其中該有效量是導(dǎo)致免疫特異性結(jié)合嵌合病毒的抗原的抗體和/或特異性結(jié)合融合蛋白的抗原的抗體的血清滴度在首次施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天且在任何后繼施用前達到約10微克/毫升、約20微克/毫升、約30微克/毫升、約40微克/毫升、約50微克/毫升、約60微克/毫升、約70微克/毫升、約80微克/毫升、約100微克/毫升或者更多的量。在一些實施方式中，施用給個體或動物模型的嵌合流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5Xl06、107、5X107、108、5X108、lx109、5X109、lx1010、5Xl010、lxl011、5X1011、1012pfU。本發(fā)明還提供了預(yù)防、治療和/或控制至少一種疾病的方法，該方法包含對所述個體施用有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合流感病毒，其中該有效量是導(dǎo)致相比于沒有施用本發(fā)明的免疫原性制劑的個體而言致死率降低、入院率降低、疾病嚴重程度降低和/或疾病臨床癥狀減輕的量。在某些實施方式中，該個體是人。在一些實施方式中，施用給個體的嵌合流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5X106、107、5X107、108、5X108、lx109、5X109、"1010、5x1010、lx1011、5X1011、10'2pfU。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中(優(yōu)選鳥類)預(yù)防、治療和/或控制至少一種疾病(如禽流感感染和/或非禽流感的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所迷個體施用有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合禽流感病毒，其中該有效量是導(dǎo)致相比于沒有施用本發(fā)明的免疫原性制劑的個體而言傳染性物質(zhì)的滴度或數(shù)量減少、致死率降低、入院率降低、感染嚴重程度降低和/或感染臨床癥狀減輕的量。在一些實施方式中，施用給個體的嵌合禽流感病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5X106、107、5X107、108、5Xl08、lx109、5x109、lx1010、5X1010、lx1011、5X1011、1012pfU。在某些實施方式中，施用&n劑染性物質(zhì)的復(fù)制減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、或者80%或者更多，如使用本領(lǐng)域熟知的或者本文例舉的任何方法(如，病毒滴度的測定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天測定的。在其它實施方式中，施用本發(fā)明的免疫原性制劑導(dǎo)致相對于未施用本發(fā)明免疫原性制劑的個體而言傳染性物質(zhì)的復(fù)制或傳染性物質(zhì)的負荷減少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或IOO倍，如使用本領(lǐng)域熟知的或者本文例舉的任何方法(如，病毒滴度或細菌負荷和/或濃度的測定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天測定的。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了在個體中(優(yōu)選鳥類)預(yù)防、治療和/或控制至少一種疾病(如NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)的感染)的方法，該方法包含對所述個體施用有效量的免疫原性制劑，該制劑包含本發(fā)明的嵌合NDV病毒，其中該有效量是導(dǎo)致相比于沒有施用本發(fā)明的免疫原性制劑的個體而言傳染性物質(zhì)的滴度或數(shù)量減少、致死率降低、入院率降低、感染嚴重程度降低和/或感染臨床癥狀減輕的量。在一些實施方式中，施用給個體的嵌合NDV病毒的劑量是102、5xl02、103、5X103、104、5Xl04、105、5X105、106、5X106、107、5X107、108、5X108、lx109、5Xl09、lxl01G、5X101G、lx1011、5X1011、1012pfU。在某些實施方式中，施用本發(fā)物質(zhì)的復(fù)制減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、或者80%或者更多，如使用本領(lǐng)域熟知的或者本文例舉的任何方法(如，病毒滴度的測定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天測定的。在其它實施方式中，施用本發(fā)明的免疫原性制劑導(dǎo)致相對于未施用本發(fā)明免疫原性制劑的個體而言傳染性物質(zhì)的復(fù)制或傳染性物質(zhì)的負荷減少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100倍，如使用本領(lǐng)域熟知的或者本文例舉的任何方法(如，病毒滴度的測定)在所述施用后2天、5天、10天、15天、20天或者優(yōu)選30天測定的。將有效治療、預(yù)防和/或緩解特定疾病(如病毒感染)的本發(fā)明免疫原性制劑的量將取決于疾病的特性，且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測定。此外，體外分析可任選地用來幫助確定最佳劑量范圍。將被用于制劑的精確劑量還取決于給藥方式，感染或者不適的嚴重度，且應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個個體的狀況決定。然而，合適的給藥劑量范圍一般約為102、5xl02、103、5X103、104、5X104、105、5X105、106、5X106、107、5X107、108、5Xl08、lxl09、5xl09、lxl010、5xl010、lx1011、5X10"或1012pfli,而最優(yōu)約為104到約1012,而且可以一次、兩次、三次或根據(jù)需要間隔地多次施用給個體。有效劑量可以根據(jù)體外或者動物模型試驗系統(tǒng)得到的劑量應(yīng)答曲線外推得到。在各種實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑或者本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體與一種或多種用于預(yù)防至少一種疾病(如流感感染和/或非流感病毒的另一傳染性物質(zhì)引起的感染)的其它治療(例如抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療)聯(lián)合施用給個體。在其它實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑或者本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體與一種或多種用于治療至少一種疾病(如流感感染和/或非流感病毒的另一傳染性物質(zhì)引起的感染)的其它治療(例如抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療)聯(lián)合施用給個體。在其它實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑或者本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體與一種或多種用于控制和/或緩解至少一種疾病(如流感感染和/或非流感病毒的另一傳染性物質(zhì)引起的感染)的其它治療(例如抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療)聯(lián)合施用給個體。在具體實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑或者本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體與一種或多種用于預(yù)防禽流感感染和/或非禽流感病毒的另一傳染性物質(zhì)引起的感染的其它治療(例如抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療)聯(lián)合施用給個體。在另一具體實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑或者本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體與一種或多種用于治療禽流感感染和/或非禽流感病毒的另一傳染性物質(zhì)引起的感染的其它治療(例如抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療)聯(lián)合施用給個體。在其它具體實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑或者本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體與一種或多種用于預(yù)防NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)引起的感染的其它治療(例如抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療)聯(lián)合施用給個體。在其它具體實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑或者本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體與一種或多種用于治療NDV感染和/或非NDV的另一傳染性物質(zhì)引起的感染的其它治療(例如抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療)聯(lián)合施用給個體。在某些實施方式中，施用該治療(如，預(yù)防性或者治療性試劑)的間隔少于5分鐘、少于30分鐘、l小時、大約1小時、約l小時到約2小時、約2小時到約3小時、約3小時到約4小時、約4小時到約5小時、約5小時到約6小時、約6小時到約7小時、約7小時到約8小時、約8小時到約9小時、約9小時到約10小時、約10小時到約11小時、約11小時到約12小時、約12小時到約18小時、約18小時到約24小時、約24小時到約36小時、約36小時到約48小時、約48小時到約52小時、約52小時到約60小時、約60小時到約72小時、約72小時到約84小時、約84小時到約96小時、約96小時到約120小時。在優(yōu)選實施方式中，兩個或者多個治療在同一次患者診療中施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何抗病毒劑均可被用在本發(fā)明的制劑(如疫苗制劑)和方法中?？共《拘詣┑姆窍薅ㄐ岳影ㄒ种坪?或降低病毒與其受體結(jié)合、病毒整合入細胞內(nèi)、病毒的復(fù)制、病毒從細胞中的釋放的蛋白、多肽、肽段、融合蛋白抗體、核酸分子、有機分子、無機分子和小分子。特別地，4元病毒劑包括但不限于核苦類似物(如齊多夫定、三環(huán)奎烷胺、gangcyclovir、阿糖腺苷、皰滲凈、三氟丙溱和病毒唑)、膦甲酸、金剛烷胺、金剛乙胺、沙奎那韋、茚地那韋、利托那韋、a-干擾素和其它干擾素，和AZT。在具體實施方式中，抗病毒劑是對病毒抗原具有免疫特異性的免疫調(diào)節(jié)劑。本文所用的術(shù)語"病毒抗原"包括但不限于能夠誘發(fā)免疫應(yīng)答的任何病毒肽、多肽和蛋白(如HIVgpl20、HIVnef、RSVF糖蛋白、RSVG糖蛋白、流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素、HTLVtax、單純皰疹病毒糖蛋白類(如gB、gC、gD和gE)和乙肝表面抗原)。本發(fā)明可用于治療病毒感染疾病的抗體包括但不限于針對致病病毒抗原的抗體，作為舉例包括但不限于腺病毒(如哺乳動物腺病毒屬、禽類腺病毒屬)、皰滲病毒科(如單純皰滲病毒1、單純皰滲病毒2、單純皰滲病毒5、單純皰滲病毒6)、光滑病毒科(如光滑病毒、腸細菌相MS2、別光滑病毒)、痘病毒科(如脊推動物痘病毒亞科、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬、4欠體動物痘病毒屬、和昆蟲痘病毒屬)、乳多空病毒科(如多瘤病毒和乳頭瘤病毒)、副粘病毒科(如副粘病毒屬、副流感病毒1、運動病毒(如麻滲病毒)、腮、腺炎病毒屬(如腮腺炎病毒))、肺炎病毒科(如肺炎病毒屬、人類呼吸多核體病毒)、和多元肺炎病毒(如禽類肺炎病毒和人類多元肺炎病毒))、細小核糖核酸病毒(如腸道病毒、鼻病毒、肝病毒(如人類甲肝病毒)、心臟病毒、和?？谔阋卟《?、呼腸;瓜病毒科(如正呼腸瓜病毒屬、環(huán)狀病毒屬、輪狀病毒屬、質(zhì)型多角體病毒屬、矮縮病毒屬、水稻病毒屬、植物呼腸孤病毒屬)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(如哺乳動物B型逆轉(zhuǎn)錄病毒、哺乳動物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、禽類C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、D型逆轉(zhuǎn)錄病毒組、BLV-HTLV逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒屬(如人類免疫缺陷病毒1和人類免疫缺陷病毒2)、泡沫病毒屬)、黃病毒科(如丙肝病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒)、嗜肝DNA病毒科(如乙肝病毒)、披膜病毒科(如甲病毒(如油棉病毒)和風(fēng)滲病毒(如風(fēng)濕瘆病毒))、棒狀病毒科(如水皰病毒屬、狂犬病毒、彈狀病毒屬、短暫熱病毒屬、壞死棒狀病毒)、沙礫病毒科(如沙礫病毒、淋巴細胞性〗沐絡(luò)叢腦膜炎病毒、愛皮病毒和拉沙病毒)和冠狀病毒科(如冠狀病毒和念狀病毒)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于預(yù)防、治療、控制或者緩解細菌感染的任何的非限定性例子包括抑制或者降低細菌感染、抑制或者降低細菌的復(fù)制、抑制或者降低細菌向其它個體的傳播的蛋白、多肽、肽、融合蛋白、抗體、核酸分子、有機分子、無機分子和小分子。特別地，抗菌劑的例子包括但不限于青霉素、頭孢菌素、亞胺培南、安曲南、萬古霉素、環(huán)絲氨酸、崔西桿菌素、氯霉素、紅霉素、氯林大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、托普霉素、慶大霉素、氨丁卡霉素、卡那霉素、新霉素、奇霉素、甲氧千氨嗜啶、氟哌酸、利福平、多粘菌素、兩性霉素B、制真菌素、酮康唑、異煙肼、甲硝噠唑和戊烷脒。抗菌治療劑及其劑量、給藥途徑和推薦用法是本領(lǐng)域已知的且已描述于例如Physician'sDeskReference(第56版，2002)的文獻中。關(guān)于呼吸感染和抗菌治療的額外信息可獲自CecilTextbookofMedicine(第18版，1988)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于預(yù)防、控制、治療和/或緩解真菌感染或其一或多種癥狀(例如真菌呼吸感染)的抗真菌劑和治療劑可用在本發(fā)明的組合物(如免疫原性制劑)和方法中?？拐婢鷦┑姆窍薅ㄐ岳影ㄒ种坪?或降低真菌感染、抑制和/或降低真菌的復(fù)制、或抑制和/或降低真菌向其它個體傳播的蛋白、多肽、肽、融合蛋白、抗體、核酸分子、有機分子、無機分子和小分子?？拐婢鷦┑木唧w例子包括但不限于唑類藥物(如雙氯苯咪唑、酮康唑(NIZORAL)、卡泊芬凈醋酸(CANCIDAS)、咪唑、三唑(如氟康唑(DIFLUCAN))、和伊曲康唑(SPORANOX⑧))、聚烯(如制霉菌素、兩性霉素B(FUNGIZONE)、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合體("ABLC")(ABELCET)、兩性霉素B膠體分散體("ABCD")(AMPHOTEC)、脂質(zhì)體兩性霉素B(AMBISONE⑧)、碘酸鉀(KI⑧)、嘧啶(如氟胞嗜啶(ANCOBON⑧))、和伏立康唑(VFEND⑧)。抗真菌治療劑及其劑量、給藥途徑和推薦用法是本領(lǐng)域已知的且已描迷于例如Dodds等，2000Pharmacotherapy20(11)1335-1355;Physician'sDeskReference(第57版，2003)和MerkManualofDiagnosisandTherapy(第17版，1999)的文獻中。在某些實施方式中，將本發(fā)明的免疫原性制劑作為單一劑量施用給個體，在3到6周后施用第二劑。根據(jù)這些實施方式，在二次接種后間隔6到12個月對個體進行加強接種。在一實施方式中，個體是哺乳動物。在另一實施方式中，個體是鳥類。在另一實施方式中，個體是人類。在更優(yōu)選的實施方式中，個體是存在接觸NDV或者禽流感病毒感染風(fēng)險的雞。在某些實施方式中，本發(fā)明的相同的免疫原性制劑的施用可以重復(fù)，施用可間隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月、或者至少6個月。5.6生物學(xué)分析5.6.1體外分析本發(fā)明的嵌合病毒的生長可以通過本領(lǐng)域已知的或者在此說明的任何方法評估(如在細胞培養(yǎng)中(如雞胚腎細胞培養(yǎng)物或者雞胚成纖維細胞(CEF)培養(yǎng)物))。本發(fā)明的減毒嵌合病毒的生長可以在IFN完全型和IFN缺陷型細胞中評估。在具體實施方式中，CEF細胞以MOI為0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1、或1和10、或者MOI為0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10被感染并在補充了5%尿囊液的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。病毒滴度如下文所述通過CEF細胞中的HA菌斑在上清液中測定。可以評價其中的病毒滴度的其它細胞包括但不限于EFK-2細胞、Vero細胞、原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)、H292人上皮細胞系和Hela細胞。融合蛋白向本發(fā)明的嵌合病毒病毒顆粒的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域已知的或本文說明的任何方法評價(如，在細胞培養(yǎng)物中、動物模型中或在胚卵病毒培養(yǎng)物中)。例如，來自胚卵尿嚢液細胞培養(yǎng)物的病毒顆?？梢酝ㄟ^蔗糖墊離心純化且隨后使用本領(lǐng)域已知的方法通過Western印跡法分析融合蛋白的表達。病毒分析包括使用本領(lǐng)域熟知的方法體外測量培養(yǎng)細胞中病毒復(fù)制的改變(如通過斑塊形成測定)或者病毒蛋白的生成(如通過Western印跡法分析測定)或者病毒RNA的生成(通過RT-PCR或者Northern印跡法分析測定)。本發(fā)明的嵌合病毒生成的抗體或其片段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法來表征(如，ELISA、表面等離子共振展示(BIAcore)、Western印跡法、免疫熒光、免疫染色和/或微量中和法分析)。尤其是，可分析本發(fā)明的嵌合病毒生成的抗體或其片段免疫特異結(jié)合嵌合骨架病毒抗原或者融合蛋白的抗原或者抗原決定簇的能力。這樣的分析可以在溶液中(如，Houghten,1992,Bio/Techniques13:412-421)、微珠上(Lam,1991，Nature354:82-84)、芯片上(Fodor,1993，Nature364:555-556)、細菌上(美國專利號5,223,409)、芽孢上(美國專利號5，571，698;5,403,484;和5,223,409)、質(zhì)粒上(Cull等，1992,Pro"Natl.Acad.Sci.USA89:1865-1869)或喧菌體上(Scott和Smith,1990，Science249:386-390;Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-6382;和Felici，1991，J.Mol.Biol.222:301-310)(各文獻均完整引入本文作為參考)。隨后可對已被鑒定為免疫特異結(jié)合嵌合骨架病毒抗原或者融合蛋白的抗原或抗原決定簇的本發(fā)明的嵌合病毒生成的抗體或者其片段進一步分析其與所迷抗原的特異性?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法分析本發(fā)明的嵌合病毒生成的抗體或其片段與本發(fā)明的嵌合病毒抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或抗原決定簇或融合蛋白的抗原或者抗原決定簇(如疾病相關(guān)抗原))的免疫特異結(jié)合和與其它抗原的交叉反應(yīng)性?？捎糜诜治雒庖咛禺惤Y(jié)合和交叉反應(yīng)性的免疫分析包括但不限于，竟?fàn)幒头蔷範(fàn)幏治鱿到y(tǒng)，其采用如Western印跡法、放射性免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、"三明治"免疫分析、免疫沉淀法、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散分析、凝集分析、補體結(jié)合分析、免疫放射分析、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析等技術(shù)。這些分析是常規(guī)的且是本領(lǐng)域已知的(參見如，Ausubel等編，1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1巻，JohnWiley&Sons公司，NewYork,其被完整引入本文作為參考)。示例免疫分析將在下文簡要說明(但并非意圖以任何方式進行限制)。免疫沉淀流程一般包括在補充了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(如EDTA、PMSF、抑肽酶、礬酸鈉)的裂解緩沖液例如RIPA緩沖液(l^。NP-40或TritonX-IOO、1%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS、0.15MNaCl、0.01M磷酸鈉、pH7.2、1%抑肽酶)中裂解細胞群，將感興趣的抗體加入細胞裂解液中，在40。C放置一段時間(如1到4小時)，將蛋白A和/或蛋白G瓊脂糖珠加入細胞裂解液中，在40。C下放置約一個小時或者更久，洗滌裂解緩沖液中的珠子并將珠子重懸于SDS/樣品緩沖液中。感興趣的抗體免疫沉淀特定抗原的能力可以通過如，Western印跡分析評價。關(guān)于可被調(diào)整從而提高抗體與抗原的結(jié)合并降低背景的參數(shù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)熟知(如用瓊脂糖珠預(yù)清洗細胞裂解液)。關(guān)于免疫沉淀流程的進一步討論參見如Ausubel等編，1994,CurrentProtocolsinMolecular'Biology,第1巻,JohnWiley&Sons公司，NewYork的10.16.1節(jié)。Western印跡分析通常包含準(zhǔn)備蛋白樣品，在聚丙烯酰胺凝膠中進行蛋白質(zhì)樣品的電泳(如8G/o-20n/oSDS-PAGE，取決于抗原的分子量)，將蛋白樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上例如硝化纖維素、PVDF尼龍，將膜放置在封閉液中(如含有3%BSA或者無脂牛奶的PBS)，用洗滌緩沖液(如PBS-Tween20)洗滌膜，將膜與稀釋在封閉緩沖液中的一抗(感興趣的抗體)共同放置，用洗滌緩沖液洗滌膜，將膜與稀釋在封閉緩沖液中的二抗(該抗體識別一抗，如抗人抗體)共同放置，該二抗偶聯(lián)酶底物(如辣根過氧物酶或者堿性磷酸酶)或者放射性分子(如"P或者125I),用洗滌緩沖液洗膜，然后檢測抗原的存在。關(guān)于可被調(diào)整從而提高可檢測信號并降低背景噪音的參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)熟知。關(guān)于1Western印跡法的進一步討論參見如，Ausubel等編，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1巻，JohnWiley&Sons公司，NewYork的10.8.1節(jié)。ELISA包括準(zhǔn)備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，將與可檢測化合物如酶底物(如辣4艮過氧物酶或者堿性磷酸酶)偶聯(lián)的感興趣的抗體加入到孔中并放置一段時間，檢測抗原的存在。在ELISA中，感興趣的抗體并不必須與可檢測的化合物偶聯(lián)；取而代之，可將與可檢測化合物偶聯(lián)的二抗(該抗體識別感興趣的抗體)加入到孔上。此外，代替用抗原包被孔，也可用抗體包被孔。這種情況下，可在向包被孔中加入感興趣的抗原之后，加入與可檢測的化合物偶聯(lián)的二抗。關(guān)于可被調(diào)整以增強可檢測的信號的參數(shù)以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其它變量，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)熟知。在優(yōu)選實施方式中，可通過用2微克/毫升的rhu-IL-9的PBS過夜包被高結(jié)合96孔微量滴定板(Costar)來進行ELISA。在用PBS三次洗滌后，在25。C將板與Fab三倍系列稀釋液共同放置l小時。在用PBS再次洗脫三次后，加入l毫克/毫升抗人K堿性磷酸酶偶聯(lián)物，然后將板在25。C放置1小時。在PBST三次洗滌后，50微升/AMP/PPMP底物中測定堿性磷酸酶活性。終止反應(yīng)并用VMAX酶標(biāo)儀測定60nm的吸光率。關(guān)于ELISA的進一步討論參見如Ausubel等編，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1巻，JohnWiley&Sons公司，NewYork的11.2.1節(jié)?？梢酝ㄟ^竟?fàn)幮越Y(jié)合分析確定抗體對抗原的結(jié)合親和力還有抗體抗原相互作用的解離率。竟?fàn)幮越Y(jié)合分析的一個例子是放射免疫分析，包含在存在遞增量的未標(biāo)記抗原的情況下，將標(biāo)記的抗原(如311或1251)與感興趣的抗體共同放置，并檢測與標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體?？梢酝ㄟ^scatchard作圖分析的數(shù)據(jù)確定本發(fā)明抗體或者其片段與IL-9多肽的親和力和結(jié)合的解離率。與二抗的竟?fàn)幰部梢杂梅派涿庖叻治龇y定。在該例中，在遞增量的未標(biāo)記的二抗的存在下，將IL-9多肽與偶聯(lián)了標(biāo)記化合物(如311或者1251)的本發(fā)明的抗體共同放置。在優(yōu)選實施方式中，BIAcore動力學(xué)分析被用來測定本發(fā)明抗體與本發(fā)明嵌合病毒抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇或者融合蛋白的抗原或者抗原決定簇(如疾病相關(guān)抗原))的結(jié)合與解離率。BIAcore動力學(xué)分析包含分析肽(包含感興趣的抗原)與表面上固定了本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體的芯片的結(jié)合和解離。典型的BIAcore動力分析包括在感受器芯片表面注射250微升不同濃度的抗體試劑(mAb,Fab)的含有0.005%Tween-20的HBS緩沖液，在該芯片表面上已經(jīng)固定了抗原。流速維持在恒定的75微升/分。在15分鐘或如果必要，在更長的時間內(nèi)收集解離數(shù)據(jù)。在每次注射/解離循環(huán)后，使用簡單的1分鐘脈沖稀酸(一般為10-100mM鹽酸)將結(jié)合的mAb從抗原表面洗脫，盡管條件允許的話，可以使用其它再生劑。更具體地，為了測定結(jié)合率k結(jié)合和解離率k解離，通過使用標(biāo)準(zhǔn)胺類結(jié)合化學(xué)(即EDC/NHS方法(EDC-N-二乙基氨丙基)-碳二亞胺)將包含抗原的多肽直接固定在感受器芯片表面上。簡單地說，制備5-100nM的包含抗原的多肽的10mMNaOAc溶液，pH4或pH5，并使其通過EDC/NHS活化表面直到大約30-50RU量的抗原被固定。在此之后，通過注射lMEt-NH2將未反應(yīng)的活性酯"滅活"。在相同固定條件下制備沒有任何抗原的空白表面用于對照。一旦制備了適當(dāng)?shù)谋砻?，在HBS/Tween-20中制備每個抗體試劑的合適的稀釋系列，并使其通過以串聯(lián)方式連接的抗原和對照細胞表面。制備的抗體濃度的范圍是可變的，取決于估計的平衡結(jié)合常數(shù)KD。如上所述，在每次注射/解離循環(huán)后，使用合適的再生劑去除結(jié)合的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)分析本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體或者其片段抑制本發(fā)明的嵌合病毒的抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇或者融合蛋白的抗原或者抗原決定簇(如疾病相關(guān)抗原))與宿主細胞受體結(jié)合的能力。例如，可在本發(fā)明嵌合病毒產(chǎn)生的抗體或者其片段的存在或不存在的情況下將表達已知與所迷抗原結(jié)合的受體的細胞與抗原接觸，并通過例如流式細胞計數(shù)法或者閃爍分析測定抗體或其片段抑制抗原結(jié)合的能力。1251)或者熒光標(biāo)簽(如異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺)標(biāo)記，從而可以檢測抗原和細胞受體之間的相互作用?；蛘?，可以在無細胞系統(tǒng)中測定本發(fā)明的嵌合病毒產(chǎn)生的抗體或者其片段抑制本發(fā)明的嵌合病毒的抗原(如嵌合病毒骨架的抗原或者抗原決定簇或者融合蛋白的抗原或者抗原決定簇(如疾病相關(guān)抗原))與受體結(jié)合的能抗體片段抑制多肽與細胞受體結(jié)合的能力。優(yōu)選地，抗體或抗體片段被固定在固體支持物上并多肽用可檢測化合物標(biāo)記?；蛘?，包含抗原的多肽被固定在固體支持物上且抗體或其片段被可檢測化合物標(biāo)記。5.6.2體內(nèi)分析本發(fā)明嵌合病毒的毒力可以在個體，尤其是禽類或者其動物模型中進行評估。在一個例子中，其在病毒感染動物模型中引發(fā)肺部損傷和造成感染的能力與野生型病毒和擬病毒相比較。肺部損傷可以根據(jù)通過肉眼觀察評估為健康肺葉的百分比。在感染后5天通過靜^c內(nèi)施用戊巴比妥對動物施行安樂死術(shù)，并將它們的肺完全移除。肉眼估計各肺葉表面被宏觀損傷影響的百分比。將百分比平均以得到每個動物7個肺葉的平均值。在其它試驗中，檢測鼻液以確定病毒負荷或滴度。在驗尸過程中獲取鼻液來確定感染后的病毒負荷。對于組織樣品的病毒定量，將組織樣品在磷酸緩沖鹽(PBS)中勻漿化，澄清勻漿稀釋液在37。C下吸附在單層細胞(如CEF或者MDCK細胞)上1小時。隨后用包含0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.01%DEAE-葡聚糖、0.1。/。NaHC03和1%瓊脂的最小必需培養(yǎng)基溶液覆蓋被感染的單層。將板培養(yǎng)2到3天直到可以看見空斑。如下進行組織培養(yǎng)感染劑量(TCID)分析以測定來自PR8-感染樣品的病毒。將96孔板中的匯合單細胞層(如CEF或者MDCK細胞)與澄清組織勻漿的對數(shù)稀釋液在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種后2到3天，通過血凝素分析(HA分析)評估來自各孔的0.05ml等份樣品的病毒生長。在其它的分析中，在感染后進行組織病理學(xué)評估。可以檢查鼻甲和氣管的上皮變化和上皮下炎癥?？梢詸z查肺在大、中、小以及末端支氣管中的支氣管上皮變化和支氣管周邊炎癥。也可以評估肺泡的炎癥變化。中支氣管分為如下0到3+級別O(正常內(nèi)襯中到高圓柱形帶有纖毛尖邊和基礎(chǔ)假復(fù)層核的上皮細胞，最小化炎癥)；l+(上皮層柱狀且大體輪廓平滑伴隨輕微的增生；在很多細胞中纖毛仍可見)；2+(上皮層發(fā)生從減弱到顯著增生的顯著改變；細胞排列錯亂和細胞層輪廓內(nèi)腔邊界不規(guī)則)；3+(上皮層顯著被破壞且排列錯亂，在內(nèi)腔有明顯壞死細胞；一些支氣管減弱而其它的則顯著的反應(yīng)性增生)。氣管被分為如下0到2.5+等級O(正常內(nèi)襯著中到高圓柱形帶有纖毛尖邊和基礎(chǔ)假復(fù)層核的上皮細胞。細胞質(zhì)明顯位于頂端邊界和細胞核間。偶爾有鱗片狀細胞的小病灶)；l+(上皮層呈病灶性的鱗狀化生)；2+(大量上皮層呈彌散的鱗狀化生，局部纖毛明顯)；2.5+(彌散的鱗狀化生伴隨極少的可見的纖毛)。使過病毒特異性單克隆抗體(如，NP-、N-或者HN-特異性單克隆抗體)進200680052285.7說明書第93/116頁行病毒免疫組織化學(xué)。染色分為以下0到3+級別O(無感染的細胞)；0.5+(極少感染的細胞)；l+(極少感染的細胞，為大范圍分開的個體細胞)；1.5+(極少感染的細胞，為大范圍分開的單個細胞和小細胞蔟)；2+(中度數(shù)量的感染細胞，通常影響支氣管內(nèi)襯的部分上皮層或肺泡的小葉下小病灶的相鄰細胞簇)；3+(很多感染細胞，影響大部分支氣管內(nèi)上皮層或者廣泛分布在肺泡的小葉下大病灶)。5.6.3病毒滴度測定通過將嵌合病毒系列稀釋液接種到細胞培養(yǎng)物(如，CEF或MDCK)、雞胚卵或者活體動物(如禽類)中來測定病毒滴度。在接種病毒一段特定時間后，4吏用標(biāo)準(zhǔn)方法將病毒分離。HA分析可以在V底96孔板中進行。每個樣本在PBS中的系列兩倍稀釋液與相同體積0.5%的雞紅血球在PBS中的懸浮液一起放置在冰上1小時。陽性孔包含紅細胞的貼壁均一層；陰性孔包含非貼壁沉淀?？赏ㄟ^對病毒上清液進行PCR(Quinn和Trevor,1997;Morgan等，1990)、血凝素分析、組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)或者卵感染劑量(EID50)來進行病毒滴度的物理定量。5.6.4毒性研究可以在在細胞培養(yǎng)物或者實驗動物中通過使用標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)步驟確定本發(fā)明的組合物(如免疫原性制劑)的毒性和/或功效，例如確定LD50(50。/q群體致死的劑量)和ED50(在50%群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果的劑量比即治療指數(shù)，其可以表示為LD50/ED50之比。優(yōu)選表現(xiàn)出大治療指數(shù)的藥劑。盡管有毒副作用的治療劑可被使用，應(yīng)當(dāng)小心設(shè)計將這樣的試劑耙向至102受感染組織的位點的給藥系統(tǒng)以將對未感染細胞的潛在影響最小化，因此減少副作用。通過細胞培養(yǎng)分析和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用來計算用于個體的治療劑的劑量范圍。這些試劑的劑量優(yōu)選地在包含ED50而具有極少或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。根據(jù)使用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在此范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明方法中使用的任何治療劑，治療有效劑量都可以首先從細胞培養(yǎng)物分析中估測?？梢栽趧游锬Ｐ椭信渲苿┝恳垣@得包含細胞培養(yǎng)中測定的IC50(即實現(xiàn)對癥狀的最大半數(shù)抑制的待測化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。此信息可以用來更精確地測定個體(如馬)中的有用劑量。血漿水平可以通過如高效液相色鐠法測量。(如疫苗制劑)和聯(lián)合治療對病毒感染或與之相關(guān)的病癥或癥狀、非病毒感染的感染或與之相關(guān)的病癥或癥狀，或在將本發(fā)明的減毒嵌合病毒用作載體以5.7本發(fā)明的具體實施例方式本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含融合蛋白，該蛋白具有(i)包舍異源肽序列的胞外結(jié)構(gòu)域，該異源序列包含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或者疾病相關(guān)抗原的至少一個抗原決定蔟，其融合到(ii)由流感病毒的必需基因編碼的糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中該融合蛋白結(jié)合進禽流感病毒，在該禽流感病毒中必需基因的功能由融合蛋白或者該禽流感病毒的天然糖蛋白提供。在某些實施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它實施方式中，流感病毒的必需基因是神經(jīng)氨酸酶(NA)基因。在某些實施方式中，嵌合禽流感病毒是減毒的。^f艮據(jù)這些實施方式，可通過NS1基因中的突變將嵌合禽流感病毒減毒。本發(fā)明拔:供了嵌合禽流感病毒，包含融合蛋白，該蛋白具有(i)NDVHN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，其融合到(ii)流感病毒NA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中該融合蛋白結(jié)合進禽流感病毒，在該禽流感病毒中NA蛋白的功能由融合蛋白或者禽流感病毒天然糖蛋白提供。在某些實施方式中，嵌合禽流感病毒是減毒的。根據(jù)這些實施方式，可通過NS1基因中的突變將嵌合禽流感病毒減毒。本發(fā)明提供了減毒嵌合流感病毒，包含融合蛋白，該蛋白具有(i)包含異源肽序列的胞外結(jié)構(gòu)域，該異源序列包含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或者與非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原的疾病湘關(guān)的抗原的至少一個抗原決定簇，其融合到(ii)由流感病毒的必需基因編碼的糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中該融合蛋白結(jié)合進減毒流感病毒，在該減毒流感病毒中必需基因的功能由融合蛋白或者該減毒流感病毒的天然糖蛋白提供。在某些實施方式中，流感病毒的必需基因是血凝素(HA)基因。在其它實施方式中，流感病毒的必需基因是神經(jīng)氨酸酶(NA)基因。本發(fā)明^供了嵌合NDV，包含融合蛋白，該蛋白具有(i)包含異源肽序列的胞外結(jié)構(gòu)域，該異源序列包含非NDV的傳染性物質(zhì)的保護性抗原或者疾病相關(guān)抗原的至少一個抗原決定簇，其融合到(ii)由NDV的必需基因編碼的糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中該融合蛋白結(jié)合進NDV，在NDV中必需基因的功能由融合蛋白或者NDV天然糖蛋白提供。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的包裝的流感病毒NA片段，其中NA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的通過N末端錨定的神經(jīng)氨酸酶抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，從而神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含編碼血凝素融合蛋白的包裝的流感病毒HA片段，其中HA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼HA胞外結(jié)構(gòu)域的核普酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的通過C末端錨定的血凝素抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，從而血凝素融合蛋白被表達并+結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含包裝的雙順反子流感病毒HA片段，其包含(a)編碼禽流感病毒血凝素蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼血凝素融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼血凝素胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼異源肽序列的核苷酸替代，該異源肽序列包含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或者疾病相關(guān)抗原的通過C末端錨定的至少一個抗原決定簇，由此流感血凝素和融合蛋白均被表達并結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含包裝的雙順反子流感病毒NA片段，其包含(a)編碼禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼異源肽序列的核苷酸替代，該異源肽序列包含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或者疾病相關(guān)抗原的通過N末端錨定的至少一個抗原決定簇，由此流感神經(jīng)氨酸酶和融合蛋白均被表達并結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了嵌合禽流感病毒，包含編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的包裝的流感病毒NA片段，其中NA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼NDV的HN抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，由此神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并結(jié)合進嵌合禽流感病毒中。在某些實施方式中，209-211和213-217段中的嵌合禽流感病毒包含封裝的NS1基因片段，其編碼經(jīng)修飾的NS1蛋白，該蛋白減弱病毒的細胞干擾素拮抗活性。在其它實施方式中，209-211和213-217段中的嵌合禽流感病毒包含HA片段，該片段包含經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點的開放閱讀框。在其它實施方式中，215段中的嵌合禽流感病毒的第一開放閱讀框被修飾以去除血凝素多元切割位點。本發(fā)明提供了編碼213和216段中NA片段的重組核酸分子(如重組DNA分子)。本發(fā)明還提供了編碼214到215段中HA片段的重組核酸分子(如重組DNA分子)。本發(fā)明提供了209-211和213-218段中的嵌合禽流感病毒的增殖方法，包括在胚卵或者對禽流感病毒易感的細胞系中培養(yǎng)嵌合禽流感病毒。本發(fā)明還提供了制備免疫原性制劑的方法，該方法包括(a)在胚卵或者對禽流感病毒易感的細胞系中增殖209-211和213-218段中的嵌合禽流感病毒；和(b)收集后代病毒，其中病毒生長到足夠量并在足以使病毒不被污染的條件下生長，由此后代病毒適用于免疫原性制劑，如疫苗制劑。本發(fā)明提供了減毒嵌合流感病毒，包含編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的包裝的流感病毒NA片段，其中NA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的通過N末端錨定的神經(jīng)氨酸酶抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，由此神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并結(jié)合進減毒嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了減毒嵌合禽流感病毒，其包含編碼血凝素融合蛋白的包裝的流感病毒HA片段，其中HA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼HA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的通過C末端錨定的血凝素抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸所替代，由此血凝素融合蛋白被表達并結(jié)合進減毒嵌合禽流感病毒中。本發(fā)明提供了減毒嵌合禽流感病毒，包含封裝的雙順反子流感病毒HA片段，其包含(a)編碼禽流感病毒血凝素蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼血凝素融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼血凝素胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼異源肽序列的核苷酸替代，該異源肽序列包含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或者疾病相關(guān)抗原的抗原決定簇，所述融合蛋白通過C末端錨定，由此流感血凝素和融合蛋白均凈皮表達并結(jié)合進減毒嵌合流感病毒中。本發(fā)明提供了減毒嵌合流感病毒，包含包裝的雙順反子流感病毒NA片段，其包含(a)編碼禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白的第一開放閱讀框，和(b)編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼異源蛋白的核苷酸替代，所迷蛋白包含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或者疾病相關(guān)抗原的抗原決定簇，所述融合蛋白通過N末端錯定，由此流感神經(jīng)氨酸酶和融合蛋白均被表達并結(jié)合進減毒嵌合流感病毒中。在某些實施方式中，221-224段中的減毒嵌合流感病毒包含包裝的NS1基因片段，該片段編碼經(jīng)修飾的NS1蛋白，該蛋白減弱病毒的細胞干擾素拮抗活性。在某些其它實施方式中，221-224段中的減毒嵌合流感病毒包含HA片段，其具有經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點的開放閱讀框。在其它實施方式中，223段中的減毒嵌合流感病毒的第一開放閱讀框被修飾以去除血凝素多元切割位點。本發(fā)明提供了編碼221和224段中NA片段的重組DNA分子。本發(fā)明還提供編碼222到223段中HA片段的重組DNA分子。本發(fā)明提供了221-225段中的減毒嵌合流感病毒的增殖方法，包括在胚卵或者對禽流感病毒易感的細胞系中培養(yǎng)減毒嵌合流感病毒。本發(fā)明還提供了制備免疫原性制劑的方法，該方法包括(a)在胚卵或?qū)η萘鞲胁《疽赘械募毎抵性鲋?11和221-225段中的減毒嵌合流感病毒；和(b)收集后代病毒，其中病毒生長到足夠量并在足以使病毒不被污染的條件下生長，由此后代病毒適用于免疫原性制劑，如疫苗制劑。本發(fā)明_提供了嵌合NDV，包含包裝的基因組，該基因組包含編碼F蛋白-融合蛋白的核苷酸序列，該蛋白具有F蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和由C末端錨定的非NDV的傳染性物質(zhì)抗原的胞外結(jié)構(gòu)域，由此F蛋白-融合蛋白被表達并被結(jié)合進嵌合NDV中。本發(fā)明提供了嵌合NDV,包含包裝的基因組，該基因組包含編碼HN融合蛋白的核苷酸序列，該蛋白具有HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和由N末端錨定的非NDV的傳染性物質(zhì)抗原的胞外結(jié)構(gòu)域，由此HN融合蛋白被表達并被結(jié)合進嵌合NDV中。在某些實施方式中，213和228-229段的嵌合NDV的基因組包含編碼F蛋白的核苷酸序列，由此除F蛋白-融合蛋白之外F蛋白被表達并結(jié)合進嵌合NDV。在其它實施方式中，編碼NDVF蛋白-融合蛋白的核苷酸序列替代編碼NDVF蛋白的核苷酸序列并且F蛋白-融合蛋白為228段的嵌合NDV提供F蛋白的功能。在某些實施方式中，212和223-224段的嵌合NDV的基因組包含編碼HN蛋白的核苷酸序列，由此HN蛋白被表達并結(jié)合入嵌合NDV。在其它實施方式中，編碼HN融合蛋白的核苷酸序列替代編碼NDVHN蛋白的核普酸序列并且HN融合蛋白為229段的嵌合NDV提供HN蛋白的功能。本發(fā)明提供了212和228-229段中的嵌合NDV的增殖方法，包括在胚卵或者對NDV易感的細胞系中培養(yǎng)嵌合NDV。本發(fā)明還提供了制備免疫原性制劑的方法，該方法包括(a)在胚卵或者細胞中增殖212和228-229段中的嵌合NDV;和(b)收集后代病毒，其中病毒生長到足夠量并在足以使病毒不被污染的條件下生長，由此后代病毒適用于免疫原性制劑，如疫苗制劑。本發(fā)明提供了包含209-210、212-218和228-229段的嵌合病毒的胚卵。本發(fā)明還提供了包含209-210、212-218和228-229段嵌合病毒的細胞系。本發(fā)明還提供了包含209-210、212-218和228-229段嵌合病毒的免疫原性制劑。本發(fā)明提供了包含211和221-225段減毒嵌合病毒的胚卵。本發(fā)明還提供了包含211和221-225段減毒嵌合病毒的細胞系。本發(fā)明還^供了包含211和221-225段減毒嵌合病毒的免疫原性制劑。本發(fā)明提供了在鳥類中誘發(fā)對兩種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的209-210和213-218段中的嵌合禽流感病毒。本發(fā)明還提供了在鳥類中誘發(fā)對兩種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的212和228-229段中的嵌合NDV。本發(fā)明還^^供了在個體中誘發(fā)對兩種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含施用有效量的211和221-225段中的減毒嵌合流感病毒。在某些實施方式中，個體是人個體。在其它實施方式中，個體是非人的哺乳動物(如豬、馬、狗、貓或牛)。在其它實施方式中，個體是禽類個體。6.實施例6.1工程改造具有新城疫病毒抗原決定簇的嵌合禽流感病毒以下實施例描述了示例性嵌合禽流感病毒的制備。尤其是，該實施例描述了將禽流感病毒，流感A/越南/1203/04(H5Nl)工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進其病毒顆粒，該融合蛋白包含禽流感病毒NA蛋白的跨膜和胞質(zhì)域和NDVHN蛋白胞外結(jié)構(gòu)域。融合蛋白功能性地替代禽流感病毒NA蛋白。6.1.1材料和方法6.1.1.1質(zhì)粒構(gòu)建所有用于重組病毒的單純性質(zhì)粒補救(plasmid-onlyrescue)的質(zhì)粒構(gòu)建體均采用相同的策略進行克隆。使用包含Sapl限制性位點的引物通過PCT擴增病毒片段的全長cDNA，該限制性位點使得PCR產(chǎn)物可以插入pPolI-SapI-Rb質(zhì)粒的Sapl位點(Flandorfer等，2003,J.Virol.77:9116-9123;Nakaya等，2001，J.Virol.75:11868-11873;兩者均全文引入本文作為參考)。所有PCR插入片段的序列均經(jīng)過確認(MountSinaiDNA測序組，NY)，合適的話，PCRLaJolla，CA)進行修正。流感A/越南/1203/04(H5Nl)、流感A/WSN/33(WSN)和NDV的GenBank序列在表2中提供。表2.病毒片段的GenBank錄入號<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>6.1.1.2嵌合病毒片段的構(gòu)建使用本領(lǐng)域熟知的重組技術(shù)構(gòu)建編碼NDVBlHN胞外結(jié)構(gòu)域及流感A/WSN/33神經(jīng)氨酸酶(NA)胞內(nèi)尾巴(CT)和跨膜(TM)域的cDNA(A/越南/1203/04-A/WSN/33NA(CT+TMrNDVBlHN(胞外結(jié)構(gòu)域))。該構(gòu)建體包含WSNNAvRNA的3'非編碼區(qū)的19個核苷酸、編碼NA編碼區(qū)l-36位氨基酸(對應(yīng)于NA蛋白的胞內(nèi)尾巴和跨膜結(jié)構(gòu)域和NA胞外結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸)的核苷酸(108個核苷酸)、編碼NDVBlHN蛋白(HN胞外結(jié)構(gòu)域)的第51-568位氨基酸的核苷酸、兩個連續(xù)的終止密碼子、WSNNA閱讀框的157個非翻譯核苷酸及WSNvRNA的5'非編碼區(qū)(圖1)。6.1.1.3編碼嵌合H5N1-NDV的質(zhì)粒構(gòu)建體的構(gòu)建為了通過單純性質(zhì)粒補救的方法基于H5N1(宿主病毒)制備經(jīng)工程改造以帶有NDV表面糖蛋白的嵌合病毒，構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建體。選擇編碼表面糖蛋白NA的H5N1片段被包含編碼NA蛋白CT和TM結(jié)構(gòu)域及A/WSN/33的NA胞外結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸以及NDV-B1的HN蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的重組片段替代。融合蛋白A/越南/1203/04-A/WSN/33NA<CT+TM)-NDVBlHN(胞外結(jié)構(gòu)域)為嵌合禽流感病毒提供神經(jīng)氨酸酶活性。嵌合片段的圖示參見圖1。表2中所列H5N1的其它7個片段(NS、M、NP、HA、PA、PB1和PB2)被克隆進pPoll以分別生成pPollVN1203-NS、pPollVN1203-M、pPollVN1203-NP、pPollVN1203-HA、pPollVN1203畫PA、pPollVN1203-PBl和pPollVN1203-PB2。為確保H5N1嵌合病毒被減毒，改變H5N1HA編碼片段以將其緊鄰HA切割位點之前的天然多元氨基酸序列(H5N1HA編碼序列第10113-1039核苷酸)轉(zhuǎn)換成基于流感AH5的無毒禽類抹的一致序列。該區(qū)域的氨基酸序列由QREMEKKRG(SEQIDNO:ll;SEQIDNO:14第2-11位氨基酸)轉(zhuǎn)換為QRETRG(SEQIDNO:12;SEQIDNO:16第2-7位氨基酸)，將下劃線氨基酸用蘇氨酸替換(圓2)。為了將通過聚合酶滑脫(splippage)在該序列中再次引入腺苷殘基并因此將堿性氨基酸殘基引入HA切割位點的幾率最小化，進一步改變該區(qū)域使用的密碼子以降低腺苷殘基的數(shù)目。只有同義突變被引入無毒HA序列中(圖3)。生成的片段被克隆進pPoll質(zhì)粒，如前所迷產(chǎn)生pPollVN1203-HALO，該片段編碼改造過的HA糖蛋白，對應(yīng)于禽流感A低毒性抹。除PB1和PB2之外，H5N1片段編碼的基因產(chǎn)物和GeneBank序列相比未作改變。PB1和PB2序列因引入Sapl限制性位點而發(fā)生變化。PB1編碼序列第32位烏噤呤核苷酸非同義替代產(chǎn)生了賴氨酸到精氨酸的突變；PB2編碼序列第1393位胸腺嘧啶核苷酸非同義替代產(chǎn)生了脯氨酸到絲氨酸的突變。H5N1的所有基因產(chǎn)物在vRNA的第4位為腺苷殘基。除編碼野生型H5N1NS的質(zhì)粒構(gòu)建體pPollVN1203-NS之外，也制備了編碼H5N1NS基因片段不同截斷形式的3個pPoll構(gòu)建體。這些編碼NS片段的改變形式的構(gòu)建體將可用于將生成的嵌合病毒進一步的減毒(參見如美國專利號6,669,943，其被完整引入本文作為參考)。這三種構(gòu)建體在由質(zhì)粒構(gòu)建體表達NS1蛋白的氨基酸(自氨基端)數(shù)量上不同。從野生型NS1蛋白的氨基末端開始計算，pPollVN1203NS1-126、pPollVN1203NS1-99和pPollVN1203NS1-73分別編碼前126、前99和前73個氨基酸。產(chǎn)生截斷構(gòu)建體的突變不影響NEP的開放閱讀框(圖4)。6.1.1.4用質(zhì)粒構(gòu)建體補救感染性病毒通過本文所迷的或本領(lǐng)域已知的任何方法對本發(fā)明的重組嵌合病毒進行補救。例如，可以用8個上述的pPoll質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染293T、HEp-2或A549細胞，這些質(zhì)粒被選擇以實現(xiàn)理想的病毒減毒水平且因此提供8個片段，即用pPollVNWSN-NA(CT+TM)-NDVBlHN(胞外結(jié)構(gòu)域)、pPollVN1203HA或pPollVN1203HALO、pPollVN1203NS、pPollVN1203NS1國126、pPollVN1203NS1-99或pPollVN1203NS1-73、pPollVN1203-M、pPollVN1203-NP、pPollVN1203-PA、pPollVN1203-PBl和pPollVN1203-PB2來轉(zhuǎn)染細胞。再用編碼NA、PA、PB1和PB2的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，這些蛋白是vRNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的。在過夜培養(yǎng)后，將被轉(zhuǎn)染的細胞與雞胚成纖維細胞共培養(yǎng)來擴增生成的病毒；在2-3天培養(yǎng)后，將共培養(yǎng)物上清液注入9或IO天大的雞胚卵尿嚢腔內(nèi)進行增殖。對于減毒病毒來說，可采用不具有完全的干擾素系統(tǒng)的7天大的卵。通過根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析收獲的尿嚢液中的血凝素可以確認病毒的生長。6.2工程改造具有外源抗原決定簇的嵌合新城疫病毒下述實施例描述了示例性NDV嵌合病毒的制備。特別的，本實施例描迷了將嵌合NDV病毒工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進病毒顆粒，該蛋白包含NDV的必需蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域及禽流感病毒的胞外結(jié)構(gòu)域。該實施例證實該種嵌合病毒誘發(fā)對流感病毒和NDV的后續(xù)感染的保護。實施例還描述了將示例性NDV工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進病毒顆粒，該蛋白包含NDVF的胞質(zhì)域和人角質(zhì)細胞生長因子受體(KGFR)的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。6.2.1材料和方法6.2.1.1細胞系MDCK、HEp-2和A549細胞在補充了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco，s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中生長。NDV病毒HitchnerBl抹的全長cDNA已被公布，其genebank錄入號為AF375823(Nakaya等，2001，J.Virol.75:11868-11873,其內(nèi)容完整引入本文作為參考)。6.2.1.2質(zhì)粒構(gòu)建已經(jīng)i兌明了將NDV的重組cDNA工程改造以編碼外源蛋白(Nakaya等，2001，J.Virol.75:11868-11873)。簡言之，將NDV全長cDNA引入質(zhì)粒的T7啟動子和丁型肝炎病射HDV)核酶及T7終止子之間，形成pNDV/Bl質(zhì)粒。在NDVcDNA的P基因和M基因之間工程改造引入Xball位點，使得外源序列作為額外轉(zhuǎn)錄單位被引入NDV基因組中(圖5)。所有的插入基因經(jīng)工程改造以依次包含基因末端；5，-TTAGAAAAAA-3，(SEQIDNO:18);順反子間核苷酸T;基因起始序列；5，-ACGGGTAGAA-3，(SEQIDNO:19)(GE/GS序列)。通過反向遺傳學(xué)方法從來自NDV病毒HitchnerBl抹的全長cDNA拷貝生成rNDV/Bl-KGFR、rNDV/Bl-KGFR/F-CT及rNDV/Bl-H7HA/F-TMCT病毒。為構(gòu)建這些病毒，如針對其它ORF所述方法(Nakaya等，2001，J.Virol.75:11868-11873,Nakaya等，2004，J.Virol.78:9366-9375，此兩篇文獻均完整引入本文作為參考)，將KGFR或H7HA(來自流感病毒AH7N2亞型的HA蛋白)ORF作為額外轉(zhuǎn)錄單元克隆到NDV/B1cDNA的P基因和M基因之間。KGFR和H7HA均為跨膜蛋白，各自包含TM和CT域。在KGFR/F-CT構(gòu)建體中，KFGR蛋白的CT域被NDVF蛋白的CT域所替換；在H7HA/F-TMCT構(gòu)建體中，H7HA蛋白的TM和CT域為NDVF蛋白的相應(yīng)區(qū)域所替換。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從cDNA獲得重組NDV病毒并進行增殖(參見如Swayne等，2003,AvianDis.47:1047-1053和Nakaya等，2001,兩者均全文引入本文作為參考)。重組病毒中新轉(zhuǎn)錄單元的插入采用逆轉(zhuǎn)錄PCR后通過序列分析進行確認。例如，通過PCR使用下列引物(包括GE/GS序列)制備H5HA基因的胞外結(jié)構(gòu)域(ECTO):Nhel-H5HAP，5，-CGGCTAGCTTAGAAAAAATGCCTTTGCA畫3，(SEQIDNO:20)和Hpal-H5HAP，5，-CGGTTAACCTGATAAGCCCCCATTGATTCTAAT-3，(SEQIDNO:21),H5HAect。PCR片段經(jīng)Nhel和Hpal消化后克隆到pSL1180中(AmershamPharmaciaBiotech)(pSLHAHAect。)；通過PCR使用下列引物擴增NDVF基因的TM和CT:Hpal-NDVF(TM+CYTO)P，5'-CGGTTAACCTCATTACCTATATCGTTTTGACT-3，(SEQIDNO:22)，SacI-Nhel-NDVF(TM+CYTO)M,5'-CGGAGCTCAAGCTAGCTTATCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCT-3'(SEQIDNO:23)。為了與H5HAeCt。融合，將NDVF基因的TM和CT用HpaI和SacI消化后克隆到pSLH5HAect。得到雜交融合基因。最后，將包含雜交H5HA基因的質(zhì)粒用Nhel消化后克隆到rNDV的cDNA的P基因和M基因間。6.2.1.3Western印跡法和生物學(xué)分析細胞或鳥囊腔提取物中的病毒用30%蔗糖墊超速離心進行純化。用特異性抗體和常規(guī)技術(shù)通過Western印跡法監(jiān)測結(jié)合進病毒的蛋白的水平。通過用3xl07pfU的嵌合病毒腹腔免疫BALB/c小鼠及三周后使用相同劑量加強免疫來測定嵌合病毒在體內(nèi)呈現(xiàn)非病毒蛋白KGFR的能力。第二次免疫兩周后，通過對轉(zhuǎn)染KGFR編碼質(zhì)粒的MDCK細胞進行免疫染色來檢測接種小鼠血清中KGFR抗體的存在。設(shè)計了體內(nèi)系統(tǒng)來對用包含雜交H7HA/F-TMCT的rNDV進行的免疫是否能針對H7或NDV的后續(xù)感染^IC供保護進行評估。兩周大的小雞通過滴眼液法用100pi下列三種疫苗進行免艱rNDV、rNDV-H7HA/F-TMCT和空白對照。4周大時，通過后鼻孔狹縫施用100pl含10"平均胚胎感染劑量的HPAIV(A/Steele/ACC-10/59[H7N7])，觀察鳥的HPAIV感染的信號和損傷。記6.2.2結(jié)果6.2.2.1表達KGFR或KGFR/F-CT的嵌合NDV病毒對KGFR的呈現(xiàn)嵌合病毒rNDV/Bl-KGFR和rNDV/Bl-KGFR/F-CT在10天大的雞胚卵的尿囊腔中生長。用小鼠抗KGFR抗體通過Western印跡分析檢測純病毒中KFGR或KGFR/F-CT的存在。在從接種rNDV/Bl-KGFR/F-CT的卵分離出的樣品中檢測出陽性反應(yīng)，但接種rNDV/Bl-KGFR的沒有(圖6)。這些嵌合病毒種的每一種也被用于免疫三只BALB/c小鼠。分析免疫動物血清種KGFR抗體的存在。使用該試驗，用rNDV/Bl-KGFR病毒免疫的動物沒有產(chǎn)生可測水平的KGFR抗體。相反，在rNDV/Bl-KGFR/F-CT病毒免疫的三只動物中通過該試驗對KGFR抗體的存在均呈陽性。6.2.2.2rNDV-H7HA/F-TMCT免疫后對H7感染的保護野生型H7HA蛋白的TM和CT域被NDVF蛋白的TM和CT域替換以生成雜交HA蛋白，H7HAecto-NDV/F(TM+co。在Western印跡分析中，表達H7HA完整ORF的對照rNDV,rNDV-H7HA和表達雜交H7HAeCt。-NDV/F(tm+ct)的嵌合rNDV,rNDV-H7HAect。-NDV/F(TM+CT^^tH7抗體產(chǎn)生陽性反應(yīng)；但rNDV-H7HAect。-NDV/F(tm+cT)所產(chǎn)生的信號強許多倍(圖7)。當(dāng)用H7流感致死劑量攻擊曾經(jīng)用rNDV-H7HAect。-NDV/F(TM^T)免疫的小雞時，10只經(jīng)免疫的小雞中有9只存活(90%)。當(dāng)用NDV致死劑量攻擊曾經(jīng)用rNDV-H7HAect。-NDV/F(TM+cr)免疫的小雞時，10只經(jīng)免疫的小雞中10只均存活(100%)。6.3工程改造呈現(xiàn)外源抗原決定簇的嵌合新城疫病毒下述實施例描述了嵌合的經(jīng)修飾的NDV的制備。特別地，制備重組NDV以改善實施例6.2中所用NDV骨架的毒性。本實施例證實rNDV增強的毒性也提高了包含基于rNDV的嵌合病毒的免疫制劑的免疫原性。6.3.1材料和方法除非另外說明，本章節(jié)中所述的所有材料和方法均與前述實施例6.2中所述和所示之材料與方法相同。6.3.1.1F蛋白中具有經(jīng)修飾的切割位點的rNDV的制備利用反向遺傳學(xué)方法制備重組NDV病毒rNDV/F2aa和rNDV/F3aa,此兩種病毒在NDVHitchnerBl抹的F基因切割位點有兩個或三個氨基酸突變。簡言之，為了產(chǎn)生rNDV/F2aa，首先利用全長NDVB1克隆，質(zhì)粒pT7NDV/Bl作為模板及下列引物獲得'PCR片段正向F2aa-l(+)5'-GGATCCCGGTTGGCGCCCTCCAGG(SEQINNO:24)，反向F2aa-l(-)5，-NO:25);再利用pT7NDV/Bl為模板及下述引物來產(chǎn)生另一個PCR片段正向F2aa-2(+)5，畫GGcGGAGACAGaGGCGCCTTATAGGCGCCATTATTGG-3，(SEQIDNO:26),反向F2aa國2(隱)5'-CCATATTCCCACCAGCTAGATTGT-3'(SEQIDNO:27)。小寫字母顯示的核苷酸被突變以使F蛋白切割位點的氨基酸序列從NDV/B1病毒抹的序列(GGRQGR丄L)變?yōu)镚RRQRR丄L。這兩個重疊的PCR片^R(重疊區(qū)在引物序列中以下劃線顯示)用引物F2aa-1(+)和F2aa-2(-)通過PCR進行組合。生成的包含完整的F基因的PCR片段被克隆進pSL1180(AmershamPharmaciaBiotech),命名為pSLF2aa。切耳又pSLF2aa的Stul-Notl片段(4646-4952位核苷酸)替換pT7NDV/Bl質(zhì)粒中的相應(yīng)片段，產(chǎn)生pT7NDV/F2aa質(zhì)粒，此質(zhì)粒用于用反向遺傳學(xué)方法制備rNDV/F2aa病毒。為了制備rNDV/F3aa，采用與以上所述相同的策略，用pT7NDV/Bl為模板及下述引物進行PCR基因突變正向，F(xiàn)3aa-l(+)5'-GGATCCCGGTTGGCGCCCTCCAGG誦3，(SEQIDNO:28);反向，F(xiàn)3aa-l(-)5，國AAaGCGCCtCTGTCTCCgCCCTCCAGATGTAGTCACAG-3，(SEQIDNO:29);正向，F(xiàn)3aa-2(+)5，-GGcGGAGACAGaGGCGCtTTATAGGCGCCATTATTGG隱3，(SEQIDNO:30);反向，F(xiàn)3aa-2(畫)5，-CCATATTCCCACCAGCTAGATTGT-3，(SEQIDNO:31)(突變核苷酸以小寫字母顯示)。這兩個重疊PCR片段(重疊區(qū)在引物序列中以下劃線顯示)用引物F3aa-l(+)和F3aa-2(-)通過PCR進行組合，將切割位點從GGRQGR丄L變?yōu)镚RRQRR丄F。切取pSLF3aa的Stul-Notl片段(4646-4952)替換pT7NDV/Bl質(zhì)粒的相應(yīng)片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pT7NDV/F3aa，此質(zhì)粒用于產(chǎn)生rNDV/F3aa病毒。6.3.1.2制備表達嵌合H7HA蛋白的融合rNDV載體為將嵌合H7HA基因構(gòu)建為rNDV/F3aa基因組的額外轉(zhuǎn)錄單元，首先以含NDVF基因的質(zhì)粒為模板，用下迷引物通過PCR制備含NDVF基因跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和胞質(zhì)尾巴(CYTO)的片段HpaNDVF(TM+CYTO)P，5，-cgGTTAACCTCATTACCTATATCGTTTTGACT-3，(SEQIDNO:32)和SacNheNDW(TM+CYTO)M,5，cgGAGCTCAAGCTAGCTTATCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTG醫(yī)3，(SEQIDNO:33)。此PCR產(chǎn)物經(jīng)Sacl和Hpal消化后克隆入含NDV基因終止和基因起始信號的pNhe-NDV-GE/GS質(zhì)粒，產(chǎn)生pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM+CYTO)質(zhì)粒。然后，為了將含H7HA胞外結(jié)構(gòu)域的片段與含NDVF基因的TM和CYTO區(qū)的片段相連，以含A/雞/NY/13142-5/94(H7N2)的H7HA基因的質(zhì)粒為模板，用下述引物通過PCR制備H7HA胞外區(qū)SpeH7(ECTO)P，5'-cgACTAGTCCGCCACCATGAACACTCAAATTCTGGCATTCAT-3，(SEQIDNO:34)，HpaH7(ECTO)M,5，-cgGTTAACGTCTTTGTATCCACTACTCAATTTCAC-3，(SEQIDNO:35)。該PCR產(chǎn)物經(jīng)Spel和Hpal消化后插入質(zhì)粒pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM-CYTO)。最后，質(zhì)粒pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM-CYTO)經(jīng)Nhel消化后，切出嵌合H7HA基因。該片段DNA被克隆入pT7NDV/F3aa的P基因和M基因之間，產(chǎn)生pT7NDV/F3aa-嵌合H7。表達嵌合H7HA蛋白的rNDV/F3aa病毒通過前迷方法從pT7NDV/F3aa-chimericH7質(zhì)粒中獲得。6.3.1.3病毒生長動力學(xué)將rNDV/Bl、rNDV/F2aa、rNDV/F3aa、rNDV/Bl-H7或rNDV/F3aa陽嵌合H7病毒(100PFU/卵)接種到IO天大的雞胚卵中。于不同時間點(24、48及72小時)采集尿囊液檢測病毒滴度。通過免疫熒光(IFA)分析確定尿囊液中每、種病毒的50。/。組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。為了該目的，用IO倍系列稀釋的樣品感染培養(yǎng)于96孔板中的Vero細胞，通過IFA確定NDV蛋白或嵌合H7HA蛋白的存在。6.3.2免疫熒光分析6.3.2.1免疫熒光分析用轉(zhuǎn)染流感病毒感染的MDCK細胞被固定并經(jīng)冰甲醇透化。用抗NDVHN單克隆抗體(7B1)、抗流感HIHA單克隆抗體(2G9)和抗流感H5HA多克隆血清檢測病毒抗原。為了分析NDV生長及病毒蛋白的表達，用重組病毒感染匯合的Vero細胞，并于不同時間點(24、48、72小時)收獲細胞。用含0.1%TitonX-100的2.5%甲醛固定感染細胞。固定的細胞用抗兔NDV多克隆抗體或抗雞AIVH7多克隆血清處理、洗滌用異疏氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗雞免疫球蛋白(DAKO)對AIVH7HA進行染色或用德克薩斯紅偶聯(lián)的抗兔免疫球蛋白對NDV病毒蛋白染色。用熒光顯微鏡檢測病毒蛋白表達。6.3.2.2平均死亡時間為檢測重組病毒對雞胚卵的致病性，測定平均死亡時間(MDT)。簡言之，用10倍系列稀釋的病毒感染5個IO天大的雞胚卵。將卵培養(yǎng)于37。C,每天監(jiān)測兩次，連續(xù)監(jiān)測7天。記錄雞胚死亡時間。殺死所有雞胚的最高稀釋度確定為最小致死劑量。MDT計算為最小致死劑量殺死胚的平均時間。6.3.2.3雞的免疫和攻擊經(jīng)結(jié)膜囊滴眼法，在白色Leghom雞2周及4周大時用10"61平均雞胚感染劑量(EIDso)的rNDV/F3aa-嵌合H7進行1次或2次接種、或用105'7—"EIDso的親代NDV/Bl(pNDV)進行2次接種、或無菌組織培養(yǎng)液(空白對照)進行兩次接種。在6周大時，用強毒NDVFontana抹(wNDV)(1051EDIso/每只)或A/A/Steele/59(H7N7)HPAI(1051EID5o/每只)鼻內(nèi)攻擊雞。存活的雞于攻擊后14日進行放血及安樂死。用標(biāo)準(zhǔn)方法確定血凝素抑制(HI)血清滴度。6.3.3結(jié)果6.3.3.1制備融合性rNDV突變體為增強rNDV骨架的融合特性，構(gòu)建了兩個rNDV突變體rNDV/F2aa和rNDV/F3aa，其中F蛋白的切割位點分別由兩種變化的多元切割位點之一所替換，該位點可被廣泛表達的蛋白酶(如融合素蛋白酶)所活化(圖8A)。用rNDV/F2aa和rNDV/F3aa感染雞胚成纖維細胞(CEF)導(dǎo)致在無外加蛋白酶的條件下產(chǎn)生合胞體，而rNDV/Bl感染則無此現(xiàn)象(圖8B)。此外，與rNDV/F2aa相比，rNDV/F3aa在CEF細胞中會更迅速地誘導(dǎo)合胞體。由此推測，病毒在免疫動物體內(nèi)更好的擴散可以增強對外源插入蛋白的免疫原性。據(jù)此，選擇rNDV/F3aa作為骨架載體以構(gòu)建設(shè)計用于保護家禽免受AIV和NDV感染的雙價疫苗。6.3.3.2雞胚卵中rNDV平臺栽體的平均死亡時間分析基于對雞的致病性，NDV可被分為高毒性(強毒力)、中度毒性(中等毒力)和無毒性(弱毒力)三類。因為已知具有多元切割位點的F蛋白的存在是NDV毒力因子，我們在10天大的雞胚蛋中對具有經(jīng)修飾的F蛋白的rNDV的致病性進行了分析。感染NDV的雞胚平均死亡時間(MDT)在體內(nèi)與毒力相關(guān)。低毒抹(在鳥類中產(chǎn)生無癥狀感染)特征為多于90小時的MDT,中等毒抹(烏類中產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)疾病)的MDT在60-90小時之間，強毒抹(導(dǎo)致鳥類嚴重疾病)的MDT低于60小時。rNDV/F2aa的MDT顯示低毒抹特征，而rNDV/F3aa的MDT則具有典型的中毒抹特征。此兩抹的MDT均無高致病性(強毒)林特征(表3)。表3.rNDV在雞胚卵中的MDT<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>基于這些數(shù)據(jù)，rNDV/F3aa載體對鳥類不據(jù)危害，因此適于作為構(gòu)建可保護鳥類免受AIV和NDV感染的雙價疫苗的骨架載體。6.3.3.3制備表達AIVHA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的融合性rNDV栽體如上所迷，A/雞/NY/131425/94(H7N2)的H7HA蛋白編碼基因結(jié)合進rNDV/F3aa載體，形成rNDV/F3aa-嵌合H7(圖9A)。雞胚卵中rNDV/F3aa-嵌合H7的生長動力學(xué)與親本rNDV/F3aa比較。表達嵌合H7HA蛋白的病毒比沒有插入片段的病毒生長更慢，其最大滴度大約低一個數(shù)量級。有趣的是，該病毒的MDT具有低毒抹特征(128-140小時)(表3)。rNDV/F3aa-嵌合H7對嵌合H7HA蛋白的表達通過對感染后36小時的Vero細胞進行Western印跡分析加以確認(圖9C)。6.3.3.4AIVH7HA蛋白向rNDV病毒顆粒中提高的結(jié)合為確定包含NDVF蛋白異源跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)的嵌合H7HA蛋白的表達是否與提高的蛋白向病毒顆粒中的結(jié)合相關(guān)，按6.3節(jié)中所述方法純化rNDV/Bl-H7和rNDV/F3aa-chimericH7病毒顆粒。利用抗雞AIVH7多克隆抗體和抗兔NDV多克隆血清通過Western印跡法對來自rNDV/Bl-H7或rNDV/F33-嵌合H7的H7HA蛋白和NDV病毒蛋白的量進行測定。和預(yù)期的一樣，與野生型H7HA蛋白相比，嵌合H7HA蛋白向rNDV病毒顆粒中的結(jié)合顯著提高(圖9D)。該數(shù)據(jù)暗示NDVF蛋白的跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)在改善外源蛋白向病毒表面中的結(jié)合中發(fā)揮重要作用。6.3.3.5雞的免疫與攻擊經(jīng)一次或兩次rNDV/F3aa-嵌合H7接種后，50-80%的雞具有對H7AIV的血凝素抑制(HI)滴度，90-100%的雞具有對NDV的HI活性(表4A和B)。盡管所有經(jīng)親本NDV/Bl(pNDV)免疫兩次的雞都具有對NDV的ffl滴度，但所有雞均無對H7AIV的HI滴度。所有無菌組織培養(yǎng)基(空白對照)感染的雞對任何一種病毒均無滴度。當(dāng)用wNDV攻擊時，100%的rNDV/F3aa-嵌合H7及pNDV免疫的雞得到保護。與此相比，90%的rNDV/F3aa-嵌合H7免疫的雞對HPAIH7病毒得到保護，而任何pNDV免疫的雞均無對HPAIH7病毒的保護。作為對比，100%和70%的空白對照感染的雞分別死于wNDV和HPAIH7攻擊。除了空白對照-HPAIH7病毒攻擊組中缺乏受感染的血清學(xué)證據(jù)的三只存活動物外，其它存活動物均具有失憶反應(yīng)，表現(xiàn)為對相應(yīng)攻擊病毒的HI滴度發(fā)生4倍以上的升高。表4A嵌合病毒免疫雞受攻擊前的HI血清學(xué)<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>表4B嵌合病毒免疫雞受攻擊后HI血清學(xué)(攻擊后14天)<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>空白=無菌組織培養(yǎng)液HPAIV-A/A/Steele/59(H7N7)病毒HI血清學(xué)顯示為HI陽性血清雞的數(shù)目/接種雞的數(shù)目；括號中的值是幾何平均滴度(GMT)'11=10只雞/組，1x=一次接種，2X-2次接種Man-SeongPark等，題為"EngineeredViralVaccineConstructswithDualSpecificity:AvianInfluenzaandNewcastleDisease,",PNAS103:8203-8208(2006)的出版物被完整引入本文作為參考。6.4等同物本發(fā)明不限于在此所述的具體實施方式的范圍，這些實施方式意在對本發(fā)明的各方面進行單個示例，功能性等同的方法和組分都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，除了本文所展示和描述的內(nèi)容外，根據(jù)前面的說明和附圖，對本發(fā)明的各種修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。這樣的修改均落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。本文中引用了各種出版物。它們的內(nèi)容被完整引入本申請為各種目的作為參考。權(quán)利要求1.一種嵌合禽流感病毒，包含包裝的流感病毒NA片段，該片段編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白，其中NA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的神經(jīng)氨酸酶抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸替代，該胞外結(jié)構(gòu)域通過N端錨定，由此神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并被結(jié)合進該嵌合禽流感病毒中。2.—種嵌合禽流感病毒，包含包裝的流感病毒HA片段，該片段編碼血凝素融合蛋白，其中HA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼HA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的受體結(jié)合/融合性抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸替代；該胞外結(jié)構(gòu)域通過C端錨定，由此血凝素融合蛋白被表達并被結(jié)合進該嵌合禽流感病毒中。3.—種嵌合禽流感病毒，包含包裝的雙順反子流感病毒HA片段，包含a)編碼禽流感血凝素蛋白的第一開放閱讀框，和b)編碼血凝素融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼該血凝素胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原的胞外結(jié)構(gòu)域替代，該胞外結(jié)構(gòu)與通過C端錨定，由此，該流感血凝素和該融合蛋白均^皮表達且凈皮結(jié)合進該嵌合禽流感病毒中。4.一種嵌合禽流感病毒，包含包裝的雙順反子流感病毒NA片段，包含a)編碼禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白第一開放閱讀框，和b)編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼該神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原的胞外結(jié)構(gòu)域替代，該胞外結(jié)構(gòu)與由N端錨定，由此，該流感神經(jīng)氨酸酶和該融合蛋白均#:表達并結(jié)合進該嵌合禽流感病毒中。5.—種嵌合禽流感病毒，包含包裝的流感病毒NA片段，該片段編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白，其中NA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苦酸被編碼NDV的HN抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸替代，由此該神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并被結(jié)合進該嵌合禽流感病毒中。6.權(quán)利要求1、2、3、4或5中所述的嵌合禽流感病毒，其包含包裝的NSl基因片段，該片段編碼降低該病毒的細胞干擾素拮抗活性的經(jīng)修飾的NSl蛋白。7.權(quán)利要求l、4或5中所述的嵌合禽流感病毒，其包含HA片段，該片段具有經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點的開放閱讀框。8.權(quán)利要求3中所述嵌合禽流感病毒，其中，所迷第一開放閱讀框經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點。9.編碼權(quán)利要求1、4或5所述NA片段的重組DNA分子。10.編碼權(quán)利要求2或3所述HA片段的重組DNA分子。11.一種制備免疫原性制劑的方法，所述方法包括a)在胚蛋中增殖權(quán)利要求1、2、3、4或5中所述的嵌合禽流感病毒；和b)收集后代病毒，其中所述病毒生長至足夠的量且在足以使該病毒免受污染的條件下生長，由此該后代病毒適用于免疫原性制劑。12.—種制備免疫原性制劑的方法，所述方法包括a)在對禽流感病毒易感的細胞系中增殖權(quán)利要求1、2、3、4或5中所迷的嵌合禽流感病毒；和b)收集后代病毒，其中該病毒生長至足夠的量且在足以使該病毒免受污染的條件下生長，由此該后代病毒適用于免疫原性制劑。13.—種減毒的嵌合流感病毒，包含包裝的流感病毒NA片段，該片段編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白，其中NA開放閱讀框經(jīng)修飾由此編碼NA胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的神經(jīng)氨酸酶抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸替代，該胞外結(jié)構(gòu)域通過N端錨定，由此該神經(jīng)氨酸酶融合蛋白被表達并被結(jié)合進該減毒嵌合禽流感病毒中。14.一種減毒的嵌合禽流感病毒，包含包裝的流感病毒HA片段，該片段編碼血凝素融合蛋白，其中HA閱讀框經(jīng)修飾由此編碼HA胞外結(jié)構(gòu)域的核香酸被編碼非流感傳染性物質(zhì)的受體結(jié)合/融合性抗原胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸替代，該胞外結(jié)構(gòu)域通過C端錨定，由此該血凝素融合蛋白可#1表達并被結(jié)合進該減毒嵌合流感病毒中。15.—種減毒嵌合禽流感病毒，包含包裝的雙順反子流感病毒HA片段，包含a)編碼禽流感血凝素蛋白的第一開放閱讀框，和b)編碼血凝素融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼該血凝素胞外結(jié)構(gòu)域的核普酸被編碼包含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或疾病相關(guān)抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個抗原決定簇的蛋白的核苷酸替代，該蛋白通過C端錨定，由此，該流感血凝素和該融合蛋白均^皮表達并被結(jié)合進該減毒嵌合流感病毒中。16.—種減毒嵌合流感病毒，包含包裝的雙順反子流感病毒NA片段，包含a)編碼禽流感神經(jīng)氨酸酶蛋白的第一開放閱讀框，和b)編碼神經(jīng)氨酸酶融合蛋白的第二開放閱讀框，其中編碼該神經(jīng)氨酸酶胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸被編碼含非流感傳染性物質(zhì)的保護性抗原或疾病相關(guān)抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個抗原決定簇的蛋白的核苷酸替代，該蛋白通過N端錨定，由此，該流感病毒神經(jīng)氨酸酶和該融合蛋白均被表達并^皮結(jié)合進該減毒嵌合流感病毒中。17.權(quán)利要求13、14、15或16中所述的減毒嵌合流感病毒，其包含包裝的NS1基因片段，該片段編碼降低該病毒的細胞干擾素拮抗活性的經(jīng)修飾的NS1蛋白。18.權(quán)利要求13或16中所迷的減毒嵌合流感病毒，其包含HA片段，該片段具有經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點的開放閱讀框。19.權(quán)利要求15中所述的減毒嵌合流感病毒，其中該第一開放閱讀框經(jīng)修飾以去除血凝素多元切割位點。20.編碼權(quán)利要求13或16中所述NA片段的重組DNA分子。21.編碼權(quán)利要求14或15中所述HA片段的重組DNA分子。22.—種制備免疫原性制劑的方法，所述方法包括a)在胚蛋中增殖權(quán)利要求13、14、15或16中所述的減毒嵌合流感病毒j和b)收集后代病毒，其中該病毒生長至足夠的量且在足以使該病毒免受污染的條件下生長，由此該后代病毒適用于免疫原性制劑。23.—種制備免疫原性制劑的方法，所述方法包括a)在對減毒流感病毒易感的細胞系中增殖權(quán)利要求13、14、15或16中所述的減毒嵌合流感病毒；和b)收集后代病毒，其中該病毒生長至足夠的量且在足以使該病毒免受污染的條件下生長，由此該后代病毒適用于免疫原性制劑。24.—種嵌合NDV,包含包裝的基因組，該基因組包含編碼F融合蛋白的核苷酸序列，該融合蛋白具有F蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以及非NDV傳染性物質(zhì)的保護性抗原或疾病相關(guān)抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個抗原決定簇，該融合蛋白通過C末端錨定，由此該F蛋白-融合蛋白被表達并4皮結(jié)合進該嵌合NDV病毒中。25.權(quán)利要求24中所迷的嵌合NDV,其中該基因組包含編碼F蛋白的核苷酸序列，由此F蛋白可被表達并被結(jié)合進該嵌合NDV中。26.權(quán)利要求24中所述的嵌合NDV,其中編碼F融合蛋白的核苷酸序列替代編碼NDVF蛋白的核苷酸序列，且F融合蛋白拔:供F蛋白的功能。27.—種嵌合NDV,包含包裝的基因組，該基因組包含編碼HN融合蛋白的核苷酸序列，該融合蛋白具有HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域及非NDV傳染性物質(zhì)的保護性抗原或疾病相關(guān)抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個抗原決定簇，該融合蛋白通過N末端錨定，由此該HN蛋白-融合蛋白被表達并被結(jié)合進該嵌合NDV中。28.權(quán)利要求27中所述的嵌合NDV，其中該基因組包含編碼HN蛋白的核苷酸序列，由此該HN蛋白被表達并被結(jié)合進嵌合NDV中。29.權(quán)利要求27中所述的嵌合NDV，其中編碼該HN融合蛋白的核苷酸序列替代編碼NDVHN蛋白的核苷酸序列，且F融合蛋白提供HN蛋白的功能。30.—種制備免疫原性制劑的方法，該方法包括a)在胚蛋中增殖權(quán)利要求24-29中任一權(quán)利要求所述的嵌合NDV;和b)收集后代病毒，其中該病毒生長至足夠的量且在足以使該病毒免受污染的條件下生長，由此該后代病毒適用于免疫原性制劑。31.—種制備免疫原性制劑的方法，所述方法包括a)在對NDV易感的細胞系中增殖權(quán)利要求24-29中任一權(quán)利要求所述的嵌合NDV;和b)收集后代病毒，其中該病毒生長至足夠的量且在足以使該病毒免受污染的條件下生長，由此該后代病毒適用于免疫原性制劑。32.—種在禽類中誘導(dǎo)針對兩種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，所迷方法包括施用權(quán)利要求1、2、3、4、5、13、14、15、16、24、25、26、27、28或29中所述的嵌合病毒。33.—種在人類中誘導(dǎo)針對兩種傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括施用權(quán)利要求13、14、16、24、25、26、27、28或29中所述的嵌合病毒。全文摘要本發(fā)明提供了嵌合負鏈RNA病毒，通過使用本發(fā)明的單個嵌合病毒，該RNA病毒使得個體例如鳥類對兩種傳染性物質(zhì)產(chǎn)生免疫。特別地，本發(fā)明提供了經(jīng)工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進病毒顆粒的嵌合流感病毒，該融合蛋白包含傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和流感病毒蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這樣的嵌合病毒誘導(dǎo)針對流感病毒和傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了經(jīng)工程改造以表達融合蛋白并將其結(jié)合進病毒顆粒的嵌合新城疫病毒(NDV)，該融合蛋白包含傳染性物質(zhì)的蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和NDV蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這樣的嵌合病毒誘導(dǎo)針對NDV和傳染性物質(zhì)的免疫應(yīng)答。文檔編號A61K39/00GK101365479SQ200680052285公開日2009年2月11日申請日期2006年12月1日優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日發(fā)明者P·帕里斯,阿道夫·加西亞-莎絲特申請人:紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院