專利名稱：一種蛇傷快速鑒別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛇傷鑒別方法，具體為一種利用包被有蛇毒特異性抗體的酶標(biāo)條快速鑒別蛇傷的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)蛇傷類型判斷是依靠蛇傷臨床癥狀分析來(lái)實(shí)現(xiàn)的，由于醫(yī)者經(jīng)驗(yàn)不足、臨床癥狀不明顯或已擴(kuò)散至無(wú)法判斷，就會(huì)導(dǎo)致誤判，耽誤蛇傷治療。為避免傳統(tǒng)蛇傷判定的缺陷，世界范圍內(nèi)已有一些國(guó)家開展以蛇毒特異性抗體來(lái)制備蛇傷快速診斷產(chǎn)品的研究， 相關(guān)診斷產(chǎn)品利用被蛇類咬傷患者的體液能在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地判定蛇傷類型，從而保障抗蛇毒血清的準(zhǔn)確使用。盡管有研究表明膠體金、乳膠凝集法等方法在技術(shù)上都能用于鑒別蛇毒，從而確定蛇傷類型，但鑒于成本高或者操作復(fù)雜等原因，至今尚未有產(chǎn)品得以實(shí)際應(yīng)用。酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)在蛇毒鑒別中運(yùn)用最為廣泛，其中澳大利亞已經(jīng)生產(chǎn)蛇傷快速診斷試劑盒用于臨床檢測(cè)，為蛇傷的快速判斷與治療作出了積極的貢獻(xiàn)。我國(guó)是蛇類資源大國(guó)，長(zhǎng)江以南地區(qū)普遍分布有各類毒蛇，在每年的活動(dòng)旺季，對(duì)當(dāng)?shù)氐娜祟惢顒?dòng)造成了嚴(yán)重的危害。但迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)蛇傷類型的判斷仍舊依靠其臨床癥狀表現(xiàn)，缺乏快速、 簡(jiǎn)單、有效的診斷方法用于臨床輔助判斷蛇傷。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述問題，本發(fā)明提供一種蛇傷快速鑒別的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行I.制備抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。選取所需鑒別的6種蛇毒，用20mM PBS溶解后， 離心取上清，并測(cè)定蛋白含量。皮下多點(diǎn)注射大鼠，制備6種多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀去除非蛋白組分，再通過(guò)Hitrap protein IgG柱純化,獲得6種抗蛇毒 IgG02.篩選蛇毒物種特異性IgG。將蛇毒偶聯(lián)至活化的CNBr-activated sepharose 4B親和介質(zhì)上，等量任取5種蛇毒偶聯(lián)后的濕潤(rùn)親和介質(zhì)共O. 3g混合后裝入離心濃縮管內(nèi)管。室溫下，500 μ g的每種蛇毒的抗血清IgG分別與其余種蛇毒偶聯(lián)的親和介質(zhì)在水平搖床溫和地混勻2小時(shí)。隨后離心，用離心濃縮管外管收集未結(jié)合組分的洗出液，即為該種蛇毒區(qū)別于其它5種蛇毒的物種特異性IgG。3.蛇毒特異性IgG生物素化。特異性抗體和生物素重量比I : 5混合后，室溫震蕩結(jié)合2小時(shí)，隨后透析去除未結(jié)合生物素，得到生物素化特異性IgG。4.檢測(cè)酶標(biāo)條制作。以8孔酶標(biāo)條為載體，配有一個(gè)“T”形支架。酶標(biāo)條上設(shè)置 6個(gè)樣品檢測(cè)孔，I個(gè)陽(yáng)性和I個(gè)陰性對(duì)照孔。各孔經(jīng)2%牛血清封閉，漂洗控干后在-20度保存。5.蛇傷快速鑒別。檢測(cè)時(shí)，采集蛇傷患者傷口部位流出液，滴加至各檢測(cè)孔，依次經(jīng)過(guò)生物素化特異性抗體、親和素化HRP的結(jié)合后，加入TMB顯色，根據(jù)檢測(cè)孔的陽(yáng)性或者陰性結(jié)果準(zhǔn)確判斷蛇傷類型。上述一種蛇傷快速鑒別方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)I.成本低。各種特異性抗體的篩選、測(cè)試條和測(cè)試過(guò)程輔助試劑的制備成本低，無(wú)需昂貴的耗材支撐。2.操作簡(jiǎn)單。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程所需組件簡(jiǎn)單、體積小，無(wú)需借助儀器，檢測(cè)人員無(wú)需豐富的臨床診斷經(jīng)驗(yàn)。3.檢測(cè)時(shí)間短。從低溫下取出測(cè)試條到顯色結(jié)束，用時(shí)40-45分鐘，在蛇傷發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)或患者運(yùn)送過(guò)程中就能完成。4.準(zhǔn)確性高。借助抗原抗體特異性結(jié)合原理，能有效保證待測(cè)樣品中蛇毒結(jié)合到特異性抗體上。借助生物素-親和素結(jié)合原理，能將最終顯色效果的信號(hào)較傳統(tǒng)的雙抗夾心法放大4倍，有效保證陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果能被肉眼準(zhǔn)確識(shí)別。本發(fā)明已列入杭州市屬高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科技創(chuàng)新項(xiàng)目(項(xiàng)目合同號(hào) 20080433T03)和浙江省科學(xué)技術(shù)廳重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目(項(xiàng)目合同號(hào)2009C13045)。


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具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.制備抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。選取所需鑒別的6種蛇毒(眼鏡蛇、銀環(huán)蛇、五步蛇、蝮蛇、竹葉青和烙鐵頭蛇毒)，用20mM PBS溶解后，離心取上清，并測(cè)定蛋白含量。皮下多點(diǎn)注射大鼠，制備6種多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀去除非蛋白組分，再通過(guò)Hitrap protein IgG柱純化,獲得6種抗蛇毒IgG。2.篩選蛇毒物種特異性IgG。將蛇毒偶聯(lián)至活化的CNBr-activated sepharose 4B親和介質(zhì)上，等量任取5種蛇毒偶聯(lián)后的濕潤(rùn)親和介質(zhì)共O. 3g混合后裝入離心濃縮管內(nèi)管。室溫下，500 μ g的每種蛇毒的抗血清IgG分別與其余種蛇毒偶聯(lián)的親和介質(zhì)在水平搖床溫和地混勻2小時(shí)。隨后離心，用離心濃縮管外管收集未結(jié)合組分的洗出液，即為該種蛇毒區(qū)別于其它5種蛇毒的物種特異性IgG。3.蛇毒特異性IgG生物素化。特異性抗體和生物素重量比I : 5混合后，室溫震蕩結(jié)合2小時(shí)，隨后透析去除未結(jié)合生物素，得到生物素化特異性IgG。4.檢測(cè)酶標(biāo)條制作。以8孔酶標(biāo)條為載體，配有一個(gè)“T”形支架。8個(gè)孔依次包被6種蛇毒特異性抗體混合液(I)、包被液(2)、銀環(huán)蛇毒特異性IgG(3)、眼鏡蛇毒特異性 IgG(4)、五步蛇毒特異性IgG(5)、短尾蝮蛇特異性IgG(6)、竹葉青蛇毒特異性抗體(7)和烙鐵頭蛇毒特異性抗體(8)，每孔的抗體加樣量為200ng，在37度結(jié)合2小時(shí)。各孔經(jīng)2%牛血清封閉，漂洗控干后在-20度保存。5.蛇傷快速鑒別。檢測(cè)時(shí)，取出測(cè)試條，室溫靜置5分鐘。在對(duì)照孔1、2中加入6 種蛇毒的混合液，在檢測(cè)孔3-8中均勻滴入蛇傷患者體液(傷口溢出液、血液或尿液)，室溫孵育10分鐘。倒去液體，用清水快速漂洗3次后控干。隨后在對(duì)照孔中加入6種蛇毒的生物素化特異性IgG混合液，在檢測(cè)孔中分別加入生物素化的銀環(huán)蛇毒特異性IgG、眼鏡蛇毒特異性IgG、五步蛇毒特異性IgG、蝮蛇毒特異性IgG、竹葉青蛇毒特異性IgG和烙鐵頭蛇毒特異性IgG，室溫孵育10分鐘。倒去液體，用清水快速漂洗3次后控干。加入親和素化的HRP，室溫孵育10分鐘。倒去液體，用清水快速漂洗3次。隨后加入TMB顯色液，室溫顯色5-10分鐘，判斷蛇傷類型。其中，如果僅有孔I顯色，則為無(wú)毒蛇咬傷(圖3);如果孔I、 3同時(shí)顯色，則為銀環(huán)蛇咬傷(圖4);如果孔1、4同時(shí)顯色，則為眼鏡蛇咬傷(圖5);如果孔1、5同時(shí)顯色，則為五步蛇咬傷(圖6);如果孔1、6同時(shí)顯色，則為短尾蝮咬傷(圖7); 如果孔1、7同時(shí)顯色，則為竹葉青咬傷(圖8);如果孔1、8同時(shí)顯色，則為烙鐵頭咬傷(圖 9);如果各孔均不顯色，則檢測(cè)條失效(見圖10)，應(yīng)更換新測(cè)試條后重新測(cè)試。
權(quán)利要求
1.一種蛇傷快速鑒別的方法，其特征步驟在于按如下步驟進(jìn)行(1)制備抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。選取所需鑒別的6種蛇毒(眼鏡蛇、銀環(huán)蛇、五步蛇、蝮蛇、竹葉青和烙鐵頭蛇毒)，皮下多點(diǎn)注射大鼠，制備6種多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀去除非蛋白組分，再通過(guò)Hitrap protein IgG柱純化,獲得抗蛇毒 IgG0(2)篩選蛇毒物種特異性IgG。將蛇毒偶聯(lián)至活化的CNBr-activatedsepharose 4B親和介質(zhì)上，等量任取5種蛇毒偶聯(lián)后的濕潤(rùn)親和介質(zhì)共O. 3g混合后裝入離心濃縮管內(nèi)管。 室溫下，500 μ g的每種蛇毒的抗血清IgG分別與其余種蛇毒偶聯(lián)的親和介質(zhì)在水平搖床溫和地混勻2小時(shí)。隨后離心，用離心濃縮管外管收集未結(jié)合組分的洗出液，即為該種蛇毒區(qū)別于其它5種蛇毒的物種特異性IgG。(3)蛇毒特異性IgG生物素化。特異性抗體和生物素重量比I: 5混合后，室溫震蕩結(jié)合2小時(shí)，隨后透析去除未結(jié)合生物素，得到生物素化特異性IgG。(4)檢測(cè)酶標(biāo)條制作。以8孔酶標(biāo)條為載體，配有一個(gè)“T”形支架。酶標(biāo)條上設(shè)置6個(gè)樣品檢測(cè)孔，I個(gè)陽(yáng)性和I個(gè)陰性對(duì)照孔。各孔經(jīng)2%牛血清封閉，漂洗控干后在-20度保存。(5)蛇傷快速鑒別。檢測(cè)時(shí)，采集蛇傷患者傷口部位流出液，滴加至各檢測(cè)孔，依次經(jīng)過(guò)生物素化特異性抗體、親和素化HRP的結(jié)合后，加入TMB顯色，根據(jù)檢測(cè)孔的陽(yáng)性或者陰性結(jié)果準(zhǔn)確判斷蛇傷類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種蛇傷快速鑒別的方法，其特征在于所述步驟(4)中的8孔分別包被6種蛇毒特異性抗體混合液(I)、包被液(2)、銀環(huán)蛇毒特異性IgG(3)、眼鏡蛇毒特異性IgG(4)、五步蛇毒特異性IgG(5)、短尾蝮蛇特異性IgG(6)、竹葉青蛇毒特異性抗體(7) 和烙鐵頭蛇毒特異性抗體(8)，每孔抗體量為200ng。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種蛇傷快速鑒別的方法，其特征在于所述步驟(4)中在酶標(biāo)孔中包被6種蛇毒特異性抗體混合液為陽(yáng)性對(duì)照(6)，在酶標(biāo)孔中加入包被液為陰性對(duì)照(5)。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種用酶標(biāo)條為載體的蛇傷快速鑒別方法，即以蛇毒物種特異性抗體包被酶標(biāo)孔，將采集的蛇傷患者血清滴至孔內(nèi)，能在短時(shí)間內(nèi)判斷出蛇傷類型。本方法中各種特異性抗體的篩選、酶標(biāo)條和測(cè)試過(guò)程輔助試劑的制備成本低；檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)需借助儀器，檢測(cè)人員無(wú)需豐富的臨床診斷經(jīng)驗(yàn)；檢測(cè)時(shí)間短，從低溫下取出酶標(biāo)條到結(jié)果顯色約40-45分鐘；準(zhǔn)確性高，AB-雙抗夾心法能有效保證蛇毒與特異性抗體結(jié)合，生物素-親和素有效放大信號(hào)，肉眼能直接觀測(cè)顯色結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102590496SQ20121003275
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者屈彥福, 王金, 計(jì)翔, 馬小梅, 高建芳 申請(qǐng)人:屈彥福, 王金, 計(jì)翔, 馬小梅, 高建芳