專利名稱：抗細菌組合物的制作方法
抗細菌組合物1.發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防病原細菌感染的抗細菌組合物和方法。更具體來說，本發(fā) 明涉及用于治療或預(yù)防細菌感染和與其相關(guān)的疾病的抗細菌藥物組合物。本發(fā)明的其它方 面、目的和優(yōu)勢從下面的描述來看是顯而易見的。
2.發(fā)明背景
腸上皮圍圈住腸腔中的細菌，從而允許宿主收獲其自身無法合成的原核生物代謝 產(chǎn)物，同時保護宿主免遭感染。由于上皮細胞經(jīng)常暴露于胃腸道的微生物群，其也是很多病 原體的主要進入點。為了防止宿主感染，上皮細胞表達各種模式識別受體(PRR)如Nod2來 提供抵御入侵的第一道防線。PRR是先天免疫系統(tǒng)的基本組分。它們識別存在于細菌、卵菌、 線蟲、真菌、病毒和昆蟲中的保守基序，并在宿主中觸發(fā)對入侵微生物直接的可測且靶向的 反應(yīng)(Ting JPY 和 Davis BK, 2005)
包括Nod、Nalp和植物R蛋白家族在內(nèi)的許多PRR的一個共有元件是富亮氨酸重 復(fù)序列(LRR)結(jié)構(gòu)域。該保守富亮氨酸重復(fù)序列為LRR結(jié)構(gòu)域的馬蹄鐵圖樣形狀提供了結(jié) 構(gòu)支架，而PRR側(cè)翼區(qū)是變化多樣的多肽片段，賦予對共同微生物基序的識別(Matsushima N.等人，2005)。LRR結(jié)構(gòu)域存在于從植物到人類的PRR中，并且對宿主抗病原體的抗性是 必不可少的。某些含LRR蛋白的缺失或自發(fā)突變造成宿主對感染的易感性(Dangl幾和 Jones JDG, 2001) 0無顎魚類利用LRR結(jié)構(gòu)域作為支架基于不同LRR肽序列的重組，發(fā)育新 的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)(Pancer Z等人，2004，Alder MN等人，2005，Nagawa F等人，2007)。
在人類中，基因研究已在很多LRR中鑒定了與各種疾病(包括傳染性或炎癥性起 源的那些疾病)易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP) (Matsushima N.等人，2005)。Nod2可 能是獲得最廣泛研究的與疾病相關(guān)的含LRR蛋白。其賦予克羅恩病易感性，并且在許多獨 立的研究中已經(jīng)證實其與該疾病的聯(lián)系(Hugot JP等人，2001，Ogura Y等人，2001，Hampe J 等人，2007，Libioulle C 等人，2007，Raelson JV 等人，2007，The Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007)。Nod2的LRR結(jié)構(gòu)域中的突變賦予克羅恩病易感性，而Nod2的 相鄰NACHT結(jié)構(gòu)域中的特定突變是Blau綜合征(一種少見的常染色體顯性紊亂，其特點是 早發(fā)肉芽腫性關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎和皮疹伴先天性指屈曲)的遺傳原因(Miceli-Richard C 等人，2001)。這表明Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域的特定分子功能造成對腸病的易感性。
大多數(shù)圍繞Nod2的研究集中于其響應(yīng)于推定配體對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活。與克 羅恩病最通常相關(guān)的三個Nod2 SNP在其對MDP (細菌蛋白聚糖衣外被的組分)的響應(yīng)上均 存在缺陷，表現(xiàn)出缺少NFkB易位和細胞因子的產(chǎn)生(Barnich N等人，2005)。相反地，克羅 恩病的特征在于升高的NFkB-依賴性細胞因子產(chǎn)生。關(guān)于克羅恩病相關(guān)Nod2 SNP是功能 突變的獲得還是失去的辯論正在進行(Watanabe T等人，2004，Kobayashi KS等人，2005， Maeda S，2005)。
在利用Nod2敲除小鼠株的研究中也已經(jīng)突顯Nod2在保護宿主免遭細菌感染中 的作用(Kobayashi KS等人，2005)。Nod2敲除對由單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)引起的口腔(但不是全身性)感染更敏感。這是個重要的發(fā)現(xiàn)，因為已報道克羅恩病患者顯示出其胞內(nèi)細菌及上皮相關(guān)細菌的實質(zhì)性增加(Swidsinski A等人， 2002, Darfeuille-Michaud A，2002，Liu Y 等人，1995)。一些報告已經(jīng)提示 Nod2 在預(yù)防 細胞的細菌感染中的作用(Hisamatsu T等人，2003)。這些研究表明克羅恩病相關(guān)Nod2 3020insC蛋白在作為防御因子對抗胞內(nèi)細菌方面的缺陷。同一組的隨訪研究表明抗沙門 氏菌(Salmonella)感染的Nod2_依賴性保護作用依賴于線粒體蛋白griml9 (Barnich N等 人，2005)。Nod家族的其它成員(Nodl)也已經(jīng)顯示抗胞內(nèi)細菌的保護功能(Zilbauer M等 人，2007，Travassos LH 等人，2005)。與 Nod2 不同，Nodl 與 griml9 沒有關(guān)系(Barnich N 等人，2005)，表明Nod蛋白阻止細胞感染的機理仍有待于確定。
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3.發(fā)明概述
本發(fā)明至少部分基于含有富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)基序的蛋白具有直接抗細菌 活性的發(fā)現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個方面，提供了包含(或基本上組成是，或組成是)式⑴的LRR的 分離蛋白質(zhì)
(FlLxxLxLxxZF2)(I)
其中
Fl和F2獨立地是1至30個殘基的連續(xù)氨基酸序列；
χ可以是任何氨基酸、
L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ；
Z 可以是 NxL 或 CxxL ；
N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ；
C 是 078或^51·。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含(或基本上組成是，或組成是)兩個或兩個以上 (例如2至50個)串聯(lián)的式(I)LRR的分離蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含(或基本上組成是，或組成是)兩個或兩個以上 (例如2至50個)衍生自天然含LRR蛋白的式(I)LRR(例如串聯(lián))的分離蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含(或基本上組成是，或組成是)核苷酸結(jié)合位點 (NBS) -LRR、例如 NOD-LRR (例如 N0D2-LRR 或 N0D1-LRR，特別是人 N0D2-LRR 或人 N0D1-LRR) 的分離蛋白質(zhì)。在其它方面，提供了包含(或基本上組成是，或組成是)CIITA-LRR、Toll受 體-LRR(例如TLR2，4，5，7，8，9-LRR結(jié)構(gòu)域)、NAIP-LRR的分離蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個方面，提供了包含(或基本上組成是，或組成是)核苷酸結(jié)合寡聚 化結(jié)構(gòu)域(NOD)、氨基端效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域和羧基端富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)結(jié)構(gòu)域的分離蛋 白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了組合物(特別是具有抗細菌活性的藥物組合物)，其 包含(例如作為其唯一活性成分)分離的蛋白質(zhì)，所述分離蛋白質(zhì)包含(或基本上組成是， 或組成是)NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端死亡折疊結(jié)構(gòu)域(例如CARD、Pyrin、死亡結(jié)構(gòu)域或死亡效應(yīng) 子結(jié)構(gòu)域)和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含(或基本上組成是，或組成是)NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域的分離蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了組合物，其包含(例如作為其唯一活性成分)分離的 蛋白質(zhì)，所述分離蛋白質(zhì)包含NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端CARD結(jié)構(gòu)域和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域，或基本 上由NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端CARD結(jié)構(gòu)域和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域組成。
在本發(fā)明的又一個方面，提供了組合物，特別是藥物組合物，其包含(例如作為其 唯一活性成分)分離的NOD蛋白、特別是NOD1和/或N0D2、更特別是人NOD1和/或人N0D2。
在本發(fā)明的又一個方面，提供了組合物，特別是藥物組合物(例如殺細菌藥物組 合物)，其包含(例如作為其唯一活性成分)分離的TLR蛋白、特別是哺乳動物TLR蛋白、更 特別是人TLR蛋白例如人TLR2和/或人TLR4和/或人TLR5。
在另一方面，提供了抗細菌(例如殺細菌)組合物(特別是藥物組合物)，其包含 (例如作為其唯一活性成分)分離的N0D2蛋白(特別是人N0D2)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含分離蛋白質(zhì)和可藥用載體的藥物組合物，所述 分離蛋白質(zhì)包含(或基本上組成是，或組成是)NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端死亡折疊結(jié)構(gòu)域(例如 CARD結(jié)構(gòu)域)和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的另一方面，提供了藥物組合物(特別是殺細菌藥物組合物)，其包含 (例如作為其唯一活性成分)分離的NOD蛋白(例如人NODl或人N0D2)、特別是分離的人 N0D2和可藥用載體。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療或預(yù)防病原體感染(特別是細菌感染)的方法， 所述方法包括提供包含分離蛋白質(zhì)的組合物，所述分離蛋白質(zhì)包含(或基本上組成是，或 組成是)NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端死亡折疊結(jié)構(gòu)域(例如CARD結(jié)構(gòu)域)和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療或預(yù)防病原體感染(特別是細菌感染)的方法， 所述方法包括提供包含分離蛋白質(zhì)的組合物，所述分離蛋白質(zhì)包含(或基本上組成是，或 組成是)NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端死亡折疊結(jié)構(gòu)域(例如CARD結(jié)構(gòu)域)和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療或預(yù)防病原體感染(例如細菌感染)的方法，所 述方法包括提供包含分離的NOD蛋白、例如分離的人NODl和/或人N0D2的組合物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療或預(yù)防人類患者的病原體感染、特別是細菌感 染的方法，所述方法包括向所述患者施用(藥物組合物，其包括)治療有效量的分離NOD蛋 白、特別是分離人NODl和/或人N0D2。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端死亡折疊結(jié)構(gòu)域(例如 CARD)和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域的分離蛋白質(zhì)在醫(yī)藥、特別是人類醫(yī)藥中的用途。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端死亡折疊結(jié)構(gòu)域(例如 CARD)和羧基端LRR的分離蛋白質(zhì)(例如分離人N0D2)在制備用于治療或預(yù)防病原體感染、 特別是細菌感染、更特別是革蘭氏陽性菌感染的藥物中的用途。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含NOD結(jié)構(gòu)域、氨基端死亡折疊結(jié)構(gòu)域(例如 CARD)和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域的分離蛋白質(zhì)在制備用于治療克羅恩病、炎性腸病、敗血病的藥 物中的用途。
在本發(fā)明的另一方面，提供了分離NOD蛋白(例如人NODl或人N0D2)在制備用于 治療克羅恩病、炎性腸病的藥物中的用途。
在本發(fā)明的另一方面，提供了包含蛋白和可藥用載體的殺細菌藥物組合物，所述蛋白包含(或基本上組成是，或組成是)LRR結(jié)構(gòu)域(例如作為其唯一活性成分)。在一 個實施方案中，LRR結(jié)構(gòu)域是人N0D-LRR，例如人NODl-LRR或人N0D2-LRR。在其它實施方 案中，LRR 結(jié)構(gòu)域是 TLR-LRR 結(jié)構(gòu)域例如人 TLR-LRR，例如 TLR2-LRR、TLR4-LRR、TLR5-LRR、 TLR7-LRR、TLR8-LRR、TLR9-LRR。
本發(fā)明還包括該蛋白和/或本發(fā)明的蛋白殺細菌、特別是革蘭氏陽性菌的用途。
在另一個實施方案中，提供了用于治療和/或預(yù)防非人哺乳動物的病原細菌感染 的分離的非人哺乳動物LRR蛋白(例如NOD或TLR蛋白)，其中該LRR蛋白源自該非人哺乳 動物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定殺細菌蛋白的方法，所述方法包括將細菌、特別 是哺乳動物例如人的病理性細菌，與分離的LRR蛋白相接觸，如果該蛋白表現(xiàn)出殺細菌活 性則鑒定所述蛋白。在一些實施方案中，細菌是需氧的；在其它實施方案中，是厭氧的；在 另外的其它實施方案中，細菌是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌。
4.附圖簡述


圖1 結(jié)腸上皮中Nod2表達的免疫組織化學(xué)測定。圖A 大鼠和人結(jié)腸的福爾馬林 固定的石蠟包埋塊用親和純化的兔抗_Nod2抗體(AB5 ；左)或作為陰性對照的兔IgG (右) 探測。紫色顯示DAPI染色。圖B:將大鼠結(jié)腸直接提取至SDS-PAGE樣品緩沖液中，并使用 AB5通過蛋白質(zhì)印跡來分析。鑒定到與Nod2相關(guān)的約IOOkDa的單個蛋白。
圖2:在用大腸桿菌孵育SW480腸上皮細胞之后進行Nod2的免疫定位。以 10000 1的Μ0Ι，將SW480細胞與或不與大腸桿菌孵育4小時。固定細胞，并用抗-Nod2(綠 色)、鬼筆環(huán)肽(紅色)和DAPI (紫色)染色。與大腸桿菌孵育之后，Nod2從細胞溶膠轉(zhuǎn)移 至細胞質(zhì)中的點狀結(jié)構(gòu)。
圖3 在腸上皮細胞中大腸桿菌和Nod2的免疫定位。以10000 1的Μ0Ι，用大 腸桿菌將Caco2腸上皮細胞的匯合單層孵育2小時。固定細胞，并使用共聚焦顯微鏡使用 抗-Nod2 (AB5)和抗-LPS抗體通過免疫熒光來分析。
圖4 用重組Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域孵育之后大腸桿菌的體外聚集。用20 μ g/ml BSA或 純化的重組Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域?qū)ml PBS中的大腸桿菌(106)孵育12小時。將培養(yǎng)物的等 份試樣接種在帶蓋玻片的載玻片上，并使用63X物鏡通過光學(xué)顯微鏡分析。
圖5 表達Nod2的293細胞的肺炎鏈球菌感染。自相同染色體基因座穩(wěn)定表達氯 霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(對照)、Nod2或克羅恩病相關(guān)Nod2突變體(Nod2-3020inSC)的293細胞 用肺炎鏈球菌(ATCC 49619)感染，10 1的Μ0Ι。將經(jīng)慶大霉素保護的細菌鋪在巧克力瓊 脂上，觀察每個細胞系的胞內(nèi)細菌數(shù)目。
圖6 加入金黃色葡萄球菌之前，用200 μ g/ml所示細菌組分預(yù)孵育純化的Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域(Nod2 :30 μ g/ml)。加入BSA作為蛋白對照。使用商品化蛋白聚糖提取物(sPGN 可溶性蛋白聚糖，iPGN 不溶性蛋白聚糖)、脂磷壁酸(LTA 脂磷壁酸粗提取物，upLTA 超純 脂磷壁酸提取物)或加熱滅活的金黃色葡萄球菌(HKSA)。對照指示僅BSA存在時細菌的生長。
圖7 :Nod2 LRR抗細菌靶(大腸桿菌)的純化。將大腸桿菌(ATCC)在LB肉湯中 生長過夜，沉淀，并通過弗氏細胞壓碎器(French press)提取細菌沉淀。進行競爭試驗，監(jiān) 控相對于金黃色葡萄球菌(ATCC 29233)的Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域活性。在每個步驟，將級分的7體積補至等體積，將樣品加至抗細菌分析試驗。最終在去污劑(NP40)不溶性級分中發(fā)現(xiàn)抑 制性級分。用鹽酸胍提取該級分，通過凝膠過濾分離，收集級分，評價Nod2 LRR活性對金黃 色葡萄球菌的抑制。級分5(冊)含有抑制LRR活性(通過對蛋白酶K的敏感性確定)的蛋白。
圖8 :Nod2抗細菌靶的LRR親和純化以及質(zhì)譜法鑒定。圖A 圖7中用鹽酸胍提取 的去污劑不溶性大腸桿菌級分進行凝膠過濾而得的級分5，加樣到Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域親和柱 上。通過NaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白。圖B:考馬斯亮藍染色的凝膠，顯示在Nod2 LRR結(jié)構(gòu) 域親和純化之前的級分5 (F5)以及來自親和柱的鹽洗脫級分(E)。圖C:在圖B所示的提取 條帶中的質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定。
圖9 來自大腸桿菌的野生型和3020insC LRR結(jié)構(gòu)域親和純化的去污劑不溶性蛋 白的分離。通過弗氏細胞壓碎器分級分離大腸桿菌，離心，用鹽酸胍提取沉淀。將溶解的沉 淀分成兩份，每個級分分別在Nod2LRR(WT)或Nod2 3020insC LRR(3020)親和柱上分離。 用鹽洗脫結(jié)合在兩柱上的蛋白，用冰冷丙酮或TCA/丙酮沉淀，并通過SDS PAGE凝膠電泳分 離。選擇、切割并處理凝膠的各區(qū)域，以用于蛋白的質(zhì)譜鑒定(如表4、表5所示)。
圖10 :TLR2和Nalp3 LRR結(jié)構(gòu)域抑制單核細胞增生性李斯特菌生存力(由ATP-偶 聯(lián)的發(fā)光分析試驗顯示)。用漸增濃度的所示重組LRR結(jié)構(gòu)域在37°C孵育單核細胞增生性 李斯特菌(5X105個細菌/100μ 1)6小時，并通過發(fā)光分析(BacTiter-Glo =Promega)評價 ATP水平。所示的值是相對于在缺少LRR結(jié)構(gòu)域下進行孵育的對照(100%)的值。結(jié)果代 表TLR2和Nalp3的兩個實驗。
圖11:純化的Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域的殺細菌作用在攜帶克羅恩病相關(guān)Nod2 3020insC 突變的蛋白中是缺陷的。所示結(jié)果代表若干實驗。圖A和B:Nod2 LRR結(jié)構(gòu)域影響大腸桿 菌(圖A)和枯草芽孢桿菌(圖B)的膜極性。以所示的濃度將蛋白加入5X IO5個細菌的 100 μ L生長培養(yǎng)基中，并在37°C孵育2小時。在該過程結(jié)束前15分鐘，將50 μ 1 10 μ g/ ml DiBAC4溶液加至每個孔中。用750 μ 1冰冷PBS/孔將板洗滌兩次。通過流式細胞術(shù)測 定吸取染料的去極化細菌的百分比。圖C 來自一系列模式識別受體的LRR結(jié)構(gòu)域影響枯草 芽孢桿菌膜極性。如針對圖A和B所描述的，用所示LRR結(jié)構(gòu)域處理細菌，定量其對該細菌 的膜極性的影響。圖D 通過瓊脂擴散分析試驗證實，Nodl和Nod2而不是Nod2 3020insC LRR結(jié)構(gòu)域顯示抗細菌活性。瓊脂板接種所示細菌的菌苔。用無菌玻璃吸管在瓊脂中穿出 約0.5cm直徑孔，將所示蛋白(BSA蛋白對照或所示LRR結(jié)構(gòu)域)或抗生素(氨芐西林或卡 那霉素)以在無菌PBS中的0. 5mg/ml濃度加至各孔。
圖12 :Nod2 SNP (全長)抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生性李 斯特菌和糞腸球菌的生存力(由ATP-偶聯(lián)的發(fā)光分析顯示)。該活性在攜帶克羅恩病相關(guān) Nod2 3020insC和G908R突變的蛋白中是缺陷的。
圖13 于35°C、37°C和39°C在細菌脅迫的條件下測試了 Nod2對金黃色葡萄球菌 生存力(通過ATP-偶聯(lián)的發(fā)光分析試驗顯示)的影響。Nod2的抗細菌活性隨細菌脅迫而 增加。
圖14 漸增濃度的Nod2抑制枯草芽孢桿菌(圖A)和金黃色葡萄球菌(圖B)的 生長。所示的值是相對于在缺少LRR結(jié)構(gòu)域下進行孵育的對照(100%)的值。
圖15 :NAIP抑制嗜麥芽窄食單孢菌(S. maltophilia)的生長(圖A)。Nodl抑制大8腸桿菌生長(圖B)，單核細胞增生性李斯特菌生長被Nodl、Nod2、Nod2 3020insC和CIASl 抑制(圖C)。
圖16 :Nod2抑制金黃色葡萄球菌的生長。這種抑制不受共施用MDP、LPS或PGN的影響。
5.發(fā)明詳述
依據(jù)本發(fā)明，因此提供了用作抗微生物劑的分離蛋白質(zhì)，其包含多個LRR(富亮氨 酸重復(fù)序列)結(jié)構(gòu)域。在例如下文所描述的本發(fā)明的使用中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些蛋白可有效殺 死多種細菌且具有與已知抗生素相當?shù)男ЯΑ?br> 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，有LRR在蛋白的C端。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這可增加該蛋白的 抗微生物活性。
進一步優(yōu)選，每個LRR結(jié)構(gòu)域獨立地包含式(I)的氨基酸序列或者基本上由式(I) 的氨基酸序列組成
(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)
其中
Fl和F2獨立地是1至30個殘基的連續(xù)氨基酸序列；
χ可以是任何氨基酸；
L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ；
Z 可以是 NxL 或 CxxL ；
N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ；
C 是〔78或％1·;且
Y = 0 或 1。
富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)通常是形成α / β馬蹄形褶(horseshoe folds)的蛋白 結(jié)構(gòu)基序。每個LRR通常由重復(fù)的20-30個氨基酸的段組成，所述氨基酸段異乎尋常地富含 亮氨酸殘基，盡管這些殘基可被其它疏水殘基取代。每個重復(fù)單元可具有β鏈-轉(zhuǎn)角 螺旋結(jié)構(gòu)，以致于由多個此LRR組成的組裝區(qū)具有馬蹄形或弧形，具有內(nèi)部平行β折疊和 外部螺旋陣列(helix array)。β折疊的一面和螺旋陣列的一側(cè)暴露于溶劑，因此，典型地 親水殘基占優(yōu)勢。螺旋與折疊之間的區(qū)域通常形成疏水核，通常與亮氨酸殘基緊密地在空 間上壓在一起。在本發(fā)明的備選實施方案中，其它疏水氨基酸殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸或半胱氨酸可取代亮氨酸殘基。
—般而言，在本發(fā)明的蛋白中，所有LRR結(jié)構(gòu)域均形成單個連續(xù)結(jié)構(gòu)，采用弧形或 馬蹄形?；』蝰R蹄的內(nèi)部凹面可主要由平行β-鏈組成，而外部凸面可包括多種二級結(jié)構(gòu)， 例如α-螺旋、31(|-螺旋、聚脯氨酸II螺旋或β-轉(zhuǎn)角的串聯(lián)排列。在本發(fā)明的實施方案 中，凹面上的β-鏈與凸面的主要螺旋的元件通過短環(huán)或β-轉(zhuǎn)角連接。
本發(fā)明的蛋白包含足夠LRR以具有抗微生物活性，并且本發(fā)明的蛋白適宜地包括 3至20個LRR結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的具體實施方案包含至少3個LRR、至少5個LRR或至少7 個LRR。在本發(fā)明的其它實施方案中，該蛋白可包含至少4個、至少6個、至少8個、至少9 個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少 17個、至少18個、至少19或至少20個LRR結(jié)構(gòu)域。
在形成本發(fā)明的實施方案的一類蛋白中，存在高比例的亮氨酸殘基。因此，每個LRR中至少2個L殘基是Leu，或每個LRR中至少3個L殘基是Leu。在某些實施方案中，基 本上所有的L殘基均是Leu。本發(fā)明的蛋白進一步優(yōu)選是水溶性的。
本發(fā)明蛋白的一個具體的亞類包含5個或5個以上的LRR(富亮氨酸重復(fù)序列) 結(jié)構(gòu)域，其用作抗細菌劑，其中該蛋白的C端是LRR結(jié)構(gòu)域，并且每個LRR結(jié)構(gòu)域包含式(I) 的氨基酸序列
(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)
其中
Fl和F2獨立地是1至30個殘基的連續(xù)氨基酸序列；
χ可以是任何氨基酸；
L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ；
Z 可以是 NxL 或 CxxL ；
N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ；
C 是 078或％1·;且
Y = 0 或 1。
在蛋白的該亞類中，每個LRR中至少2個L殘基優(yōu)選為Leu。
本文所用的術(shù)語“分離的”是指本發(fā)明的蛋白和多核苷酸，根據(jù)具體情況而定，存 在于不同于其天然環(huán)境的物理環(huán)境中。例如，分離的蛋白或多核苷酸，相對于其天然存在的 復(fù)雜的細胞環(huán)境，可以是基本上分離的(例如純化的)。然而，應(yīng)注意到，盡管本發(fā)明的蛋白 可以在本文中描述成“分離的”，但是這并不意味著該蛋白必須天然存在。
術(shù)語“源自，，和“源于”指所討論的蛋白或多核苷酸時，不管其物理起源。因此，舉 例來說，“源自天然含LRR蛋白的式(I)LRR(例如串聯(lián)的)”是指具有如下一級氨基酸序列 的LRR，所述一級氨基酸序列與存在于天然含LRR蛋白中的相同但不必純化自該天然來源。
術(shù)語“死亡折疊結(jié)構(gòu)域(death fold domain) ”是指一個結(jié)構(gòu)域家族，其特征在 于六個緊壓在一起的α螺旋，所述α螺旋在程序性細胞死亡(細胞凋亡)中起顯著的作 用。該家族的成員包括胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)、熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)、死亡結(jié)構(gòu)域 (DD)和死亡效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(DED)。對于該家族的更多信息，讀者尤其可以參考Lahm A等人 (2003) ；Cell dead and Differentiation, 10,10-12 以及其中所引用的參考文獻。
術(shù)語“LRR”或“LRR基序”及其語法變異是指式(I)的富亮氨酸重復(fù)序列基序。
術(shù)語“LRR結(jié)構(gòu)域”是指包含(或基本上組成是，或組成是)兩個或兩個以上(多 達約50個)，通常串聯(lián)的，式(I)LRR的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語“NOD蛋白”是指含有中央核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)、氨基端CARD結(jié) 構(gòu)域和羧基端LRR結(jié)構(gòu)域的蛋白。讀者尤其可以參考^iohara N.等人(2005)，Armu. Rev. Biochem 74 :355-383的第361頁的表I，獲得有關(guān)人NOD家族成員的細節(jié)(不必是毫無遺 漏的)。
后綴“-LRR”是指該后綴之前的蛋白質(zhì)的天然LRR結(jié)構(gòu)域，因此，“N0D-LRR”是指 存在于天然NOD家族成員中的LRR結(jié)構(gòu)域。
“LRR蛋白”表示蛋白包含至少一個LRR結(jié)構(gòu)域。
“TLR”是指toll樣受體家族。Toll-樣受體(TLR)是一類單跨膜非催化性受體， 其結(jié)構(gòu)性地識別源自微生物的保守分子。參見Mitchell JA (2007), J Endocrinol 193(3)；323-30，其全部內(nèi)容通過引用并入本文并且尤其可以被讀者參考。
“蛋白”包括多肽。
“人 N0D2” 是指 SEQ ID NO 1 的蛋白。
“人 N0D1” 是指 SEQ ID N0:2 的蛋白。
“人 N0D2-LRR” 是指 SEQ ID NO :3 的蛋白。
“人 NODl-LRR"是指 SEQ ID NO 4 的蛋白。
“人 CIITA-LRR” 是指 SEQ ID NO 5 的蛋白。
“人 TLR2-LRR” 是指 SEQ ID NO 6 的蛋白。
“人 Nalp3-LRR” 是指 SEQ ID NO 7 的蛋白。
“抗細菌藥物組合物”是指在施用至個體之前尤其具有抗細菌活性的藥物組合物。
5.1蛋白質(zhì)
本發(fā)明至少部分基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)含有LRR基序(式(I))的蛋白質(zhì)具有抗細 菌(特別是殺細菌)活性。盡管我們證明了包含LRR結(jié)構(gòu)域和其它結(jié)構(gòu)域(例如NOD家族 蛋白質(zhì)中見到的結(jié)構(gòu)域)的天然蛋白質(zhì)具有顯著的抗細菌活性，但是我們也證明LRR結(jié)構(gòu) 域自身具有抗細菌活性。
在一些實施方案中，該分離蛋白質(zhì)包含2至100個、更特別是2至50個、例如2至 45個串聯(lián)排列的式⑴的LRR基序。
在典型的實施方案中，該LRR基序為15至50個殘基長，例如20至30個殘基長。 因此，在一些實施方案中，該分離蛋白質(zhì)包含2至100個(例如2至50個)串聯(lián)排列的式 (I)的LRR基序，每個基序由15至50個連續(xù)氨基酸殘基(例如20至30個殘基)組成。
在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是人工的，其具有不存在于自然界中的排列。在這些實 施方案中，蛋白質(zhì)可包含中央核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)、羧基端LRR結(jié)構(gòu)域(包含例 如人為數(shù)量的LRR結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選串聯(lián)排列)和氨基端效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。該效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域例如 可以促進殺死(例如通過細胞凋亡)靶細胞，例如病原細菌。該效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的實例是死 亡折疊結(jié)構(gòu)域，例如CARD、熱蛋白質(zhì)、死亡結(jié)構(gòu)域和死亡效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的其它方面，提供了分離的蛋白質(zhì)，其包含源自天然蛋白質(zhì)的LRR結(jié)構(gòu) 域。在本發(fā)明的這個方面的一些實施方案中，該分離蛋白質(zhì)是包含LRR結(jié)構(gòu)域的天然蛋 白質(zhì)(本文有時稱為“LRR蛋白質(zhì)”)。該天然LRR蛋白質(zhì)可以是“RI-樣”、“CC”、“細菌 的”、“SDS22-樣”、“植物特異性”、“典型的”或“TpLRR”，參見 Kajava Α. V. (1998)，J. Mol. Biol. 277，519-527 和 Ohyanagi T 等人(1997)，F(xiàn)ASEB J 11 :A949，這兩篇文獻全部內(nèi)容通 過引用并入本文并且尤其可以被讀者參考。該天然蛋白質(zhì)的實例是動物源性蛋白質(zhì)并且包 括NOD家族的成員，特別是人類(或其它靈長類動物)N0D蛋白質(zhì)(例如人NODl或人N0D2)。 其它成員包括Toll-樣受體(TLI )家族并且包括TLR 2，4，5，7，8和9，特別是其人類和其它 哺乳動物直系同源物。其它進一步的實例包括成員CIITA和NAIP。
在一些實施方案中，分離蛋白質(zhì)選自SEQ ID N0:l、2、3或4。
在本發(fā)明的其它方面，提供了分離的LRR結(jié)構(gòu)域，S卩，由分離的LRR結(jié)構(gòu)域組成的 蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)可以是分離的LRR結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明的其它方面，提供了分離的LRR蛋白質(zhì)，條件是該LRR蛋白質(zhì)不是包含N 端富亮氨酸重復(fù)序列、一個或多個富亮氨酸重復(fù)序列、C端富亮氨酸重復(fù)序列以及包含α螺旋的連接肽的分離多肽。
5. 2多核苷酸
在本發(fā)明的其它方面，提供了編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的分離多核苷酸(例如RNA或 cDNA)。此多核苷酸可用于制備本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)的方法中，例如用于制備包含本發(fā)明的 分離蛋白質(zhì)的藥物(例如藥物組合物)。在其它方面，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸可摻入 載體例如質(zhì)粒、病毒、微型染色體、轉(zhuǎn)座子等中，作為治療性或預(yù)防性免疫原性組合物(例 如疫苗、例如DNA疫苗)的一部分，以增加宿主對病原體例如病原細菌的防御。
因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了分離多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其 編碼包含(或基本上組成是，或組成是)式(I)的LRR的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了分離多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其編碼 包含LRR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在這個方面的一些實施方案中，提供了編碼天然LRR結(jié)構(gòu)域例 如NOD LRR結(jié)構(gòu)域、特別是人NOD LRR結(jié)構(gòu)域例如SEQ ID NO :2或3的蛋白質(zhì)的分離多核苷酸。
在本發(fā)明的另一方面，提供了分離多核苷酸例如DNA(例如cDNA)或RNA，其編碼 LRR蛋白質(zhì)、特別是動物源性天然LRR蛋白質(zhì)例如NOD蛋白質(zhì)、更特別是人類或其它靈長類 動物NOD蛋白質(zhì)。其中的實例包括編碼人NOD 1或人N0D2的分離多核苷酸。其它實例包 括編碼Toll樣受體(TLR)例如TLR2，7，8或9和CIITA或NAIP的分離多核苷酸。
5. 3制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的某些方面涉及制備本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)、特別是第5. 1節(jié)中提 及的那些蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)通?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組細胞 培養(yǎng)技術(shù)來制備。將編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸分離并插入到復(fù)制型載體例如質(zhì)粒，以用 于進一步克隆(擴增)或表達。一種有用的表達系統(tǒng)是谷氨酸合成酶系統(tǒng)(例如Lonza Biologies公司出售的)，特別在宿主細胞是CHO或NSO時(參見下文)。使用常規(guī)操作(例 如寡核苷酸探針)可以方便地對編碼多核苷酸或蛋白質(zhì)的多核苷酸進行分離和測序。可以 使用的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微型染色體，其中質(zhì)粒是典型的實施方案。一 般來說，此類載體還包括信號序列、復(fù)制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和 轉(zhuǎn)錄終止序列，與多核苷酸可操作地連接以便促進表達。
5. 3.1信號序列
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可被制備成帶有異源信號序列的、在成熟蛋白質(zhì)的N末端具有特 異性切割位點的融合蛋白質(zhì)。該信號序列應(yīng)為宿主細胞所識別和加工。對于原核宿主細胞， 該信號序列可以是堿性磷酸酶、青霉素酶或熱穩(wěn)定性腸毒素II的前導(dǎo)序列(leader)。對 于酵母分泌，該信號序列可以是酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，[α]因子前導(dǎo)序列或酸性磷酸酶前 導(dǎo)序列，參見例如W090/13646。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，病毒分泌性前導(dǎo)序列例如單純皰 疹gD信號和天然免疫球蛋白信號序列是可獲得的。通常，該信號序列與編碼本發(fā)明抗體的 DNA在閱讀框內(nèi)連接。
5. 3. 2復(fù)制起點
復(fù)制起點是本領(lǐng)域眾所周知的，其中pBR322適于大多數(shù)革蘭氏陰性菌、2μ質(zhì)粒 適于大多數(shù)酵母、各種病毒起點，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV適于大多數(shù)哺乳動物細胞。通常，哺乳動物表達載體不需要復(fù)制起點組分，但是SV40包含早期啟動子，所以 可以被使用。
5. 3. 3選擇標記
典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，其(a)賦予對抗生素或其它毒素(例如氨芐 西林、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，或(b)彌補營養(yǎng)缺陷或提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒有 的營養(yǎng)素。選擇方案可包括停滯宿主細胞的生長。已用編碼本發(fā)明的治療性抗體的基因成 功地轉(zhuǎn)化的細胞，由于例如選擇標記所賦予的藥物抗性而存活。另一個實例是所謂的DHFR 選擇標記，其中在存在氨甲蝶呤下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。在典型的實施方案中，在存在漸增量的氨甲 蝶呤下培養(yǎng)細胞以擴增感興趣的外源基因的拷貝數(shù)。CHO細胞是對于DHFR選擇特別有用的 細胞系。其它的實例是谷氨酸合成酶表達系統(tǒng)(Lonza Biologies)。適用于酵母的選擇基 因是 trpl 基因，參見 Stinchcomb 等人 Nature 282，38，1979。
5. 3. 4 啟動子
用于表達本發(fā)明蛋白質(zhì)和多核苷酸的適宜啟動子與編碼該抗體的DNA/多核苷酸 可操作地連接。用于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、 堿性磷酸酶、色氨酸和雜合啟動子，例如Tac。適用于在酵母細胞中表達的啟動子包括3-磷 酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，例如烯醇酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧 酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶和葡糖激酶?？烧T導(dǎo)的酵 母啟動子包括醇脫氫酶2、異細胞色素CGsocytochrome C)、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白和負 責氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用的酶。
用于在哺乳動物細胞系統(tǒng)中表達的啟動子包括病毒啟動子，例如多瘤病毒、禽痘 病毒和腺病毒(例如腺病毒幻、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒(特別是立即早 期基因啟動子)、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、肌動蛋白、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子和早期 或晚期猿猴病毒40。當然，啟動子的選擇是基于與用于表達的宿主細胞的合適相容性。因 此，在一個實施方案中，提供了包含RSV和/或SV40和/或CMV啟動子、編碼本發(fā)明的輕鏈 V區(qū)(VL)、KC區(qū)的DNA、以及新霉素與氨芐西林抗性選擇標記的第一質(zhì)粒，以及包含RSV或 SV40啟動子、編碼本發(fā)明的重鏈V區(qū)(VH)的DNA、編碼[γ 1]恒定區(qū)的DNA、DHFR和氨芐西 林抗性標記的第二質(zhì)粒。
5. 3. 5增強子元件
在合適的情況下(例如用于在高等真核生物中表達時)，可以使用在載體中與啟 動子元件可操作地連接的增強子元件。合適的哺乳動物增強子序列包括來自珠蛋白、彈性 蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素的增強子元件?；蛘撸墒褂脕碜哉婧思毎《镜脑鰪?子元件，例如SV40增強子(在bpl00-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強 子、桿狀病毒增強子或鼠IgGh基因座(參見W004/00982;3)。增強子優(yōu)選在載體上位于啟 動子上游。
5. 3. 6宿主細胞
對于編碼本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的克隆或表達載體，合適的宿主細胞是原核、酵母 或高等真核細胞。合適的原核細胞包括真細菌，例如腸桿菌科(entercAacteriaceae)， 如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如大腸桿菌(例如ATCC 31，446 ;31，537 ;27，325))、腸 桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Slmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、 沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志賀氏菌屬 (Shigella)，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿 菌(B. Iicheniformis)(參見DD 266 710)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)例如銅綠假單胞 桿菌(P. aeruginosa)和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。酵母宿主細胞中，還可以考慮釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、克魯維 酵母(Kluyveromyces)(例如 ATCC16, 045 ； 12，424 ；24178 ；56，500)、耶氏酵母(yarrowia) (EP402, 226)、巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris) (EP183, 070，還參見 Peng 等人 J. Biotechnol. 108 Q004) 185-192)、假絲酵母(Candida)、里氏木霉(Thchoderma reesia) (EP244, 234)、青霉(Penicillin)、彎頸霉(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)宿主，例 如構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。
本發(fā)明的宿主細胞可以是高等真核細胞。合適的高等真核宿主細胞包括哺乳動物 細胞例如 COS-I (ATCC No. CRL 1650)、COS-7 (ATCC CRL1651)、人胚胎腎細胞系 293、幼倉鼠 腎細胞(BHK) (ATCC CRL. 1632)、BHK570 (ATCC NO CRL 10314) ,293 (ATCC NO. CRL 1573)、 中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-KU ATCC NO =CCL 61)、DHFR-CHO細胞系例如DG44(參 見 Urlaub 等人(1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12，555-556))，特別是那些適應(yīng)于懸浮 培養(yǎng)的CHO細胞系、小鼠塞爾托利細胞(Sertoli cell)、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞(ATCC CRL-1587)、HELA 細胞、犬腎細胞(ATCC CCL 34)、人肺細胞(ATCC CCL 75), Hep G2 和骨髓 瘤或淋巴瘤細胞例如NSO(參見US 5，807，715)、Sp2/0，Y0。因此，在本發(fā)明的一個實施方 案中，提供了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其包含編碼分離蛋白質(zhì)的載體，所述分離蛋白質(zhì)包含兩 個或兩個以上的式(I)的LRR、LRR結(jié)構(gòu)域或LRR蛋白質(zhì)。
5. 3. 7細菌發(fā)酵
細菌系統(tǒng)可以用于制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。通常，它們被制備成不溶性周質(zhì)蛋白 質(zhì)，其可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法被提取和再折疊以形成活性蛋白質(zhì)，參見Sanchez 等人(1999) J. Biotechnol. 72，13-20 和 Cupit PM 等人(1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277。
5.3.8細胞培養(yǎng)方法
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，培養(yǎng)用編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其抗 原結(jié)合片段的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。宿主細胞可以在轉(zhuǎn)瓶、滾瓶或中空纖維系統(tǒng)中培養(yǎng)， 但是對于大規(guī)模生產(chǎn)，優(yōu)選使用攪拌釜反應(yīng)器，特別是用于懸浮培養(yǎng)。優(yōu)選，使用例如噴 頭(sparger)、擋板或低剪切渦輪使攪拌釜適應(yīng)于通氣。對于鼓泡塔和氣升式反應(yīng)器，可 以用空氣或氧氣泡直接通氣。當宿主細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，優(yōu)選該培養(yǎng)基補充有 細胞保護劑(例如pluronic F-68)，以幫助避免由通氣操作造成的細胞損傷。根據(jù)宿主 細胞的特點，對于貼壁依賴性細胞系，使用微載體作為生長基底，或可以對細胞進行懸浮培 養(yǎng)(典型的情況)適應(yīng)化。宿主細胞、特別是無脊椎動物宿主細胞的培養(yǎng)可以使用多種操 作模式例如補料-分批、重復(fù)的分批工藝(參見Drapeau等人(1994) cytotechnology 15 103-109)、延長的分批工藝或灌流培養(yǎng)。雖然可以在含有血清例如胎牛血清(FCS)的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)重組轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細胞，但是，優(yōu)選地在合成的無血清培養(yǎng)基(例如在 Keen等人(199 Cytotechnology 17 :153-163中公開的培養(yǎng)基)或市售可得的培養(yǎng)基例14如ftx)CH0-CDM或UltraCHO(TM) (Cambrex NJ,USA)中培養(yǎng)此類宿主細胞，如果需要，可以在 培養(yǎng)基中補充能源例如葡萄糖和合成的生長因子例如重組胰島素。宿主細胞的無血清培養(yǎng) 可能要求對那些細胞進行在無血清條件下生長的適應(yīng)化。一種適應(yīng)化方法是在含有血清的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)此宿主細胞，然后反復(fù)地將80%的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，以使宿主細胞 學(xué)習(xí)適應(yīng)無血清條件(參見例如Scharfenberg K等人(19卯)動物細胞技術(shù)面向21世紀 的發(fā)展(Animal Cell technology !Developments towards the 21st century) (Beuvery E. G.等人編輯)，第 19-623 頁，KluwerAcademic publishers)。
可以使用多種技術(shù)回收和純化分泌到培養(yǎng)基中的本發(fā)明蛋白質(zhì)，從而提供適合于 所需用途的純化程度。例如，本發(fā)明的治療性蛋白質(zhì)用于治療人類患者的用途通常要求至 少95%純度、更常見地要求98%或99%或更高的純度(與粗培養(yǎng)基相比)。首先，通常利 用離心去除培養(yǎng)基中的細胞碎片，隨后使用例如微濾、超濾和/或深層過濾進行上清液的 澄清化步驟。還可以使用多種其它技術(shù)，例如透析和凝膠電泳和層析技術(shù)，例如羥基磷灰 石(HA)層析、親和層析(任選地涉及親和標簽體系如多組氨酸)和/或疏水相互作用層析 (HIC，參見US 5, 429, 746) 0通常，還可以使用各種去除病毒的步驟(例如，納米過濾，使用 例如DV-20濾器進行)。經(jīng)過各種這些步驟，可以提供純化制品，其包含至少35mg/ml或更 多(例如100mg/ml或更多)的本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)，從而構(gòu)成本發(fā)明的一個實施方案。適 宜地，此類制品基本上不含聚集形式的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
5.4.藥物組合物
在某些實施方案中，將本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)和多核苷酸摻入藥物組合物中，以用 于治療和/或預(yù)防病原細菌感染。在一些實施方案中，藥物組合物用于治療和/或預(yù)防對人 具有致病性的細菌的感染。在其它實施方案中，藥物組合物用于治療和/或預(yù)防對非人動 物具有致病性的細菌的感染，例如獸醫(yī)用。用于治療和/或預(yù)防特定病原細菌感染的實施 方案在下面更詳細地描述。讀者可以想到第3節(jié)、第5. 1節(jié)和第5. 2節(jié)中描述的每種和所 有蛋白質(zhì)或多核苷酸方面或?qū)嵤┓桨钢荚趩为毜厍揖唧w地在此處考慮并入藥物組合物中。
通常地，本發(fā)明的藥物組合物包含(或基本上組成是)治療有效量的(例如 以單位劑量的形式)的本發(fā)明分離蛋白質(zhì)和公認的藥學(xué)實踐所已知且要求的可藥用載 體。用于藥學(xué)用途的蛋白質(zhì)制劑是熟知的，讀者尤其可以參考Hovgaard L(2000) “肽和 蛋白質(zhì)的藥學(xué)制劑發(fā)展(Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins) CRC Press, ISBN :0748407456 ；Nail S.等人(2002) “蛋白質(zhì)制劑的發(fā)展 禾口 3a (Development and manufacture of protein pharmaceuticals)，，，Springer, ISBN :0306467453 ；McNal Iy Ε. J. (1999) “蛋白質(zhì)配制與遞送(protein formulation and delivery)(Drugs & the Pharmaceutical Sciences), Marcel Dekker Ltd, ISBN 08M778839。還參見Oslo等人編輯的雷明頓藥物科學(xué)(Remington' s Pharmaceutical kiences)，第16版，1980，Mack Publishing Co.，所述公開物由此通過引用并入本文?？?以根據(jù)希望治療的根本性疾病或狀態(tài)，使本發(fā)明的藥物組合物適用于通過任何便利或必需 的途徑施用。因此在一些實施方案中，提供了可靜脈內(nèi)施用的藥物組合物，其包含治療有效 量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在其它實施方案中，提供了適用于皮下施用治療有效量的本發(fā)明蛋 白質(zhì)的藥物組合物。
通過將具有所需的純化程度的本發(fā)明蛋白質(zhì)與藥理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或15穩(wěn)定劑混合，可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)制備用于貯存或施用。此類材料在所用的劑量和濃度 下對接受者是無毒的。如果本發(fā)明的蛋白質(zhì)是水溶性的，那么它可在緩沖液(優(yōu)選PH為約 7至8)例如磷酸鹽或其它有機酸鹽中配制。如果蛋白質(zhì)在水中僅部分可溶，那么可以通過 用0. 04-0. 05% (w/v)量的非離子表面活性劑例如Tween、Pluronics或PEG(例如Tween 80)對蛋白質(zhì)進行配制，將其制備成微乳，從而增加蛋白質(zhì)的溶解度。
任選地，可以加入其它成分，例如抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量(少于約10個 殘基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合 物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和 其它碳水化合物(包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精類；螯合劑例如EDTA ；和 糖醇例如甘露醇或山梨醇。
用于治療施用的本發(fā)明蛋白質(zhì)必須是無菌的?？梢酝ㄟ^過濾穿過無菌濾膜(例如 0.2微米膜)容易地實現(xiàn)無菌。本發(fā)明的蛋白質(zhì)通常以凍干形式，或者如果它具有高度的熱 和氧化變性穩(wěn)定性，以水溶液形式貯存。本發(fā)明的蛋白質(zhì)制品的PH通常為約6至8，盡管在 某些情況中較高或較低的PH值也可以是合適的。應(yīng)理解，使用某些前述賦形劑、載體或穩(wěn) 定劑將會導(dǎo)致本發(fā)明蛋白質(zhì)的鹽的形成。
如果胃腸外使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)，則可以將含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的治療性組合物置 于具有無菌取用孔的容器中，例如具有可被皮下注射針刺穿的瓶塞的靜脈溶液袋或小瓶。
一般來說，當疾病/病癥允許時，技術(shù)人員應(yīng)該對本發(fā)明的蛋白質(zhì)進行配制并確 定劑量以用于位點特異性遞送。這在創(chuàng)傷和潰瘍的情況下是方便的。例如，本發(fā)明的蛋白 質(zhì)可以摻入凝膠(例如水凝膠)中并施用至創(chuàng)傷或潰瘍床。
還可制備持續(xù)釋放制劑，包括微囊顆粒和可植入品的形成。對于制備持續(xù)釋放組 合物，優(yōu)選將本發(fā)明的蛋白質(zhì)摻入可生物降解的基質(zhì)或微囊中。適用于此意圖的材料是 聚乳酸，盡管可以使用聚-(a_羥基羧酸)的其它聚合物，例如聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133，988A)。其它可生物降解的聚合物包括聚(內(nèi)酯)類、聚(縮醛)類、聚(原酸酯)類 或聚(原碳酸酯)類。這里最初的考慮必須是載體本身或其降解產(chǎn)物在靶組織中是無毒 的，并且不會進一步加重病狀。這可通過在靶紊亂的動物模型中，或如果此類模型是得不到 的，在正常動物中的常規(guī)篩選來確定。很多科學(xué)出版物記載此類動物模型。
對于持續(xù)釋放組合物的實例，參見U. S.專利號3，773，919、EP 58，481A、U. S.專 利號 3，887，699、EP 158，277A、加拿大專利號 1176565、U. Sidman 等人，Biopolymers 22， 547 [1983]和 R. Langer 等人，Chem. Tech. 12，98 [1982]。
當局部應(yīng)用時，本發(fā)明的蛋白質(zhì)適于與其它成分例如載體和/或助劑組合。對此 類其它成分的性質(zhì)沒有限定，除了它們必須是可藥用的并且對于其預(yù)期的施用是有效的， 并且不會降低該組合物的活性成分的活性。合適賦形劑的實例包括含有或不含純化膠原的 軟膏、乳膏、凝膠或懸液。還可將該組合物充入透皮貼片、硬膏劑和繃帶中，優(yōu)選以液體或半 液體形式。
為了獲得凝膠制劑，可將配制于液體組合物中的本發(fā)明蛋白質(zhì)與有效量的水溶性 多糖或合成聚合物例如聚乙二醇混合，以形成可局部應(yīng)用的適宜粘度的凝膠。可以使用的 多糖包括例如纖維素衍生物，例如醚化纖維素衍生物，包括烷基纖維素、羥烷基纖維素和烷 基羥烷基纖維素，例如甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羥丙基纖維素；淀粉和分級淀粉(fractionated starch)；瓊脂；海藻酸和藻酸鹽；阿拉伯膠； 普魯蘭多糖(pullullan)；瓊脂糖；角叉菜膠；右旋糖酐類；糊精類；果聚糖類；菊粉；甘露 聚糖類；木聚糖類；阿拉伯聚糖；殼聚糖；糖原；葡聚糖類；和合成生物聚合物；以及膠類例 如黃原膠；瓜爾膠；刺槐豆膠(locust bean gum)；阿拉伯膠；西黃蓍膠；和刺梧桐樹膠；及 其衍生物和混合物。本文優(yōu)選的膠凝劑對生物系統(tǒng)惰性、無毒、易于制備且不太松軟或粘 稠，并且不會使包含于其中的本發(fā)明蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。
優(yōu)選，多糖是醚化纖維素衍生物，更優(yōu)選是成分明確的、純化的并記載于USP中的 多糖，例如甲基纖維素和羥烷基纖維素衍生物，例如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素和羥丙基 甲基纖維素。本文最優(yōu)選的是甲基纖維素。
用于膠凝的聚乙二醇通常是為獲得適宜粘度的低分子量和高分子量聚乙二醇的 混合物。例如，當分子量為400-600的聚乙二醇和分子量為1500的聚乙二醇的混合物以適 宜比率混合而獲得糊劑時，該混合物對此目的是有效的。
用于多糖和聚乙二醇的術(shù)語“水溶性的”意指包括膠體溶液和分散液。通常地，纖 維素衍生物的溶解度由醚基的取代程度決定，并且本文有用的穩(wěn)定衍生物應(yīng)在纖維素鏈中 具有足夠量的此類醚基/脫水葡萄糖單元以使衍生物具有水溶性。至少0. 35醚基/脫水 葡萄糖單元的醚取代程度通常是足夠的。此外，該纖維素衍生物可以是堿金屬鹽的形式，例 如Li鹽、Na鹽、K鹽或Cs鹽。
如果在凝膠中使用甲基纖維素，則優(yōu)選它包含約2-5%、更優(yōu)選約3%的凝膠，本 發(fā)明的蛋白質(zhì)以約300-1000mg/ml凝膠的量存在。
所使用的劑量取決于上述的各因素。作為一般的建議，配制本發(fā)明的蛋白質(zhì)，并以 能在組織中建立有效但并未過分有毒的大于約0. lng/cc (最高至最大劑量)的水平的劑量 遞送至靶點或組織。如果可能的話，通過連續(xù)輸注、持續(xù)釋放、局部應(yīng)用或以憑經(jīng)驗而定的 頻率注射，應(yīng)保持這種組織內(nèi)濃度。
特別適合于此本發(fā)明實踐中所用的本發(fā)明蛋白質(zhì)的臨床施用的組合物包括，例如 無菌水溶液或無菌可水合粉末例如凍干蛋白質(zhì)。通常期望在制劑中還包括適宜量(一般以 足以使制劑等滲的量)的可藥用鹽。通常也包括足夠量的PH調(diào)節(jié)劑例如精氨酸堿和磷酸 以維持適宜的PH，一般為5. 5至7. 5。而且，為了提高含水制劑的貨架期或穩(wěn)定性，還可期 望包括其它試劑，例如甘油。照這樣，使制劑適于胃腸外施用，特別是靜脈內(nèi)施用。
本發(fā)明的藥物組合物的劑量和所需藥物濃度可隨所展望的特定用途而變化，并且 在主治醫(yī)師/健康護理專業(yè)人士的視野內(nèi)。
因此，在某些實施方案中，提供了抗細菌(例如殺細菌)藥物組合物，其包含分離 的NOD蛋白質(zhì)，特別是分離的人NOD蛋白質(zhì)，例如人NODl或人N0D2 (例如作為其唯一活性 成分)。
在其它實施方案中，提供了藥物組合物、特別是抗細菌藥物組合物的制備方法，所 述方法包括提供分離NOD蛋白質(zhì)，特別是分離人NOD蛋白質(zhì)，例如人NODl和/或人N0D2。
因此，在一些其它實施方案中，提供了抗細菌(例如殺細菌)藥物組合物，其包含 分離NOD-LRR結(jié)構(gòu)域，特別是分離人NOD-LRR結(jié)構(gòu)域，例如人NODl-LRR或人N0D2_LRR(例 如作為其唯一活性成分)。
因此，在一些其它實施方案中，提供了包含蛋白質(zhì)作為其唯一活性成分的藥物組合物(例如抗細菌如殺細菌藥物組合物)，所述蛋白質(zhì)由分離的LRR結(jié)構(gòu)域例如分離的 NOD-LRR結(jié)構(gòu)域，特別是分離人NOD-LRR結(jié)構(gòu)域例如人NODl-LRR或人N0D2_LRR(例如作 為其唯一活性成分)，或分離的人TLR-LRR結(jié)構(gòu)域例如TLR2-LRR、TLR4-LRR，TLR5-LRR、 TLR9-LRR 組成。
在其它實施方案中，提供了藥物組合物、特別是抗細菌藥物組合物的制備方法，所 述方法包括提供分離LRR蛋白質(zhì)例如分離人LRR蛋白質(zhì)，例如分離NOD-LRR結(jié)構(gòu)域，特別是 分離人NOD-LRR結(jié)構(gòu)域例如人NODl-LRR和/或人N0D2-LRR。
在其它實施方案中，提供了抗細菌(例如殺細菌)藥物組合物，其包含(例如作為 其唯一活性成分)分離的TLR蛋白質(zhì)，例如分離的哺乳動物TLR蛋白質(zhì)，例如人TLR 4，5。
在其它實施方案中，提供了抗細菌(例如殺細菌)藥物組合物，其包含(例如作 為其唯一活性成分)分離的TLR-LRR，例如分離的哺乳動物TLR-LRR，例如人TLR4-LRR、人 TLR5-LRR、人 TLR2-LRR。
在其它實施方案中，提供了抗細菌(例如殺細菌)藥物組合物的制備方法，所述方 法包括提供(例如作為其唯一活性成分)分離的TLR-LRR，例如分離的哺乳動物TLR-LRR， 例如人 TLR4-LRR、人 TLR5-LRR 或人 TLR2-LRR。
5. 4. 1其它組合物和物品
在一些實施方案中，有效量的本發(fā)明分離蛋白質(zhì)(例如上文第3節(jié)和5. 1中詳述) 被摻入用于對有需要的表面或物品進行消毒的消毒劑組合物，例如含水消毒劑組合物中。 讀者可以想到第3節(jié)和第5. 1節(jié)中所述的所有方面或?qū)嵤┓桨缚梢詥为毲颐鞔_地被考慮 用于本節(jié)中。此類表面的實例包括通常見于臨床環(huán)境的那些表面，例如醫(yī)院病房、手術(shù)表面 等，以及希望減少與病原細菌接觸的其它表面。本發(fā)明的消毒劑組合物還可以用于對物品 例如醫(yī)療物品(例如導(dǎo)管或手術(shù)器械)進行消毒，任選與其它良好臨床實踐中所已知且所 要求的滅菌技術(shù)聯(lián)合。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可用于對被病原細菌污染的水進行消毒，本發(fā)明 包括對被細菌、特別是對人和/或其它哺乳動物有致病性的細菌，污染的水進行消毒的方 法，所述方法包含將所述污染水與本發(fā)明的蛋白質(zhì)混合。
在其它實施方案中，還提供了包含(或基本上組成是)本發(fā)明蛋白質(zhì)的創(chuàng)傷和/ 或手術(shù)敷料。
5. 5病原細菌
在本發(fā)明的某些實施方案中，組合物例如藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防病原 細菌的感染。如前所述，細菌可以對人和/或其它哺乳動物具有致病性。在一些實施方案 中，該病原細菌是革蘭氏陽性的，在其它實施方案中，該病原細菌是革蘭氏陰性的。在其它 預(yù)期的實施方案中，該病原細菌是對宿主(例如人)具有致病性的厭氧細菌。病原細菌的 實例包括
Ififtf 云力禾干胃(Acinetobacter baumanii)、方-M 禾中(Actinobacillis spp)、放射菌類(Actinomycetes)、放線菌屬(Actinomyces)(例如以色列放線 菌(Actinomyces israelii)、內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii)、放線菌屬 物種(Actinomyces spp))、氣單胞菌屬物種(Aeromonas spp)(例如嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)、溫禾口氣單胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas Caviae))、厭氧球菌(Anaerobic Cocci)例如消化鏈球菌屬(Peptostreptococus)、韋榮球菌屬(Veillonella)、革蘭氏陽性厭氧桿菌(Anaerobic Bacilli)例如動彎桿 菌屬物種(Mobiluncus spp)、痤疫丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、乳桿菌屬 (Lactobacillus)、真細菌屬(Eubacterium)、雙岐桿菌屬物種(Bifidobacterium spp)、革 蘭氏陰性厭氧桿菌例如擬桿菌屬(Bacteroides)、普雷沃菌屬物種(Prevotella spp)、紫單 胞菌屬(Porphyromonas spp)、梭桿菌屬(Fusobacterium spp)、芽孢桿菌屬物禾中(Bacillus spp)(例如炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearthermophilus))、 擬桿菌屬物種(Bacteroides spp)(例如脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis))、博 德特菌屬物種(Bordetella spp)(例如百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、 副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)、支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchis印tica))、疏螺旋體屬物種(Borrelia spp)(例如回歸熱疏螺旋體(Borrelia recurrentis)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi))、布魯氏菌屬物種(Brucella spp)(例如流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)、犬布氏桿菌(Brucella canis)、馬爾他 布魯氏菌(Brucella melintensis)、豬布氏桿菌(Brucella suis)伯霍爾德桿菌屬物 種(Burkholderia spp)(例如類鼻疽伯霍爾德桿菌(Burkholderia pseudomallei)、洋 蔥伯霍爾德桿菌(Burkholderia c印acia))、彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.)(例如 空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、紅嘴 鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)、胎兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus))、檸檬酸 桿菌屬物種(Citrobacter spp)(例如弗氏檸檬酸桿菌屬(Citrobacter freundii)、 多變檸檬酸桿菌(Citrobacter diversus))、梭菌屬物種(Clostridium spp)(例如產(chǎn) 氣莢膜梭菌(Clostridium perfingens)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭 菌(Clostridium botulinum))、棒桿菌屬物種(Corynebacterium spp)(例如白喉棒桿 菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒桿菌(Corynebacterium jeikeum)、角軍月尿棒 If |if (Corynebacterium urealyticum)) > jHI^S^^ 1 lif (Edwardsiella tarda) > 1 If 菌屬物禾中(Enterobacter spp)(例如產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、聚團腸 桿菌(Enterobacter agglomerans)、陰溝腸桿菌(Enterbacter cloacae))、大腸桿菌 (Escherichia coli)(例如腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxigenic Ε. coli)、腸侵襲性大 腸桿菌(enteroinvasive Ε· coli)、腸致病性大腸桿菌(enteropathogenic E. coli)、腸 IfiI ；JSff (enterohemorrhagic Ε. coli) > ^ ^ fii；Jgff^ (uropathogenic Ε. coli))、克雷伯菌屬物種(Klebsiella spp)(例如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca))、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、變形菌屬物種(Proteus spp)(例如奇異變形菌(Proteus mirabilis)、普通 變形菌(Proteus vulgaris))、普羅威登斯菌屬物種(Providencia spp)(例如產(chǎn)堿普羅 ^ Ι " (Providencia alcalifaciens) >|| 1 1(Providencia rettgeri) >斯氏普羅威登斯菌(Providenciastuartii))、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)(例 如傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi)、腸炎 沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholerauis)、鼠 傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬物種(Serratia spp)(粘質(zhì)沙 雷氏菌(Serratia marcesans)、液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens))、志賀菌屬物種(shigella spp)(例如痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志賀菌(Shigella flexneri)、鮑氏志賀菌(Shigella boydii)、宋氏志賀菌(Shigella sonnei))、耶爾森菌 屬物種(Yersinia spp)(例如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫 耳口爾森菌(Yersinia pestis)、假結(jié)核病耳口爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)) > 腸球菌屬物禾中(Enterococcus spp)(例如糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸 球菌(Enterococcus faecium)) > Erysipelothrix rhusopathiae> 土拉熱弗 Il月西絲 胃(Francisella tularensis)、Hf il 木干胃 M 禾中(Haemophilus spp) ( M1 ^ Bf ifil ff ^ (Haemophilus influenzae) > ft 3 W Bf il ff ^ (Haemophilus dureyi) > Bf ifil ff ^ (Haemophilus aegyptius)、畐Ij流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)、畐Ij溶血性 嗜血桿菌(Haemophilus parahaemolyticus))、螺桿菌屬物種(Helicobacter spp)(例如 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、同性戀螺桿菌(Helicobacter cinaedi)、芬納爾螺 桿菌(Helicobacter fennelliae))、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、問號鉤端螺 旋體(Leptospira interrogans)、單核細胞±曾生j■生李斯特菌(Listeria monocytogenes) > 微球菌屬物種(Micrococcus spp)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、麻風分 枝桿菌(Mycobacterium leprae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、奴 卡菌屬物種(Nocardia spp)(例如星狀諾卡爾菌(Nocardia asteroides)、巴西諾卡 菌(Nocardia brasiliensis)、奈瑟球菌屬物種(Neisseria spp)(例如淋病奈瑟球菌 (Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Nesseria meningitides))、多殺巴斯德菌 (Pasteurella multocida)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)、銅綠假單 胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、紅球菌屬物禾中(Rhodococcus spp)、葡萄球菌屬物禾中 (Staphylococcus spp)(例如金黃色葡萄球菌(Maphylococcus aureus)、特別是抗甲氧 苯青霉素金黃色葡萄球菌(MRSA)和抗萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA))、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、腐生j"生葡萄王求菌(Staphylococcus saprophyticus))、B譽 麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、鏈球菌屬物禾中(Streptococcus spp) (例如酉良膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、 咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus)、似馬鏈球菌(Streptococcus equismilis)、 牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、咽峽炎鏈球菌、變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、 唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、血鏈球菌(Streptococcus sanguis)、緩癥鏈 王求胃(Streptococcus mitis)、:^ ! (Streptococcus milleri))、11 ·禾中 (Streptomyces spp)、密螺旋體屬物種(Ti^ponema spp)(例如蒼白密螺旋體CTi^ponema pallidum)、地方性密螺旋體(Treponema endemicum)、細弱密螺旋體(Treponema pertenue)、品他病密螺旋體CTi^ponema carateum)、弧菌屬物種(Vibrio spp)(例如霍 亂弧菌(Vibrio cholerae)，包括其致病血清型例如01和0139)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、 最小孤菌(Vibrio minicus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、雞霍亂弧菌(Vibrio metchnikovii)、海魚弧菌(Vibrio damsela)、弗尼其jf弧菌(Vibrio furnisii)。
因此，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防任何一種上述病原細菌的感染(特別是 在人類患者中)的藥物組合物(和與其有關(guān)的治療方法)，所述組合物包含(或基本上組成 是)第3節(jié)和/或第5. 1節(jié)中所述的任一種蛋白質(zhì)實施方案。讀者可以想到第3節(jié)和第205. 1節(jié)中所述的蛋白質(zhì)的所有可能組合都明確且單獨地考慮用于治療和/或預(yù)防本節(jié)中所 述的任一種病原細菌的感染，以及所有這些組合各自形成本發(fā)明的獨立實施方案。但是特 別可以提及的是包含人LRR蛋白質(zhì)例如人NOD蛋白質(zhì)(例如人NODl或人N0D2)或人TLR 蛋白質(zhì)或基本上由其組成的藥物組合物，該組合物用于在人中治療和/或預(yù)防正在形成或 已經(jīng)形成對常用藥物具有抗性的病原細菌(例如其菌株)例如MRSA和VRSA的感染。
5. 6臨床疾病
根據(jù)本文公開物，對閱讀本說明書的本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是組合物(特 別是藥物組合物)可用于治療和/或預(yù)防多種疾病(特別是人類疾病)。因此，可以使用包 含和/或基本上組成是上文第3節(jié)和第5. 1節(jié)中的任何蛋白質(zhì)的藥物組合物，治療和/或 預(yù)防(特別是在人中)任何一種下述感染性疾病
炭疽、細菌性腦膜炎、肉毒中毒、布魯氏菌病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流 行性斑疹傷寒、食物傳播疾病例如食物中毒、淋病、膿皰病、軍團桿菌病、麻風病(漢森氏 病)、鉤端螺旋體病、李斯特菌病、萊姆病、類鼻疽、MRSA感染、腦膜炎、諾卡菌病、百日咳 (Whooping Cough)、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鸚鵡熱、Q熱、洛基山斑疹熱(RMSF)、沙門氏菌 病、猩紅熱、志賀氏菌病、梅毒、破傷風、沙眼、肺結(jié)核、兔熱病、傷寒、斑疹傷寒、泌尿道感染。
在一些實施方案中，藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防易感患者例如人(例如在 囊性纖維化和/或免疫抑制的人中)的機會性感染。
讀者可以想到上文第3節(jié)和第5. 1節(jié)中所述的蛋白質(zhì)的所有可能組合均明確且 單獨地考慮用在治療和/或預(yù)防上文所述的任何一種感染性疾病的組合物例如藥物組合 物中。
在其它實施方案中，提供了包含如上文第3節(jié)和第5. 1節(jié)中所述的蛋白質(zhì)的藥物 組合物在治療和/或預(yù)防細菌可以在其中起病理學(xué)作用的疾病中的用途。其實例包括消化 性潰瘍病和其它胃腸道疾病，例如炎性腸病(IBD)如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜 合征(IBS)，以及血液疾病例如敗血病。
在其它實施方案中，提供了包含如第3節(jié)和第5. 1節(jié)中所述的蛋白質(zhì)的藥物組合 物在治療炎性疾病或病癥中的用途。其實例包括關(guān)節(jié)炎病癥，例如銀屑病性關(guān)節(jié)炎。
6.實施例
通過下文非限定實施例的方式描述本發(fā)明。
6.1縮略詞列表
權(quán)利要求
1.一種用作抗微生物劑的分離蛋白質(zhì)，其包含多個LRR(富亮氨酸重復(fù)序列)結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的C端是LRR結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中每個LRR結(jié)構(gòu)域獨立地基本上由式(I)的氨基酸序 列組成(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)其中Fl和F2獨立地是1至30個殘基的連續(xù)氨基酸序列； χ可以是任何氨基酸； L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ； Z可以是NxL或CxxL ； N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ； C是Cys或kr ；且 Y = 0 或 1。
4.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其中每個LRR中至少2個L殘基是Leu。
5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中每個LRR中至少3個L殘基是Leu。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的蛋白質(zhì)，其包含至少3個LRR結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的蛋白質(zhì)，其包含至少4個LRR結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求1至7中任一項的蛋白質(zhì)，其包含至少5個LRR結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求1至8中任一項的蛋白質(zhì)，其包含至少6個LRR結(jié)構(gòu)域。
10.權(quán)利要求1至9中任一項的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是抗細菌的。
11.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其用于革蘭氏陽性菌。
12.權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)，其用于革蘭氏陰性菌。
13.權(quán)利要求10至12中任一項的蛋白質(zhì)，其用于治療人類的細菌感染。
14.權(quán)利要求1至13中任一項的蛋白質(zhì)，其選自NOD,TLR, CIITA0
15.權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)，其中所述NOD是NODl或N0D2。
16.權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)，其中所述TLR選自；TLRUTLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、 TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13。
17.權(quán)利要求16的蛋白質(zhì)，其中TLR是TLR2、TLR4或TLR5.
18.權(quán)利要求1至17中任一項的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)本身具有直接抗微生物活性。
19.權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)，其中所述直接抗微生物活性在體外條件下是有效的。
20.任何前述權(quán)利要求的蛋白質(zhì)，其包含5個或5個以上的LRR(富亮氨酸重復(fù)序列) 結(jié)構(gòu)域，用作抗細菌劑，其中所述蛋白質(zhì)的C端是LRR結(jié)構(gòu)域，且每個LRR結(jié)構(gòu)域獨立地包 含式(I)的氨基酸序列(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)其中Fl和F2獨立地是1至30個殘基的連續(xù)氨基酸序列； χ可以是任何氨基酸； L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ； Z可以是NxL或CxxL ；N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ； C是Cys或kr ；且Y= 0 或 1。
21.權(quán)利要求20的蛋白質(zhì)，其中每個LRR中至少2個L殘基是Leu。
22.—種藥物組合物，其包含根據(jù)任何前述權(quán)利要求的分離蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求20的藥物組合物，其用作抗細菌劑。
24.權(quán)利要求22或23的藥物組合物，其用在易于感染的宿主中治療和/或預(yù)防細菌感染。
25.權(quán)利要求對的組合物，其中所述宿主是哺乳動物，例如人。
26.權(quán)利要求M的組合物，其中所述人患有胃腸道疾病，例如克羅恩病、IBD或IBS。
27.一種治療人微生物感染的方法，其包括向該人施用有效量的包含多個LRR(富亮氨 酸重復(fù)序列)結(jié)構(gòu)域的分離蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述蛋白質(zhì)的C端是LRR結(jié)構(gòu)域。
29.權(quán)利要求27或觀的方法，其中每個LRR結(jié)構(gòu)域獨立地基本上由式⑴的氨基酸序 列組成(FILxxLxL (xxZ)YF2)(I)其中Fl和F2獨立地是1至30個殘基的連續(xù)氨基酸序列； χ可以是任何氨基酸； L 可以是 Leu、lie、Val 或 Phe ； Z可以是NxL或CxxL ； N 是 Asn、Thr、Ser 或 Cys ； C是Cys或kr ；且Y= 0 或 1。
30.權(quán)利要求四的方法，其中每個LRR中至少2個L殘基是Leu。
31.權(quán)利要求四的方法，其中每個LRR中至少3個L殘基是Leu。
32.權(quán)利要求27至31中任--項的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含至少3個LRR結(jié)構(gòu)域。
33.權(quán)利要求27至31中任--項的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含至少4個LRR結(jié)構(gòu)域。
34.權(quán)利要求27至31中任--項的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含至少5個LRR結(jié)構(gòu)域。
35.權(quán)利要求27至31中任--項的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含至少6個LRR結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明公開用作抗微生物劑的分離蛋白質(zhì)，其包含多個LRR(富亮氨酸重復(fù)序列)結(jié)構(gòu)域，每個LRR結(jié)構(gòu)域獨立地包含式(I)的氨基酸序列(F1LxxLxL(xxZ)YF2)，其中F1和F2獨立地是1至30個殘基的連續(xù)氨基酸序列；x可以是任何氨基酸；L可以是Leu、Ile、Val或Phe；Z可以是NxL或CxxL；N是Asn、Thr、Ser或Cys；C是Cys或Ser；且Y＝0或1。
文檔編號A61P31/04GK102037006SQ200980102302
公開日2011年4月27日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日
發(fā)明者L-H·佩雷茲, S·帕金森 申請人:諾瓦提斯公司