專利名稱：蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒素-ctx1在制備戒毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒素-CTXi的應(yīng)用，尤其涉及蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒 素-CTXl在制備戒毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛇毒是一個(gè)巨大的生物資源寶庫(kù)。自1968年英國(guó)科學(xué)家首先研制成功了治療血 管閉塞性疾病的蛇毒制劑-ARIN，投放市場(chǎng)后不久即獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)回報(bào)。近十年來(lái)，隨 著多達(dá)數(shù)十種蛇毒藥品的面世，并且取得了不俗的臨床療效和銷售業(yè)績(jī)，從蛇毒中開發(fā)出 價(jià)廉、物美的特效藥正在成為各國(guó)生物學(xué)家、藥學(xué)家及制藥企業(yè)爭(zhēng)相追逐的新熱點(diǎn)。舟山眼鏡蛇(Naja atra Cantor)，以頸部背面有白色眼鏡架狀斑紋為其最明顯的 特征，體長(zhǎng)可達(dá)2米。主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南諸省及臺(tái)灣等地。舟山眼鏡蛇所分泌的蛇 毒液中含有多種神經(jīng)毒素(neurotoxin，NT)及細(xì)胞毒素(Cytotoxin，CTX)。由于CTX對(duì)多 種組織細(xì)胞膜均有較強(qiáng)的生物活性，尤其對(duì)心肌細(xì)胞更為顯著，故又稱為膜毒素(Membrane toxin)或心臟毒素(cardiotoxin)。從我國(guó)大陸及臺(tái)灣產(chǎn)舟山眼鏡蛇毒中至少已分離出了 5 7種不同的CTX，均由60 63個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為6000 7000kD。藥物濫用(drug-abuse)是國(guó)內(nèi)外突出的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問題。二十世紀(jì)九十年代以 來(lái)，我國(guó)毒品問題日趨嚴(yán)重，毒品濫用者劇增。目前在我國(guó)濫用的主要毒品是鴉片、嗎啡、海 洛因、大麻、可卡因、安非他命、K粉，還有一些人工合成的毒品，包括冰毒、度冷丁、芬太尼、 搖頭丸等。吸毒帶來(lái)巨大的危害。青少年吸毒嚴(yán)重摧殘身心健康，一旦吸毒成癮，會(huì)導(dǎo)致記 憶力衰退、營(yíng)養(yǎng)嚴(yán)重不足、抵抗力下降、多種疾病發(fā)生如傳播艾滋病。青少年吸毒不僅給自 身帶來(lái)了極大的危害，而且造成家破人亡，親人為仇，乃至敗壞社會(huì)風(fēng)氣，危害社會(huì)治安，引 發(fā)刑事犯罪。同時(shí)，青少年吸毒又會(huì)助長(zhǎng)和刺激毒品犯罪，并且不斷腐蝕其他無(wú)辜青少年陷 入吸毒、販毒和其他違法犯罪的泥潭。目前我國(guó)用于戒毒的中草藥復(fù)方制劑雖有多種，但在控制吸毒和復(fù)吸方面的實(shí)際 效果并不理想。從河豚魚中發(fā)現(xiàn)的劇毒物質(zhì)TTX雖有一定的戒毒作用，但因產(chǎn)量低、價(jià)格昂 貴，毒性大，難以規(guī)模化開發(fā)利用。還有些戒毒藥物(如美沙酮)，雖然可以有效地控制戒斷 癥狀，但其自身屬于麻醉品，有較強(qiáng)的成癮性，因此，在應(yīng)用方面受到嚴(yán)格限制。近年來(lái)，將蛇毒中的NT用于戒毒已取得了可喜的進(jìn)展。蛇毒NT能明顯改善海洛因 成癮和成癮復(fù)吸大鼠腦神經(jīng)元的病理?yè)p害。昆明動(dòng)物研究所將含有蛇毒NT組分的制劑-復(fù) 方克痛寧制劑進(jìn)行戒毒治療，對(duì)海洛因依賴戒斷癥狀的控制效果較好，與美沙酮的療效相 近，但無(wú)成癮性，副作用輕，無(wú)呼吸抑制，不產(chǎn)生欣快效應(yīng)及縮瞳，便秘等，是一個(gè)在脫毒治 療和康復(fù)方面具有較好研究前景的藥物。毒蛇可以規(guī)模化養(yǎng)殖，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)容易控制，所生產(chǎn) 的蛇毒原料可完全滿足藥品大規(guī)模生產(chǎn)之需要。因此，蛇毒研制的戒毒藥價(jià)格較廉，易于被 患者接受和推廣。但鑒于NT的神經(jīng)毒性較大，致死活性較強(qiáng)，其安全性一直有較大爭(zhēng)議。1975 年，Hayashi 首次(Hayashi et al，1975)報(bào)道了從臺(tái)灣眼鏡蛇毒 (Naja najaatra)中純化出一種CTX，是一種強(qiáng)堿性多肽毒素(pI9. 0)，相對(duì)分子質(zhì)量為 6693kDa，有 60 個(gè)氨基酸殘基(LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN)，并命名為CTXl。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)泰國(guó)眼鏡蛇(Naja naja siamensis)毒中亦含此毒素(Ohkura et al，1988)。但CTXl是否有戒毒的功能，至今未見 相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒素-CTXl在制備戒毒藥物中的應(yīng)用，即涉 及CTXl在制藥方面的新用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒素-CTXl在制備戒除嗎啡類毒品 成癮的藥物中的應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，CTXl能較好的消除成癮大鼠對(duì)嗎啡的行為敏化，消除大鼠的渴藥行 為和戒斷癥狀，具有良好的戒毒效果。并且能夠改善成癮大鼠的功能狀況和飲食和活動(dòng)、明 顯增加體重從而恢復(fù)正常生理獲活動(dòng)。而且CTXl氨基酸序列清楚，成分單一，藥效顯著，質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)可控，毒、副作用小，利于大規(guī)模的生產(chǎn)，對(duì)于有效戒毒，防止毒品對(duì)社會(huì)個(gè)人的危害 有極大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖ICTXl在CM Sepharose FF離子交換色譜圖上的洗脫部位；圖2用質(zhì)譜分析法(MALDI-T0F)測(cè)定CTXl的分子量為6697. 915kDa。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例均以CTXl對(duì)嗎啡成癮大鼠的戒毒作用為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體闡 述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過以上內(nèi)容也能 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。1、CTXl的分離純化從大陸舟山眼鏡蛇自然野生分布優(yōu)勢(shì)區(qū)域之一的湛江地區(qū)野外采集舟山眼鏡蛇 毒樣本，進(jìn)行以下分離和純化得到CTXl (1)凝膠過濾采用 S印hacryl S-100HR 填料，通過 AKTA explorer 100 快速 純化工藝開拓系統(tǒng)(制備型高效液相色譜儀)進(jìn)行分子篩過濾柱規(guī)格26X 100mm，先用 0. 05MpH6. 4磷酸緩沖液兩個(gè)柱體積平衡凝膠柱，蛇毒樣品溶液通過AKTA explorer-100色 譜儀的上樣泵上樣(泵速為0. 6ml/min)，洗脫泵速0. 6ml/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，每管收 集量6ml/min。獲得三個(gè)主峰，分別用G-50預(yù)裝柱(HiPr印26/10Desalting)脫鹽，凍干， 備用。取該三個(gè)主峰的成分采用以下第3點(diǎn)所述的方法進(jìn)行戒毒試驗(yàn)，進(jìn)行戒毒作用的強(qiáng) 弱比較，選取第三主峰進(jìn)行下一步的“離子交換”。(2)離子交換采用CM Sepharose FF填料，通過AKTA explorer 100快速純化 工藝開拓系統(tǒng)進(jìn)行離子交換(柱規(guī)格26X100mm，先用0.05M pH6. 4磷酸緩沖液兩個(gè)柱 體積平衡凝膠柱，第三主峰(IOOmg)樣品溶液通過AKTA explorer-100色譜儀的上樣泵 上樣(泵速為 0. 8ml/min)，用 IOOOmL 含 0. 5mol/L NaCl 的 0. 02mol/L ρΗ8· 0 的 PBS 和 IOOOmLO. 02mol/L pH8. 0的PBS進(jìn)行梯度洗脫。洗脫泵速0. 8ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，每管收集量8ml/min。獲得CTXl (圖1)，用G-50預(yù)裝柱脫鹽，凍干，備用。2、CTXl分子量及其氨基酸序列測(cè)定用質(zhì)譜分析法(MALDI-T0F)測(cè)定CTXl的分子量為6697. 915kDa(圖2)；用埃德曼降解法(Edman degradation)測(cè)定CTXl的氨基酸序列為L(zhǎng)KCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVK YVCCNTDRCN與從臺(tái)灣舟山眼鏡蛇毒中純化出的CTXl相比，來(lái)源于大陸湛江地區(qū)舟山眼鏡蛇 毒CTXl的分子質(zhì)量?jī)H有約3kDa的差異，但兩者氨基酸序列完全一致。3、利用國(guó)際戒毒實(shí)驗(yàn)的經(jīng)典模型-條件位置偏愛模型(Conditioned plac印reference，CPP)觀察CTXl對(duì)嗎啡成癮大鼠的戒毒作用(1)嗎啡成癮大鼠模型的建立雄性SD大鼠體重180 220g，注射嗎啡(10mg/kg)后 隨即放進(jìn)條件位置偏愛實(shí)驗(yàn)箱(型號(hào)JLBehv-CPPG)中50分鐘，連續(xù)訓(xùn)練8天。于用藥后第10 天啟動(dòng)計(jì)算機(jī)程序，根據(jù)15min內(nèi)大鼠在黑、白兩箱的停留時(shí)間，篩選出嗎啡成癮大鼠50只。(2) CTXl對(duì)嗎啡誘導(dǎo)大鼠已形成CPP效應(yīng)的影響將嗎啡成癮大鼠分成5組模型組，對(duì)照組(每天腹腔注射生理鹽水)，低劑量組 (每天腹腔注射0. lmg/kg的CTX1)，中劑量組(每天腹腔注射0. 2mg/kg的CTX1)，高劑量 組(每天腹腔注射0. 4mg/kg的CTX1)，每組10只大鼠，連續(xù)給藥8天后，分別記錄大鼠的體 重、測(cè)量CPP、觀察其對(duì)嗎啡戒斷的癥狀(如直立、理毛、濕狗樣抖動(dòng)、寒戰(zhàn)、伸展、舔陰、齒顫 的次數(shù))并評(píng)分。實(shí)施例一不同劑量CTXl對(duì)嗎啡形成CPP的影響大鼠在對(duì)嗎啡產(chǎn)生穩(wěn)定的CPP后，連續(xù)分別給予CTX10. 1,0. 2,0. 4mg/kg劑量各8 天后，在dll時(shí)CTX10. 2mg/kg和0. 4mg/kg劑量組與嗎啡對(duì)照組和給CTXl前比較有顯著性 差異(P < 0. 05 0. 01)。8天連續(xù)給予CTXl處理后，各CTXl劑量組能對(duì)伴藥箱不再產(chǎn)生 偏愛甚至產(chǎn)生厭惡。CTXl抑制大鼠由嗎啡誘導(dǎo)形成的CPP(表1)說(shuō)明其對(duì)嗎啡成癮后動(dòng)物 的渴藥行為及獎(jiǎng)賞效應(yīng)有良好的戒毒效果。表1 不同劑量CTXl對(duì)嗎啡成癮cpp的影響 #p < 0. 05vsN. S groups ρ < 0. 01 · ρ < 0. 001 A ρ < 0. 05vsM0Rgroupρ < 0. 05vsCTXl (0· lmg/kg * ρ < 0. OlvsCTXl (0. lmg/kg)實(shí)施例二 CTX1對(duì)納洛酮的催癮效應(yīng)對(duì)實(shí)施例一中各實(shí)驗(yàn)組大鼠在dl8時(shí)進(jìn)行腹腔注射5mg/kg納洛酮催癮，觀察40 分鐘，記錄戒斷癥狀并評(píng)分(表2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示，嗎啡組與其他各組間差異顯著(P < 0. 05)，而生理鹽水組與各CTXl組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。該結(jié)果說(shuō)明CTXl不是以替代嗎啡類成癮藥品而發(fā)揮其戒毒的功效。表2納洛酮對(duì)模型組、CTXl各劑量組的催癮效應(yīng)(χ士 s，η = 8) ■ P < 0. 01, vs 0. 9% N. S control group ※卩^川丄…CTXl group < 0. 05 vs 0. 9% N. S control group andCTXlgroup實(shí)施例三CTX1處理對(duì)成癮大鼠體重的影響大鼠連續(xù)8天給予嗎啡進(jìn)行條件位置偏愛訓(xùn)練后，大鼠重量明顯比同樣方式處理 生理鹽水組增長(zhǎng)小，表明大鼠已對(duì)嗎啡形成依賴，影響了體重的增長(zhǎng)。成癮大鼠連續(xù)給予不 同劑量CTX18天后體重都有不同程度的增加(表3)，其中CTX10. 2mg/kg、CTX10. 4mg/kg劑
量組體重增長(zhǎng)比CTX10. lmg/kg顯著，分別達(dá)到132. 3士2. 0%及139. 2士3. 7%，較嗎啡組有 顯著差異(P < 0. 01)。結(jié)果表明CTX1能夠改善嗎啡依賴大鼠體重，改善其精神活動(dòng)和飲 食狀況且有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。表3CTX1對(duì)成癮大鼠體重的影響(％ ) (χ士s，η = 8)
權(quán)利要求
蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒素 CTX1在制備戒毒藥物中的應(yīng)用。
2.蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒素-CTXl在制備戒除嗎啡類毒品引起的毒癮的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了蛇毒來(lái)源的細(xì)胞毒素-CTX1在制備戒毒藥物中的應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，CTX1能較好的消除成癮大鼠對(duì)嗎啡的行為敏化，消除大鼠的渴藥行為和戒斷癥狀，具有良好的戒毒效果。并且能夠改善成癮大鼠的功能狀況和飲食和活動(dòng)、明顯增加體重從而恢復(fù)正常生理獲活動(dòng)。
文檔編號(hào)A61P25/36GK101926980SQ200910215378
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者仲維高, 信文君, 劉先國(guó), 唐婭, 孔天翰, 崔超偉, 崔躍, 董偉華, 黃紹 申請(qǐng)人:中山大學(xué)