專利名稱：：硫醇化的殼聚糖凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多糖和用于身體的材料。
背景技術(shù)：
：某些多糖材料已經(jīng)用于手術(shù)修復(fù)或藥物遞送。關(guān)于這些材料的文獻(xiàn)包括美國專利號6，514，522(Domb)和7，053,068B2(Prinz)，美國專利申請公開號US2005/0176620A1(Prestwych等人)和US2005/0238702A1(Ishihara等人)，加拿大專利申請?zhí)?348842Al(BernkopIchnUrch)，公開的PCT申請?zhí)朩O98/31712A2(B.F.GoodrichCo.)、W001/00246A2(Bentley等人)和WO03/020771A1(MucobiomerBiotechnologischeForschungs-undEntwicklungsGmbH),Mi等人，SynthesisandCharacterizationofaNovelChitosan-BasedNetworkPreparedUsingNaturalIy-OccurringCrosslinker,JPolymSci,PartA=PolymChem，38，2804-2814(2000)，Mi等人，SynthesisandcharacterizationofbiodegradableTPP/genipinco-crosslinkedchitosangelbeads,Polymer,44,6521-30(2003),Roldo等人，Mucoadhesivethiolatedchitosansasplatformsfororalcontrolleddrugdelivery!synthesisandinvitroevaluation,EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics,57,115-121(2004),Krauland等人’ViscoelasticPropertiesofaNewinsituGellingThiolatedChitosanConjugate,DrugDevelopmentAndIndustrialPharmacy,31,885-893(2005),Bernkop-Schniirch,Thiomers:Anewgenerationofmucoadhesivepolymers,AdvancedDrugDeliveryReviews,57,1569-1582(2005),Bernkop-Schniirch等人，Thiomers:Preparationandinvitroevaluationofamucoadhesivenanoparticulatedrugdeliverysystem,InternationaljournalofPharmaceutics,317,76-81(2006)禾口Weng等人，RheologicalCharacterizationofinSituCrosslinkableHydrogelsFormulatedfromOxidizedDextranandN-CarboxyethylChitosan,Biomacromolecules,8,1109-1115(2007)。
發(fā)明內(nèi)容硫醇化殼聚糖能夠進(jìn)行自交聯(lián)反應(yīng)從而形成凝膠。報(bào)道的膠凝時(shí)間為30分鐘或更長，并且有時(shí)表示以小時(shí)表示。如果在身體的某些部分中使用，則在膠凝化發(fā)生之前未凝膠化的材料的大部分(ampleportion)可能從該部位排出或可被纖毛或其它自然防御物運(yùn)^(carryaway)。外來的交聯(lián)劑已加入到一些殼聚糖材料中從而形成用于藥物遞送的納米顆粒珠(nanoparticlebead)或片。珠和片，當(dāng)用于一些應(yīng)用時(shí)，將不在粘膜組織上提供保護(hù)性密封層。通過使硫醇化殼聚糖與適量的氧化劑和外來的交聯(lián)劑中的一種或兩種結(jié)合，可顯著增加膠凝化發(fā)生的速率。如果將所得混合物在組織或結(jié)構(gòu)頂上展開(spread)成層，以及如果氧化劑或外來的交聯(lián)劑的量不是過量的，則可以形成保護(hù)性凝膠層。該保護(hù)性凝膠層可幫助損傷的、發(fā)炎的或手術(shù)修復(fù)的表面恢復(fù)到正常狀態(tài)，例如，通過一種或者多種痊愈機(jī)制諸如炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、吞噬作用、粘膜重塑、纖毛重生(reciliation)或其它正常功能的全部或部分修復(fù)。本發(fā)明一方面提供了治療身體組織或結(jié)構(gòu)的方法，該方法包含a)將含有硫醇化殼聚糖和氧化劑或外來交聯(lián)劑的混合物的流體層施加到其上，和b)允許該混合物原位形成保護(hù)性凝膠層。本發(fā)明另一方面提供了用于保護(hù)身體組織或結(jié)構(gòu)的二部分組合物(two-partcomposition)，第一部分包含硫醇化殼聚糖，第二部分包含充足的氧化劑或外來交聯(lián)劑以便當(dāng)該兩部分混合并涂覆到該組織或結(jié)構(gòu)上時(shí)，該混合物在少于30分鐘的時(shí)間內(nèi)形成保護(hù)性凝膠層。本發(fā)明又一方面提供了身體組織或結(jié)構(gòu)頂上的流體層，該層包含硫醇化殼聚糖和充足的氧化劑或外來交聯(lián)劑以便保護(hù)性凝膠層可以在少于30分鐘內(nèi)原位形成。所公開的保護(hù)性凝膠層期望地是內(nèi)在抗菌的，不需添加單獨(dú)的抗菌劑。所公開的兩部分組合物期望地包裝在多組件噴霧分配器、多筒式注射器或安瓿瓶中，其中可破裂或可除去的隔片(s印turn)位于該第一部分和第二部分之間。所公開的方法、組合物和層對于治療耳、鼻或喉中的粘膜組織，以及肢體(limb)或脊柱中的開口(opening)、隱窩(recess)、通道(passageway)或關(guān)節(jié)特別有用。所公開的方法、組合物和流體層不是并且沒有利用植入物或可植入的設(shè)備。圖1是顯示所公開的方法的示意性視圖；圖2是可以在所公開的方法中使用的分配工具的立體圖；圖3是示出各種硫醇化殼聚糖溶液的膠凝化性能和流變性質(zhì)的圖表；圖4是示出各種殼聚糖溶液粘度的圖表；圖5是原位交聯(lián)的硫醇化殼聚糖凝膠層與胰胨豆胨培養(yǎng)液對照的抗菌性質(zhì)比較的圖表；和圖6是示出各種硫醇化殼聚糖凝膠層降解的圖表。在附圖的各張圖中類似的附圖標(biāo)記表示類似的元件。附圖中的元件沒有按比例繪制。具體實(shí)施例方式下面的詳述描述了某些實(shí)施方式，并且不能認(rèn)為具有限制性的意義。本文中的所有重量、量和比率為按重量計(jì)，除非另外具體地注明。下面顯示的術(shù)語具有下列的含義術(shù)語“粘附性”是指將身體結(jié)構(gòu)或假體材料與組織粘在一起，指將組織與組織粘在一起使其緊密地接觸持續(xù)延長的時(shí)間，或指形成將身體結(jié)構(gòu)、假體材料或組織跨越正常開放的空間彼此連接的組織。術(shù)語“抗菌”是指在金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌或粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)的一種或多種的群體中導(dǎo)致大于90%的數(shù)值減少(即，至少1個(gè)對數(shù)數(shù)量級的減少)的能力。術(shù)語“附著”和“粘附”當(dāng)用來提及細(xì)菌生物膜和表面時(shí)是指該生物膜建立在和至少部分地涂敷在或覆蓋在該表面上，并且具有一些對從該表面上去除的抵抗力。因?yàn)榇岁P(guān)系的性質(zhì)是復(fù)雜的和理解甚少，因此這種使用并不意在有特殊的附著或粘附機(jī)制。術(shù)語“細(xì)菌生物膜”是指附著在表面上的細(xì)菌的群落，在該群體中的生物體包含在由該細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖(EPS)基質(zhì)中。術(shù)語“生物相容的”當(dāng)用來提及物質(zhì)時(shí)是指該物質(zhì)表現(xiàn)出對身體的不顯著的有害或不良作用。術(shù)語“生物可降解的”當(dāng)用來提及物質(zhì)時(shí)是指該物質(zhì)在體內(nèi)將降解或蝕解以形成小的化學(xué)或物理種類。此類降解過程可以是酶促的、化學(xué)的或物理的。術(shù)語“生物可吸收的”當(dāng)用來提及物質(zhì)時(shí)是指該物質(zhì)能夠被身體吸收。術(shù)語“粘性的”當(dāng)用來提及液體或凝膠時(shí)是指當(dāng)置于水平面上時(shí)該液體或凝膠將趨于(但不一定在所有情況下)粘住其自身并且形成單一團(tuán)塊。術(shù)語“粉碎的”當(dāng)用來提及顆粒物質(zhì)時(shí)是指顆粒已經(jīng)通過切割、磨碎、粉碎、搗碎或采用外部施加力量的其他顆粒破碎工藝被破碎并且尺寸減小。術(shù)語“共形的”當(dāng)用來提及施用于組織或其他身體結(jié)構(gòu)的組合物時(shí)是指該組合物可以在已經(jīng)施用該組合物的區(qū)域上形成基本上連續(xù)的層。術(shù)語“分離”、“去除”和“破壞”當(dāng)用于提及附著或粘附在表面上的細(xì)菌生物膜時(shí)是指至少顯著量的最初存在于該表面上的生物膜不再附著或粘附于該表面。這種使用不意在有特殊的分離、去除或破壞機(jī)制。術(shù)語“流體”當(dāng)用來提及物質(zhì)時(shí)是指該物質(zhì)是其損耗模量(G")大于其儲能模量(G')且損耗角正切值(tanδ)大于1的液體。術(shù)語“凝膠”當(dāng)用來提及物質(zhì)時(shí)是指該物質(zhì)是可變形的(即，不是固體)，G"小于G'且tanδ小于1。術(shù)語“凝膠化”當(dāng)用來提及凝膠層的形成時(shí)是指G"等于G'且tanδ等于1的時(shí)刻。術(shù)語“止血器”是指停止血流的裝置或材料。術(shù)語“水凝膠”當(dāng)用來提及凝膠時(shí)是指該凝膠是親水的且含有水。術(shù)語“水合的”當(dāng)用來提及裝置或物質(zhì)時(shí)是指該裝置或物質(zhì)含有均勻分布的化學(xué)鍵合的水?！巴耆系摹毖b置或物質(zhì)不能吸收額外的水化作用的水?！安糠炙系摹毖b置或物質(zhì)能夠吸收額外的水化作用的水。術(shù)語“植入物”表示無菌固體制品，其尺寸和形狀適合一種或多種活性物質(zhì)在一段時(shí)間內(nèi)腸胃外植入和釋放。術(shù)語“可植入設(shè)備”表示固體設(shè)備，其經(jīng)手術(shù)程序被全部引入到人體中或代替上皮表面或眼睛表面，并且在該手術(shù)程序后保持在適當(dāng)位置。通過手術(shù)程序被部分地引入到人體中并在手術(shù)程序之后保持在適當(dāng)位置至少30天的任何固體設(shè)備也被認(rèn)為是可植入設(shè)備。術(shù)語“內(nèi)耳”是指半規(guī)管和耳蝸。術(shù)語“中耳”是指由鼓膜、內(nèi)部結(jié)構(gòu)諸如聽骨鏈、周圍襯里和邊緣結(jié)構(gòu)諸如乳突限定的區(qū)域。術(shù)語“粘膜附著劑”當(dāng)用來提及裝置或物質(zhì)時(shí)是指該裝置或物質(zhì)將粘附于粘液被覆上皮。術(shù)語“鼻腔或竇腔”是指在鼻和竇內(nèi)限定正常充氣通道和小室的各種組織，包括但不限于鼻孔、鼻甲(nasalconcha)或鼻甲骨(turbinate)、額竇、篩竇、蝶竇和上頌竇、竇口(sinusostia)禾口|口因(nasopharnyx)。術(shù)語“多糖”包括多糖的衍生物和改性多糖，以及各多糖種類和改性的各多糖種類的衍生物。例如，術(shù)語“羧甲基纖維素”包括羧甲基纖維素衍生物和改性的羧甲基纖維素，術(shù)語“殼聚糖”包括殼聚糖衍生物和改性的殼聚糖，術(shù)語“淀粉”包括淀粉衍生物和改性淀粉。術(shù)語“保護(hù)性的”當(dāng)用來提及在組織或其他身體結(jié)構(gòu)上的組合物層時(shí)是指該層有助于使損傷的、發(fā)炎的或手術(shù)修復(fù)的組織表面恢復(fù)至正常狀態(tài)，例如，通過一種或多種愈合機(jī)制諸如炎性應(yīng)答的調(diào)節(jié)、吞噬作用、粘膜重塑、纖毛再生或其他正常功能的完全或部分恢Μ.ο術(shù)語“停留時(shí)間”當(dāng)用來提及在組織或其他身體結(jié)構(gòu)上的保護(hù)性凝膠層時(shí)是指在肉眼觀察下凝膠層或其一部分在體內(nèi)仍然就位所持續(xù)的時(shí)間期限。術(shù)語“溶劑化”是指形成含有溶劑或其他載體的溶液或分散體，溶質(zhì)溶解或懸浮在所述溶劑或載體內(nèi)。術(shù)語“基本上不含膠原的”是指含有足夠低量的膠原使得不會造成傳播或感染牛海綿狀腦病(BSE)或變異性克雅氏病(variantCreutzfeldt-Jakobdisease)(vCJD)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)語“薄的”當(dāng)用來提及在組織或其他身體結(jié)構(gòu)上的保護(hù)層時(shí)是指具有小于約2毫米的平均厚度。參照圖1，所公開的治療方法可以在例如患者的鼻腔或竇腔100中進(jìn)行，竇腔包括上頌竇IlOaUlOb和額竇112a、112b，它們都可以通過鼻孔114a、114b進(jìn)入。應(yīng)當(dāng)注意，患者的外部特征，包括鼻孔114a、114b以虛線顯示。當(dāng)患者患有例如慢性鼻竇炎時(shí)，與上頌竇IlOa的表面相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)治療部位諸如治療部位116可以經(jīng)醫(yī)療或如果需要經(jīng)手術(shù)治療。治療部位116包括上頌竇IlOa的纖毛上皮并且可以包括棲息在相關(guān)的生物膜中的細(xì)菌的相關(guān)層(在圖1中未顯示)。治療部位不必是自然組織并且可以改為人工結(jié)構(gòu)(在圖1中未顯示)諸如竇填塞材料或支架，其也可以至少部分地用細(xì)菌生物膜層覆蓋。如果存在，生物膜可以使用溶劑化系統(tǒng)(例如美國專利申請公開號US2007/(^64310A1中所述的溶劑化系統(tǒng))去除，該系統(tǒng)可以使用帶有含有灌洗管(隱藏在圖1中)的活節(jié)式(articulatable)輸送管122的導(dǎo)引器120來施用至治療部位116，通過所述輸送管122，溶劑化系統(tǒng)可以流動(dòng)至導(dǎo)引器120的遠(yuǎn)端處的噴嘴IM并且因此流動(dòng)至治療部位。溶劑化系統(tǒng)和生物膜的殘留物可以從治療部位經(jīng)吸引管(隱藏在圖1中)被去除。所公開的硫醇化殼聚糖組合物可以同樣地使用導(dǎo)引器120中的相同或不同的灌洗管在治療部位處施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解，所公開的硫醇化殼聚糖組合物(和如果使用，溶劑化系統(tǒng))可以使用其他方法或裝置施用至治療部位。示例性的其他方法包括動(dòng)力噴霧或其他噴涂法、灌洗、噴霧(misting)、涂抹(mopping)、芯吸(wicking)、滴落(dripping)和環(huán)鉆術(shù)，并且示例性的其他裝置包括噴霧嘴(例如，單個(gè)元件或多個(gè)元件的噴霧嘴)和注射器(例如，單管或多管玻璃或塑料注射器和沖洗球)。治療方法還可以在其他身體部分中進(jìn)行。治療方法特別地用于非血管應(yīng)用，包括治療耳、咽喉、肢體或者脊柱內(nèi)中或其附近的組織(例如粘膜組織)或結(jié)構(gòu)。圖2顯示示例性的工具200，其可以用于所公開的治療方法中。工具200包括手柄202和導(dǎo)引器222，其遠(yuǎn)端224(總體參考)包括噴嘴、灌洗和吸引管(在圖2中未單獨(dú)編號)。工具200可以任選地進(jìn)一步包括第一致動(dòng)器組件226(總體參考)和第二致動(dòng)器組件228(總體參考)。第一致動(dòng)器組件226中的控制輪230可以由用戶操作以實(shí)現(xiàn)導(dǎo)引器222的彎曲，并且第二致動(dòng)器組件228中的控制輪232可以由用戶操作以實(shí)現(xiàn)從導(dǎo)引器222的遠(yuǎn)端2M噴出的液體相對于導(dǎo)引器222的移動(dòng)或旋轉(zhuǎn)。手柄202通常用作工具200的各種其他元件的外殼并且作為導(dǎo)引器222的支撐。手柄202可以具有手槍柄樣的形狀，限定把手部234和機(jī)頭236。把手部234的大小和形狀制成為適于用戶的手抓握，而機(jī)頭236則適于與導(dǎo)引器222連接。扳機(jī)238和相關(guān)的傳感器和閥門(圖2中未顯示)可以用來控制所公開的可再水化凝膠(和如果使用，公開的溶劑化系統(tǒng))通過灌洗管240和然后通過遠(yuǎn)端224的噴嘴并到所需的治療部位上的流動(dòng)。扳機(jī)238可以設(shè)置以多向運(yùn)動(dòng)范圍并且與一個(gè)或多個(gè)附加的傳感器和閥門(圖2中未顯示)相關(guān)聯(lián)以控制溶劑化系統(tǒng)、生物膜殘留物和其他碎片從治療部位通過遠(yuǎn)端224的吸引管去除并且從此進(jìn)入至吸引管242中。扳機(jī)238還可以用來控制所公開的可再水化凝膠通過灌洗管240中的獨(dú)立腔的流動(dòng)并且從此通過遠(yuǎn)端224的噴嘴流動(dòng)至所需治療部位上。施用的硫醇化殼聚糖組合物可以填充治療部位(例如，鼻腔或竇腔，或一部分肢體或脊柱中的開口、隱窩、通道或關(guān)節(jié))，在此情況下，所公開的凝膠層可以是非常厚的，并且不暴露于空氣或其他附近的氣體，并且在整個(gè)層上具有不同的厚度。硫醇化殼聚糖組合物還可以作為薄膜或其他共形涂層施用，在此情況下所公開的層可以是相對薄的，并且暴露于空氣或其他附近的氣體，并且在整個(gè)層上具有基本上均一的厚度。在凝膠化之后，保護(hù)性凝膠層可以是粘性的、彈性的或粘彈性的。該保護(hù)凝膠層理想地粘附于治療部位處的粘膜或其他天然組織(例如，軟骨或骨)并且抵抗分離或其他破壞直至凝膠層發(fā)生天然的降解或吸收，例如，在1天至幾天(例如，2、3、或4天)、幾周或幾個(gè)月的體內(nèi)停留時(shí)間后。同時(shí)細(xì)菌再建群(recolonization)或再感染可以顯著地減少或避免，并且可以發(fā)生改善的愈合和纖毛再生(reciliation)。保護(hù)性凝膠層可以提供多種治療優(yōu)勢，包括但不限于抵抗細(xì)菌粘附、抗感染特性、局部免疫調(diào)節(jié)、組織保護(hù)、減少或消除疼痛或出血、減少炎癥、優(yōu)化纖毛再生環(huán)境、減少與重要解剖結(jié)構(gòu)的粘附等等。這些優(yōu)勢可以由多種機(jī)制引起，包括a)殺死細(xì)菌，b)抑制細(xì)菌建群，c)抑制細(xì)菌與組織的粘附，d)減少組織發(fā)病或膿腫形成，e)減少或防止疾病復(fù)發(fā)(例如，特別是減少與細(xì)菌毒素和EPS相關(guān)的慢性炎癥)，f)在愈合期間涂敷和保護(hù)組織，諸如通過保持濕潤的傷口，從而促進(jìn)血小板聚集，或通過閉合干性傷口而不會形成過度粗糙的結(jié)構(gòu)，g)止血，h)優(yōu)化粘膜纖毛再生的環(huán)境，i)加速纖毛的生長或再生和j)將一種或多種治療劑遞送至治療部位。理想地保護(hù)性凝膠層將粘附于一部分粘膜，而使未粘附部分中的纖毛游離以經(jīng)歷自然的有節(jié)律的纖毛運(yùn)動(dòng)(即，纖毛擺動(dòng))，如果需要也將抗菌劑或其他的治療劑遞送至治療部位，并且理想地將阻礙或阻止細(xì)菌粘附于治療部位。示例性硫醇化殼聚糖可以從各種商業(yè)來源獲得，包括ThioMatrixForschungsBeratungsGmbH禾口MucobiomerBiotechnologischeForschungs-undEntwicklungsGmbH,或可以通過殼聚糖與適合的硫醇化反應(yīng)物的反應(yīng)制備，例如，如上述公開的PCT申請WO03/020771A1或上述Roldo等人、Krauland等人、Bernkop-Schnurch和Bernkop-Schnurch等人的論文中描述的。示例性硫醇化反應(yīng)物包括巰基乙酸、半胱氨酸、硫代丁基脒(thiobutylamidine)、谷胱甘肽和硫代乙基脒。硫醇化殼聚糖可以具有各種數(shù)均分子量，例如，約5約2000kDa、約10約500kDa或約10約lOOkDa。硫醇化殼聚糖可以為，例如數(shù)均分子量小于約50kDa的超低分子量材料、數(shù)均分子量為約50約200kDa的低分子量材料、數(shù)均分子量為約200約500kDa的中分子量材料，或數(shù)均分子量在約500kDa以上的高分子量材料。硫醇化殼聚糖典型地含有多個(gè)側(cè)硫羥基團(tuán)，它們經(jīng)由包括一個(gè)或多個(gè)羰基或胺位點(diǎn)(site)的短鏈結(jié)構(gòu)連接到殼聚糖環(huán)上的胺基，并且該硫醇化殼聚糖可以具有例如，約50約1000，或約400約1000的硫醇化度(以μmolSH/g表示)。該硫醇化殼聚糖期望地以干燥顆粒形式獲得，例如，以自由流動(dòng)細(xì)粒形式，其平均粒徑小于約1mm、小于約100μm、約1約80μm,或小于1μm。硫醇化殼聚糖優(yōu)選以此種干燥顆粒形式包裝和運(yùn)送給用戶，以便減少硫醇化殼聚糖在持續(xù)很久的儲存期間的降解。例如，在即將使用之前，可以通過將硫醇化殼聚糖溶解在水或另外合適的溶劑中形成該硫醇化殼聚糖溶液。推薦的硫醇化殼聚糖的量取決于硫醇化殼聚糖分子量，并且可以為，例如所得溶液的約1約20%、約1約10%或約1約5%。2008年4月M日提交的共同未決的美國專利臨時(shí)申請No.61/047，598描述了使硫醇化殼聚糖再水合的優(yōu)選技術(shù)，通過將自由流動(dòng)的硫醇化殼聚糖顆粒分散在生物相容的水混溶性極性分散劑中，并使分散體與該顆粒的充足的水性溶劑結(jié)合從而將它們轉(zhuǎn)化成粘合性水凝膠。硫醇化殼聚糖可以是粉碎的但期望是非粉碎的。同時(shí)，通常保持氧化劑或外來交聯(lián)劑(其各自也可以為溶液形式)與硫醇化殼聚糖分開直至即將使用之前。可使用的示例性氧化劑包括http://WWW.organic-chemistry,org/chemicals/oxidations中列出的那些,例如過氧化氫、辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)、蘑菇酪氨酸酶(mushroomtyrosinase)、氧氣、高碘酸鹽，及其混合物?？墒褂玫氖纠酝獠拷宦?lián)劑包括低分子量醛，例如京尼平(genipin)和戊二醛，以及聚合醛，例如氧化的多糖。如果需要，可以使用含有氧化劑和外來交聯(lián)劑的混合物。期望采用充足的氧化劑或外來交聯(lián)劑，以便在混合之后保護(hù)性凝膠層將在少于30分鐘內(nèi)形成，更優(yōu)選在少于20分鐘、少于10分鐘、少于5分鐘的時(shí)間內(nèi)或者混合之后基本立即形成。例如，當(dāng)使用諸如過氧化氫的氧化劑時(shí)，以含有硫醇化殼聚糖的最終混合物重量為基準(zhǔn)，推薦量包括約0.01約或約0.1約1%。當(dāng)使用諸如京尼平的外來交聯(lián)劑時(shí)，推薦量包括該混合物的約0.1約10%或約0.25約1%。過多量的氧化劑或外來交聯(lián)劑可以不期望地降低混合物的粘度，或者使敏感組織發(fā)炎或以其它方式刺激敏感組織。所公開的硫醇化殼聚糖組合物期望基本不含膠原。優(yōu)選地，硫醇化殼聚糖組合物充分不含膠原(例如，根本不含膠原)，以便適于全世界范圍內(nèi)銷售，并不限于人類使用。所公開的硫醇化殼聚糖組合物可以任選地包括多種其它成分。在使這些其它成分混合在兩部分組合物中的第一部分、第二部分或兩部分中之前，可以對它們進(jìn)行處理。示例性其它成分包括水和其它溶劑(例如，醇)、酸、堿、緩沖劑、抗菌劑、治療劑和其它助劑。酸、堿或緩沖劑可以例如將組合物維持在適于接觸人組織的pH，例如大于5的pH、接近中性的PH或小于8.5的pH。示例性緩沖劑包括巴比妥鈉、甘氨酰胺、甘氨酸、氯化鉀、磷酸鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉和它們的共軛酸。所公開的硫醇化殼聚糖組合物期望地是內(nèi)在抗菌的，而不需要添加單獨(dú)的抗菌劑。但如果需要，可以采用單獨(dú)的抗菌劑。例如，在上述美國專利申請公開No.US2007/0264310A1中可以找到此種抗菌劑的有用列表。可用在所公開的硫醇化殼聚糖組合物中的示例性治療劑包括適用于預(yù)期治療部位的任何材料，包括鎮(zhèn)痛劑、抗膽堿能藥物、抗真菌劑、抗組胺劑、留族或非留族抗炎劑、抗寄生蟲藥(anti-parasiticagent)、抗病毒劑、生物穩(wěn)定型(biostatic)組合物、化學(xué)治療劑/抗腫瘤劑、細(xì)胞因子、解充血藥、止血?jiǎng)?例如，凝血酶)、免疫抑制劑、粘液溶解劑(mucolytics)、核酸、肽、蛋白質(zhì)、類固醇、血管收縮劑、維生素、其混合物，以及所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它治療材料。例如，在上述美國專利申請公開No.US2007/(^64310Α1中可以找到此種治療劑的有用列表。可包括在所公開的硫醇化殼聚糖組合物中的其它助劑包括染料、色素或其它著色劑(例如，F(xiàn)D&CRedNo.3、FD&CRedNo.20、FD&CYellowNo.6、FD&CBlueNo.2、D&CGreenNo.5、D&COrangeNo.4、D&CRedNo.8、焦糖、二氧化鈦、水果或蔬菜著色劑如甜菜粉末或胡蘿卜素、姜黃、辣椒粉和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以得知的其它材料)；指示劑；調(diào)味劑或甜味劑，其中包括但不局限于茴香油、櫻桃、肉桂油、柑橘油(例如，檸檬油、萊檬油或橙油)、可可(cocoa)、桉樹、草藥芳香烴(例如，丁香油、鼠尾草油或桂皮油)、乳糖、麥芽糖、薄荷醇、薄荷油、糖精、環(huán)己氨磺酸鈉、留蘭香油、山梨糖醇、蔗糖、香草醛、冬青油、木糖醇及其混合物；抗氧化劑；防泡劑；和流變改性劑，其中包括增稠劑和觸變膠(thixotrope)。所公開的硫醇化殼聚糖組合物期望不含有可能潛在損害粘膜組織或結(jié)構(gòu)，例如鼻腔或竇腔中的組織的成分。在期望從組織中除去水的那些情況下，例如從息肉或水腫組織中除去流體，在所公開的硫醇化殼聚糖組合物中可以采用高滲劑(hyperosmolaragent)。示例性高滲劑包括呋塞米(furosemide)、氯化鈉凝膠和從組織中吸取水的其它鹽制劑或者直接或間接改變粘膜層滲透含量(osmolarcontent)的物質(zhì)。如果治療劑的持續(xù)釋放或延遲釋放是期望的，則也可以包括脫模劑改性劑。典型地，所公開的組合物在運(yùn)送給最終用戶之前將被滅菌并放置在合適的密封包裝(例如，多組件注射器、小瓶或多個(gè)小瓶，或由合適材料制成的多室袋(multi-chamberpouch))中。另外的性能定制可通過使用諸如、輻射或電子束(E-束)處理的滅菌程序進(jìn)行，從而控制斷鏈。可以采用冷電離輻射滅菌(例如，冷E-束滅菌)，從而限制斷鏈程度，如與本發(fā)明同日提交的共同未決的PCT申請?zhí)?代理人案號P0035142.00和151-P-35142W001)中描述的。不論是否滅菌，含有硫醇化殼聚糖的第一部分通常與含有氧化劑或外來交聯(lián)劑的第二部分保持分開直至即將使用之前。所公開的硫醇化殼聚糖組合物可以期望地用作破壞細(xì)菌生物膜和阻礙其恢復(fù)的多步治療方案中的一部分。例如，可以進(jìn)行一系列步驟，這些步驟大體可分為清洗/破壞、殺死、通氣、保護(hù)/包被，和愈合。清洗/破壞步驟可以通過結(jié)合圖1和圖2施用如上討論的溶劑化體系進(jìn)行。殺死步驟可以通過將合適的抗菌劑施加到治療部位進(jìn)行。這可以，例如通過在溶劑化體系中包括抗菌劑作為單獨(dú)施加的組合物，或在該溶劑化體系和單獨(dú)施加的組合物中都包括抗菌劑完成?？咕鷦┮部梢栽谛g(shù)后施加或施用。通氣步驟可以通過打開堵塞或部分堵塞的通路，例如，鼻應(yīng)用中的鼻竇或竇口而提供通往治療組織的空氣通道或改善通往治療組織的空氣通道進(jìn)行。這可以，例如通過手術(shù)除去阻塞組織結(jié)構(gòu)或可通過手動(dòng)移動(dòng)(displace)此種結(jié)構(gòu)來完成。保護(hù)/包被步驟可以通過用所公開的硫醇化殼聚糖組合物包被至少一部分如此治療的組織進(jìn)行。愈合步驟可以通過允許經(jīng)過清洗、保護(hù)和密封的組織表面恢復(fù)到正常狀態(tài)來進(jìn)行，例如，通過一種或多種愈合機(jī)制，如炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、吞噬作用、粘膜重塑、纖毛重生或正常功能的全部或部分修復(fù)。該多步治療方案可以包括或其后接著清除步驟，其中所公開的硫醇化殼聚糖組合物是生物可充分降解的或生物可充分吸收的從而在期望時(shí)間段，例如1天以上、3天以上，或約47天內(nèi)從治療部位消失，并期望地沒有流出大固體塊。所公開的方法可以有利地在不需手術(shù)的情況下完成，例如通過施加和除去可選的溶劑化體系和通過經(jīng)由正常的抽吸/吸出技術(shù)施加所公開的硫醇化殼聚糖組合物或通過簡單地沖洗受影響的組織進(jìn)行。可比系列的步驟可以在中耳或內(nèi)耳的一部分的多步治療方案中進(jìn)行。關(guān)于此方案的進(jìn)一步詳細(xì)信息可在美國專利申請公開號US2007/0264310A1中找到。下非面限制性實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1hkThioMatrixForschungsBeratungsGmbH(Innsbruck,)^hMf^zFif式的硫醇化殼聚糖原料。按照Kast等人，Thiolatedpolymers-thiomersdevelopmentandinvitroevaluationofchitosan-thioglycolicacidconjugates,Biomaterials,22,2345-2352(2001)中描述的制備巰基乙酸修飾的(TGA-修飾的)殼聚糖原料。硫代丁基脒-修飾的(TBA-修飾的)原料按照上述Roldo等人論文中描述的方法制備。殼聚糖原料的特性在下表1中示出。表1硫醇化殼聚糖原料原料1硫醇化類型硫醇化度(μmolSH/g)~ULCS-TGA低琉基乙酸59HCS-TGA低琉基乙酸57ULCS-TBA低硫代丁基脒72HCS-TBA低硫代丁基脒54ULCS-TGA高琉基乙酸3θHCS-TGA高琉基乙酸265ULCS-TBA高硫代丁基脒425HCS-TBA高硫代丁基脒2261ULCS=超低分子量殼聚糖；HCS=高分子量殼聚糖硫醇化殼聚糖的原位膠凝。將150mgULCS-TBAHigh溶解在4mL去離子水中。利用0.5MNaOH將溶液pH調(diào)節(jié)到6.0并將其稀釋到9mL，接著加入ImL1%(m/m)過氧化氫溶液。所得制劑含有1.5%硫醇化殼聚糖并在少于30分鐘的時(shí)間內(nèi)形成凝膠，如采用流變測量法測定的(G'彡G"，見圖3中G'的曲線A和G"的曲線B)。含有50mgULCS_TBAHigh(5%)和過氧化氫的制劑在5分鐘內(nèi)膠凝化(見圖3中G'的曲線CjPG"的曲線D)，而含有500mgULCS-TBAHigh(5%)但不含過氧化氫的制劑需要60分鐘膠凝(見圖3中G'的曲線EjPG"的曲線F)。含有500mgULCS-TBAHigh(5%)和過氧化氫的制劑表現(xiàn)出非常有利的(favorable)流變性質(zhì)，包括開始混合時(shí)的低起始G'值(小于0.IPa)和約10分鐘內(nèi)的大得多的G"值(大于8，OOOPa)。在醛交聯(lián)劑京尼平的存在下，利用含有1.5%HCS-TBALow或1.5%HCS-TBAHigh的制劑進(jìn)行另外的膠凝化實(shí)驗(yàn)。在每種情況下，凝膠均在5-10分鐘內(nèi)形成，其中G'值為約100-200Pao實(shí)施例2噴霧性硫醇化殼聚糖溶液的粘度。在25°C下，在去離子水中測定分別利用高和低分子量殼聚糖鹽制備的兩種未硫醇化的殼聚糖溶液(圖4中的曲線A和B)，和分別利用2.5%HCS-TGALow和10%ULCS-TGALow制備的兩種硫醇化殼聚糖溶液(圖4中的數(shù)據(jù)點(diǎn)C和D)的粘度。HCS-TGALow溶液的粘度相對高，約為650cP，而ULCS-TGALow溶液的粘度非常低，約為10cP。從這些結(jié)果和利用其它殼聚糖溶液進(jìn)行的噴霧實(shí)驗(yàn)來看，似乎ULCS-TGALow溶液在10%的濃度下是可噴射的并且在10%以上可能很好。實(shí)施例3抗菌特性硫醇化殼聚糖凝膠的抗菌特性。測定了利用1.5和5%ULCS-TBAHigh制劑和0.1%過氧化氫制得的凝膠對金黃色葡萄球菌(S.Areus)的抗菌活性。在無菌條件下，將該硫醇化殼聚糖凝膠制劑一式兩份直接放到M孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板中。每孔用lmL(500，000菌落形成單位)金黃色葡萄球菌的細(xì)菌懸浮液(ATCC25923)溫育。陽性對照用ImL胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)溫育。在37°C下溫育6小時(shí)之后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新管中，并進(jìn)行連續(xù)的十倍稀釋。采用稀釋跟蹤方法(JettB.D等人，Biotechniques,23,648-650(1997))，將適當(dāng)稀釋液的10μ1等份試樣一式三份置于胰胨豆胨瓊脂板中。在37°C下溫育該板M小時(shí)并計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU)。如圖5中所示，與胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)對照(條A)相比，5%凝膠(條B)顯示細(xì)菌被完全殺死(大于6個(gè)log的減少)。利用1.5%凝膠獲得類似結(jié)果(6個(gè)log的減少)。實(shí)施例4降解硫醇化CS凝膠的降解。在溶菌酶(lmg/mL)的存在下，通過將利用1.5%(見圖6中的曲線A)和5%(見圖6中的曲線B)ULCS-TBAHigh和0.1%過氧化氫制得的凝膠放置在pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，測試它的降解特性。在多達(dá)觀天的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定重量損失。如圖6中所示，觀察到顯著的重量損失。觀天之后，該樣品沒有完全降解。實(shí)施例1-4中的結(jié)果表明硫醇化殼聚糖可以用來制備可注射或可噴射的制劑，其可以快速地原位膠凝從而形成內(nèi)在抗菌的保護(hù)層。雖然本文為了說明優(yōu)選實(shí)施例而對具體實(shí)施例進(jìn)行了說明和描述，但是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，為實(shí)現(xiàn)相同目的而設(shè)計(jì)的各種供替換或等價(jià)的實(shí)施方式都可以代替所示和所述的具體實(shí)施例而不背離本發(fā)明的范圍。本申請意在涵蓋本文所討論的優(yōu)選實(shí)施例的所有改變或變體。因此，明顯地，本發(fā)明僅由權(quán)利要求及其等價(jià)形式所限定。權(quán)利要求1.在手術(shù)期間或手術(shù)之后立即治療耳、鼻或喉中粘膜組織的方法，所述方法包括a)在手術(shù)期間或手術(shù)后立即將含有硫醇化殼聚糖和氧化劑或外來交聯(lián)劑的混合物的流體層施加到所述耳、鼻或喉中粘膜組織，和b)允許所述混合物在原位形成保護(hù)性凝膠層作為組織密封劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括將所述流體層施加到鼻腔。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括將所述流體層施加到竇腔。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括將所述流體層施加到中耳或內(nèi)耳。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括通過噴霧、灌洗、霧化、擦拭、芯吸或滴注施加所述流體層。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流體層含有過氧化氫。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流體層含有京尼平。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中膠凝化在少于30分鐘內(nèi)發(fā)生。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中膠凝化在少于10分鐘內(nèi)發(fā)生。10.一種用于保護(hù)耳、鼻或喉中粘膜組織的二部分組合物，第一部分包含硫醇化殼聚糖，第二部分包含充足的氧化劑或外來交聯(lián)劑以便當(dāng)兩部分混合并包被到所述粘膜組織上時(shí)，混合物在少于30分鐘內(nèi)形成保護(hù)性凝膠層。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述第一和第二部分各自包裝在多筒式注射器的筒中。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述第一部分是自由流動(dòng)的干燥粉末。13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述第一和第二部分各自為水溶液。14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述第二部分含有過氧化氫。15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述第二部分含有京尼平。16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中當(dāng)所述二部分混合時(shí)，凝膠層將在少于10分鐘內(nèi)形成。17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中當(dāng)所述二部分混合時(shí)，凝膠層將在少于5分鐘內(nèi)形成。18.—種在耳、鼻或喉中的粘膜組織頂上的流體層，所述層包含硫醇化殼聚糖和充足的氧化劑或外來交聯(lián)劑以便保護(hù)性凝膠層將在少于30分鐘內(nèi)原位形成。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的流體層，其含有過氧化氫。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的流體層，其含有京尼平。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的流體層，含有約1約20wt.%的硫醇化殼聚糖和約0.01約Iwt.%的氧化劑。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的流體層，含有約1約20wt.%的硫醇化殼聚糖和約0.1約IOwt.%的外來交聯(lián)劑。全文摘要身體組織和結(jié)構(gòu)可以用由兩部分組合物制成的凝膠層包被，其第一部分含有硫醇化殼聚糖，其第二部分含有充足的氧化劑或外部交聯(lián)劑以便當(dāng)該兩部分混合并包被到該組織或結(jié)構(gòu)上時(shí)，該混合物將在少于30分鐘的時(shí)間內(nèi)形成保護(hù)性凝膠層。文檔編號A61K47/02GK102159220SQ200980118448公開日2011年8月17日申請日期2009年4月23日優(yōu)先權(quán)日2008年4月24日發(fā)明者E·J·緹吉斯瑪,M·N·岡薩雷斯,N·沙夫豪森申請人:麥德托尼克公司