專利名稱：作為針對hcv感染的抗病毒治療的靶標(biāo)的宿主細(xì)胞激酶的制作方法
作為針對HCV感染的抗病毒治療的靶標(biāo)的宿主細(xì)胞激酶相關(guān)申請本申請要求于2008年9月沈提交的歐洲專利申請EP 08 305 604. 4的優(yōu)先權(quán)。 將該歐洲專利申請全部內(nèi)容引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是全球性的重大健康問題，據(jù)估計在世界范圍內(nèi)有1. 5-2億人感染了丙型肝炎病毒，其中在歐盟國家內(nèi)至少有500萬感染個體(PaWlOtsky，2004)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)報告，每年新增300-400萬感染患者。該感染通常是無癥狀的，但是大多數(shù)HCV感染個體會發(fā)展成慢性感染(HOOfnagle，2002，Lauer， 2001和keff，1995)。慢性HCV感染通常會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟疾病，包括纖維化和脂肪變性 (Chisari，2005)。約20 %的慢性HCV感染患者會發(fā)展成為肝硬化，其中約5 %的患者會惡化成為肝細(xì)胞癌。慢性HCV感染是肝移植的主要適應(yīng)癥(Seeff，20(^)。不幸的是，肝移植并不能治愈丙型肝炎。病毒的復(fù)發(fā)是必須面對的問題和移植失敗的主要原因(Brown，2005)。還沒有對抗HCV的疫苗。目前的治療包括給予利巴韋林和/或α干擾素(IFN-α)，這是兩種非特異抗病毒劑。使用聚乙二醇化α干擾素和利巴韋林的聯(lián)合治療在約50%-80%的慢性丙型肝炎患者中獲得持久的清除率。但是大量患者對該組合中的一種成分有禁忌，不能耐受該治療，對IFN治療完全無反應(yīng)或者在停止給藥后發(fā)生復(fù)發(fā)。除了療效有限、重大的副作用 (例如中性粒細(xì)胞減少、溶血性貧血和嚴(yán)重的抑郁)外，當(dāng)前的抗病毒治療成本也很高。直到最近，開發(fā)更有效的抗HCV感染的治療由于缺少支持HCV復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)而受到阻礙。目前已使用源自日本爆發(fā)性丙型肝炎患者血液的獨特HCV基因組(JFH-I) 實現(xiàn)了感染性HCV在細(xì)胞培養(yǎng)物中的穩(wěn)定生產(chǎn)(Wakita，2005 ；Lindenbach, 2005 ；Zhong, 2005)。HCV的JFH-I株在細(xì)胞培養(yǎng)物中釋放感染性顆粒(HCVcc)和產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒HCV擬顆粒(HCVpp)的能力(BartOSch，2003 ；Hsu, 2003)使得能夠?qū)ν暾《旧芷谶M行研究。 這又導(dǎo)致了新的針對HCV蛋白加工和復(fù)制的抗病毒劑的開發(fā)。然而，已經(jīng)證明這些藥劑中的許多藥劑具有毒性并且非常容易發(fā)生病毒抗性，提示HCV感染的治療需要不同的策略。HCV是一種正鏈RNA病毒，屬于黃病毒(Flaviviridae)科的肝病毒屬 (Hepacivirus)。HCV基因組的主要開放閱讀框的翻譯導(dǎo)致產(chǎn)生了約3000個氨基酸長度的多聚蛋白，該蛋白質(zhì)在細(xì)胞和病毒蛋白酶的協(xié)同作用下在翻譯同時和翻譯后切割成至少 10個成熟蛋白質(zhì)，包括兩種包膜糖蛋白(El和E2)。HCV通過附著到肝細(xì)胞表面的分子或受體而開始傳染。由于HCV進入是病毒-宿主相互作用的第一步，它代表了抗病毒治療的有前途的靶標(biāo)。已經(jīng)鑒別了幾種在病毒結(jié)合和進入過程中與HCV相互作用的細(xì)胞表面分子。其中包括四跨膜蛋白(tetraSpanin)CD81(Pileri，1998)、B類I型清道夫受體(SB-RI) (BScarsell i，2002)、緊密連接蛋白密蛋白(Claudin)-1 (CLDNl) (Evans, 2007)、閉合蛋白 (Occludin) (Ploss，2009)、高度硫酸化的硫酸肝素(Barth，200 和低密度脂蛋白(LDL)受體(綜述參見Barth，2006和kisel，2008)。所有這些因子在許多組織中表達(dá)，并且不是肝臟特異性的。盡管CD81、SR-BI和緊密連接蛋白的過量表達(dá)可以使某些細(xì)胞系具有HCV敏感性，但是其他表達(dá)被鑒別的進入因子的細(xì)胞系仍然不能接受。這些發(fā)現(xiàn)提示存在其它介導(dǎo)或調(diào)節(jié)HCV進入的輔助進入因子。已知病毒在其生命周期的一個或多個步驟(包括進入、內(nèi)化、復(fù)制和釋放)中利用它們的靶細(xì)胞的信號傳導(dǎo)途徑(Cirone，1990 ；Constantinescu，1991 ；Pelkmans, 2005 ； Root, 2000 ；和Sieckarski，2003)。最近幾年，已經(jīng)清楚在病毒-宿主相互作用第一步過程中，進入病毒與宿主細(xì)胞之間的形成交換不限于細(xì)胞給予病毒的、導(dǎo)致病毒的細(xì)胞結(jié)合和進入的線索。對于許多病毒來說，病毒-宿主相互作用類似于雙向?qū)υ?，其中病毒利用?xì)胞自身的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)向細(xì)胞傳送信號(Smith，2004)。這些信號-通常在細(xì)胞表面產(chǎn)生-誘導(dǎo)可促進進入的改變、使細(xì)胞準(zhǔn)備好被侵入以及中和宿主的防御。利用對結(jié)合至肝細(xì)胞瘤細(xì)胞的HCV包膜糖蛋白的應(yīng)答的基因組分析，本申請人的實驗室先前已經(jīng)證明了 HCV包膜糖蛋白與宿主細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致可調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)，這可以調(diào)節(jié)細(xì)胞使其支持病毒繁殖(Fang，2006)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于醫(yī)療干預(yù)哺乳動物、特別是人類中丙型肝炎病毒(HCV)感染和 HCV相關(guān)疾病的新靶標(biāo)。本發(fā)明提供人細(xì)胞蛋白激酶的鑒別，該人細(xì)胞蛋白激酶可以作為新型治療方案的靶標(biāo)用于治療和/或預(yù)防由HCV引起的感染和疾病，以及用于鑒別和開發(fā)新的HCV抗病毒劑。更具體而言，以鑒別新型HCV進入因子為目的，本申請人應(yīng)用了針對691種細(xì)胞激酶和相關(guān)蛋白的功能性siRNA(小干擾RNA)篩選，并且采用基于HCV假型(pseudotyped) 顆粒(HCVpp)的模型系統(tǒng)(BartOSch，2003)研究了激酶基因沉默化對HCV進入的影響。在某些實驗中，為了區(qū)別HCV特異性的和非特異性的效應(yīng)，他們也在并排(side-by-side)實驗中研究了激酶基因沉默化對水泡性口炎病毒擬顆粒(VSVpp) (Barth,2006)的影響。初步實驗(見實施例1)導(dǎo)致鑒別出101種蛋白激酶，它們的相應(yīng)基因的沉默化導(dǎo)致HCV進入細(xì)胞顯著減少。其中，69種蛋白激酶的基因沉默化導(dǎo)致HCV特異性的病毒進入細(xì)胞的減少，而不影響VSVpp的進入(見

圖1)，32種蛋白激酶的相應(yīng)基因的沉默化導(dǎo)致HCV病毒進入細(xì)胞顯著減少，不考慮基因沉默化對VSVpp進入引起的變化(見圖2)。第二組實驗(見實施例2)導(dǎo)致鑒別出78種可影響HCV進入和HCV感染啟動的人激酶(見圖 5)。這 78 種人激酶是CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、 EPHB4、FASTK, FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYTl、PLK3、PRKD2、STK24、 WEEl、CDKL3、ADRBKl、CKS1B、DCAMKLU DDR2、EPS8L1、GAK, ITPKA, MAPK7、PAK4、STKl 1、 STK38、TYK2、ACVR2B、APEGl、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、 CIB2、CKMTl、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAPl、GRK4、IKBKB, MAP3K7IP1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKHU PTK2、PTK2B、RIOKU RPS6KA5、RPS6KL1、Sharp in, SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2 (這些激酶的全稱和相應(yīng)基因的 GenBank登錄號示于圖5中)。在上述78種人激酶中，發(fā)現(xiàn)有34種對HCVpp進入和HCVcc感染有功能性影響，但是對VSV進入沒有影響(實驗細(xì)節(jié)見圖5A和實施例2)。這34種人激酶是CALM2、CSK、 MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、 GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38和TYK2 (這些激酶的全稱和相應(yīng)基因的GenBank登錄號示于圖5A中)。利用STRING數(shù)據(jù)庫對這78種人激酶進行的生物信息學(xué)分析揭示了調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)學(xué)(包括細(xì)胞極性、緊密連接滲透性和整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo))的激酶網(wǎng)絡(luò)，以及參與細(xì)胞周期的激酶的網(wǎng)絡(luò)(圖6C)。這樣鑒別出總共23種人激酶，尤其包括2種調(diào)節(jié)細(xì)胞極性的激酶 STKll和PRKAG ；3種調(diào)節(jié)緊密連接的激酶MAGI_l、EphA2和EGFR ；4種參與整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)的激酶CSK、PTK2、PTK2B和ILK ；和8種參與細(xì)胞周期的激酶CDC2、CDK3、CDK4、CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 和 WEEl。本申請人然后利用細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的感染性HCV(HCVcc) (Wakita，2005)證實了鑒別的候選激酶對于病毒生命周期的相關(guān)性，并且評估了已經(jīng)批準(zhǔn)的激酶抑制藥物用于抗 HCV治療的潛力。已經(jīng)利用該方法證實的人激酶包括STK11、PRKAG2、EPHA2、EGFR和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(即⑶C2、⑶K3、⑶K4、CHKA,⑶KNlB和⑶KN2C中的一種或多種)。所有鑒別的細(xì)胞蛋白激酶都代表新型抗病毒干預(yù)的潛在靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的一個方面提供了這些蛋白激酶作為針對HCV感染和HCV相關(guān)疾病的抗病毒治療的靶標(biāo)。另一方面，本發(fā)明提供了鑒別可用于預(yù)防和/或治療HCV感染和/或HCV相關(guān)疾病的化合物的方法。具體地，這些方法包括將表達(dá)或能夠表達(dá)至少一種此處公開的蛋白激酶的生物系統(tǒng)(例如細(xì)胞)與候選化合物接觸，并且確定所述蛋白激酶的活性或代表所述激酶的活性的因子(factor)。如果該蛋白激酶的活性在存在候選化合物時低于不存在該候選化合物時，則該候選化合物被鑒別為潛在的HCV抗病毒劑(即，可能用于治療和/或預(yù)防由HCV引起的感染或疾病的化合物)?；蛘?，如果代表所述激酶活性的因子在存在候選化合物時和不存在候選化合物時不同(較低或較高，取決于因子和活性之間的關(guān)系)，則該候選化合物被鑒別為潛在的HCV抗病毒劑。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法用于篩選候選化合物個體。在其他實施方式中， 本發(fā)明的方法用于篩查候選化合物的文庫。候選化合物可能屬于廣泛多種分子家族中的任一種。在某些實施方式中，候選化合物選自小分子、單克隆抗體、多克隆抗體、RNA聚合酶抑制劑、反義化合物、核酶、siRNA, siDNA及其任意組合。通過此處所述的篩選方法鑒別的任何潛在HCV抗病毒劑包括在本發(fā)明中。特別是，本發(fā)明提供用于防止細(xì)胞被HCV感染的藥劑，其中該藥劑抑制至少一種此處公開的蛋白激酶的活性，從而防止、阻斷或抑制HCV進入細(xì)胞。本發(fā)明還提供用于預(yù)防或治療受試者的HCV感染或HCV相關(guān)疾病的藥劑，其中該藥劑抑制至少一種此處公開的蛋白激酶的活性，從而防止、阻斷或抑制HCV進入該受試者的易感細(xì)胞。本發(fā)明還提供用于預(yù)防肝移植患者的HCV復(fù)發(fā)的藥劑，其中該藥劑抑制至少一種此處公開的蛋白激酶的活性，從而防止、 阻斷或抑制HCV進入該患者的易感細(xì)胞。這些藥劑(或激酶抑制劑)可以是小分子、單克隆抗體、多克隆抗體、RNA聚合酶抑制劑、反義化合物、siRNA, siDNA、核酶等。在某些實施方式中，這些藥劑是本領(lǐng)域已知的抑制至少一種此處公開的蛋白激酶的活性的化合物。本領(lǐng)域已知的抑制至少一種蛋白激酶的活性的化合物包括2-氰基-3，12- 二氧代齊墩果-1， 9-二烯-28-酸甲酯(methyl 2-cyano_3，12-dioxoolean-l，9-dien-28_oate)、西妥昔單抗 (cetuximab)、AEE 788、帕木單抗(panitumumab)、BMS-599626, ARRY-334543, XLM7、卡紐替尼(canertinib)、吉非替尼(gefitinib)、HKI-272、PD 153035、拉帕替尼(Iapatinib)、 凡德他尼(vandetanib)、埃羅替尼(erlotinib)、BMS-387032、夫拉平度(flavopiridol)、 XL647、達(dá)沙替尼(dasatinib)、AZM-475271、伊馬替尼(imatinib)、AZD-1152、索拉非尼 (sorafenib)、PD-0332991，其衍生物、其生理學(xué)可接受的鹽、及其任意組合。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和/或治療HCV感染和HCV相關(guān)疾病的靶向系統(tǒng)和方案。 具體地，本發(fā)明涉及通過抑制此處公開的激酶的活性干擾HCV-宿主細(xì)胞相互作用、特別是 HCV進入的藥劑。這些激酶抑制劑可用于預(yù)防或治療HCV感染(急性或慢性HCV感染)和 HCV相關(guān)疾病或紊亂(例如肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞瘤)。抑制HCV進入細(xì)胞的激酶抑制劑 (例如本文提供的那些)作為抗病毒治療藥物是特別有吸引力的。本發(fā)明的激酶抑制劑可應(yīng)用于多種預(yù)防和治療應(yīng)用中。因此，在另一方面，本發(fā)明的激酶抑制劑提供防止細(xì)胞(例如易感細(xì)胞或易感細(xì)胞群)的HCV感染、防止或治療受試者中的HCV感染或HCV相關(guān)疾病、和防止肝移植患者的HCV復(fù)發(fā)。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了降低易感細(xì)胞由于接觸HCV而感染HCV的可能性的方法，該方法包括使易感細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的激酶抑制劑接觸。本發(fā)明也提供了降低受試者的易感細(xì)胞由于與HCV接觸而受到HCV感染的可能性，該方法包括給予受試者有效量的本發(fā)明的激酶抑制劑。本發(fā)明也提供了在需要的受試者中治療或預(yù)防HCV感染或HCV 相關(guān)疾病(例如肝疾病或病理狀態(tài))的方法，該方法包括給予受試者有效量的本發(fā)明的激酶抑制劑。本發(fā)明也提供了防止肝移植患者的HCV復(fù)發(fā)的方法，該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明的激酶抑制劑。將本發(fā)明的激酶抑制劑給予受試者可以通過任何合適的途徑， 包括例如腸胃外、氣霧劑、口服和局部途徑。本發(fā)明的激酶抑制劑可以單獨給予或與例如抗病毒劑的治療劑聯(lián)合給予。因此，本發(fā)明的激酶抑制劑包括那些本領(lǐng)域已知為至少一種此處所述目標(biāo)激酶的活性抑制劑的藥劑和那些通過此處公開的任一種篩選試驗鑒別的藥劑。特別是，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了 Dorsomorphin、達(dá)沙替尼、埃羅替尼、夫拉平度、凡德他尼、吉非替尼或拉帕替尼在預(yù)防或治療HCV感染中的應(yīng)用。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了達(dá)沙替尼或埃羅替尼在防止肝移植患者的HCV復(fù)發(fā)中的應(yīng)用。本發(fā)明的激酶抑制劑可以以本來的形式給予或以藥物組合物的形式給予。因此， 在另一方面，本發(fā)明提供了將本發(fā)明的激酶抑制劑用于制備治療和/或預(yù)防HCV感染和HCV 相關(guān)疾病的藥物、藥物組合物、藥物試劑盒的用途。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了包含有效量的本發(fā)明的激酶抑制劑以及至少一種可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。在某些實施方式中，藥物組合物適合與另外的治療劑 (例如抗病毒劑)聯(lián)合給藥。在其它實施方式中，藥物組合物還包含另外的治療劑，例如抗病毒劑。適用于本發(fā)明方法和藥物組合物中的抗病毒劑包括但不限于干擾素(例如，α 干擾素和聚乙二醇化的α干擾素)、利巴韋林、抗HCV(單克隆或多克隆)抗體、RNA聚合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、IRES抑制劑、解旋酶抑制劑、反義化合物、核酶及其任意組合。對于閱讀了以下優(yōu)選實施方式的詳細(xì)說明的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，本發(fā)明的這些和其它目的、優(yōu)勢和特征將會變得明顯。附圖簡述圖1是一張表格，其中示出了在初步實驗(見實施例1)中鑒別為針對HCV感染的抗病毒治療的潛在靶標(biāo)的69種人蛋白激酶。如果使用SiRNA進行沉默化，則編碼這些蛋白激酶的基因顯示對病毒進入細(xì)胞有HCV特異性的影響(即，使用HCVpp的HCV感染減少，但對對照假型VSVpp沒有類似的影響)。各蛋白激酶的全稱及相應(yīng)基因的GenBank登錄號也在表格中給出。圖2是一張表格，其中示出了在初步實驗(見實施例1)中鑒別為針對HCV感染的抗病毒治療的潛在靶標(biāo)的32種蛋白激酶。如果使用siRNA進行沉默化，則編碼這些蛋白激酶的基因顯示病毒進入細(xì)胞顯著減少，而不考慮基因沉默化對VSVpp進入引起的變化。各蛋白激酶的全稱及相應(yīng)基因的GenBank登錄號也在表格中給出。圖3證明表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑顯著抑制HCVpp進入和HCVcc感染(實驗細(xì)節(jié)見實施例1)。在與埃羅替尼(圖3A)、吉非替尼(圖3B)、拉帕替尼(圖3C)和凡德他尼(圖3D)孵育后，通過Huh7. 5. 1細(xì)胞中HCV RNA的螢光素酶報道基因表達(dá)或RT-PCR評估了 HCVpp進入(HCVpp H77C，基因型la)和HCVcc JFHl感染。細(xì)胞與溶劑(CTRL)、1 μ M 或10 μ M抑制劑孵育，從感染前1小時到感染后3小時。感染后72小時評價螢光素酶活性， 并相對于總蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為相對于對照細(xì)胞的％ HCVpp進入或HCVcc感染 (CTRL = 100%，示出了平均值士SD)。圖4顯示在第二次實驗中用來鑒別宿主細(xì)胞來源的HCV進入輔助因子的功能性 RNAi HCVpp進入篩選的示意略圖。篩選的細(xì)節(jié)在實施例2中給出。圖5是一張表格，其中示出了在第二組實驗(見實施例幻中鑒別的78種可影響 HCV進入和HCV感染啟動的人蛋白激酶。發(fā)現(xiàn)表格中示出的前34種人蛋白激酶對HCV進入和HCV感染有功能性影響，而對VSV進入沒有影響(圖5A)。各蛋白激酶的全稱及相應(yīng)基因的GenBank登錄號也在表格中給出。圖6顯示在第二組實驗中鑒別為對HCV進入有顯著影響的細(xì)胞激酶的生物學(xué)過程和蛋白質(zhì)締合網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果。鑒別的78種參與HCV進入的細(xì)胞激酶(A)和鑒別的34 種影響HCV進入但不影響VSV進入的激酶⑶利用hgenuity Pattiways數(shù)據(jù)庫進行分析。 該分析確定了生物體內(nèi)具有與鑒別的候選激酶相關(guān)的最普遍的生物過程的項(閾值P值 < IO-5)。最顯著的生物學(xué)功能項按P值升序排列。(C)通過STRING分析鑒別的78種參與 HCV進入的激酶的蛋白質(zhì)締合網(wǎng)絡(luò)。連接激酶的線顯示來自大量來源的直接(物理)和間接(功能性)締合，這些來源包括實驗儲庫、計算預(yù)測方法和公共文本收集。參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、緊密連接和細(xì)胞極性(綠色)、細(xì)胞粘附(深綠色)和細(xì)胞周期進展(藍(lán)色)的激酶被突出顯示。(D)在RNAi篩選中鑒別的細(xì)胞激酶對HCV進入機制的影響模型。HCV進入因子以橙色顯示，在進入篩選中鑒別的細(xì)胞激酶以紅色示出。圖7證明了肝激酶Bl (STKll)和AMP-活化蛋白激酶亞基Y 2 (PRKAG2)表達(dá)的沉默化導(dǎo)致HCVpp進入和HCVcc感染的抑制(見實施例2)。Huh7. 5細(xì)胞中特異性siRNA個體對STKll (A)或PRKAG2 (B)的沉默化導(dǎo)致來自于基因型la、la、2a、3a和如的HCVpp進入 (左欄)和HCVcc感染(HCVcc Luc-Jcl ；基因型h/a2)(右欄)的抑制。相反，對照siRNA 轉(zhuǎn)染(CTRL)不影響HCV感染。蛋白激酶抑制劑Dorsomorphin對AMPK活性的抑制抑制了 Huh7. 5細(xì)胞中的HCVpp進入(HCVpp H77C ；基因型la) (C)和Huh7. 5. 1細(xì)胞中的HCVcc 感染(HCVcc Luc-Jcl ；基因型(D)。Huh7. 5細(xì)胞中的細(xì)胞生存力沒有降低，但是在 Huh7. 5. 1中略微降低(如通過MTT試驗顯示)(C-D)。細(xì)胞用10 μ M Dorsomorphin預(yù)處理1小時并在感染過程中處理6小時。數(shù)據(jù)表示為相對于CTRL siRNA-感染細(xì)胞或溶劑對照處理細(xì)胞的HCVpp進入、HCVcc感染或細(xì)胞生存力的百分比(CTRL = 100% ；示出了平均值士 SD)。圖8證明了人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中EphA2和EGFR表達(dá)的沉默化導(dǎo)致獨立于基因型的 HCVpp進入和HCVcc感染的抑制。(A)使用siRNA個體對Huh7. 5細(xì)胞中EphA2或EGFR基因轉(zhuǎn)錄的沉默化導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)減少。如通過免疫沉淀和Western印跡法所示，將表達(dá)與對照SiRNA(CTRL)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進行比較。模擬物=未處理的細(xì)胞。(B)特異性siRNA 個體對EphA2、EGFR或⑶81表達(dá)的沉默化導(dǎo)致來源于基因型la、lb、2a、3a和4a的HCVpp 進入的抑制。與EGFR相反，EphA2沉默化對VSVpp對照顆粒的進入沒有影響。(C) siRNA個體對EphA2、EGFR或CD81表達(dá)的沉默化導(dǎo)致HCVcc感染(HCVcc Luc-Jc 1，基因型2a/2a)的顯著抑制。相反，對照siRNA轉(zhuǎn)染(CTRL)不影響HCV感染。數(shù)據(jù)表示為相對于CTRL_siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的％ HCVpp進入或HCVcc感染(CTRL = 100% ；示出了平均值士SD)。圖9顯示蛋白激酶抑制劑達(dá)沙替尼和埃羅替尼對HCVcc感染和HCVpp進入的劑量依賴性抑制。與達(dá)沙替尼或埃羅替尼孵育后，通過螢光素酶報道基因表達(dá)評價Huh7. 5細(xì)胞的HCVcc感染(HCVcc Luc-Jc 1，基因型2a/2a) (A)和原代人肝細(xì)胞中的HCVpp進入(HCVpp JFHl ；基因型2a) (B)0達(dá)沙替尼和埃羅替尼以劑量依賴的方式抑制HCVcc感染(A)和原代人肝細(xì)胞中的HCVpp進入(B)。激酶抑制劑在感染前1小時加入。處理的細(xì)胞的生存力利用MTT試驗評價，并且顯示為灰色虛線。數(shù)據(jù)表示為HCVcc感染或HCVpp進入相對于溶劑處理的對照細(xì)胞的百分比(CTRL = 100% ；示出了平均值士SD)。(C)達(dá)沙替尼和埃羅替尼不抑制HCV復(fù)制，作為HCVcc復(fù)制百分比。如實施例2所述，Huh7.5細(xì)胞用來自亞基因組 HCV JFHl復(fù)制子的HCV RNA轉(zhuǎn)染。電穿孔4小時后，細(xì)胞與溶劑對照、達(dá)沙替尼或埃羅替尼孵育24小時。HCV RNA和GAPDH RNA通過Northern印跡法進行分析。圖10證明用多激酶抑制劑靶向宿主細(xì)胞激酶導(dǎo)致來源于肝移植患者的HCV分離株感染的抑制。來自HCV株VD、VH、VK、VN的帶有包膜糖蛋白的HCVpp(基因型lb)在肝移植過程中從4名不同HCV感染患者中分離。在Huh7. 5中使用針對EphA2、EGFR或⑶81的特異性siRNA個體進行基因沉默化(A)，和在感染前1小時用濃度為10 μ M的達(dá)沙替尼或埃羅替尼處理Huh7.5細(xì)胞(B)或原代人肝細(xì)胞(PHH) (C)，抑制了所有株的進入。相反，渥曼青霉素(10 μ M)不抑制HCVpp進入。基因沉默化(與非特異性對照siRNA相比)或抑制劑處理(與溶劑對照相比)都不降低細(xì)胞生存力(B-C)。數(shù)據(jù)表示為相對于對照siRNA-感染的細(xì)胞或溶劑對照處理的細(xì)胞的HCVpp進入或細(xì)胞生存力的百分比(CTRL = 100% ；示出了平均值士 SD)。定義在整個說明書中使用了一些術(shù)語，這些術(shù)語在下文中定義。術(shù)語“激酶”和“蛋白激酶”在本文中可以互換使用。它們指催化磷酸基團從核苷三磷酸轉(zhuǎn)移至參與信號途徑的另一分子(在此稱為“底物”或“激酶底物”)的特定氨基酸殘基的酶。例如，磷酸基團可以從ATP或GTP(腺苷或鳥苷三磷酸)轉(zhuǎn)移。激酶可以是跨膜或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。真核蛋白激酶的特征在于構(gòu)成催化(激酶)結(jié)構(gòu)域的大約250個氨基酸的連續(xù)區(qū)段的序列。激酶可以是酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、組氨酸激酶或雙特異性激酶。
術(shù)語“激酶活性”和“激酶的活性”在本文中可以互換使用，是指蛋白激酶催化底物分子的特定氨基酸殘基磷酸化的能力。當(dāng)用于化合物時，術(shù)語“激酶活性抑制劑”是指該化合物能夠抑制(例如完全抑制或部分降低)蛋白激酶催化磷酸基團從核苷三磷酸轉(zhuǎn)移到底物分子的特定氨基酸殘基的能力。在本發(fā)明的實踐中，激酶活性的抑制可以通過多種機制中的任一種實現(xiàn)。但是，無論機制如何，激酶活性的抑制都導(dǎo)致激酶催化其底物磷酸化的能力降低。因此，“抑制”的意思是在化合物存在下孵育后，例如在本發(fā)明的試驗中，底物的磷酸化水平降低至少50 %。優(yōu)選地，該化合物使底物的磷酸化水平降低至少90%。更優(yōu)選地，該化合物使底物的磷酸化水平降低至少95%。在本發(fā)明的激酶分析中誘導(dǎo)這種底物分子磷酸化水平降低的候選化合物被“鑒別”為激酶活性抑制劑。因此，在某些實施方式中，“激酶活性抑制劑”是已經(jīng)通過本發(fā)明的篩選方法確定為抑制/阻抑給定激酶活性的化合物。術(shù)語“蛋白激酶信號途徑”和“蛋白激酶級聯(lián)”在本文中可以互換使用。它們是指激酶蛋白信號級聯(lián)的上游和下游成分。術(shù)語“底物”和“激酶底物”在本文中可以互換使用。它們是指參與一個或多個信號途徑的分子，它們通過激酶的作用可以被磷酸化，并且其磷酸化最終導(dǎo)致一個或多個細(xì)胞應(yīng)答的改變。示例性的底物包括但不限于代謝酶、基因調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白或其他蛋白激酶(例如，參與相同信號途徑的下游激酶)。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“激酶激活物”是指任何細(xì)胞外或其他類型的刺激物，它能引發(fā)激酶的活化，激酶的活化又誘導(dǎo)底物分子的磷酸化。激酶激活物的例子包括環(huán)境應(yīng)激信號(例如滲透壓休克、熱休克、低氧和UV照射)、化學(xué)應(yīng)激信號(例如氧化應(yīng)激、人類致癌物和環(huán)境污染物)和生化刺激物(例如生長因子、細(xì)胞因子、生長激素和神經(jīng)遞質(zhì))。生化刺激物通常是影響其他細(xì)胞功能的細(xì)胞自然分泌的分子。當(dāng)用于蛋白激酶時，術(shù)語“組成型活性”是指激酶在不存在激酶激活物的情況下具有催化底物磷酸化的能力。組成型活性激酶可以在本發(fā)明的篩選試驗中使用的細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)，或者，細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)化從而表達(dá)組成型活性激酶。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“基因”是指編碼不連續(xù)產(chǎn)物(RNA或蛋白質(zhì))的多核苷酸，并且可以包括位于編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。由于一種以上的多核苷酸可以編碼不連續(xù)產(chǎn)物，該術(shù)語也包括編碼同一產(chǎn)物的基因的等位基因和多態(tài)性，或其功能相關(guān)(包括功能的獲得、喪失或調(diào)節(jié))的類似物。本文使用的術(shù)語“基本同質(zhì)群”當(dāng)用于細(xì)胞時是指這樣的細(xì)胞群體該群體中至少大約80%、優(yōu)選至少大約90%的細(xì)胞具有相同的細(xì)胞型。細(xì)胞型的例子包括但不限于血小板、淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等等。術(shù)語“系統(tǒng)”和“生物系統(tǒng)”在本文中可以互換使用。它們是指體外、體內(nèi)或離體生物實體，如細(xì)胞、生物流體或生物組織。例如，系統(tǒng)可以來源于活的受試者(例如它可以通過活檢或通過抽血獲得)或來自死亡的受試者(例如，它可以在尸檢時獲得)。從中獲得生物系統(tǒng)的受試者可以是HCV感染的動物模型?；蛘?，它可以是人類。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“受試者”是指可以成為丙型肝炎病毒(HCV)宿主的人或其它的哺乳動物，例如靈長類、狗、貓、山羊、馬、豬、小鼠、大鼠、兔等，但是可以受到或未受到該病毒的感染和/或患上或未患上HCV相關(guān)疾病。非人類受試者可以是轉(zhuǎn)基因的或用其它方法改變的動物。在本發(fā)明的許多實施方式中，受試者是人類。在這樣的實施方式中，受試者常被稱為“個體”。術(shù)語“個體”不表示特定的年齡，并因此包括新生兒、兒童、青少年和成年人。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“HCV”是指任何主要的HCV基因型、亞型、分離物和/或準(zhǔn)種。 HCV基因型包括但不限于基因型1、2、3、4、5和6 ;HCV亞型包括但不限于亞型la、lb、2a、2b、 2c、3a、4a_f、5a 禾口 6a。術(shù)語“患有HCV”或“感染HCV”在本文中可互換使用。當(dāng)這兩個術(shù)語用于受試者時，是指患者的至少一個細(xì)胞被HCV感染。術(shù)語“HCV感染”是指例如通過靶細(xì)胞膜與HCV 或HCV包膜糖蛋白陽性細(xì)胞的融合將HCV的遺傳信息引入靶細(xì)胞中。術(shù)語“HCV相關(guān)疾病”和“與HCV有關(guān)的疾病”在本文中可互換使用。其是指已知或懷疑與HCV有關(guān)的和/或直接或間接地由HCV引起的疾病或紊亂。HCV相關(guān)(或與HCV有關(guān)) 的疾病包括但不限于眾多的肝臟疾病，例如急性肝炎的亞臨床攜帶者狀態(tài)(subclinical carrier state)、慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌。該術(shù)語包括任何HCV感染的癥狀和副作用， 包括潛伏的、持續(xù)的和亞臨床的感染，無論感染是否是臨床顯性的。術(shù)語“治療”在本文中用于表示目的在于(1)延緩或防止疾病或病癥(例如HCV 感染或HCV相關(guān)疾病)的發(fā)作；(2)減慢或阻止疾病或病癥的癥狀的發(fā)展、惡化或劣化；(3) 促進疾病或病癥的癥狀的改善；或(4)治愈疾病或病癥的方法或過程。治療可以在疾病或病癥發(fā)作前進行，以發(fā)揮預(yù)防或防止作用?？蛇x擇地或另外地，治療可在疾病開始后進行以發(fā)揮治療作用。“藥物組合物”在本文中定義為包含有效量的至少一種生物活性成分(例如蛋白激酶抑制劑)和至少一種可藥用載體或賦形劑。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“有效量”是指足以實現(xiàn)其預(yù)期的目的(例如在細(xì)胞、組織、系統(tǒng)或受試者中期望的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng))的化合物或組合物的任何量。例如，在本發(fā)明某些實施方式中，所述目的可以是抑制激酶的活性；防止HCV感染，防止HCV相關(guān)疾病的發(fā)作， 減慢、減輕或阻止HCV相關(guān)疾病(例如慢性丙型肝炎、肝硬化等)的癥狀的發(fā)展、惡化或劣化，促進疾病癥狀的改善和/或治愈HCV相關(guān)疾病。術(shù)語“可藥用載體或賦形劑”是指不會干擾活性成分生物活性的效力并且在所施用的濃度下對宿主沒有過度的毒性的載體介質(zhì)。該術(shù)語包括溶劑、分散體、介質(zhì)、涂料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。將這類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)在本領(lǐng)域中是公知的(見例如"Remington' s Pharmaceutical Sciences" ，Ε· W. Martin，第 18 版， 1990，Mack Publishing Co. :Easton，PA，將該文獻全部內(nèi)容通過引用并入本文)。術(shù)語“易感細(xì)胞”和“HCV易感細(xì)胞”在此可互換使用。它們是指可被HCV感染的任何細(xì)胞。易感細(xì)胞包括但不限于肝臟或肝細(xì)胞、原代細(xì)胞、肝細(xì)胞瘤細(xì)胞、CaCo2細(xì)胞、 樹突細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞(B和T細(xì)胞)、外周血單核細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。當(dāng)術(shù)語“防止、抑制或阻斷HCV感染”用于藥劑(例如蛋白激酶抑制劑)時，是指與不存在該藥劑的情況下引入的HCV遺傳信息的量相比，減少引入易感細(xì)胞或易感細(xì)胞群中的HCV遺傳信息的量。
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術(shù)語“候選化合物”是指任何天然存在的或非天然存在的分子，如生物大分子(例如核酸、多肽或蛋白質(zhì))、有機或無機分子、或從將要檢測目標(biāo)活性的諸如細(xì)菌、植物、真菌或動物(特別是哺乳動物，包括人類)細(xì)胞或組織等生物材料獲得的提取物。在本發(fā)明的篩選方法中，評價候選化合物抑制給定蛋白激酶的活性的能力。本文使用的術(shù)語“小分子”是指任何天然或合成的低分子量有機或無機化合物或因子。優(yōu)選的小分子的分子量為大于50道爾頓且小于2500道爾頓。更優(yōu)選地，小分子的分子量小于600-700道爾頓。再更優(yōu)選地，小分子的分子量小于350道爾頓。本文使用的術(shù)語“生理學(xué)可接受的鹽或前藥”是指這樣的鹽或前藥它們在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于與患者的組織接觸，而不引起過度的毒性、刺激、變應(yīng)性應(yīng)答等，具有合理的收益/風(fēng)險比，并且對于預(yù)期應(yīng)用是有效的。術(shù)語“鹽”是指任何酸加成鹽或堿加成鹽，它們分別保留相應(yīng)的游離堿或游離酸的生物活性和性質(zhì)，并且在生物學(xué)或其它方面是理想的。酸加成鹽由無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)和有機酸(例如乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等)形成。堿加成鹽可由無機堿(例如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鋅、鋁鹽等)和有機堿(例如以下物質(zhì)的鹽伯胺、仲胺和叔胺、取代胺，包括天然存在的取代胺、環(huán)胺和堿性離子交換樹脂，如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基-氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、氨基丁三醇、二環(huán)己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、哈胺(hydrabamine)、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿(theobromine)、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、 聚胺樹脂等)形成。術(shù)語“前藥”是指在體內(nèi)給藥后被代謝或以其他方式轉(zhuǎn)化為該化合物的生物學(xué)、藥學(xué)或治療活性形式的化合物。前藥可以設(shè)計為改變化合物的代謝穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)運特性、掩蔽副作用或毒性、改善化合物的香味、和/或改變化合物的其他特性或性質(zhì)?；趯w內(nèi)藥效學(xué)過程和藥物代謝的了解，一旦確定了藥物活性化合物，制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員通常可以設(shè) ifHHMit^^^mM (Nogrady,"Medicinal Chemistry A Biochemical Approach", 1985, Oxford University Press :N. Y.，第388-392頁)。選擇和制備合適的前藥的程序也是本領(lǐng)域已知的。當(dāng)術(shù)語“大約”和“約”在本文中用于數(shù)值時，除非另外指明或從上下文中另外證明的外，通常包括落入該值沿任一方向(大于或小于該值)的10%范圍內(nèi)的值(除了所述值超過可能值的100%的情況)。某些優(yōu)選實施方式的詳細(xì)說明如上所述，本發(fā)明提供了一組作為抗病毒物質(zhì)的假定目標(biāo)的新的HCV進入因子， 所述因子通過應(yīng)用靶向691種細(xì)胞激酶和相關(guān)蛋白的功能性siRNA篩選并研究激酶基因沉默化對于HCV進入因子的效應(yīng)來鑒別。已鑒別的在HCV進入和感染中直接或間接地發(fā)揮作用的蛋白激酶提供新的治療方案、有用的抗病毒療法和新的篩選方法(如分析)和材料，以發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的抗病毒劑。I-宿主細(xì)胞蛋白激酶在精選的一組實驗中(參見實施例2和圖3)，申請人進行了初步和二級篩選，以鑒別可影響HCV進入和HCV感染啟動的人激酶基因。更具體地說，這些基因的沉默化導(dǎo)致HCVpp和HCVcc進入細(xì)胞顯著減少。這些篩選導(dǎo)致鑒別了具有以下GenBank登錄號的 78 種激酶基因NM_001743、NM_004383、NM_173515、NM_001123、NM_001258、NM_004064、 NM_001262、NM_004431、NM_004444、NM_006712、NM_005248、NM_004517、NM_001570、 NM_007229、NM_152835、NM_003559、NM_004203、NM_004073、NM_016457、NM_003576、 NM_003390、NM_016508、NM_001619、NM_001826、NM_004734、NM_006182、NM_017729、 NM_005255、NM_002220、NM_002749、NM_005884、NM_000455、NM_007271、NM_003331、 NM_001106、NM_005876、NM_000051、NM_004217、NM_001721、NM_004333、NM_001786、 NM_033487、NM_000075、NM_001260、NM_001277、NM_005198、NM_006383、NM_020990、 NM_004080、NM_005228、NM_005233、NM_004441、NM_005246、NM_002011、BF688722、 NM_022158、NM_000162、NM_025211、NM_182982、NM_001556、NM_006116、NM_024117、 NM_033116、NM_024594、NM_018425、NM_005028、NM_016203、NM_006742、NM_173176、 NM_031480、NM_004755、NM_031464、NM_030 974、XM_051221、NM_05284U NM_005781 和 NM_014683。因此，本發(fā)明提供78種人細(xì)胞蛋白激酶作為針對HCV感染和HCV相關(guān)疾病的醫(yī)療干預(yù)的新靶標(biāo)。這些蛋白激酶由上述78種基因編碼。更具體地說，這些激酶是CALM2、CSK、 MAGI1、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、 PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、 GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、AURKB、BMX、BRAF、CDC2、 CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA、CHKB、CIB2、CKMT1、DGKB、EGFR、EPHA3、EPHB1、FER、FGFR4、FLT3LG、 FN3K、GCK、GKAP1、GRK4、IKBKB、MAP3K71P1、MAPKAP1、NEK9、PANK3、P14KII、PIP5K2A、PRKAG2、 PSKHl、PTK2、PTK2B、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin,SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2。在圖 5所列的表中提供了蛋白激酶(和相應(yīng)的基因)的全稱和基因的GenBank登錄號。進行并排篩選(side-by-side screen)以鑒別激酶基因，如果使用siRNA進行沉默化，該激酶基因顯示HCVpp和HCVcc進入細(xì)胞顯著減少，但沒有導(dǎo)致VSVpp進入細(xì)胞有任何變化。這導(dǎo)致鑒別了具有以下GenBank登錄號的34種激酶基因NM_001743、NM_004383、 NM_173515、NM_001123、NM_001258、NM_004064、NM_001262、NM_004431、NM_004444、 NM_006712、NM_005248、NM_004517、NM_001570、NM_007229、NM_152835、NM_003559、 NM_004203、NM_004073、NM_016457、NM_003576、NM_003390、NM_016508、NM_001619、 NM_001826、NM_004734、NM_006182、NM_017729、NM_005255、NM_002220、NM_002749、 NM_005884、NM_000455、NM_007271 和 NM_003331。因此，本發(fā)明提供34種人細(xì)胞蛋白激酶作為針對病毒感染、特別是HCV感染和 HCV相關(guān)疾病的醫(yī)療干預(yù)的新靶標(biāo)。這些蛋白激酶由上述34種基因編碼。更具體地說，這些激酶是CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、ΕΡΗΑ2、ΕΡΗΒ4、FASTK, FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STKll、STK38 和 TYK2。在圖 5A 所列的表中提供了激酶(和相應(yīng)的基因)的全稱和基因的GenBank登錄號。使用STRING數(shù)據(jù)庫對78種人激酶進行的生物信息學(xué)分析揭示了調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài) (包括細(xì)胞極性、緊密連接滲透性和整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo))的激酶網(wǎng)絡(luò)以及參與細(xì)胞周期的激酶網(wǎng)絡(luò)(圖6C)。這樣鑒別了總共23種人激酶，尤其包括2種調(diào)節(jié)細(xì)胞極性的激酶、3種調(diào)節(jié)緊密連接的激酶、4種參與整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)的激酶；和8種參與細(xì)胞周期的激酶。因此，本發(fā)明提供17種人細(xì)胞蛋白激酶作為針對病毒感染、特別是HCV感染和HCV 相關(guān)疾病的醫(yī)療干預(yù)的新靶標(biāo)。這17種蛋白激酶是STKll、PRKAG2、MAGI-l、EphA2、EGFR、 CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 和 WEEl。申請人:已經(jīng)使用批準(zhǔn)的激酶抑制藥物驗證了鑒別的蛋白激酶是針對HCV感染的醫(yī)療干預(yù)的新靶標(biāo)(參見實施例1和幻。他們發(fā)現(xiàn)，用D0rS0m0rphin(AMPK活性的抑制劑)預(yù)孵育Η 7. 5細(xì)胞顯著抑制HCVpp進入，從而證實了 STKll和PRKAG2的作用。類似地，與達(dá)沙替尼(EphA2功能的抑制劑)預(yù)孵育顯著抑制在原代人肝細(xì)胞中的HCVpp進入和Huh7. 5. 1細(xì)胞的HCVcc感染，這證實EphA2功能對于HCV進入是重要的。此外，申請人發(fā)現(xiàn)，使用埃羅替尼抑制EGFR活性劑量依賴性地抑制了 HCV進入和HCV感染，從而證實了 EGFR的作用。使用其他EGFR抑制劑如凡德他尼、吉非替尼和拉帕替尼，獲得類似的結(jié)果。 最后，夫拉平度(良好表征的CDK家族的抑制劑)顯著抑制在原代人肝細(xì)胞中的HCVpp進入，證實細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、特別是CDK3的作用。因此，本發(fā)明提供以下蛋白激酶作為針對病毒感染、特別是HCV感染和HCV相關(guān)疾病的醫(yī)療干預(yù)的新靶標(biāo)。這些蛋白激酶是STK11、PRKAG2、EPHA2、EGFR和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、特別是CDK3。II-作為HCV抗病毒劑的激酶抑制劑本發(fā)明者鑒別的人細(xì)胞蛋白激酶可以用作鑒定、設(shè)計和開發(fā)新的HCV抗病毒劑的靶標(biāo)?？捎米鱄CV抗病毒劑的激酶抑制劑可以屬于多種分子家族中的任一個，包括但不限于有機化合物(例如，小分子、糖類、類固醇類等)、單克隆或多克隆抗體(例如，結(jié)合激酶的抗體)、肽、多肽、核酸分子(例如，反義化合物、核酶、三股螺旋分子、SELEXRNAs等)。如上文提及，本發(fā)明的激酶抑制劑可以通過多種機制中的一種或多種發(fā)揮其作用，該機制導(dǎo)致感興趣的蛋白激酶催化其底物磷酸化的能力受到抑制(例如，完全抑制或部分降低)。因此，激酶抑制劑可以通過以下方式來發(fā)揮其作用例如，通過抑制、阻斷或防止編碼感興趣的激酶的基因的表達(dá)(基因治療方法)，和/或抑制、阻斷或防止酶活性(包括通過激酶底物的活性或功能的競爭或調(diào)節(jié)，或通過競爭性結(jié)合激酶或其催化/酶結(jié)構(gòu)域，通過競爭性結(jié)合激酶底物和/或任何上游和/或下游激酶效應(yīng)器)。本發(fā)明提供通過根據(jù)抑制至少一種本文公開的(見下文)激酶的活性的能力篩選候選化合物，鑒別可用于預(yù)防和/或治療HCV感染的化合物的方法。本發(fā)明包括通過本發(fā)明的篩選方法鑒別為激酶抑制劑的任一種化合物。然而，本發(fā)明還包括本領(lǐng)域的已知化合物在抑制本文公開的至少一種蛋白激酶的活性中的應(yīng)用。這些蛋白激酶抑制劑通常被設(shè)計為抗癌藥物，且由不同公司開發(fā)，所述公司包括但不限于Genetech、Boehringer Ingelheim, Imclone、Novartis、Roche、AstraZeneca、OSI> Onyx、Bayer> Pfizer、BMS> Sanofi> GSK 禾口 Amgen。已知的激酶抑制劑的例子包括但不限于2-氰基-3，12- 二氧代齊墩果-1，9- 二烯-28-酸甲酯(用于CHUK的抑制)；西妥昔單抗(用于EGFR的抑制)、AEE 788、帕木單抗、BMS-599626、ARRY-334543、XL647、卡紐替尼、吉非替尼、HKI-272、PD 153035、拉帕替尼、凡德他尼和埃羅替尼(用于EGFR的抑制)；BMS-387032和夫拉平度(用于⑶K2、⑶K3、 CDK4和CDK8的抑制)；XL647 (用于EPHB4的抑制)；達(dá)沙替尼和AZM-475271 (用于SRC的抑制)；伊馬替尼(用于BCR的抑制作用)；達(dá)沙替尼(用于EPHA2的抑制)；和AZD_1152(用于AURKB的抑制)。已知的激酶抑制劑的其他例子包括但不限于索拉非尼(用于BRAF的抑制)；BMS-599626 (用于ERBB4的抑制)；PD-0332991和夫拉平度(用于CDK4的抑制)。如上文提及，本申請人已經(jīng)表明，一些激酶的已知抑制劑可以顯著抑制HCV進入和HCV感染(參見實施例1和2)。因此，本發(fā)明提供所有已知的EGFR活性抑制劑埃羅替尼 (Tarceva )、凡德他尼(Zactima )、吉非替尼(Iressa )或拉帕替尼(Tyverb )在預(yù)防和/或治療HCV感染中的用途。本發(fā)明還提供了 AMPK活性抑制劑D0rS0m0rphin、EphA2功能抑制劑達(dá)沙替尼(Sprycel )或⑶K家族(包括⑶K3、⑶C2、⑶K2、⑶K4和⑶K8)的良好表征的抑制劑夫拉平度(Alvocidib )在預(yù)防和/或治療HCV感染中的用途。本申請人還表明，埃羅替尼和達(dá)沙替尼分別對EGFR和EphA2功能的抑制，阻斷了所有主要HCV基因型的進入和在肝移植過程中從HCV感染患者分離的一大組病毒株的進入 (參見實施例2)。因此，本發(fā)明提供埃羅替尼或達(dá)沙替尼在預(yù)防肝移植患者的HCV復(fù)發(fā)中的用途。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供這些已知的激酶抑制劑中的任何一種在制造預(yù)防或治療 HCV感染與HCV相關(guān)疾病的藥物中的用途。III-鑒別激酶抑制劑為HCV抗病毒劑的方法如上所述，本發(fā)明提供鑒別化合物的方法，所述化合物通過抑制本發(fā)明的至少一種激酶的活性減少、抑制或阻抑HCV進入細(xì)胞和/或HCV感染。各種分析方案和檢測技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，且可以很容易地為本領(lǐng)域的技術(shù)人員用于此目的。這些方法包括但不限于高通量分析(如，微陣列技術(shù)、噬菌體展示技術(shù))及體外和體內(nèi)細(xì)胞和組織分析。在某些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法包括在一定條件下將表達(dá)(或可以表達(dá))本發(fā)明的至少一種激酶的生物系統(tǒng)與候選化合物一起孵育一段時間，該條件和時間足以使得該候選化合物調(diào)節(jié)激酶活性；和測量激酶活性。降低激酶活性的候選化合物被鑒別為激酶抑制劑和潛在的HCV抗病毒劑。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法更具體地包括在一定條件下將表達(dá)(或可以表達(dá))本發(fā)明的至少一種激酶的生物系統(tǒng)與候選化合物一起孵育一段時間，該條件和時間足以使得該候選化合物調(diào)節(jié)激酶活性，從而獲得測試系統(tǒng)；在沒有該候選化合物的情況下，在相同條件下孵育生物系統(tǒng)相同的時間，從而獲得對照系統(tǒng)；在測試系統(tǒng)中測量至少一種代表激酶活性的因子；在對照系統(tǒng)中測量該因子；比較在測試系統(tǒng)和對照系統(tǒng)中測量的因子；如果在測試系統(tǒng)測量的因子小于或大于在對照系統(tǒng)中測量的因子，則確定該候選化合物抑制激酶的活性。本文提供的篩選方法將導(dǎo)致HCV抗病毒劑的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，所述HCV抗病毒劑通過抑制本發(fā)明的一種或多種激酶的活性發(fā)揮作用。這些藥劑可以潛在地用于治療和/或預(yù)防 HCV感染和/或HCV相關(guān)疾病和病癥。A.生物系統(tǒng)可以使用任何類型的生物系統(tǒng)(即細(xì)胞、生物流體、生物組織、或動物)進行本發(fā)明的分析和篩選方法。在某些實施方式中，系統(tǒng)是表達(dá)(或可以表達(dá))本發(fā)明的至少一種激酶的生物實體(例如，細(xì)胞、血液樣本、組織樣品、器官的全部或部分例如肝臟、或動物模型)。在某些實施方式中，生物系統(tǒng)可以受HCV感染(例如，易感HCV的細(xì)胞)。在某些實施方式中，可以使用在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料制品中生長的細(xì)胞進行本發(fā)明的分析和篩選方法。這些細(xì)胞包括所有正常的細(xì)胞和來自于任何認(rèn)可來源的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動物(人類或動物，如嚙齒動物或猿)來源的。更優(yōu)選地，細(xì)胞是人類來源的。哺乳動物細(xì)胞可以是任何器官或組織來源(如腦、肝、肺、心、腎、皮膚、肌肉、骨骼、 骨髓或血液等)和任何細(xì)胞類型的。合適的細(xì)胞類型包括但不限于基底細(xì)胞、上皮細(xì)胞、 血小板、淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、巨細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、 枯否細(xì)胞(Kupffer cell)、郎格罕氏細(xì)胞(Langerhans cell)、襯細(xì)胞(littoral cell)、 組織細(xì)胞如肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞、去核細(xì)胞等。在某些實施方式中，使用HCV易感的并表達(dá)本發(fā)明的至少一種激酶的細(xì)胞進行本發(fā)明的分析和篩選方法。這種細(xì)胞的例子包括但不限于，肝臟或肝細(xì)胞、原代人肝細(xì)胞、人類或其他物種的原代細(xì)胞、肝細(xì)胞瘤細(xì)胞、CaCo2細(xì)胞、 樹突狀細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞(B和T細(xì)胞)、外周血單核細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。用于實施本發(fā)明的分析和篩選方法的細(xì)胞可以是原代細(xì)胞、次級細(xì)胞或永生化細(xì)胞(如確立的細(xì)胞系)。它們可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來制備(例如，可以通過從患者或健康供體抽取血液或活檢獲得細(xì)胞)，或從免疫和微生物商業(yè)來源購買(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA))?？蛇x擇地或另外地，可以遺傳改造細(xì)胞以包含，例如，感興趣的基因，如表達(dá)感興趣的激酶的基因。在某些實施方式中，用于本發(fā)明的篩選方法的細(xì)胞具有一種以上的細(xì)胞類型。在其他實施方式中，細(xì)胞是單一細(xì)胞類型。優(yōu)選地，細(xì)胞來自基本上同質(zhì)的細(xì)胞群體，其中，群體中的至少大約80%、優(yōu)選至少大約90%的細(xì)胞是相同的細(xì)胞類型。用于本發(fā)明的方法的細(xì)胞可以來自同一物種的不同受試者或個體。不過，優(yōu)選地，細(xì)胞來自單一受試者或個體。為了進行本發(fā)明的分析而選擇特定的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞株取決于一些因素，如正在研究其活性的激酶的性質(zhì)，以及該分析的預(yù)期目的。例如，可以使用確立的細(xì)胞系優(yōu)選地進行為了初級藥物篩選(即第一輪篩選)而開發(fā)的分析，所述確立的細(xì)胞系是可商購的， 通常比較容易生長；而可以優(yōu)選使用原代或次級細(xì)胞進行藥物開發(fā)過程后期使用的分析， 所述原代或次級細(xì)胞往往比永生化細(xì)胞更難獲得、維持和/或生長，但它代表用于體內(nèi)情況的更好的實驗?zāi)Ｐ?。可以用于實施本發(fā)明的分析和篩選方法的建立的細(xì)胞系的例子包括!fepG2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞、IfepIBB肝細(xì)胞瘤細(xì)胞、原代肝細(xì)胞、Huh7衍生的細(xì)胞系和永生化肝細(xì)胞?？梢杂糜趯嵤┍景l(fā)明的篩選方法的原代和次級細(xì)胞包括但不限于上皮細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。用于本發(fā)明的分析的細(xì)胞可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來培養(yǎng)。例如，細(xì)胞通常在合適的容器中、無菌的環(huán)境下、37°C下、含有加濕的95%空氣-5% CO2氣氛的培養(yǎng)箱中生長。容器可以含有攪拌或靜止的培養(yǎng)物?？梢允褂貌煌?xì)胞培養(yǎng)基，包括含有成分不確定的生物流體如胎牛血清的培養(yǎng)基以及成分完全確定的培養(yǎng)基如^3SFM無血清培養(yǎng)基 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA) 0細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，且確立的方案可以用于多種細(xì)胞類型的培養(yǎng)(例如，參見，R. I. Freshney，“Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique，，,第二版，1987, Alan R. Liss, Inc.)。在某些實施方式中，使用在多孔分析板的多個孔中包含的細(xì)胞進行篩選方法。這些分析板是例如可從 Strategene Corp. (La Jolla, CA)和 Corning Inc. (Acton, MA)商購的，且包括例如48孔、96孔、384孔和1536孔板。如果需要，可以在分析之前確定細(xì)胞生存力，例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，包括組織學(xué)、 用放射性同位素定量評估、使用光學(xué)或掃描電子顯微鏡或熒光顯微鏡目視觀察。可選擇地， 可以通過熒光活化細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)評估細(xì)胞生存力。在其中感興趣的激酶是非組成型活性激酶的實施方式中，響應(yīng)于胞外或其他類型的刺激物(本文稱為“激酶激活物”)而發(fā)生底物分子的磷酸化。因此，在某些實施方式中， 本發(fā)明的分析包括在一定條件下將細(xì)胞暴露于激酶激活物，并持續(xù)一段時間，在這段時間內(nèi)可以發(fā)生激酶的活化并導(dǎo)致底物磷酸化(在沒有抑制劑的情況下)?？梢杂糜趯嵤┍景l(fā)明的方法的激酶激活物可以是多種刺激物中的任一種，包括環(huán)境應(yīng)激信號、化學(xué)應(yīng)激信號、 生化刺激及這些刺激的任意組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，為了開發(fā)本發(fā)明的分析方法而選擇激酶激活物取決于在存在候選化合物的情況下評估其活性的激酶的性質(zhì)。在涉及組成型活性的激酶(即在沒有刺激存在的情況下顯示催化底物分子磷酸化的能力的激酶)的實施方式中，本發(fā)明的方法不涉及使用激酶激活物的激酶刺激。在本發(fā)明的某些方法中，將細(xì)胞暴露于試劑、將細(xì)胞與試劑接觸、或?qū)⒓?xì)胞與試劑孵育包括將試劑加入含有細(xì)胞的容器中(例如，多孔板的一個孔)，在一定條件下，在試劑存在下，在合適的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞，持續(xù)一段時間，使得實現(xiàn)或可以實現(xiàn)特定試劑的預(yù)定作用。更具體地說，優(yōu)選在一定的條件下使細(xì)胞暴露于激酶激活物，所述條件允許在缺乏抑制劑的情況下，感興趣的(非組成型活性)蛋白激酶被激活和底物分子被磷酸化。優(yōu)選在一定的條件下使細(xì)胞暴露于待測試其對于給定激酶的活性的效應(yīng)的候選化合物，所述條件允許這種激酶活性的已知抑制劑發(fā)揮其作用。這些條件或者是本領(lǐng)域公知的，或者可以很容易地由本領(lǐng)域的技術(shù)人員，例如，根據(jù)經(jīng)驗確定。在某些實施方式中，本發(fā)明的分析和篩選方法可以包括在將細(xì)胞暴露于不同試劑前使其饑餓(Starve)的步驟。在感興趣的蛋白質(zhì)激酶沒有組成型活性的情況下，細(xì)胞饑餓可能特別有用?？梢酝ㄟ^任何合適的方法進行細(xì)胞饑餓，例如，通過在無血清或生長補充物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在某些實施方式中，本發(fā)明的分析和篩選方法可以包括固定細(xì)胞。 一般進行這一步驟以使細(xì)胞保持或“凍結(jié)”在一定狀態(tài)，優(yōu)選保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精確表示。例如，通常需要維持細(xì)胞的原始大小和形狀，以最小化細(xì)胞材料的損失，和/或保留它的細(xì)胞內(nèi)成分的反應(yīng)性和/或狀態(tài)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的任一種合適的化學(xué)和物理方法固定細(xì)胞。在某些實施方式中，本發(fā)明的分析和篩選方法包括細(xì)胞透化(permeabilization)的步驟。進行透化是為了方便進入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)分子、細(xì)胞的組成部分或結(jié)構(gòu)。特別地，透化可以允許藥劑進入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到比在缺乏這種透化處理的情況下正常滲入細(xì)胞的濃度更大的濃度?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行細(xì)胞的透化，包括但不限于暴露于去污劑或有機醇。B.候選化合物本發(fā)明的篩選方法可以用于鑒別能夠抑制至少一種本發(fā)明鑒別的激酶的活性的化合物或藥劑。進行本發(fā)明的篩選一般是為了開發(fā)用于預(yù)防和/或治療HCV感染和/或 HCV相關(guān)疾病的治療。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，可以使用本發(fā)明的方法測試任一種化合物或藥劑。候選化合物可以是合成或天然化合物；它可以是單分子或不同分子的混合物或復(fù)合物。 在某些實施方式中，本發(fā)明的方法用于測試一種或多種化合物。在其他實施方式中，本發(fā)明的方法用于篩選化合物的集合或文庫。本文所用的術(shù)語“集合”指化合物、分子或藥劑的任何集合，而術(shù)語“文庫”指為結(jié)構(gòu)類似物的化合物、分子或藥劑的任何集合。鑒別和表征新的和有用的藥物候選物的傳統(tǒng)方法一般包括產(chǎn)生化合物的大的集合和/或文庫，接著針對已知或未知的靶標(biāo)進行測試。可以通過本發(fā)明的方法測試天然產(chǎn)物和化學(xué)化合物。天然產(chǎn)物的集合一般來源于微生物、動物、植物或海洋生物；它們包括聚酮化合物(polyketide)、非核糖體肽和/或其變體(非天然存在的)?；瘜W(xué)文庫往往包括已知化合物的結(jié)構(gòu)類似物，或者通過天然產(chǎn)物篩選而被鑒別為“命中物”(“hits”)或“先導(dǎo)物”(“l(fā)eads”)的化合物?；瘜W(xué)文庫通過傳統(tǒng)自動合成、PCR擴增、克隆或?qū)Ｓ泻铣煞椒ㄏ鄬θ菀椎刂苽洹＜?xì)菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物的集合，例如，可以從Pan Laboratories (Bothell, WA)或 Mycc^earch (Durham，NC)獲得?？梢杂糜趯嵤┍景l(fā)明的候選化合物的文庫可以制備或從許多公司購買。合成化合物文庫可以從例如 Comgenex (Princeton, NJ)、Brandon Associates(Merrimack, NH)、Microsource(New Milford，CT)和Aldrich (Milwaukee，WI)的公司商購獲得。候選化合物的文庫也可以由大的化工企業(yè)開發(fā)和從其商購,包括例如，Merck、Glaxo Welcome、Bristol-Meyers-Squibb、 Novartis>Monsanto/Searle禾口 Pharmacia Upjohn。此夕卜，天然集合禾口合成產(chǎn)生的文庫禾口化合物可以通過傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法容易地修改。本發(fā)明的激酶活性的有用的抑制劑可能存在于許多種類的化學(xué)品中，包括小分子、抗體、肽、核酸分子、糖類、類固醇等。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法用于確定為小分子化合物的化合物或藥劑。在其他實施方式中，本發(fā)明的方法用于篩選小分子文庫。優(yōu)選的有機小分子的分子量大于大約50道爾頓且小于2500道爾頓，優(yōu)選小于600-700道爾頓， 更優(yōu)選小于約350道爾頓。通過本發(fā)明的試驗測試或篩選的候選化合物可以是以前未知具有任何藥理活性的化合物，也可以是本領(lǐng)域已知的藥物。特別地，如上所述，可以在本領(lǐng)域已知抑制激酶活性的藥劑或藥劑的衍生物中選擇候選化合物。例如，嘌呤環(huán)系統(tǒng)被認(rèn)為是用于尋找各種蛋白激酶的抑制劑的好的起點，且已經(jīng)開發(fā)了 2，6，9_三取代嘌呤庫用于上述目的(參見，例如，P. Shultz, Science, 1998,281 :533-538 ；和 Y. T. Chang 等人，Chem Biol. 1999,6 361-375)。同樣，ATP結(jié)合口袋的保守的和極好確定的性質(zhì)是用于激酶抑制的最常見和成功的靶標(biāo)之一。因此，靶向ATP的化合物的文庫已經(jīng)生成，并可以用于本發(fā)明的篩選方法。 可選擇地，可以在本領(lǐng)域已知可用于治療與激酶介導(dǎo)的事件引發(fā)的異常細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)或懷疑與其相關(guān)的疾病或病理生理病癥的藥物或藥物衍生物中，選擇候選化合物。根據(jù)本發(fā)明的方法篩選文庫提供“命中物”或“先導(dǎo)物”，即具備所需的但不是最優(yōu)化的生物活性的化合物。在開發(fā)有用的候選藥物中的下一步驟通常包括分析“命中”化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)或藥理活性的關(guān)系。通過觀察系統(tǒng)性結(jié)構(gòu)修飾對于確定的生物終點的結(jié)果，使分子結(jié)構(gòu)和生物活性相關(guān)。由第一輪篩選獲得的構(gòu)效關(guān)系信息可以用來生成小的二級庫，隨后對于該二級庫篩選具有高親和力的化合物。進行生物活性化合物的合成修飾以滿足臨床有用性所需的立體電子、物理化學(xué)、藥代動力學(xué)和毒理學(xué)因素的過程被稱為先導(dǎo)優(yōu)化。通過本發(fā)明的篩選方法鑒別的候選化合物同樣可以經(jīng)受結(jié)構(gòu)關(guān)系分析，并經(jīng)化學(xué)修飾以提供改善的候選藥物。本發(fā)明還包括這些改善的候選藥物。C.激酶活性抑制劑的鑒別根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，測定候選化合物抑制感興趣的激酶活性的能力包括測量激酶的活性或至少一種代表激酶活性的因子。測定激酶活性的方法是本領(lǐng)域已知的。代表激酶活性的因子(factor)可以是任何合適的因子，包括但不限于表達(dá)的激酶的量、磷酸化激酶底物的量、由于激酶底物磷酸化導(dǎo)致的細(xì)胞性質(zhì)的改變等。在本發(fā)明的篩選方法中，如果在候選化合物存在的情況下的激酶活性低于不存在候選化合物的情況下的激酶活性，或者如果代表激酶活性的因子在存在和不存在候選化合物的情況下是不同的(較高或較低，根據(jù)因子和激酶活性之間的關(guān)系而定)，則該候選化合物被鑒別為感興趣的激酶的抑韋劑?？梢允辜?xì)胞與相同濃度的相同候選化合物孵育來測試結(jié)果的可重復(fù)性(例如，在分析板的一個以上的孔中)。此外，由于候選化合物可能根據(jù)化合物的性質(zhì)和其作用機理的性質(zhì)而在不同濃度時有效，可以向含有細(xì)胞的不同的孔添加不同濃度的候選化合物。一般地，大約IfM至大約IOmM的濃度用于篩選。優(yōu)選的篩選濃度為大約IOpM至大約100 μ Μ。 此外，根據(jù)本發(fā)明的方法篩選不同濃度的候選化合物允許確定該化合物的IC5tl值。在某些實施方式中，本發(fā)明的方法進一步包括使用一種或多種陰性或陽性對照化合物。陽性對照化合物可以是已知在篩選方法中抑制研究的激酶活性的任何分子、試劑或藥物。陰性對照化合物可以是已知對于研究的激酶活性沒有效應(yīng)的任何分子、試劑或藥物。 在這些實施方式中，本發(fā)明的方法進一步包括比較候選化合物的效應(yīng)與陽性或陰性對照化合物的效應(yīng)(或不存在)。這種陰性和陽性對照化合物是本領(lǐng)域已知的，或可以通過本文所述的方法或由通過任何其他激酶分析來鑒別。如上所述，鑒別為感興趣的激酶抑制劑的化合物可以通過單一的作用機理抑制激酶的活性。可選擇地，它可以通過不同的作用機理的組合抑制激酶活性。例如，該化合物可以抑制(例如，通過排除、反轉(zhuǎn)或破壞)激酶激活物與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合。可選擇地， 該化合物可以支持或刺激激酶激活物與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合。該化合物可以，另外地或者可選擇地，防止或支持下游細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的活化，和/或可以影響磷酸基團向底物分子的轉(zhuǎn)移。D.激酶活性的候選抑制劑的表征如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，一般需要通過本發(fā)明的篩選方法或本領(lǐng)域已知的激酶抑制劑進一步表征激酶抑制劑。例如，如果候選化合物已在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(例如，建立的細(xì)胞系)中被鑒別為感興趣的激酶活性的抑制劑，可能需要在不同的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(例如，原代或次級細(xì)胞)中測試這種能力。可選擇地或另外地，可能需要直接測試化合物對于HCV進入細(xì)胞和/或細(xì)胞的 HCV感染的效應(yīng)(參見，例如，描述HCVpp系統(tǒng)和HCVcc系統(tǒng)的應(yīng)用的實施例2)。也可能需要進行藥代動力學(xué)和毒理學(xué)研究。也可以在允許測定化合物的體內(nèi)性質(zhì)的分析中，進一步測試通過本發(fā)明的篩選方法鑒別為激酶抑制劑的候選化合物。合適的動物模型包括但不限于已經(jīng)開發(fā)用于HCV感染研究的用人類肝細(xì)胞重構(gòu)(!^populated)的嵌合轉(zhuǎn)基因小鼠(Mercer，2001)。這些動物是通過將正常的人類肝細(xì)胞移植進入攜帶纖溶酶原激活物轉(zhuǎn)基因的SCID小鼠(Alb-uPA) 而產(chǎn)生的。Alb-uPA轉(zhuǎn)基因的表達(dá)對于有利于肝細(xì)胞植入的小鼠肝細(xì)胞是細(xì)胞毒性的。與 SCID小鼠回交允許異種肝細(xì)胞的移植和重構(gòu)(!^population)。一旦人類肝細(xì)胞被穩(wěn)定地移植到SCID/Alb-uPA小鼠，這些動物可以感染人類嗜肝病毒，包括丙型肝炎病毒。人類SCID/Alb-uPA小鼠模型已經(jīng)成功地用于研究中和抗體用于控制HCV感染的效力(Law， 2008)以及抗病毒的效力(Vamrolleghem，2007)。其他小鼠模型包括表達(dá)HCV蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠(參見Barth，2008的綜述)和黑猩猩(Kato，2008)。本文所述的系統(tǒng)可以被制成試劑盒。例如，表達(dá)本文公開的一種或多種激酶的細(xì)胞或表達(dá)本文公開的一種或多種激酶并能夠持續(xù)HCV復(fù)制的細(xì)胞或其細(xì)胞裂解產(chǎn)物可以包裝在各種容器中，例如，小瓶、管、微量滴定孔板、瓶等。其他試劑可以包含在單獨的容器中，并用試劑盒提供，例如，陽性對照樣品或化合物、陰性對照樣品或化合物、緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)基、特異性檢測探針等。IV-HCV感染與HCV相關(guān)疾病的治療或預(yù)防本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防HCV感染和/或HCV相關(guān)疾病的新的治療方案， 其用于靶向由本申請人鑒別為靶標(biāo)的至少一種人蛋白激酶。更具體地，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防受試者的HCV感染或HCV相關(guān)疾病的方法，包括向受試者施用有效量的抑制本發(fā)明鑒別的激酶活性的藥劑的步驟。A.適應(yīng)癥本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑可用于治療和/或預(yù)防HCV感染或治療和/或預(yù)防肝疾病或影響HCV-易感細(xì)胞(例如肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)的病理狀態(tài)的治療和預(yù)防方法。在本發(fā)明的實踐中，蛋白激酶抑制劑通過抑制本發(fā)明的激酶的活性干擾 HCV-宿主細(xì)胞的相互作用，從而減少、抑制、阻斷或防止HCV進入細(xì)胞和/或細(xì)胞的HCV感染。本發(fā)明治療方法可使用本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或含有本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑的藥物組合物(見下文)完成。這些方法通常包括給予需要的受試者有效量的至少一種蛋白激酶抑制劑或其藥物組合物。給藥可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。具體地，蛋白激酶抑制劑或其組合物可通過各種途徑給予，包括但不限于氣溶膠、腸胃外、口服或局部途徑。通常，本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物以有效量給予，即足以達(dá)到其預(yù)定目的的量。根據(jù)待治療的受試者的年齡、性別、體重、總體健康狀況、期望的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)(例如防止HCV感染或治療HCV相關(guān)的肝疾病)等，給予的蛋白激酶抑制劑和藥物組合物的精確量將不同。在許多實施方式中，有效量是抑制激酶活性從而抑制或防止HCV進入受試者易感細(xì)胞和/或感染受試者細(xì)胞從而防止HCV感染、治療或防止受試者肝疾病或另外的HCV 相關(guān)的病理狀況的量。本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑和組合物可用于多種治療和預(yù)防方法。具體地，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者的HCV相關(guān)肝疾病或病理狀況的方法，該方法包括給予受試者有效量的抑制本發(fā)明激酶活性從而抑制HCV進入或感染受試者細(xì)胞的本發(fā)明蛋白激酶抑制劑(或其組合物)，從而治療或預(yù)防受試者的肝疾病或病理狀況。肝疾病或病理狀況可以是與HCV感染相關(guān)的肝的炎癥、肝纖維化、硬化和/或肝細(xì)胞癌(即肝癌)。本發(fā)明也提供了治療或預(yù)防受試者的HCV相關(guān)的疾病或病癥(包括肝疾病)的方法，該方法包括給予受試者有效量的抑制本發(fā)明激酶活性從而抑制HCV進入或感染受試者細(xì)胞的本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑(或其組合物)，從而治療或預(yù)防受試者的HCV相關(guān)的疾病或病癥。在本發(fā)明的某些實施方式中，蛋白激酶抑制劑或組合物給予診斷為患有急性丙型肝炎的受試者。在本發(fā)明的其它實施方式中，蛋白激酶抑制劑或組合物給予診斷為患有慢性丙型肝炎的受試者。根據(jù)該方法給予本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物可導(dǎo)致患者遭受的至少一種癥狀得到改善，包括但不限于，急性丙型肝炎癥狀例如食欲下降、疲勞、腹痛、黃疸、瘙癢和流感樣癥狀；慢性丙型肝炎癥狀例如疲勞、體重明顯降低、流感樣癥狀、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、間歇性的低度發(fā)燒、瘙癢、睡眠障礙、腹痛、食欲改變、惡心、腹瀉、消化不良、認(rèn)知改變、抑郁、 頭痛和情緒不穩(wěn)；肝硬化癥狀例如腹水、擦傷和流血傾向、骨痛、脈管曲張(特別是胃和食道中)、脂肪痢、黃疸和肝性腦?。缓团cHCV相關(guān)的肝外表現(xiàn)癥狀例如甲狀腺炎、遲發(fā)性皮膚卟啉病、冷球蛋白血癥、腎小球腎炎、干燥綜合征、血小板減少癥、扁平苔蘚、糖尿病和B-細(xì)胞淋巴增殖性疾病?？蛇x擇地或另外地，根據(jù)本發(fā)明的方法給予本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物可減緩、降低、停止或減輕HCV感染或HCV-相關(guān)疾病的進展，或逆轉(zhuǎn)該進程至消除感染或疾病的點。根據(jù)這類方法給予本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物也可導(dǎo)致病毒感染數(shù)量減少、 感染性病毒顆粒數(shù)目的減少和/或病毒感染細(xì)胞的數(shù)目減少。根據(jù)本發(fā)明的治療的效果可使用本領(lǐng)域已知用于診斷HCV感染和/或肝病的任意分析方法來監(jiān)測。這類分析包括但不限于，血清學(xué)血液測試、肝功能檢測，以測定一種或多種白蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，及使用不同技術(shù)的分子核酸檢測，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)或分支 DNA (bDNA)。本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑和組合物也可使用免疫療法。相應(yīng)地，本發(fā)明提供降低由于與HCV接觸而使易感細(xì)胞被HCV感染的可能性的方法。該方法包括將易感細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的激酶抑制劑或組合物接觸，該蛋白激酶抑制劑或組合物抑制本發(fā)明激酶的活性從而抑制HCV進入或感染易感細(xì)胞，因此降低由于與HCV接觸而使細(xì)胞被HCV感染的可能性。本發(fā)明也提供降低受試者的易感細(xì)胞由于與HCV接觸而被HCV感染的可能性的方法。 在該方法中，可通過給予受試者本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物來使易感細(xì)胞與本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物接觸。降低易感細(xì)胞或受試者被HCV感染的可能性意味著降低易感細(xì)胞由于與HCV接觸而被HCV感染的機率。該降低可為任何有意義的量，例如，至少2倍的降低，多于2倍的降低，至少10倍的降低，多于10倍的降低，至少50倍的降低，多于50倍的降低，至少100倍的降低或多于100倍的降低。在某些實施方式中，受試者在給予本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物之前感染 HCV。在其它實施方式中，受試者在給予本發(fā)明的激酶抑制劑或組合物之前未被HCV感染。 在再其它的實施方式中，受試者沒被HCV感染，但是暴露于HCV。在某些實施方式中，受試者被HIV或HBV感染。
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例如，本發(fā)明的方法可以用于降低受試者的易感細(xì)胞由于肝移植而被HCV感染的可能性。如上面已提及的，當(dāng)患病的肝從感染HCV的患者摘除時，血清病毒水平直線下降。然而，在接受健康的肝移植后，病毒水平反彈并且可以在幾天內(nèi)超過移植前的水平 (Powers, 2006)。肝移植患者可以受益于給予抑制、阻斷或防止HCV進入細(xì)胞的本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑?？稍诟我浦睬?、肝移植過程中和/或肝移植后進行給藥。其它可受益于給予本發(fā)明的激酶抑制劑或組合物的受試者包括但不限于，感染 HCV的母親生產(chǎn)的嬰兒，特別是母親也為HIV-陽性的情況；已經(jīng)與被HCV污染的血液或血液污染的醫(yī)療器械接觸的衛(wèi)生保健工作者；通過共享注射或以其它方式施用藥物的設(shè)備而暴露于HCV的藥物使用者；和通過感染控制不良的程序紋身、耳/體穿孔和針灸而暴露于 HCV的人。可受益于給予本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物的其它受試者包括但不限于，表現(xiàn)出一種或多種已知增加HCV疾病進展速率的因素的受試者。這些因素包括，特別是，年齡、性別(男性通常比女性顯示更快的疾病進展)、飲酒、HIV協(xié)同感染(與顯著增加的疾病進展速率有關(guān))和脂肪肝。在某些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的治療方法單獨給予本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑或組合物。在其它實施方式中，本發(fā)明的激酶抑制劑或組合物與至少一種另外的治療劑組合給藥。本發(fā)明的激酶抑制劑或組合物可在給予治療劑前給藥、與治療劑同時給藥和/或給予治療劑后給藥?？膳c發(fā)明的激酶抑制劑或組合物組合給藥的治療劑可選自眾多的本領(lǐng)域已知有益于治療、控制或預(yù)防HCV感染或HCV相關(guān)的疾病或狀態(tài)的生物活性化合物。這類治療劑包括特別是抗病毒劑，包括但不限于干擾素(例如，α干擾素和聚乙二醇化的α干擾素)、 利巴韋林、抗HCV(單克隆或多克隆)抗體、RNA聚合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、IRES抑制齊IJ、 解旋酶抑制劑、反義化合物、核酶及其任何組合。B.給藥希望劑量的本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑(任選地與一種或多種合適的可藥用載體或賦形劑配制后)可以以任何合適的方式給予需要的受試者。各種不同的遞送系統(tǒng)是已知的且可用于給予本發(fā)明的激酶抑制劑，包括片劑、膠囊、注射溶液、脂質(zhì)體膠囊、微粒、微膠囊等。給藥方法包括但不限于，表皮、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、病灶內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、經(jīng)肺、 硬膜外、經(jīng)眼和口服途徑。本發(fā)明的激酶抑制劑或組合物可以通過任何方便或另外合適的途徑給藥，例如，通過輸注或快速注射(bolus injection)、通過上皮或皮膚粘膜內(nèi)層(例如，口腔、粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收。可全身性或局部給藥。腸胃外給藥優(yōu)先指向患者的肝，例如通過插管到肝動脈或到膽管中。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，在本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑與另外的治療劑聯(lián)合給藥的實施方式中，該激酶抑制劑和治療劑可通過同樣的途徑(例如，靜脈內(nèi))或不同的途徑(例如，靜脈內(nèi)或口服)給藥。C.劑量本發(fā)明的激酶抑制劑(或組合物)的給藥劑量為使得輸送的量有效達(dá)到預(yù)期的目的。給藥途徑、劑型和給藥劑量取決于所需的治療效果、需要治療的HCV感染或HCV相關(guān)病癥(如果已經(jīng)存在)的嚴(yán)重程度、任何其他感染的存在、患者的年齡、性別、體重和總體健康狀況以及取決于使用的激酶抑制劑或組合物的效力、生物利用度和體內(nèi)半衰期、伴隨治療的使用(或未使用)和其它臨床因素。這些因素可容易地在治療過程中由主治醫(yī)生確定。 可選擇地或另外地，給藥劑量可通過使用動物模型(例如，猩猩或小鼠)的研究確定。基于這些或其它方法調(diào)整劑量以達(dá)到最大效果是本領(lǐng)域熟知的，并且在訓(xùn)練有素的醫(yī)生的能力內(nèi)。隨著使用本發(fā)明的激酶抑制劑的研究的進行，將會給出與合適的劑量水平和治療進程相關(guān)的進一步信息。根據(jù)本發(fā)明的治療可由單劑或多劑組成。因此，給予本發(fā)明的激酶抑制劑，或其組合物，可在某段時間內(nèi)或定期的和以特定的間隔例如，每小時、每天、每周(或按照其它多天的間隔)、每月、每年(例如，以延時釋放的形式)持續(xù)?？蛇x擇地，在給定的時間段內(nèi)可進行多次給藥，例如，每周兩次或更多次；每月兩次或更多次等。給藥可以是一段時間內(nèi)的持續(xù)給藥，例如，靜脈內(nèi)給藥?？偟恼f來，優(yōu)選激酶抑制劑的給藥量在約lng/kg至約100mg/kg受試者體重的范圍內(nèi)，例如，在約lOOng/kg和約50mg/kg受試者體重之間，或者在約1 μ g/kg和約10mg/kg 受試者體重之間，或者在約100μ g/kg和約lmg/kg受試者體重之間。V-藥物組合物如上所述，本發(fā)明的蛋白激酶抑制劑可以以自身形式給藥或以藥物組合物的形式給藥。相應(yīng)地，提供含有有效量的本文所述的激酶抑制劑和至少一種可藥用的載體或賦形劑的藥物組合物。在一些實施方式中，組合物進一步包含一種或多種另外的生物活性劑。本發(fā)明的激酶抑制劑和藥物組合物可以以任何量和使用任何給藥途徑給藥以有效地達(dá)到所需的預(yù)防和/或治療效果。最佳的藥物劑型可根據(jù)給藥途徑和所需的劑量變化。這類劑型可影響給予的活性成分的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成單位劑量形式以易于給藥和達(dá)到劑量均勻性。此處使用的表述“單位劑量形式”指用于需要治療的患者的本發(fā)明的激酶抑制劑的物理分散單元。然而，應(yīng)理解的是組合物的總的日劑量可由主治醫(yī)生在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)決定。A.制劑注射用制劑，例如無菌的注射用水性的或油性的懸浮液可根據(jù)已知的技術(shù)使用合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配制。無菌的注射制劑也可為在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液、懸浮液或乳液，例如，作為2，3_ 丁二醇中的溶液?？墒褂玫目山邮茌d體和溶劑為水、林格氏溶液(Ringer' s solution) ,U. S. P.和等滲氯化鈉溶液。另外，通常使用無菌的非揮發(fā)油作為溶液或懸浮介質(zhì)。出于該目的，可使用任何溫和的非揮發(fā)油，包括合成的單-或二-甘油酯。脂肪酸例如油酸也可用于注射制劑的制備。無菌的液體載體用于在腸胃外給藥的無菌液體形式的組合物中。注射用制劑可以是滅菌的，例如，通過阻擋細(xì)菌的過濾器過濾，或通過引入無菌固體組合物形式的滅菌劑，該固體組合物可在使用前溶解或分散到無菌水或其它無菌的注射介質(zhì)中。作為無菌溶液或懸浮液的液體藥物組合物可通過，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射給藥。注射可通過單次推注或逐步輸注進行。當(dāng)必要或希望時，組合物可包括局部麻醉劑以減輕注射部位的疼痛。為延長活性成分(本處指激酶抑制劑)的作用，通常希望減慢從皮下或肌內(nèi)注射的成分的吸收。延遲腸胃外給藥的活性成分的吸收可通過溶解或懸浮該成分在油性載體中達(dá)到?？勺⑸涞膬煨问酵ㄟ^在可生物降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成活性成分的微膠囊化基質(zhì)來制備。根據(jù)活性成分與聚合物的比率和使用的具體聚合物的性質(zhì)， 成分釋放的速率可得到控制。其他的可生物降解的聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚 (酸酐)?？勺⑸涞膬熘苿┮部赏ㄟ^將活性成分捕獲在脂質(zhì)體或與人體組織相容的微乳液中來制備?？诜o藥的液體劑型包括但不限于，可藥用乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿劑、 酏劑和加壓組合物。除激酶抑制劑外，液體劑型可包含本領(lǐng)域通常使用的惰性稀釋劑，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特別是，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀釋劑外，口服組合物也可包括助劑例如濕潤劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑、調(diào)味劑、和芳香劑、增稠劑、著色劑、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透調(diào)節(jié)劑。適合口服給藥的液體載體的實例包括水(可能含有上述添加劑如纖維素衍生物，例如羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括一元醇和多元醇例如二醇類)及其衍生物和油(例如，分餾椰子油和花生油)。對于加壓組合物，液體載體可為商代烴或其他可藥用推進劑?？诜o藥的固體劑型包括，例如，膠囊、片齊IJ、丸齊IJ、粉末劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，本發(fā)明的激酶抑制劑可與至少一種惰性的、生理可接受的賦形劑或載體(例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣)和一種或多種以下成分混合(a)填充劑或擴充劑，例如淀粉、乳糖、 蔗糖、葡萄糖、甘露醇(marmital)和硅酸；(b)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、 聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如甘油；(d)崩解劑，例如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、土豆或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(e)溶液緩凝劑(solution retarding agent)，例如石蠟；吸收加速劑例，如季銨化合物；(g)濕潤劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土 ；和⑴潤滑劑例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉及其混合物。其他適合于固體制劑的賦形劑包括表面改性劑例如非離子和陰離子表面改性劑。表面改性劑的代表性實例包括但不限于，泊洛沙姆188、苯扎氯銨、硬脂酸鈣、十八醇十六醇混合物、聚西托醇(cetomacrogol)乳化蠟、山梨糖醇酯、 膠體二氧化硅、磷酸鹽、十二烷基硫酸鈉、硅酸鎂鋁和三乙醇胺。在膠囊、片劑和丸劑的情況，該劑型也可含有緩沖劑。在使用賦形劑例如乳糖和高分子量聚乙二醇等的軟和硬填充明膠膠囊中，類似類型的固體組合物也可作為填充劑使用。片劑、錠劑、膠囊、丸劑和顆粒劑的固體劑型可具有包衣和殼例如腸溶包衣、控釋包衣和其它在藥物制劑領(lǐng)域熟知的包衣。它們可任選地含有遮光劑且也可為使得僅釋放一種活性成分，或優(yōu)選地在腸道內(nèi)的特定部位任選地以延釋的方式釋放活性成分的組合物?？墒褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物質(zhì)和蠟。在某些實施方式中，可能希望的是局部地給予本發(fā)明的組合物到需要治療的區(qū)域 (例如，肝)。這可通過，例如但不限于手術(shù)(例如，肝移植)過程中的局部灌注、局部施用、 通過注射、通過插管的方式、通過栓劑的方式或通過皮膚貼片或支架或其它植入物的方式來達(dá)到。對于局部給藥，組合物優(yōu)選配制為凝膠、軟膏、洗劑或乳膏，其可含有載體例如水、 甘油、醇、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯或礦物油。其它局部載體包括液體石油、棕櫚酸異丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、聚氧乙烯單月桂酸酯(5%)的水溶液或十二烷基硫酸鈉 (5%)的水溶液。必要時可添加其他物質(zhì)例如抗氧化劑、保濕劑、粘度穩(wěn)定劑和類似試劑。另外，在某些情況下，本發(fā)明的組合物預(yù)期可布置在置于皮膚上、皮膚中和皮膚下的透皮裝置內(nèi)。這類裝置包括通過被動或主動釋放機制釋放活性成分的貼片、植入物和注射裝置。透皮給藥包括跨越體表和身體通道的內(nèi)襯(包括上皮和粘膜組織)的所有給藥。 這種給藥可使用洗劑、乳膏、泡沫、貼片、懸浮液、溶液和栓劑(直腸和陰道)中的本發(fā)明組合物實施。透皮給藥可通過使用含有活性成分(即，激酶抑制劑)和對皮膚無毒并使得用于系統(tǒng)性吸收的成分經(jīng)由皮膚遞送到血流中的載體的透皮貼片來實現(xiàn)。載體可采用多種形式，例如乳膏和軟膏、漿料、凝膠和封閉裝置。乳膏和軟膏可為粘性液體或水包油或油包水型的半固體乳液。由分散在含有活性成分的石油或親水石油中的吸收性粉末組成的漿料可能是適合的。多種封閉裝置可用于釋放活性成分到血流中，例如覆蓋包含具有或沒有載體的活性成分的儲庫的半滲透膜，或含有活性組分的基質(zhì)。栓劑可由傳統(tǒng)材料制備，包括可可脂(添加或不添加蠟以改變栓劑的熔點)和甘油。也可使用水溶性栓劑基質(zhì)，例如具有不同分子量的聚乙二醇。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物用作防止HCV易感細(xì)胞被HCV感染的“疫苗”時，藥物組合物可進一步包含本領(lǐng)域已知的疫苗載體，例如，甲狀腺球蛋白、白蛋白、破傷風(fēng)類毒素和聚氨基酸例如D-賴氨酸和D-谷氨酸的聚合物。該疫苗也可包括多種公知的佐劑中的任何一種，例如，不完全弗氏佐劑、明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、單磷酰脂質(zhì)A(MPL，GlaX0SmithKline)、 皂苷、CpG寡核苷酸、Montanide、維生素A和由可生物降解的油(例如角鯊烯和/或生育酚)制備的各種油包水乳液、Quil A、Ribi Detox、CRL-1005、L-121及其組合。制備各種不同制劑的材料和方法為本領(lǐng)域已知，且可適用于實施本發(fā)明。合適的用于遞送抗體的制劑可在，例如，“Remington' s Pharmaceutical Sciences “， Ε. W. Martin, 18th Ed. , 1990, Mack Publishing Co. =Easton, PA. B. Additional Biologically Active Agents 中發(fā)現(xiàn)。B.另外的生物活性劑在某些實施方式中，激酶抑制劑為本發(fā)明的藥物組合物中僅有的活性成分。在其它實施方式中，藥物組合物進一步包括一種或多種生物活性劑。合適的生物活性劑的實例包括但不限于，疫苗佐劑和治療劑例如抗病毒劑(如上所述)、抗炎劑、免疫調(diào)節(jié)劑、鎮(zhèn)痛劑、抗微生物劑、抗菌劑、抗生素、抗氧化劑、防腐劑及其組合。適用于實施本發(fā)明的抗病毒劑包括但不限于對相同蛋白激酶具有效果的抗病毒劑、對不同靶分子(即，不是蛋白激酶或不是相同的蛋白激酶)(包括參與病毒進入、病毒內(nèi)化、病毒復(fù)制和/或病毒釋放的靶分子)具有效果的抗病毒劑，防止或減少病毒抗性發(fā)生的抗病毒劑，等等。本發(fā)明的激酶抑制劑也可以與誘導(dǎo)IFN表達(dá)的藥劑聯(lián)合使用。本發(fā)明的抗病毒組合提供一種治療手段，該治療手段不僅可以減少抗病毒活性所需的任一種藥物的有效劑量，從而降低毒性，而且由于通過多種機制攻擊病毒可以提高絕對抗病毒效果。類似地，該組合提供一種防止對單一治療發(fā)生病毒抗性的手段，從而提供更有效的治療。在本發(fā)明的藥物組合物中，激酶抑制劑和另外的治療劑可結(jié)合在用于同時、分別或順序給予激酶抑制劑和治療劑的一種或多種制劑中。更具體地，本發(fā)明的組合物可以配制為使得激酶抑制劑和治療劑可以一起給藥或彼此獨立地給藥。例如，激酶抑制劑和治療劑可一起配制在單一組合物中?？蛇x地，它們可單獨地保持(例如在不同的組合物中和/ 或容器中)和給藥。C.藥物包裝或試劑盒在另一方面，本發(fā)明提供了包含含有本發(fā)明藥物組合物的一種或多種組分的一個或多個容器(例如小瓶、安剖瓶、試管、燒瓶或窄頸瓶)的藥物包裝或試劑盒，使得可以給予本發(fā)明的激酶抑制劑。藥物包裝或試劑盒的不同組分可以以固體(例如凍干的)或液體形式提供。各成分通常適當(dāng)?shù)刈鳛樵诟髯匀萜髦械牡确衷嚇踊蛞詽饪s的形式提供。藥物包裝或試劑盒可以包括用于凍干成分重構(gòu)的介質(zhì)。試劑盒的單個容器優(yōu)選保持在封閉空間中以用于商業(yè)銷
佳口。在某些實施方式中，藥物包裝或試劑包含一種或多種另外的治療劑(例如一種或多種抗病毒劑，如上所述)。任選地，在容器上有管理藥物或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售政府部門規(guī)定的形式的告示或者包裝插頁，該告示表明了管理部門對生產(chǎn)、使用或銷售的批準(zhǔn)以用于人類施用。告示或包裝插頁可含有根據(jù)本文公開的治療方法使用藥物組合物的使用說明。例如條形碼、無線射頻、ID標(biāo)簽等的標(biāo)識物可存在于試劑盒內(nèi)或試劑盒上。標(biāo)識物可用于例如唯一地確定試劑盒以達(dá)到質(zhì)量控制、庫存控制、工作區(qū)之間的跟蹤運動等的目的。
實施例以下實施例描述了一些實現(xiàn)和實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。但是，應(yīng)該理解的是這些實施例僅是出于說明目的，并不意圖限制本發(fā)明的范圍。另外，除非實施例中的說明以過去形式呈現(xiàn)，該表述如說明書其它部分一樣，并不意圖表明實驗事實上已經(jīng)實施或者數(shù)據(jù)實際上已經(jīng)得到。下面報告的一些結(jié)果已經(jīng)在第15屆丙型肝炎病毒和相關(guān)病毒國際研討會(15th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses,Antonio,Texas, USA, 5-9 October, 2008)上介紹，并且由 J. Lupberger 等人在標(biāo)題為 “Identification of cellular kinases as co-factors for hepatitis C virus entry using a functional high-throughput siRNA screen”的摘要中對其進行了概述。以下報告的其他結(jié)果是提交給 Molecular Systems Biology 的手禾高主題(J. Lupberger 等人，“Genome-wide analysis of human kinases as host factors for hepatitis C virus entry”)。實施例1 作為HCV進入的輔助因子的宿主細(xì)胞激酶的初步鑒別1.材料和方法細(xì)胞和復(fù)制子。在本研究中使用的HEK 293T、Huh7和Huh7. 5. 1細(xì)胞以前已被描述過(Bartosch,2003 ；Barth,2003 ；Zhong，2005)。如以前所描述的(David，1998，其全部內(nèi)容通過引用方式結(jié)合在本文中)，分離和培養(yǎng)原代人肝細(xì)胞。如以前所描述的(Kato，2005)， 在此使用亞基因組HCV復(fù)制子JFH1-SGR。
逆轉(zhuǎn)錄病毒HCV和VSV擬顆粒的產(chǎn)生。如之前所描述的(Bartosch，2003 ；Barth, 2006)，產(chǎn)生由H77衍生的HCVpp和VSVpp。不含包裝糖蛋白(對照pp)的擬顆粒(pp)用作陰性對照(Barth，2003)。為了在Huh7感染后獲得相等的螢光素酶活性，調(diào)節(jié)HCVpp和 VSVpp制劑。重組HCV的產(chǎn)生和感染分析。雙順反子質(zhì)粒Pi7K-Luc-Jcl (Koutsoudakis，2006) 編碼螢光素酶報道基因和被稱為Jcl的由J6CF和JFHl片段構(gòu)成的嵌合HCV基因組。如以前所描述的(Wakita，2005)，進行體外HCV RNA合成和RNA轉(zhuǎn)染。澄清來自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，且如上所述使用Amicon Ultra 15 (Millipore, USA)進行濃縮，直接使用或貯存在4°C或-80°C下。通過使用具有少許微小變化的有限稀釋分析，在Huh7. 5. 1細(xì)胞上滴定病毒，并基于以前描述的方法(LindenbaCh，2005)計算TCID50值。使用siRNA的高通量基因沉默化。人激酶SiRNA套裝版本2. 0 (Qiagen,德國)由 4個獨立siRNA/靶基因的691個集合(pool)構(gòu)成，并用于沉默化Huh7細(xì)胞中的691種細(xì)胞激酶和相關(guān)蛋白。使用1 μ L的Interferrin轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus，法國)和3. 5pmol siRNA來反向轉(zhuǎn)染5，000個細(xì)胞/0. 3cm2。轉(zhuǎn)染72小時后，除去上清液，使用50 μ L HCVpp和 VCVpp并排感染細(xì)胞。在37°C下培養(yǎng)6小時后，添加100 μ L新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，感染48小時后，除去完全細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并使用IOOyL Glo裂解緩沖液(Pr0mega，USA)裂解細(xì)胞。 細(xì)胞裂解10分鐘后，在高通量發(fā)光計(Berthold，德國)上，使用25% (v/v)Bright-Glo螢光素酶底物(Promega，USA)測量螢火蟲熒光素酶活性。使用Dc蛋白分析試劑盒(Biorad， USA)，通過總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化來評估比感染性。新的HCV進入因子的鑒別。通過HCVpp進入的增加或降低(與轉(zhuǎn)染有非特異性siRNA的細(xì)胞相比)來定義基因沉默的影響。具體而言，如以前描述的(Ploner，2006 ； Raffelsberger, 2008 ；Wettenhall，2004)，進行統(tǒng)計學(xué)分析，從而在不損害真陽性測試結(jié)果 (II型誤差)的情況下，確保假陽性(I型誤差)的最大降低。對HCV進入的HCV特異性影響在并排實驗(HCV特異性作用HCV進入顯著降低，VSVpp進入未明顯改變或增加，反之亦然)中被確定為對對照病毒(VSVpp)的進入不存在明顯類似的影響。此外，對病毒進入機理具有潛在普遍重要性的蛋白激酶被確定，沉默化該激酶的相應(yīng)基因?qū)е翲CV病毒進入細(xì)胞顯著減少(如果可重復(fù)性是統(tǒng)計學(xué)顯著的話，等于> 80%的HCV進入的抑制)，不考慮基因沉默化對VSVpp進入所引起的改變。通過二級siRNA篩選確定了鑒別的候選激酶對感染性 HCV生命周期的影響，該篩選測量(如對上述pp-siRNA篩選所述)候選基因沉默化對HCVcc 感染的影響。此外，為了確保二級HCVcc-siRNA篩選的特異性，如以前所述(Cole，1986)，并排測試轉(zhuǎn)染的siRNA的MTT-細(xì)胞毒性檢測。使用蛋白激酶抑制劑對HCV感染的抑制。在本研究中使用的所有抑制劑均是從LC Laboratories(USA)獲得的。使用之前，將它們?nèi)芙庠贒MSO中，并在Huh7. 5. 1細(xì)胞培養(yǎng)基中進行稀釋(Zhong，2005)。培養(yǎng)之后，如以前所報道的(Pestka，2007 ；Zeisel，2007)，通過螢光素酶報道基因的表達(dá)和細(xì)胞中HCV RNA的RT-PCR來評估HCVpp的進入和HCVcc的感
^fe οNorthern印跡法。通過使用NEBlot試劑盒(NEB，USA)，使用α 32P-CTP將用 Xbal和EcoRI消化質(zhì)粒JKHl (ffakita, 2005)得到的9. 7kb片段進行標(biāo)記。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案 (F. M. Ausubel 等人，"Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley !Sons,Inc.，2007)進行 Northern 印跡法。2.作為HCV進入的輔助因子的宿主細(xì)胞激酶的鑒別使用現(xiàn)有技術(shù)一功能性高通量siRNA HCVpp進入篩選，本發(fā)明人已經(jīng)鑒別出兩組宿主細(xì)胞激酶。第一組激酶對HCVpp的進入顯示出顯著的、特異性的抑制，但不影響不相關(guān)的對照病毒(VSVpp)的進入。第二組激酶對HCVpp的進入/感染顯示出顯著的抑制，不考慮基因沉默對VSVpp進入所引起的改變。通過應(yīng)用選擇標(biāo)準(zhǔn)，在691種激酶和相關(guān)蛋白質(zhì)的基因中沉默化69種基因?qū)е聦?HCVpp進入的特異性功能性影響，但不影響不相關(guān)的對照病毒(VSVpp)的進入。在圖1中示出的 69 種激酶是FGR、CHUK、PSKH1、DGKB、ILK、CKS1B、PLK3、GKAP1、CALM2、RPS6KA5、MAGI1、 LTK、ITPKA, PIP5K2A、ADK、STK11、CDKN1B、CHKB, BUBIB, STK38、TYK2、PRKCABP、EGFR、CSK, AK3、FER、PRKD2、CDKL3、PDIK1L、CKMTl、CDKN2C、CDK2、CAMK2G、EPHB4、GAK, PACSIN2、SGK2、 DCAMKL1、MAP3K13、IRAK2、ARAF、PAK4、MAPK7、ATR、SRC、PTK2B、EPHB1、BCR、EPHA2、PIP5K2B、 CDK3、STK24、MKNK2、PKMYTU FES, ACVR2B、MAP2K1 IPl、APEGl、JAKU AURKB, CHKA, PRKACG, DDR2、PIK3C2A、ADRBK1、CALM3、FASTK、TOE1和JAK2。鑒別的匹配選擇標(biāo)準(zhǔn)的激酶數(shù)目對應(yīng)于所研究的基因總數(shù)的10%。有意思的是，鑒別的分子包括可用在確定藥物的治療干預(yù)中的 9 種激酶。這 9 種激酶是CHUK、EGFR、CDK2、EPHB4、SRC、BCR、EPHA2、CDK3 和 AURKB。在691種激酶中沉默32種激酶導(dǎo)致對HCV進入的極度抑制，不考慮基因沉默對 VSVpp進入所引起的改變。在圖2中示出的這32種激酶是FN3K、CIB2、BCKDK、NEK9、STK33、 BRAF,STK22C、PI4KII、RIOKl、CKB、Sharpin、RPS6KL1、FLT3LG、HIPK3、CDC2、ERBB4、CDC2L1、 PANK3、SKIP、MAP4K5、ATM、CDK4、KIAA1446、BMP2K、BMX, CDK8、TNK2、NEK4、EPHA3、FGFR4、 MAP3K7IP1和MAPKAP1。鑒別的匹配選擇標(biāo)準(zhǔn)的激酶數(shù)目對應(yīng)于所研究的基因總數(shù)的約 5%。鑒別的分子包括可用在確定藥物的治療干預(yù)中的5種激酶，即BRAF、⑶C2、ERBB4、 CDK4 和 CDK8。為了證實通過HCV進入篩選鑒別的候選分子的功能性影響，本發(fā)明人已經(jīng)分析了鑒別的基因產(chǎn)物對肝細(xì)胞瘤細(xì)胞感染的影響，該分析使用不同基因型的HCVpp和細(xì)胞培養(yǎng)物來源的感染性HCV (HCVcc)。作為通過siRNA HCVpp進入篩選來鑒別HCV輔助進入因子的可靠性和可行性的例子，本發(fā)明人已經(jīng)表明，沉默化激酶EphA2顯著和特異性地抑制了來自所有主要基因型的HCVpp的進入，并顯著抑制了 Huh7. 5人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞的HCVcc感染。有意思的是，蛋白激酶EphA2已顯示通過磷酸化密蛋白(CLDN)蛋白家族的成員來調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接的滲透性(Tanaka，2005)，且HCV非結(jié)構(gòu)性蛋白NS4B向上調(diào)節(jié)EphA2的表達(dá)(Zheng，200 。EphA2在肝臟和人原代肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)。這對于在分子水平上理解HCV進入具有重要意義，因為密蛋白家族的成員已表明代表Huh7肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中HCV感染的關(guān)鍵宿主輔助因子(Evans，2007 ；Meertens，2008)。3.抑制HCV進入和感染的激酶抑制劑鑒別EphA2為推定的HCV輔助進入因子對于研發(fā)針對HCV進入的新型抗病毒策略也具有意義，因為已表明EphA2是達(dá)沙替尼的靶標(biāo)(Huang，2007)，達(dá)沙替尼是用于治療慢性骨髓性白血病的臨床上許可的激酶抑韋劑。為了研究達(dá)沙替尼(針對EphA2的蛋白激酶抑制劑)是否抑制HCV的進入和感染， 本發(fā)明人已經(jīng)將肝細(xì)胞瘤細(xì)胞與達(dá)沙替尼一起進行培養(yǎng)，并隨后研究了達(dá)沙替尼對HCVpp進入和HCVcc感染的影響。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在類似于臨床治療惡性血液病中所用的濃度的濃度下，達(dá)沙替尼以劑量依賴性方式顯著影響HCVpp進入(H77c株-基因型la)和HCVcc感染 (JFH-1株-基因型2a)。使用HCV亞基因組復(fù)制子(JFH1株，Kato, 2005)的進一步分析表明，達(dá)沙替尼事實上特異性靶向HCV進入，而不是在病毒復(fù)制過程中的病毒-宿主相互作用。使用靶向表皮生長因子受體(EGFR)的抑制劑獲得了相似的結(jié)果，該受體在本研究中也被鑒別為用于HCV進入的輔助因子。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在類似于臨床使用的治療濃度的濃度下，埃羅替尼、凡德他尼、吉非替尼或拉帕替尼以劑量依賴性方式顯著抑制huh7. 5. 1細(xì)胞的HCVcc感染(參見圖3)?？傊?，一組宿主細(xì)胞激酶已被鑒別為新型HCV輔助因子，包括EphA2和EGF受體家族的成員。此外，HCV激酶相互作用代表用于針對HCV感染的治療干預(yù)的新型和獨創(chuàng)靶標(biāo)， 如蛋白激酶抑制劑達(dá)沙替尼有效抑制HCV進入和感染所示。實施例2 作為HCV進入的輔助因子的宿主細(xì)胞激酶的精細(xì)鑒別1.材料和方法試劑和抗體。人激酶SiRNA套裝版本2. 0 (4種siRNA的集合)和siRNA個體獲自Qiagen。埃羅替尼(Tarceva )、達(dá)沙替尼(Sprycel )、吉非替尼(Iressa )、凡德他尼 (Zactima )和拉帕替尼(Tykerb )獲自IC Laboratories，TpIII激酶抑制劑和渥曼青霉素獲自 Calbiochem,Flavopiridol,Dorsomorphin 獲自 Sigma-Aldrich0 抗 EphA2 C-20 禾P 蛋白A/G-瓊脂糖珠粒獲自Santa Cruz Biotechnologies，EGFR獲自Millipore，且堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體獲自GE Healthcare.細(xì)胞系、原代肝細(xì)胞和復(fù)制子。同上。基因組范圍的RNAi 激酶 HCV 進入篩選。在 Transfected Cell Array (TCA)， Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire(IGBMC) in Illkirch, France平臺上進行篩選。用于該篩選的文庫是來自Qiagen的人激酶siRNA 套裝版本2. O (4種siRNA的集合)。siRNA個體獲自Qiagen。如圖4所示，建立針對691種細(xì)胞激酶和相關(guān)蛋白質(zhì)的功能性HCV進入siRNA篩選。對于每個靶標(biāo)，使用 Interferrin(Polyplus)以 5，000 個 Huh7 細(xì)胞/0. 3cm2 反向轉(zhuǎn)染 3. 5pmol siRNA。siRNA 轉(zhuǎn)染三天后，使用攜帶螢光素酶報道基因的HCV假型顆粒(HCVpp H77C ；基因型la) (Bartosh, 2003 ；Pestka,2007)研究基因沉默化對病毒進入的影響。并排分析對VSVpp進入的影響。 使用具有 Mithras LB 940 發(fā)光計(Berthold Technologies)的 Bright Glo 螢光素酶分析系統(tǒng)(Promega)，通過測量細(xì)胞裂解產(chǎn)物中報道基因螢光素酶的活性，評估感染兩天后的病毒進入。使用獲自同一 siRNA文庫(Qiagen)的四種不同的單個siRNA沉默化同一靶標(biāo) mRNA，獨立確定命中物(hit)。通過如上所述的相同方案在Huh7. 5. 1細(xì)胞中使用HCVcc株 Luc-Jcl(Dimitrova, 2008 ；Pietschmann, 2006) (TCID5tl約 103/mL)進行驗證。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進行所有的siRNA的篩選。使用Dc蛋白分析(Bio-Rad)，通過裂解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化螢光素酶結(jié)果。為了最小化由于蒸發(fā)所致的非特異性影響，外側(cè)孔未用于篩選，而是用磷酸緩沖液(PBS)填充。通過測量單個孔中的蛋白質(zhì)含量來標(biāo)準(zhǔn)化由于細(xì)胞增殖的改變所導(dǎo)致的基因沉默化的非特異性影響。通過計算Z因子(Zhang，1999)，在試驗性實驗中評估建立的高通量篩選的質(zhì)量、單個板的設(shè)計和復(fù)制的數(shù)目。在用于篩選的96個中央板位置中的60個位置上一式兩份地進行HCVpp的篩選(Z = 0. 37)。在用于篩選的96個中央板位置中的32個位置上進行HCVcc驗證篩選(Z = 0.47)，一式三份進行。作為基因沉默化、 HCVpp和HCVcc感染的內(nèi)部質(zhì)量控制，在各個板上并排轉(zhuǎn)染陽性和陰性對照siRNAs(GFP， ⑶81)。如下所述，通過分析代謝3-G，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基四氮唑溴化物 (MTT)的能力，評估對細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響，一式三份進行。高通量篩選命中物的選擇?；虺聊挠绊懕欢x為表示為進入比率(與進入轉(zhuǎn)染的對照(靶向GFP的siRNA)中的實驗平均值相比)的HCVpp進入的增加或減少。HCV特異性被確定為對VSVpp對照病毒的進入不具有顯著類似的影響。使用應(yīng)用于 Bioconductor (Gentleman, 2004)包 limma (Wettenhall，2004)的經(jīng)驗性 Bayes 方法，測試至 O的差異的log2-比率，從而在不損害真陽性測試結(jié)果(II型誤差)的情況下，確保假陽性 (I型誤差)的最大降低(Allison，2006)。研究從經(jīng)驗性測試所得到的B值的分布，以定義有用的截止值(未顯示)。最后，基于基本的頻率分布(數(shù)據(jù)未顯示)，選擇-3. 5的HCVpp 閾值(對應(yīng)虹10_4的最大ρ值)、-4. 4的HCVpp閾值(對應(yīng)3xl(T6的最大ρ值)和-3. 6的 VSVpp閾值(對應(yīng)1. IxlO-3的最大ρ值)作為嚴(yán)格性參數(shù)。不考慮VSVpp的進入，對HCVpp 的進入具有顯著影響(B-值>5)的基因(總共四個)也包括進來用于進一步的鑒別。使用文庫“fdrt00l”6trimmer，2008)來確定每個基因?qū)τ谒袑Ρ鹊木植考侔l(fā)現(xiàn)率(fdr)。 用于確認(rèn)，還包括了 10個另外的基因，這些基因降低HCV進入彡板平均值的2SD(即Brass， 2008使用的策略)，但由于高度內(nèi)部變化性僅給出高的ρ值或低的相應(yīng)B值，所以通過本發(fā)明人的方法可能不能發(fā)現(xiàn)這些基因。為了排除集合的siRNA的脫靶影響，如果至少兩個單獨的siRNA使HCV進入與對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比降低彡50%，則證實候選物。基因本體論和基因注釋?；虮倔w論術(shù)語和基因相關(guān)性獲自hgenuity Pathways 數(shù)據(jù)庫(Mountainview，CA, USA)確定的人激酶siRNA套裝版本2. 0。使用Ingenuity Pattiways數(shù)據(jù)庫對鑒別的激酶進行生物功能分析(Krishnan，2008 ；Tuvin，2009)。如果它們以< 10_5的ρ-值顯著富集的話，生物功能術(shù)語是可接受的。此外，使用STRING mega-數(shù)據(jù)庫來分析鑒別的命中物的已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用，該數(shù)據(jù)庫將所有的相互作用證據(jù)繪制在一組普通的基因組和蛋白質(zhì)上(Jensen，2009)。通過免疫沉淀反應(yīng)和免疫印跡法對激酶表達(dá)的分析。使用包含50mM Tris，pH 8， 150mM NaCl, 1 % NP-40和蛋白酶抑制劑混合物的緩沖液(Roche)，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解之后進行EphA2的免疫沉淀反應(yīng)。對于免疫沉淀反應(yīng)，使用2. 5 μ g抗-EphA2C-20抗體(180 μ g 蛋白含量)禾口 25μ L 蛋白 A/G 珠粒(Santa Cruz Biotechnologies)。根據(jù) GE Healthcare 方案，使用Hybond-P膜進行Wfestern印跡法，使用ECF底物和Typhoon Trio高效熒光掃描儀(GE Healthcare)進行顯示。Huh7來源的細(xì)胞系和人原代肝細(xì)胞感染HCVpp和HCVcc。如以前所述(Bartosch， 2003 ；Dimitrova,2008 ；Fati-Kremer, 2009 ；Pestka,2007 ；Pietschmann,2006 ；Tarr,2006 ； 和 kisel，2007)產(chǎn)生 HCVpp (株 H77C、HCV-J, UKN2A. 2. 4、UKN3A、UKN4A. 21. 16、VD、VH、 VK、VN)、VSPpp 和 HCVcc (株 Jcl、Luc-Jc 1)。如以前所述(Dimitrova, 2008 ；Fati-Kremer, 2009 ；Lan, 2008 ；Meunier, 2008 ；禾口 Zeisel，2007)進行 Huh7、Huh7. 5 細(xì)胞和人肝細(xì)胞被源自株 H77C(la)的 HCVpp、源自株 Jcl(^i/2a) ^P Luc-Jcl (2a/2a) (TCID50 1 03/mL)的 HCVcc 的感染。如RNAi篩選所述，感染前3天進行基因沉默。在0. 25% DMSO的最終溶劑濃度下使用蛋白激酶抑制劑(渥曼青霉素例外，它使用1%DMS0終濃度)。HCVpp或HCVcc感染前1 小時向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加抑制劑。HCV復(fù)制的分析。如從前所述(Lan，2008)對來自質(zhì)粒pSGR-JFHl的RNA進行電穿孔。電穿孔后4小時，細(xì)胞與蛋白激酶抑制劑在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中培養(yǎng)24小時。如 (Lohmann, 1999)所述通過HCV RNA的Northern印跡分析來分離和分析總RNA。毒性分析。通過分析代謝3-(4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四氮唑溴化物(MTT)的能力(Lan，2008)，來評估對細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響，一式三份進行。對于siRNA 實驗，用siRNA轉(zhuǎn)染5小時后3天，加入MTT。MTT的最終濃度是0. 6mg/mL。如(Mosmann, 1983)所述溶解和測量細(xì)胞所產(chǎn)生的甲勝晶體。2.使用基因組范圍的RNAi激酶HCV進入篩選來鑒別參與HCV進入的細(xì)胞激酶在Huh7細(xì)胞中進行基于siRNA的篩選，沉默化691種人激酶，以全面地鑒別在人基因組中可能與HCV進入相關(guān)的所有的細(xì)胞激酶。在感染的較晚期(如復(fù)制、組裝或分泌) 中的缺陷未在該分析中強調(diào)。該分析的讀數(shù)包括基因沉默化的細(xì)胞被包含螢光素酶報告基因的HCVpp或HCVcc的感染。隨后在感染72小時后通過分析報道基因的表達(dá)來定量病毒的進入。篩選包括三步并列使用HCVpp和來自水泡性口炎病毒的假型顆粒(VSVpp)(作為不相關(guān)的對照病毒)的初步篩選。為了確定鑒別的命中物對于感染性病毒生命周期的相關(guān)性，在初級篩選中鑒別的命中物在二級篩選中進行證實，該二級篩選使用基于重組HCVcc 和Huh7. 5. 1細(xì)胞的感染性HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型(圖4)。初級篩選和二級篩選使用靶向同一基因的四個siRNA的集合進行。來自二級篩選的候選基因進行第三輪篩選，其中每個集合中的四個組分siRNA被分別重新篩選(圖4)。總而言之，通過初級HCVpp篩選鑒別出107種激酶，它們中的82種激酶通過與重組HCVpp的感染而被鑒別。該差異可能是由于以下事實HCVpp和HCVcc的進入機理可能存在略微不同?；蛘撸承┘っ缚呻S后對HCV生命周期中的進入后事件(如復(fù)制)具有拮抗作用。這得到如下發(fā)現(xiàn)的證實已顯示提高復(fù)制的NEK4激酶的沉默化(Tai，2009)，提高了 HCVcc的感染，但抑制了 HCVpp的進入(數(shù)據(jù)未顯示)。通過單個siRNA在82種激酶中鑒別出78種激酶(95%),它們對HCVpp進入和HCVcc感染啟動具有相似的作用(圖10)， 證明了事實上是基因沉默化，而不是單個siRNA序列的脫靶作用，導(dǎo)致了觀測到的基因型。因此，基因組范圍的RNAi激酶篩選鑒別出78種對HCV進入和HCV感染啟動具有影響的激酶，如在感染性細(xì)胞培養(yǎng)模型中所鑒別的(圖10)。為了鑒別可能特別參與HCV進入的激酶，研究了沉默化對不相關(guān)的對照病毒VSV的進入的影響。使用并列分析，鑒別了 34 個基因，它們對HCVpp進入和HCVcc感染具有功能性影響，但是對VSV的進入沒有影響(圖 10A)。該RNAi篩選方法的有效性是通過鑒別已知對對照病毒VSV的進入關(guān)鍵的激酶來確定的。在初級篩選和Pelkmans和同事(Pelkmans，2005)進行的篩選中，VSVpp進入鑒別的命中物的對比分析確定了 參與網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的病毒胞吞的激酶對HSV進入有功能相關(guān)性。此外，初步HCVpp篩選確定了蛋白激酶A對于HCVpp進入的相關(guān)性，如近期 Farquhar等人(Farquhar，2008)所表明的。這些激酶被鑒別為VSV和HCV進入的輔助宿主因子確定了本發(fā)明篩選方法的有效性。3.通過生物信息學(xué)分析對HCV進入中涉及的激酶網(wǎng)絡(luò)的鑒別
為了獲得鑒別的激酶和相關(guān)蛋白質(zhì)的已知生理學(xué)功能的分類，如對于其他基于 RNAn siRNA 篩選所述的(Krishnan，2008 和 Tuvim，2009)，使用 Ingenuity Pathways 數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析。該分析表明了癌癥和細(xì)胞死亡中涉及的基因的高度表現(xiàn)(圖6A)。 當(dāng)根據(jù)對HCV而不是對VSV進入的影響進行分類時，五種最高度表現(xiàn)的類別包括氨基酸代謝、翻譯后修飾、小分子生物化學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和癌癥 (圖 6B)。接下來，使用STRING數(shù)據(jù)庫(Jensen，2009)分析鑒別的命中物的已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用。強調(diào)的相互作用包括來自多種來源的直接(物理)或間接(功能性)的相關(guān)，該來源包括實驗性儲庫、計算預(yù)測方法和公眾文本收集(Jensen，2009)。STRING代表一個元數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫將所有已知的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用制圖在基因組和蛋白質(zhì)的常規(guī)套裝上。對RNAi篩選中鑒別的78種激酶的分析揭示了調(diào)控細(xì)胞形態(tài)學(xué)(包括細(xì)胞極性、緊密接頭的滲透性和整聯(lián)蛋白的信號傳導(dǎo))的激酶網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞周期中涉及的激酶的網(wǎng)絡(luò)(圖6C)。a)調(diào)控細(xì)胞極性的宿主細(xì)胞激酶。首先，使用后續(xù)的STRING分析的RNAi篩選鑒別出作為HCV進入的宿主因子的肝激酶Bl (STKll)和AMP-激活的蛋白激酶(ΑΜΡ，γ 2 非催化性亞基PRKAG2)(圖6-7)。PRKAG2亞基作為AMPK的激活劑。如圖7所示，沉默化 STKll或AMPK亞基PRKAG2的基因表達(dá)對來自所有主要的基因型的HCVpp的進入產(chǎn)生顯著的抑制(圖7Α-Β，左欄)。使用重組HCV感染獲得類似的結(jié)果，這表明所鑒別的激酶對于生產(chǎn)性感染的啟動是重要的(圖7Α-Β，右欄)。相反，對照siRNA與細(xì)胞孵育沒有顯著改變 HCV的進入或HCV的感染(圖7)。沉默化兩個相應(yīng)的抑制性AMPK亞基(即β 1 (PRKABl) 和β 2(PRKAB2))刺激了 HCVpp的進入，這表明AMPK的活性對HCV的進入和感染是關(guān)鍵的。 通過使用AMPK活性抑制劑Dorsomorphin進一步確定了該途徑的影響(Zhou，2001)。使用 Dorsomorphin與Huh7. 5細(xì)胞預(yù)孵育顯著抑制了 HCVpp的進入(圖7C)，并表明，AMPK功能事實上對HCV的進入是重要的。STKll及其下游底物AMPK已顯示在上皮細(xì)胞(包括肝細(xì)胞)中極性的確立中起主要作用(Williams，2008)。其他研究表明，AMPK介導(dǎo)STKll的控制極性和有絲分裂的功能 (Lee, 2007)。這對于HCV的進入是特別有利的，因為細(xì)胞極性已顯示是HCV的進入的重要宿主因子(Brazzoli,2008 ；Evans, 2007 ；Mee, 2008 ；Meertens, 2008 ；Ploss, 2009)。細(xì)胞極性看起來改變HCV進入因子密蛋白-1的亞細(xì)胞定位，并調(diào)節(jié)H印G2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中的病毒進入(Mee，2009)。此外，Brazzoli 和同事(Brazzoli, 2008)已表明，HCV E2 糖蛋白與 CD81 的結(jié)合引發(fā)了 HCVE2/CD81復(fù)合物依賴于肌動蛋白地再定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸區(qū)，在該接觸區(qū)，CD81與緊密連接蛋白閉合蛋白(occluding)、Z0-1和密蛋白-1相接觸。Dorsomorphin 對AMPK的抑制已顯示阻斷非肌肉肌球蛋白調(diào)控性輕鏈(MRLC)的磷酸化(Lee，2007)。結(jié)合起來，這些結(jié)果支持如下模型，其中STK11/AMPK功能可能對細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白_肌球蛋白依賴性的HCV進入因子復(fù)合物的轉(zhuǎn)運或運輸是必需的(圖6D)。b)調(diào)控緊密連接功能的宿主細(xì)胞激酶。RNAi篩選鑒別了幾種與調(diào)控緊密連接 (TJ)功能有關(guān)的激酶。這些激酶包括MAGI-l、EphA2和EGFR(圖6C)。在極化的肝細(xì)胞中， TJ將它們的質(zhì)膜分成頂端結(jié)構(gòu)域和基底外側(cè)結(jié)構(gòu)域。這對于HCV的進入是特別有利的和相關(guān)的，因為幾種 TJ 蛋白(即密蛋白 _1、6 和 9) (Evans, 2007 ；Harris，2008 ；Meertens, 2008)和閉合蛋白(BenedictO，2009 ；Ploss,2009)已顯示是HCV進入的輔助因子。使用幾種具有不同細(xì)胞表面分布的攝取因子與以下的假設(shè)相一致HCV可以遵循協(xié)調(diào)的進入途徑，該途徑與柯薩奇病毒B的進入途徑類似，依賴于肝細(xì)胞的TJ (Ploss, 2009)?；蛘撸琀CV可使用與 TJ無關(guān)的密蛋白-1形式(Mee，2009)。破壞TJ已顯示出提高CaCo_2細(xì)胞中的HCV進入， 這支持如下的模型，其中TJ為病毒接觸在側(cè)面和基底外側(cè)結(jié)構(gòu)域上表達(dá)的HCV進入因子提供了物理屏障(Mee，2008)。MAGI-I是連接復(fù)合物形成過程中涉及的膜結(jié)合鳥苷酸激酶(Laura，2002)。 Ephrin受體2 (EphA2)是最大一類受體酪氨酸激酶的成員，并介導(dǎo)細(xì)胞定位、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和移動性以及細(xì)胞旁TJ滲透性(Lackmarm，2008)。如圖8所示，EphA2基因表達(dá)的沉默化(圖 8A)導(dǎo)致對來自所有主要基因型1-4的HCVpp的進入(圖8B)和重組HCV感染的顯著抑制， 這表明鑒別的激酶對生產(chǎn)性感染的啟動是重要的(圖8C)。相反，使用對照SiRNA(CTRL)與細(xì)胞孵育沒有顯著改變HCV的進入或HCV的感染(圖8)。對該途徑的影響還進一步通過使用EphA2功能抑制劑達(dá)沙替尼進行了確定(HUang，2007)。使用達(dá)沙替尼的預(yù)孵育顯著抑制了人原代肝細(xì)胞中HCVpp的進入和Huh7. 5. 1細(xì)胞的HCVcc感染(圖9)，并確定了 EphA2 功能事實上對HCV的進入是重要的。EphA4已顯示通過TJ蛋白密蛋白-4介導(dǎo)內(nèi)皮組織中細(xì)胞旁滲透性(Tanaka，2005)。此外，表皮生長因子(EGFR)被鑒別為HCV進入的輔助因子。如圖8所示，沉默化 EGFR表達(dá)(圖8A)導(dǎo)致對來自所有主要基因型1-4的HCVpp的進入(圖8B)和重組HCV感染的顯著抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明，該激酶對于生產(chǎn)性感染的啟動是重要的(圖8C)。如EphA2 一樣，EGFR是調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)鍵步驟的酪氨酸激酶受體，該關(guān)鍵步驟包括增殖、生存、 分化、發(fā)育過程、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生(Schneider和Wolf，2009)。EGFR在體內(nèi)主要激活 Raf/MEK/ERK 和 PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)(Lackmann，2008 ；Schneider，2009)。有意思的是，所用的初級篩選還表明，沉默化介導(dǎo)EGFR信號傳導(dǎo)的激酶顯著抑制了 HCV的進入這些激酶包括 b-Raf (BRAF)、MEKl (MAP2K1)和 ERKl (MAPK3)(圖 6D)。Raf/MEK/ERK 途徑對 HCV 進入的相關(guān)性還進一步通過應(yīng)用限定的抑制EGFR和EGFR的下游激酶的抑制劑得到支持。使用埃羅替尼對EGFR活性的抑制以劑量依賴性地抑制HCV的進入和HCV的感染(圖9)。相反，使用渥曼青霉素(Arcaro，1993)對PI3K活性的抑制不會這樣(圖10B)。Raf/MAK/ERK信號傳導(dǎo)途徑對HCV進入的相關(guān)性還進一步得到近期研究的支持，該研究表明，CD81的參與激活Raf/MAK/ERK信號級聯(lián)，且該途徑影響病毒生命周期的進入后事件(Brazzoli，2008)。綜合考慮，這些數(shù)據(jù)支持以下模型，其中通過MAP激酶途徑的EGFR激活和信號傳導(dǎo)是HCV進入所必需的。在HCV進入過程中的EGFR的分子功能是什么？ EGFR激活已顯示誘導(dǎo)細(xì)胞再分布和增加密蛋白-1的表達(dá)(Flores-Benitez,2007 ；Singh，2004)，且EGF介導(dǎo)的MAP激酶信號傳導(dǎo)已顯示導(dǎo)致MAP激酶ERK-I與閉合蛋白的C末端區(qū)域的相互作用，其防止H2O2-誘導(dǎo)的EGF對緊密連接的破壞(Basuroy，2006)。綜合考慮，這些數(shù)據(jù)和本RNAi篩選的結(jié)果進一步支持TJ蛋白對HCV進入的功能性作用，并表明了 EGFR與MAP激酶途徑介導(dǎo)的TJ蛋白密蛋白-1或閉合蛋白之間的功能連接。(圖6D)。有意思的是注意到，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)已顯示導(dǎo)致EphA2和EGFR表達(dá)的向上調(diào)節(jié)。事實上，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B已顯示導(dǎo)致EphA2的總水平的伴隨性增加(Zheng，2005)。NS5B已顯示導(dǎo)致EGFR表達(dá)的增加和EGFR的運輸分布的改變(Mankouri，2008)。該研究的作者已經(jīng)表明，MAP激酶信號傳導(dǎo)可能維持對于HCV持續(xù)性最佳的環(huán)境(Mankouri， 2008)。綜合考慮，這些數(shù)據(jù)和本RNAi篩選的結(jié)果提示了正反饋環(huán)路，其中HCV復(fù)制和非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B和NS5A的表達(dá)造成HCV輔助進入因子EphA2和EGFR的向上調(diào)節(jié)，從而有利于 HCV的進入和病毒的繁殖。c)整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)中涉及的宿主細(xì)胞激酶。STRING分析確定了細(xì)胞粘附和整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)中涉及的四種激酶的網(wǎng)絡(luò)=C-Src(CSK)、粘著斑激酶(PTK2)、粘著斑激酶2(PTK2B)和整聯(lián)蛋白連接的激酶(ILK)，它們均調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用(D Nichila，1999 ;Harburger，2009)(圖 6C)。已顯示，CD81 (—種關(guān)鍵的 HCV 進入因子)和其他四跨膜蛋白與整聯(lián)蛋白家族的粘附受體關(guān)聯(lián)，并調(diào)控整聯(lián)蛋白依賴性細(xì)胞遷移 (BerditCheVski，2001)。因此，可以想到，功能性整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)可能對于HCV進入因子的運輸和在細(xì)胞表面上的定位和最終的HCV進入是必需的。在這種情況下，多種四跨膜蛋白包括⑶81與II型磷脂酰肌醇4-激酶關(guān)聯(lián)，表明這可能通過將這些酶限制于整聯(lián)蛋白異二聚體來促進信號傳導(dǎo)復(fù)合物的組裝(BerditchevskidOOl)。這得到以下發(fā)現(xiàn)的支持沉默化2型α磷脂酰肌醇4-激酶(ΡΙ4ΚΙΙ)特異性地?fù)p害HCV的進入和感染，但不影響VSV 的進入。此外，已知整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)在其他病毒如腺病毒、漢坦病毒和皰疹病毒的進入中起關(guān)鍵作用(評論參見MeWart，2007)因此HCV可能具有另一整聯(lián)蛋白依賴性進入機理。d)細(xì)胞周期中涉及的宿主細(xì)胞激酶。STRING指出了包括參與細(xì)胞周期調(diào)控的8種激酶的網(wǎng)絡(luò)(圖6C)，包括細(xì)胞分裂周期2激酶(CDC2)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶3(CDK3)、 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、膽堿激酶α (CHKA)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 1B(CDKN1B)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2C(CDKN2C)、膜結(jié)合賴氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 (PKMYTl)和TOEl同系物粟酒酵母(S. pombe) (WEEl)。盡管不能排除這些⑶K是由于細(xì)胞分裂依賴性肝細(xì)胞瘤模型系統(tǒng)的內(nèi)在性質(zhì)而被鑒別的可能性，但幾種觀察支持CDK對于 HCV進入的特定作用。首先，CDK3的沉默化顯著抑制來自所有主要HCV基因型1_4的HCVpp 的進入，但不抑制VSVpp的進入。當(dāng)⑶KN1B、⑶KN2C、WEEl和PKMYTl被沉默化時，也觀察到對HCV進入的特定作用。第二，基因沉默化后(除了使用CHKA的實驗)，通過MTT的細(xì)胞代謝測量沒有觀察到細(xì)胞毒性。這表明激酶的沉默化不是由于非特異性的毒性作用。第三，夫拉平度，一種公知的CDK3抑制劑，在人原代肝細(xì)胞中不存在可檢測的細(xì)胞毒性作用， 但顯著抑制HCVpp的進入。這些數(shù)據(jù)表明，CDK的作用與模型靶細(xì)胞系或擬顆粒進入分析均無關(guān)，但可能與HCV進入有關(guān)。公知的是，CDK在人免疫缺陷病毒和皰疹病毒的生命周期中起重要作用。這些作用包括通過⑶K9調(diào)節(jié)HIV的轉(zhuǎn)錄(3κηι，2009)和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒對⑶Κ4和⑶Κ6的激活，其中⑶Κ4和⑶Κ6調(diào)節(jié)微絲組織和細(xì)胞形態(tài)學(xué)(Cuomo， 2005)。因此，可以想到，HCV具有類似的機理。4.通過定義的抑制劑對宿主細(xì)胞激酶的抑制，所鑒別的激酶對于HCV進入的特定影響的證實為了進一步研究鑒別的激酶對于HCV生命周期的影響，表征了 EphA2和EGFR的功能影響。選擇這些激酶，是因為它們是所確定的網(wǎng)絡(luò)中的組分(圖6C)。此外，EphA2和EGFR 被臨床批準(zhǔn)的激酶抑制劑達(dá)沙替尼(用于EphA^和埃羅替尼(用于EGFR)強烈抑制，使得可以研究這些激酶在病毒生命周期的不同階段的功能影響。研究了激酶抑制劑對于HCV進入、復(fù)制和感染的影響。如圖9所示，達(dá)沙替尼和埃羅替尼顯著抑制HCV感染。埃羅替尼是 HCV進入和感染的最有效的抑制劑(IC5tl大約為0.5 μ M)，其次是達(dá)沙替尼(IC5tl為2μΜ)。 所觀察到的IC5tl值均高于所述的純化的EphA2 (Huang, 2007)或EGFR (Minami，2007)的IC5tl 值。在肝細(xì)胞或肝細(xì)胞來源的細(xì)胞株中觀測的IC5tl值較高可能是由于抑制劑在肝細(xì)胞或肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中的快速代謝。不過，也不能排除其他激酶對于達(dá)沙替尼和埃羅替尼的抗病毒影響產(chǎn)生貢獻的可能性，但在EGFR的情況下，目前的結(jié)果(圖9)由三種另外的以類似的 IC5tl (未顯示)抑制HCV感染的EGFR抑制劑(吉非替尼、凡德他尼、拉帕替尼)證實。達(dá)沙替尼和埃羅替尼對于HCVcc感染的抑制效應(yīng)也通過使用排除藥物對于螢光素酶報告分子翻譯的非特異性影響(數(shù)據(jù)未顯示)的RT-PCR檢測病毒RNA得到證實。為了證實這些分子對于HCV感染的抑制效應(yīng)確實是對病毒進入的抑制，研究了它們對于HCV分離株JFHl的進入和復(fù)制的影響。如圖9所示，達(dá)沙替尼和埃羅替尼抑制源自 JFHl的HCVpp進入，沒有明顯調(diào)節(jié)亞基因組JFHl復(fù)制子的復(fù)制。與此相反，抑制病毒復(fù)制的蛋白激酶抑制劑渥曼青霉素(Tai，2009)對于源自JFHl的HCVpp進入沒有任何影響(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)證實，被達(dá)沙替尼和埃羅替尼選擇性抑制的激酶在HCV進入方面是重要的，但在病毒復(fù)制方面不重要。這些發(fā)現(xiàn)進一步證實，被達(dá)沙替尼和埃羅替尼選擇性抑制的激酶在HCV進入方面是重要的，但在病毒復(fù)制方面不重要。這些發(fā)現(xiàn)進一步證實鑒別的激酶對于HCV進入的影響，并提示使用經(jīng)批準(zhǔn)的化合物抑制宿主激酶可能是一種有用的抗 HCV的治療策略。5.使用多激酶抑制劑通過靶向宿主細(xì)胞激酶對源自經(jīng)受肝移植患者的HCV分離株進入的抑制由于埃羅替尼在對應(yīng)于可達(dá)到的血漿濃度(平均血漿濃度 4 μ M，Hidalgo和 Bloedow,2003)的劑量范圍(IC5tl為0. 5 μ M)內(nèi)有效抑制HCV進入和感染，評估其對于用患者來源的分離株感染的影響。使用原代人肝細(xì)胞和源自四個HCV感染的經(jīng)受肝移植患者的攜帶病毒包膜糖蛋白的HCV準(zhǔn)型，本申請人已經(jīng)證明在肝移植物的HCV再感染過程中，增強的病毒進入和避開抗體介導(dǎo)的中和是選擇病毒變異體的關(guān)鍵因素(Fafi-Kremer， 2009)。這個以前研究的結(jié)果已經(jīng)表明，病毒進入是預(yù)防肝移植者的HCV再感染的可行的目標(biāo)(Fafi-Kremer，2009)。在本研究中，研究了多激酶抑制劑對于源自在4個不同患者的移植和肝移植物再感染過程中選擇的HCV株(HCV株VD、VH、VK、VN)的攜帶包膜糖蛋白的 HCVpp進入的影響。如圖9所示，鑒別的宿主細(xì)胞激酶的沉默化以及細(xì)胞與激酶抑制劑達(dá)沙替尼和埃羅替尼的預(yù)先孵育可以顯著抑制源自患者的HCVpp在Huh7. 5細(xì)胞和原代人類肝細(xì)胞中的進入。在Huh7. 5細(xì)胞中埃羅替尼似乎比達(dá)沙替尼更有效，但在原代人類肝細(xì)胞不是這樣。與此相反，渥曼青霉素(圖10)或基于二氮雜萘(naphthyridine)的TpI2激酶抑制劑(數(shù)據(jù)未顯示)并不會導(dǎo)致可重復(fù)的HCVpp感染的抑制。這些數(shù)據(jù)表明，埃羅替尼和達(dá)沙替尼特異性地抑制感染肝移植物的源自患者的分離株的HCV進入。在基于MTT法測試的細(xì)胞生存力的并排分析中沒有檢測到毒性效應(yīng)(圖10)?？傊?，這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)HCV進入的宿主細(xì)胞激酶是抗病毒治療的可行的靶標(biāo)。 蛋白激酶抑制劑的臨床開發(fā)提供了基于靶向病毒感染所必需的特異性宿主細(xì)胞激酶的抗病毒策略的新前景。由于這種方法與針對病毒蛋白的抗病毒策略是相輔相成的，它可以代表一種克服病毒抗性的有價值的方法。此外，使用許可的HCV激酶抑制劑抑制HCV進入可以構(gòu)成一種新的預(yù)防原發(fā)HCV感染、特別是肝移植術(shù)后感染的治療方法，也可以減弱病毒在慢性感染患者中的擴散。參考文獻D. B. Allison et al.，Nat. Rev. Genet.，2006，7 :55-65.A. Arcaro et al.，Biochem. J.，1993，296 (2)，297-301.H. Barth et al.，J. Biol. Chem.，2003，278 :41003-41012.H. Barth et al.，J. Virol.，2006,80 10579—10590.H. Barth et al. , Hepatology 2006，44 :527-35.H. Barth et al.，J Hepatol.，2008，49 :134-42.B. Bartosch et al.，J. Exp. Med.，2003，197 :633-642.S. Basuroy, Biochem. J.，2006，393 :69-77.I.Benedictor et al, J. Virol. ,2009,83 :8012-8020.F. Berditchevski et al, J. Cell. Sci. ,2001,114 :4143-4151.Μ. Brazzoli et al.，J. Virol.，2008，82，8316—8329.R. S ；Brown, Nature, 2005，436 :973-978.Μ. A Cirone et al.，Int. J. Cancer, 1990,45 :490-493.F. V. Chisari, Nature, 2005,435 :930-932.S. N. Constantinescu et al.，F(xiàn)EBS Lett.，1991，292 :31-33.Μ. Ε. Cuomo, J. Biol. Chem.，2005，280 :35844-35858.P. David et al.，Hum. Exp. Toxicol.，1998，17 :544-553.Μ. 0 De Nichilo et al.，J. Cell Physiol.，1999，178 :164-172.Μ.Dimitova et al.，PNAS，USA,2008，105 :16320-16325.Μ. J. Evans et al.，Nature, 2007,446 :801-805.S. Fafi-Kremer et al. , "Escape from antibody-mediated neutralization and viral entry are key determinants for HCV re-infection in liver transplantation，，, 2009,已提交.X. Fang et al. , Hepatology 2006，43 :1326—36.M. J. Farquhar et al.，J. Virol.，2008，82 :8797-8811.J. J. Feld et al.，Nature, 2005，436 :967-972.D. Flores-Benites et al. , Am. J. Physiol. Renal. Physiol. , 2007, 292
F828-836.

C Gentleman et al. , Genome Biol. ,2004,5 :R80.
S. Harburger et al. , J. Cell. Sci. ,2009,122 :159-163.
J. Harris et al. , J. Virol. ,2008,82 :5007-5020.
Hildago et al. , Semin. Oncol. ,2003,30 :25-33.
H. Hoofnagle, Hepatology,2002, 36 :S21_S29.
Huang et al.，Cancer Res.，2007，67 :2226-2238.
Hsu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003,100 :7271-727.
Huang et al.，Cancer Res.，2007，67 :2226-2238.J. L. Jensen et al. , Nucleic Acids Res. ,2009,37, D412-416.
T.Kato et al.，J Virol.，2005，79 :592-6.
Τ. Kato et al.，J. Virol.，2007，81 :4405-4411.
Τ.Kato et al. , Hepatology,2008,48 :732-40.
G.Koutsoudakis et al. , J. Virol. ,2006,80 :5308-53 20.
Μ. N. Krishnan et al, Nature,2008,455 :242-245.
Μ. Lackmann et al. , Sci. Signal. , 2008,1 :re2.
L. Lan et al.，J. Immunol.，2008，181 :4926-4935.
G. M-Lauer et al.，N. Engl. J. Med.，2001，345 :41-52.
R. P. Laura et al. , Exp. Cell. Res. ,2002,275 :155-170.
M. Law et al.，Nat Med.，2008，14 :25-7.
J. H. Lee et al.，Nature,2007，447，1017—1020.
B.D.Lindenbach et al.，Science,2005，309 :623-626.
B.D.Lindenbachet al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2006,103 :3805-3809. V.Lohmann et al. , Science,1999,285 :110-113.
J. Mankouri et al.，Traffic,2008，9 :1497-1509.
C.J. Mee et al.，J. Virol.，2008，82，461-470.
C.J. Mee et al.，J. Virol.，2009，83，6211-6221.
L. Meertens et al.，J.Virol.，2008，82，3555-3560. J. C. Meunier et al.，J. Virol.，2008,82 :966-973.
D.F.Merceret al.，Nat Med.，2001，7 :927-33.
Y. Minami et al. , Oncogene,2007, 26 :5023-5027. T. Mosmann et al. , J. Immunol. Methods, 1983,65 :55-63. J. M.Pestka et al.，PNAS，USA，2007，104 :6025-6030. Pawlotsky, Trends Microbiol. ,2004,12 :96-102. L.Pelkmans et al. , Nature,2005,436 :78-86.
J. M. Pestka et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，2007，104 :6025-6030.
Τ.Pietschmann et al.，PNAS,USA,2006，103 :7408-7413
P.Pileri et al. , Science,1998,282 :938-941.
C. N. Root et al.，J. Gen. Virol.，2000,81 :2697-2705.
A.Ploss et al. ，Nature，2009，457 :882-886.
M. R. Schneider et al.，J. Cell. Physiol.，2009，218 :460-466.
L. B. Seeff, Semin.Gastrointest. ,1995,6 :20-27.
L.B.Seeff and J. H. Hoofnagle, Hepatology,2002, 36 1-2.
E.Scarselliet al.，EMBO J.，2002，21 :5017-5025.
S. B. Sieczkarski et al.，J. Virol.，2003，77 :460-469. A. B. Singh et al.，J. Biol. Chem.，2004，279 :3543-3552. A.S. Smith et al. ，Science 2004,304 :237-42. P. L. Stewart et al. ，Trends Microbiol. ，2007,15 :500-507.
CN 102227237 A說明書34/35 頁K. Strimmer, Bioinformatics,2008，24 1461—1462.A. W. Tai et al.，J. Hepatol.，2009，50 :412-420.M. Tanaka et al.，J. Biol. Chem.，2005，280 :42375-42382.A. W. Tarr et al.，Hepatology, 2006,43 :592-601.M. J. Tuvim et al.，PLoS ONE, 2009,4, e4176.Τ.Vanwolleghem et al. , Gastroenterology,2007,133 :1144-55.Τ. Wakita et al. , Nat. Med.，2005，11 :791-796.J. Μ. Wettenhall et al.，Bioinformatics，2004，20 :3705-3706.Τ. Williams et al. , Trends Cell. Biol.，2008，18，193-198.M. B. Zeisel et al.，H印atology，2007，46 :1722-1731.M. B. Zeisel et al.，H印atology，2008，48 :299-307Y. Zheng et al.，J. Biochem. Mol. Biol.，2005，38 :151-160.G.Zhou et al.，J. Clin. Invest.，2001，108，1167-1174.M-Zhou et al. , J.Virol.，2009，83 :1036-1044.其它實施方式本發(fā)明的其它實施方式在考慮了本文公開的本發(fā)明說明書或?qū)嵤┍景l(fā)明后對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將會是明顯的。說明書和實施例意圖被視為僅是示例性的，本發(fā)明的真實范圍由下述權(quán)利要求書指明。
權(quán)利要求
1.一種用于防止細(xì)胞被丙型肝炎病毒(HCV)感染的藥劑，其中所述藥劑抑制至少一種蛋白激酶的活性，該蛋白激酶選自EGFR、PRKAG2、STKlU EPHA2和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶， 或者選自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者選自 CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2,或者選自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、EPHA3、 EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK, GKAPl、GRK4、IKBKB, ΜΑΡ3Κ7ΙΡ1、MAPKAPU ΝΕΚ9、 ΡΑΝΚ3、ΡΙ4ΚΙΙ、ΡΙΡ5Κ2Α、PRKAG2、PSKHl、ΡΤΚ2、ΡΤΚ2Β、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2。
2.一種用于預(yù)防或治療受試者的HCV感染或HCV相關(guān)疾病的藥劑，其中所述藥劑抑制至少一種蛋白激酶的活性，該蛋白激酶選自EGFR、PRKAG2、STKl 1、EPHA2和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶， 或者選自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者選自 CALM2、CSK、MAGIU ADK, CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2,或者選自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、ΕΡΗΑ3、 EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK, GKAPl、GRK4、IKBKB, ΜΑΡ3Κ7ΙΡ1、MAPKAPU ΝΕΚ9、 ΡΑΝΚ3、ΡΙ4ΚΙΙ、ΡΙΡ5Κ2Α、PRKAG2、PSKHl、ΡΤΚ2、ΡΤΚ2Β、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、ΤΝΚ2 和 ULK2。
3.一種用于預(yù)防肝移植患者的HCV復(fù)發(fā)的藥劑，其中所述藥劑抑制至少一種蛋白激酶的活性，該蛋白激酶選自EGFR、PRKAG2、STKlU EPHA2和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶， 或者選自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者選自 CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2，或者選自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、EPHA3、 EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAPl、GRK4、IKBKB, MAP3K7IP1、MAPKAPU NEK9、 PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKHl、PTK2、PTK2B、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、TNK2 和 ULK2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的藥劑，其中所述藥劑選自小分子、單克隆抗體、多克隆抗體、RNA聚合酶抑制劑、反義化合物、核酶、siRNA, siDNA及其任意組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的藥劑，其中所述藥劑抑制EGFR的活性并且選自埃羅替尼、凡德他尼、吉非替尼和拉帕替尼。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的藥劑，其中所述藥劑為抑制AMPK的活性的 Dorsomorphin0
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的藥劑，其中所述藥劑為抑制EPHA2的活性的達(dá)沙替尼。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的藥劑，其中所述藥劑為抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性的夫拉平度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的藥劑在制備用于治療和/或預(yù)防HCV感染或HCV 相關(guān)疾病的藥物中的用途。
10.一種藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的藥劑和至少一種可藥用載體或賦形劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，還包含至少一種生物活性劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其適合與至少一種生物活性劑聯(lián)合使用。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物，其中所述生物活性劑為抗病毒劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述抗病毒劑選自干擾素、利巴韋林、抗 HCV單克隆抗體、抗HCV多克隆抗體、RNA聚合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、IRES抑制劑、解旋酶抑制劑、反義化合物、核酶及其任意組合。
15.一種鑒別潛在的HCV抗病毒劑的方法，包括以下步驟(a)在體外將表達(dá)至少一種人細(xì)胞蛋白激酶的生物系統(tǒng)與候選化合物接觸，其中該蛋白激酶選自EGFR、PRKAG2、STKlU EPHA2和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，或者選自 STK11、PRKAG2、MAGI-1、EphA2、EGFR、CSK、PTK2、PTK2B、ILK、CDC2、CDK3、CDK4、 CHKA, CDKNlB, CDKN2C、PKMYTl 禾口 WEEl，或者選自 CALM2、CSK、MAGI1、ADK、CDK3、CDKNlB, CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK, FGR、 ILK、IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、 CKSIB、DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38 和 TYK2,或者選自 CALM2、CSK、MAG11、ADK、CDK3、CDKN1B、CDKN2C、EPHA2、EPHB4、FASTK、FGR、ILK、 IRAK2、PACSIN2、PDIK1L、PIP5K2B、PKMYT1、PLK3、PRKD2、STK24、WEE1、CDKL3、ADRBK1、CKS1B、 DCAMKL1、DDR2、EPS8L1、GAK、ITPKA、MAPK7、PAK4、STK11、STK38、TYK2、ACVR2B、APEG1、ATM、 AURKB, BMX、BRAF, CDC2、CDC2L1、CDK4、CDK8、CHKA, CHKB, CIB2、CKMTU DGKB, EGFR、EPHA3、EPHBl、FER、FGFR4、FLT3LG、FN3K、GCK、GKAPl、GRK4、IKBKB, MAP3K7IP1、MAPKAPU NEK9、 PANK3、PI4KII、PIP5K2A、PRKAG2、PSKHl、PTK2、PTK2B、RIOKl、RPS6KA5、RPS6KL1、Sharpin、 SKIP、STK22C、TNK2 禾口 ULK2 ；禾口 (b)確定所述蛋白激酶的活性，其中，如果在步驟(b)中確定的活性低于在不存在該候選化合物的情況下在所述生物系統(tǒng)中確定的所述蛋白激酶的活性，則該候選化合物被鑒別為潛在的HCV抗病毒劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述候選化合物選自小分子、單克隆抗體、多克隆抗體、RNA聚合酶抑制劑、反義化合物、核酶、siRNA, siDNA及其任意組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述候選化合物屬于候選化合物的集合或文庫。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項所述的方法，其中所述生物系統(tǒng)是細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了幾種細(xì)胞蛋白激酶網(wǎng)絡(luò)，作為針對哺乳動物(包括人類)中丙型肝炎病毒(HCV)感染和HCV相關(guān)疾病和紊亂的醫(yī)療干預(yù)的潛在靶標(biāo)。本發(fā)明涉及治療方案和藥物組合物，它們設(shè)計用來抑制這些蛋白激酶中的一種或多種的活性，用于預(yù)防和/或治療由HCV引起的感染和疾病。本發(fā)明還涉及鑒別可用于治療或預(yù)防HCV感染和HCV相關(guān)疾病的激酶抑制劑的方法。
文檔編號A61K31/711GK102227237SQ200980147952
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者托馬斯·博梅爾, 若阿基姆·呂普貝熱 申請人:國家健康與醫(yī)學(xué)研究院