專利名稱：：抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于抗肝癌藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及反義寡核苷酸納米制劑，具體為一種具有良好應(yīng)用前景的抗肝癌反義寡核苷酸納米制劑及其應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(h印atocellularcarcinoma,HCC)是一種高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的實(shí)體惡性腫瘤，但還缺乏理想的治療方法?；蛑委熞?yàn)槿狈硐氲幕蜉d體而限制了其在臨床上的應(yīng)用。中期因子(midkine，MK)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子，它是一種具有促細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促有絲分裂作用、促腫瘤血管生成、抗細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)纖維蛋白溶解等腫瘤形成相關(guān)活性的堿性肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)，僅在胚胎中期和成年腎臟表達(dá)。已有的研究表明，在肝癌等許多人類腫瘤組織中MKmRNA及蛋白均呈高度表達(dá)，而各種正常組織僅有低水平表達(dá)或無表達(dá)，并與肝癌的發(fā)生、浸潤轉(zhuǎn)移，血管生成及預(yù)后密切相關(guān)，而血管生成是肝癌無限制侵襲，生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。因此，MK可能是抗血管生成治療肝癌的理想耙位。納米脂質(zhì)體是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統(tǒng)的一種新劑型，可以將毒副作用大、穩(wěn)定性差、降解快的藥物粉末或溶液包埋在直徑為納米級的脂質(zhì)體微粒中，這種微粒具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以透過人體病灶部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙到達(dá)病灶部位，并改變被包封藥物的體內(nèi)分布，使其在病灶部堆積釋放，從而達(dá)到提高藥物治療指數(shù)，減少藥物治療劑量和降低藥物毒性的目的，以實(shí)現(xiàn)定向給藥。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種制備具有治療原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌潛能的反義寡核苷酸納米藥物的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑，由0.01500mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和io1000iiM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比20:io.i:i混合制成，其中抗中期因子反義寡核苷酸的序列為CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA。所述陽離子納米脂質(zhì)體可選用本領(lǐng)域常規(guī)陽離子納米脂質(zhì)體，本發(fā)明中優(yōu)選為DC-chol納米脂質(zhì)體。優(yōu)選的，所述納米制劑由1.86mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和150yM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比1.8:l混合制成。本發(fā)明還涉及所述的抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑的制備方法，所述方法包括(1)陽離子納米脂質(zhì)體制備將陽離子脂質(zhì)和中性磷脂溶于有機(jī)溶劑中，采用常規(guī)薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，加入糖的水溶液，水浴超聲波處理得到含糖3%30%(w/v)的粗脂質(zhì)體懸液(脂質(zhì)體懸液中脂質(zhì)體濃度可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行控制)，通過均質(zhì)機(jī)均質(zhì)、微射流泵、超聲或是擠壓器均勻粒徑，控制粒徑為100200nm，過濾除菌，得到陽離子納米脂質(zhì)體；分裝于西林瓶中，可以在2°C『C下保存或凍干保存至使用，所述的制備脂質(zhì)體的方法有很多，如薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、溶劑注入法、凍融法等，都可以用來制備空白脂質(zhì)體。所述的陽離子脂質(zhì)體可為3-!3-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙基)]氨甲?；懝檀?DC-chol)以及類似的膽固醇衍生物，N-[l-(2，3)-二油烯氧基]丙基-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)及其類似物，如1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)，還有溴化二甲基雙十八烷基銨(DDAB)及其類似的烷基胺/酰胺復(fù)合物中的一種或多種。所述中性磷脂選自二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂中的一種或多種；磷脂種類繁多，但制備脂質(zhì)體的方法大同小異，本發(fā)明所用的中性磷脂不局限于以上所舉實(shí)例。所述的有機(jī)溶劑選自氯仿、甲醇、乙醇、叔丁醇、異丙醇和正丁醇中的一種或多種的混合；所述的糖選自乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、綿白糖中的一種或多種；(2)納米制劑制備0.01500mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和101000yM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比為20:10.1:l混合后靜置10min以上，制得所述的抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑。所述陽離子脂質(zhì)與中性磷脂摩爾比為47:36。所述步驟(2)為將1.86mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和150yM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比1.8:1混合后靜置10分鐘以上，制得所述抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑。所述中性磷脂優(yōu)選為二油酰磷脂酰乙醇胺。所述陽離子脂質(zhì)優(yōu)選為3-!3-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙基)]氨甲?；懝檀肌１景l(fā)明采用抗中期因子反義寡核苷酸和納米脂質(zhì)體制備得到具有治療原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌潛能的反義寡核苷酸藥物。抗中期因子反義寡核苷酸藥物進(jìn)入血液循環(huán)后，被血漿調(diào)理素的蛋白吸附，最主要的調(diào)理素為補(bǔ)體和免疫球蛋白。由于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對這種調(diào)理素具有特異的識別能力，故吸附了調(diào)理素的抗中期因子反義寡核苷酸藥物大部分被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別并吞噬，其中性的表面適于延長其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，因此可極大地提高藥物的生物利用度，可有效延長藥物的半衰期。同時(shí)，此種藥物還具有廣譜、放大的抗腫瘤作用，且兼毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性、可實(shí)現(xiàn)耙向運(yùn)輸、在體內(nèi)能夠降解、生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑可用于制備抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長的藥物。或者用于制備治療高表達(dá)MK的原發(fā)性肝癌的藥物。本發(fā)明的目的可以通過以下措施來實(shí)現(xiàn)l.抗中期因子反義寡核苷酸序列合成所有反義寡核苷酸序列均采用合成儀自動合成，并在合成時(shí)進(jìn)行硫代修飾，采用TETD為硫化劑。反義寡核苷酸硫代過程在恒溫25°C±1°C，恒濕50%±5%，萬級空氣凈化室中進(jìn)行。使用的乙腈通過0.22ym的分子篩處理。反義寡核苷酸在偶聯(lián)反應(yīng)之前必須用無水乙腈反復(fù)洗滌以徹底除去，如果反應(yīng)體系殘留有水或其他親核試劑會同羥基展開競爭從而影響偶聯(lián)效率。合成完畢用濃氨水55t:切割并脫保護(hù)，含7mo1/1尿素的16%聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。260nm紫外定量后真空干燥，-2(TC保存?zhèn)溆?使用時(shí)加水溶解)。采用HPLC檢測合成的反義寡核苷酸序列純度和濃度。2.納米脂質(zhì)體合成將膜材陽離子脂質(zhì)和中性磷脂溶于有機(jī)溶劑中，采用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，得到含糖3%30%(w/v)的粗脂質(zhì)體懸液，然后通過均質(zhì)機(jī)均質(zhì)、微射流泵、超聲或是擠壓器均勻粒徑，粒徑控制在200nm左右，最后將陽離子納米脂質(zhì)體過濾除菌，分裝于西林瓶中，成品可以在2t:8t:下保存或凍干保存至使用。用透射電鏡和動態(tài)光散射觀察納米脂質(zhì)體的形態(tài)和測定其粒徑。3.抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物的制備無菌操作條件下取出納米脂質(zhì)體，將其與反義寡核苷酸(ASODN)混勻即可。4.抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物的鑒定無菌操作取出2030iiL經(jīng)過濾除菌的納米脂質(zhì)體，測其與ASODN的結(jié)合率，試驗(yàn)測得納米制劑與ASODN的結(jié)合率為1.8:1。通過肉眼觀察凍干的納米脂質(zhì)體制劑的形狀，為白色細(xì)顆粒狀粉末。取lmL注射用水復(fù)溶后檢測PH，pH為6.08.0。Fisher法測定反義寡核苷酸包裹前干燥失重，干燥失重《1%。HPLC檢測反義寡核苷酸包裹前含量、反義寡核苷酸單個(gè)堿基缺失，比例《1%。透射電鏡觀察(每瓶制劑用lmL注射用水復(fù)溶，吸取1滴與等量磷鴇酸混合)、馬爾文粒徑儀測量顆粒載藥量均一性、顆粒均質(zhì)性，顆粒粒徑在50400nm之內(nèi)。通過不同凍干方法釋出試驗(yàn)測定制劑的穩(wěn)定性、微球包封率和制劑再分散性，試驗(yàn)結(jié)果表明產(chǎn)品穩(wěn)定期為12個(gè)月，微球包封率^95%，制劑再分散性>95%。顆粒表面正電位>10mV，溶解度^5mg/ml。采用MTT法，檢測抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物對H印G2細(xì)胞增殖的影響；制備BALB/C小鼠移植瘤模型，檢測抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物對腫瘤生長的影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物具有抗腫瘤作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種新的抗腫瘤藥物即抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物，該藥物可特異抑制原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌新生血管的生成，具有抗腫瘤活性好、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性、可實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸、生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)?？蓪?shí)現(xiàn)較好的社會經(jīng)濟(jì)效益，具有重大的臨床意義。圖1為抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物電鏡圖；圖2為抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；A.免疫熒光染色檢測MK-AS對細(xì)胞的影響；B.Real-timePCR檢測MK-AS對細(xì)胞生長的影響；C.采用MTS法測定MK-AS對細(xì)胞生長的抑制程度；圖3為中期因子反義寡核苷酸納米制劑的組織分布初步研究；A.非納米反義寡核苷酸對照組，在肝臟部位無加強(qiáng)信號；B.反義寡核苷酸納米制劑組，在肝臟部位可見強(qiáng)信號；圖4為整體觀察抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑對癌裸鼠原位移植瘤發(fā)的影響；圖5為H.E染色光鏡觀察抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；A.正常裸鼠對照組；B.空納米組；C.5-FU陽性對照組；D.Midkine反義寡核苷酸50mg/kg組；E.納米反義寡核苷酸100mg/kg;F.納米反義寡核苷酸50mg/kg;G.納米反義寡核苷酸25mg/kg;H.納米50mg/kg加5-FU聯(lián)合用藥。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:納米脂質(zhì)體的制備(1)制備空白脂質(zhì)體將10mg的DC-Chol與8mg的DOPE用10ml的無水氯仿溶解，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于氮?dú)夥諊小?(TC減壓蒸發(fā)去除氯仿，直至形成均勻類脂薄膜，加入5X(w/v)葡萄糖水溶液lOmL，水浴超聲波處理得到初脂質(zhì)體混懸液。(2)勻化脂質(zhì)體水化完全通過高壓勻質(zhì)機(jī)擠壓通過0.1m的膜，反復(fù)6次，得到200nm左右的納米脂質(zhì)體。(3)脂質(zhì)體的保存將經(jīng)0.22Pm膜濾過的無菌納米脂質(zhì)體溶液分裝在西林瓶中，成品可以在4t:下保存或凍干保存至使用。實(shí)施例2:制備抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物將上述所得的1.86mMDC-Chol納米脂質(zhì)體溶液與150yM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液(序列為CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA)按照1.8:1(v/v)混合后靜置30min，即可得到抗中期因子反義寡核苷酸納米藥物。結(jié)論納米制劑的鑒定結(jié)果表明本品各項(xiàng)指標(biāo)包括性狀、pH、反義寡核苷酸包裹前干燥失重、反義寡核苷酸包裹前含量、反義寡核苷酸單個(gè)堿基缺失、顆粒載藥量均一性、顆粒均質(zhì)性、表面電位、溶解度、產(chǎn)品穩(wěn)定性、微球包封率、制劑再分散性均達(dá)到要求(見圖l和表1)。表1:納米粒鑒定檢測結(jié)果匯總檢測項(xiàng)目結(jié)果性狀白色細(xì)顆粒狀粉沬pH6.0-8.0反義寡核苷酸包裹前干燥失重《1%反義寡核苷酸單個(gè)堿基缺失《1%6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3:抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(—)材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)人H印G2(肝癌細(xì)胞系)，10X小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37。C，5X(A孵育箱培養(yǎng)。2.轉(zhuǎn)染試劑MK-AS(150iiM)與DC-Chol納米脂質(zhì)體(1.86mM)體積比為1:1.8，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組如下空白nano組1.44iiLDC-Cho1納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基;0.luMMK-AS+nano組0.1iiLMK-AS+0.18iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.2uMMK-AS+nano組0.2iiLMK-AS+0.36iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.4uMMK-AS+nano組0.4iiLMK-AS+0.72iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.8uMMK-AS+nano組0.8iiLMK-AS+1.44iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.4uMMK-AS+lipo組0.4iiLMK-AS+0.25iiLlipofectin，150iiL1640培養(yǎng)基3.轉(zhuǎn)染試驗(yàn)H印G2細(xì)胞在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，接種96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)，培養(yǎng)基為150iiL，培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)4-6h換用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。整個(gè)流程采用細(xì)胞芯片實(shí)時(shí)監(jiān)測。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR1)試驗(yàn)材料與儀器試驗(yàn)材料H印G2，HUVEC，MK-AS(反義寡核苷酸)和納米脂質(zhì)體均由浙江大學(xué)分子醫(yī)學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供；1640培養(yǎng)基，10%小牛血清，購自promega;lipofectin2000購自invitrogen;Trizol，逆轉(zhuǎn)錄試劑TAKARAPrimeScriprtTMRT-PCRkit(code:DRR037S)和定量試劑takaraSYBRPremixExTaqTM(PerfectRealTime,code:DRR041)購自TAKARA;引物GAPDH(內(nèi)參)up:5'-ggagccaaaagggtcateatet_3，Down:5'_aggggccatccacagtcttct-3'，MKup:5'-ctccgcggtcgccaaaaagaaaga-3'禾口MKdown:5'_cccccateacacgcaccccagtt-3'由TAKARA公司合成。儀器熒光定量PCR儀7500購自ABI;Biorad分光光度計(jì)。試驗(yàn)方法1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及收集H印G2細(xì)胞在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，接種6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為104個(gè)，培養(yǎng)基為2ml，培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)46h換用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。2)RNA抽提每孔收集的細(xì)胞加入lmlTrizol液裂解。室溫放置5分鐘，然后以每lmlTrizol液加入O.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。室溫放置15分鐘，4。C下12000g離心10min。取上層水相于一新的離心管，按每lmlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min。棄去上清液，按每mlTrizol液加入至少lml的比例加入75X乙醇，渦旋混勻，4t:下7500g離心5min。小心棄去上清液，然后室溫干燥510min。然后將RNA溶于DEPC水中。Bio-rad分光光度計(jì)定量RNA濃度。3)逆轉(zhuǎn)錄Bio-rad分光光度計(jì)定量RNA濃度，定量后稀釋濃度到250ng/ml，取500ng(2yL)做逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄操作按照TAKARAPrimeScriprtRT-PCRkit操作手則進(jìn)行。4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物終體積調(diào)整至15ill，取2ul做PCR模板，按照takaraSYBRPremixExTaqTM(PerfectRealTime)試劑盒操作手冊進(jìn)行熒光定量PCR。以GAPDH作為內(nèi)參照基因。PCR條件如下95。C，2min;95。C，20s;56。C，20s;72。C，40s。40個(gè)循環(huán)。在延伸階段收集熒光。5.MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法試驗(yàn)[OOSS](1)試驗(yàn)材料與儀器試驗(yàn)材料H印G2，HUVEC，MK-AS(反義寡核苷酸)和納米制劑均由浙江大學(xué)分子醫(yī)學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。1640培養(yǎng)基，10%小牛血清，購自promega。lipofectin2000購自invitrogen(2)試驗(yàn)方法轉(zhuǎn)染試劑配制MK-AS(150iiM)與DC-Choi納米脂質(zhì)體(1.86mM)體積比為1:1.8，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組如下空白nano組1.44iiLDC-Cho1納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基;0.luMMK-AS+nano組0.1iiLMK-AS+0.18iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.2uMMK-AS+nano組0.2iiLMK-AS+0.36iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.4uMMK-AS+nano組0.4iiLMK-AS+0.72iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.8uMMK-AS+nano組0.8iiLMK-AS+1.44iiL納米脂質(zhì)體，150iiL1640培養(yǎng)基0.4uMMK-AS+lipo組0.4iiLMK-AS+0.25iiLlipofectin，150iiL1640培養(yǎng)基[OWO](3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和MTT法測定H印G2細(xì)胞在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，接種96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)，培養(yǎng)基為150iU，培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)46h換用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后加入40iUMTT(5g*")，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入200ii1DMS0，振蕩10min，測0D490nm。(4)結(jié)果:1.Real-timePCR結(jié)果顯示，MK_AS對H印G2細(xì)胞MKmRNA的表達(dá)有明顯的抑制效應(yīng)(圖2)2.采用納米粒作為載體比lipo作為載體時(shí)，MK-AS對H印G2細(xì)胞生長的抑制更為明顯。(5)結(jié)論:抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長。實(shí)施例4:中期因子反義寡核苷酸納米制劑的組織分布初步研究1、材料和方法人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植模型HCM-Y89(H印atocellularCarcinomaModels,建株時(shí)間1989年)由中國人民解放軍第二零二醫(yī)院人類消化系惡性腫瘤裸鼠原位移植瘤株庫提供。三天后原位肝癌模型的建立，老鼠被分成6組隨機(jī)和每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組由8只老鼠。它們分別由尾靜脈注入PBS(陰性對照組)，5-氟尿嘧啶(5-FU，陽性對照組)10mg/kg/day和空白納米粒子作為陽性對照。按實(shí)施例2方法制備的反義寡核苷酸納米制劑25，50和100mg/kg/day組注入小鼠20天。之后對反義寡核苷酸納米制劑體內(nèi)分布運(yùn)用體內(nèi)成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(ICE-FM-1024B，LumazoneFM)。法簡言之，小鼠麻醉和熒光納米寡核苷酸或非納米組尾靜脈注入。使用掃描儀分別在注射0分鐘、30分鐘、60分鐘和90分獲得圖像。結(jié)果見圖3。結(jié)論反義寡核苷酸納米制劑在肝臟的局部呈非特異性聚集。實(shí)施例5:抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)—、材料和方法肝癌裸鼠原位移植模型抑制作用的藥效學(xué)試驗(yàn)(l)實(shí)驗(yàn)動物和材料中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動物中心提供的BALB/C-皿/nu裸小鼠，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號為SCXK2005-0004。體重為16_18g，雌性和雄性動物各半。每籠4只動物，喂以北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的SPF鼠料，產(chǎn)品許可證號SCXK(京)2005-0007。在恒溫(25°C_27°C)，恒濕(45-60%)，新鮮空氣除塵除菌，無特定病原菌(SPF)環(huán)境下的中國人民解放軍第二零二醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物室飼養(yǎng)，滅菌處理的水和飼料供動物自由攝入，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號為SYXK(軍)2002-020(三級)。人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植模型HCM-Y89(H印atocellularCarcinomaModels，建株時(shí)間1989年)由中國人民解放軍第二零二醫(yī)院人類消化系惡性腫瘤裸鼠原位移植瘤株庫提供。藥物1:Midkine基因的反義核酸(序列為CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA);藥物2:按實(shí)施例2方法制備的Midkine基因的反義寡核苷酸納米制劑，以上由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)研究室提供，2t:8t:保存。臨用前加規(guī)定稀釋液(0.9%氯化鈉注射液)配成實(shí)驗(yàn)所需藥物濃度。對照藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)。上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。2°C8°C保存。臨用前加稀釋液(同上)配成實(shí)驗(yàn)所需藥物濃度。甲胎蛋白AFP檢測試劑盒濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司。美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的DF5分類完全自動全血分析儀。(2)實(shí)驗(yàn)方法模型制備人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植模型HCM-Y89(H印atocellularCarcinomaModels,建株時(shí)間1989年)由中國人民解放軍第二零二醫(yī)院人類消化系惡性腫瘤裸鼠原位移植瘤株庫提供。取人肝癌裸鼠原位移植瘤組織，剪切成lmmXlmmXlmm組織小塊，供移植用。裸鼠在0.5%硫噴妥鈉(0.075mg/kg)靜脈注射麻醉下，取腹正中切口，暴露肝臟，切開肝左葉被膜，將2粒瘤組織小塊移植在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，0/10無損傷縫合線縫合肝被膜，0/7絲線縫合腹膜，0/5絲線縫皮。整個(gè)手術(shù)過程在SPF條件手術(shù)室內(nèi)操作完成。術(shù)后不用抗菌素，精心飼養(yǎng)和觀察，自由進(jìn)食。給藥方案a.劑量設(shè)置受試藥物Midkine反義寡核苷酸組(lOOmg.kg—1,d—\50mg.kg—1,d—\25mg.kg—1,d—0三個(gè)劑量組，5-FU與本發(fā)明納米制劑聯(lián)合用藥組(50mg.kg—1,d—^5-FU10mg.kg—1,d—0。本發(fā)明納米制劑組(lOOmg.kg—1,d—\50mg.kg—1,d—\25mg.kg—1,d-0三個(gè)劑量組。陽性對照藥物5_氟尿嘧啶的劑量為10mg.kg—1,d—1及生理鹽水對照組。b.分組:人肝癌裸鼠原位移植模型，原位移植后第三天將荷瘤動物隨機(jī)分成11組模型對照組(生理鹽水)，Midkine反義寡核苷酸組(lOOmg.kg—1,d—\50mg.kg—1,d—\25mg.kg—1,d-0三個(gè)劑量組，5-FU與本發(fā)明納米制劑聯(lián)合用藥組(50mg.kg—1,d—^5-FU10mg.kg—1,d—0。本發(fā)明納米制劑組(lOOmg.kg—1,d—\50mg.kg—1,d—\25mg.kg—1,d-0三個(gè)劑量組。陽性對照藥物5_氟尿嘧啶的劑量為10mg.kg—1,d—、各組動物數(shù)均為8只。c.給藥方法采用靜脈給藥途徑，各治療組每天尾靜脈注射給藥，注射藥物容量為每20克體重0.3ml。d.給藥期荷瘤裸鼠隨機(jī)分組后當(dāng)日尾靜脈給藥，每天給藥一次，給藥20次。給藥時(shí)間為上午8.00-12.00。觀察指標(biāo)1.藥效學(xué)有效性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照我國《抗腫瘤藥物篩選規(guī)程》規(guī)定方法和美國《腫瘤研究院(NCI)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》停藥3天后處死荷瘤動物，系統(tǒng)解剖，取出腫瘤并稱重，按平均瘤重計(jì)算腫瘤抑制10率。計(jì)算公式如下對照組平均瘤重-治療組平均瘤重腫瘤生長抑制率=-xl00%對照組平均瘤重2.腫瘤體積停藥三天后處死荷瘤動物，系統(tǒng)解剖，取出腫瘤，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，腫瘤體積的計(jì)算按下列公式進(jìn)行V=(LXS1XS2)/2，L=腫瘤的長徑(mm)，SI=腫瘤的短徑1(mm)，S2=腫瘤的短徑2(咖)。3.病理組織學(xué)檢查正常裸鼠對照組肝組織切片，正常裸小鼠肝細(xì)胞，細(xì)胞呈多邊形，邊緣清楚，胞漿豐富，細(xì)胞核呈圓形，核漿比例正常，核仁明顯。匯管區(qū)可見小葉間靜脈，小葉間膽管和小葉間動脈，細(xì)胞排列規(guī)則。生理鹽水對照組裸鼠人肝癌病理切片H.E染色光鏡觀察可見，癌細(xì)胞呈多邊形，胞核大而不規(guī)則，核仁明顯，部分細(xì)胞有雙核，多核及巨核，癌細(xì)胞排列多樣化，除粗梁排列外，還可見腺管樣排列，血竇不明顯，分化III級。(圖5A)?？占{米組癌細(xì)胞異形，核大不規(guī)則。核質(zhì)比例大，染色深淺不一，核仁多且明顯，可見核分裂象(5B)。5-FU陽性對照組部分癌細(xì)胞膜溶解，核固縮，呈現(xiàn)溶解變性壞死改變見(圖5C)。Midkine反義寡核苷酸50mg/kg組癌組織中見片狀壞死病灶及纖維組織增生見(圖5D)，反義寡核苷酸100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、納米50mg/kg加5-FU聯(lián)合用藥治療組肝癌組織見多個(gè)片狀壞死病灶及纖維組織增生，有的細(xì)胞凝縮，核糖體、線粒體等聚集，細(xì)胞核固縮成均一的致密物，核碎裂。(圖5E、F、G、H)。整體觀察抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑對癌裸鼠原位移植瘤發(fā)的影響結(jié)果見圖4。結(jié)果1.腫瘤重量和抑瘤率Midkine反義寡核苷酸對人肝癌裸鼠原位移植模型的抑瘤作用。結(jié)果表明Midkine反義寡核苷酸及納米Midkine反義寡核苷酸對人肝癌裸鼠原位移植瘤具有明顯的抑制作用。Midkine反義寡核苷酸100mg/kg組的瘤重抑制率為70.31%，50mg/kg組的瘤重抑制率為61.98X，25mg/kg組的瘤重抑制率為40.63%，本發(fā)明納米制劑100mg/kg劑量組抑制率為81.77X，50mg/kg組的瘤重抑制率為72.92%，25mg/kg組的瘤重抑制率為56.77%，聯(lián)合用藥組瘤重抑制率為78.13%抑瘤效果好，降低給藥劑量抑瘤作用下降，呈良好的量效關(guān)系，結(jié)果表2?？占{米組的瘤重抑制率為17.18%，腫瘤重量與溶劑對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表2:酸抗人肝癌裸鼠原位移植瘤試驗(yàn)瘤重與抑瘤率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注(1)每組8只裸鼠，用藥各組均與溶劑對照組比較(2)t檢驗(yàn)各給藥組與溶劑對照組比較**P<0.01(3)聯(lián)合用藥組反義寡核苷酸50mg/kg組+5-FU10mg/kg組，陽性對照組為5-FU10mg/kg組。2.腫瘤體積與甲胎蛋白(AFP)檢測結(jié)果在本發(fā)明納米制劑及Midkine反義寡核苷酸治療停藥后第三天處死荷瘤裸鼠系統(tǒng)解剖，切取肝臟腫瘤，測量腫瘤體積，檢測AFP值。結(jié)果表明，給藥治療組腫瘤體積和AFP值明顯小于荷瘤裸鼠溶劑對照組。其中以納米Midkine反義寡核苷酸各用藥組與溶劑對照組比較差異顯著P<0.01和P<0.05?？占{米治療組與溶劑對照組比較P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AFP檢測可作為治療的評價(jià)指標(biāo)。本發(fā)明納米制劑100mg/kg/次組腫瘤體積(225.81±128.75)mm3AFP水平(58.25±30.83)ng/ml，及50mg/kg/次腫瘤體積(457.88±249.29)mm3AFP水平(89.38±61.75)ng/ml，明顯小于溶劑對照組腫瘤體積(1633.38±525.93WAFP水平(457.63±141.47)ng/ml，P<0.01有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明腫瘤體積與AFP分泌呈正相關(guān)，人肝癌裸鼠原位移植模型提供了定量研究AFP水平與腫瘤體積兩者之間關(guān)系的實(shí)驗(yàn)動物模型。結(jié)果見表3。表3:腫瘤體積與甲胎蛋白(AFP)檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注(1)每組8只裸鼠，用藥各組均與溶劑對照組比較(2)t檢驗(yàn)各給藥組與溶劑對照組比較**P<0.001，*P<0.01(3)聯(lián)合用藥組本發(fā)明納米制劑50mg/kg組+5_FU10mg/kg組，陽性對照組為5-FU10mg/kg組。結(jié)論抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑對人肝癌裸鼠原位移植瘤具有明顯的抑制作用o權(quán)利要求一種抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑，由0.01～500mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和10～1000μM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比20∶1～0.1∶1混合制成，其中抗中期因子反義寡核苷酸的序列為CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA。2.如權(quán)利要求l所述的納米制劑，其特征在于所述納米制劑由1.86mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和150iiM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比1.8:l混合制成。3.權(quán)利要求1所述的抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑的制備方法，所述方法包括陽離子納米脂質(zhì)體制備將陽離子脂質(zhì)和中性磷脂溶于有機(jī)溶劑中，采用薄膜分散法或逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體，加入糖的水溶液，水浴超聲波處理得到含糖3%30%的粗脂質(zhì)體懸液，控制粒徑為100200nm，過濾除菌，得到陽離子納米脂質(zhì)體；所述陽離子脂質(zhì)選自3-!3-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙基)]氨甲?；懝檀?，N-[l-(2，3)-二油烯氧基]丙基-N，N，N-三甲基氯化銨，1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷，溴化二甲基雙十八烷基銨中的一種；所述中性磷脂選自二油酰磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂、卵磷脂中的一種或多種；所述的有機(jī)溶劑選自氯仿、甲醇、乙醇、叔丁醇、異丙醇和正丁醇中的一種或多種的混合.所述的糖選自乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、綿白糖中的一種或多種；納米制劑制備0.01500mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和101000yM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比為20:10.1:l混合后靜置10min以上，即制得所述的抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述陽離子脂質(zhì)與中性磷脂摩爾比為47:36。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為將1.86mM的陽離子納米脂質(zhì)體溶液和150yM的抗中期因子反義寡核苷酸溶液按照體積比1.8:l混合后靜置10min以上，制得所述抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述中性磷脂為二油酰磷脂酰乙醇胺。7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述陽離子脂質(zhì)為3-P-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙基)]氨甲?；懝檀肌?.如權(quán)利要求1所述抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑在制備抑制與血管生成相關(guān)的惡性腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求1所述抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑在制備治療高表達(dá)MK的原發(fā)性肝癌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種具有治療原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌潛能的抗中期因子反義寡核苷酸納米制劑藥物及其制備方法，該制劑由陽離子納米脂質(zhì)體和抗中期因子反義寡核苷酸制成。納米脂質(zhì)體制備的工藝包括制備空白脂質(zhì)體、勻化脂質(zhì)體、分裝、保存等步驟，該納米脂質(zhì)體的制備工藝簡單、穩(wěn)定性好。本發(fā)明納米制劑相對于抗中期因子反義寡核苷酸本身而言，具有放大的抗腫瘤作用，對HepG2肝癌細(xì)胞有更加明顯的抑制作用；并且體內(nèi)藥效學(xué)分析結(jié)果顯示該納米制劑對原發(fā)性肝癌有明顯抑制作用，且兼具毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性、可實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸、在體內(nèi)能夠降解、生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有良好應(yīng)用前景的抗癌藥物。文檔編號A61K47/24GK101716352SQ200910266278公開日2010年6月2日申請日期2009年12月24日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者姚行,戴利成,王翔,鐘婧申請人:湖州市中心醫(yī)院