專利名稱：微波促進(jìn)固相合成苦瓜mc-jj6221多肽類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MC-JJ6221多肽類似物及其微波促進(jìn)固相合成方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是當(dāng)今危害人類健康的重要疾病，目前全世界約有5%-7%的人受糖尿病困擾，被認(rèn)為是繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后，導(dǎo)致人類傷殘、死亡的第三大殺手。
糖尿病分為I型和II型，I型糖尿病是一種自身免疫疾病，患者的存活需要注射胰島素。11型糖尿病占眾多糖尿病患者總數(shù)的95%左右。II型糖尿病的原因是胰島細(xì)胞代謝發(fā)生障礙，胰島素分泌不足，或者產(chǎn)生胰島素抵抗，是以胰島素抵抗為主伴胰島素分泌相對不足，或者以胰島素分泌相對不足為主伴胰島素抵抗導(dǎo)致的代謝性疾病。胰島素分泌不足，或者產(chǎn)生胰島素抵抗都可造成血液中葡萄糖過量，當(dāng)血糖含量超過腎閾時(shí)，葡萄糖就轉(zhuǎn)移到尿中排出，從而產(chǎn)生葡萄糖尿。 目前臨床應(yīng)用的幾種藥物均不能夠治愈糖尿病，主要是通過不同的作用機(jī)制，降低患者的血糖水平。糖尿病患者必須終生服藥，藥物本身對人體的毒副作用同樣威脅著糖尿病人的健康。在中國，目前使用藥物能夠控制血糖達(dá)到正常標(biāo)準(zhǔn)的，還不到糖尿病患者總數(shù)的20%(鄒大進(jìn)，2型糖尿病的禍?zhǔn)?-胰島素抵抗，大眾醫(yī)學(xué)，2002， (6):17)，直接導(dǎo)致了許多糖尿病患者的并發(fā)癥發(fā)生早，進(jìn)展快。顯然，除了篩選更加安全有效的新型藥物之外，尋找其它的輔助治療手段有效控制血糖水平，對于提高糖尿病人的健康水平同樣是十分重要的。 苦瓜(Momordica charantia)是一種人類有長期安全食用歷史的蔬菜。近二十年來，人們在苦瓜的果實(shí)中發(fā)現(xiàn)了許多具有降血糖活性的成分， 一些苦瓜果實(shí)的提取物，或者直接用苦瓜果實(shí)干燥后制成的茶飲料，已經(jīng)推薦給糖尿病人使用，某些苦瓜成分已經(jīng)被申請作為治療糖尿病藥物的專利。但是，從科技文獻(xiàn)中介紹以及已有的專利或產(chǎn)品，主要是基于對苦瓜諸多降血糖活性成分中對某個(gè)已知成分的認(rèn)識，并沒有意識到，苦瓜中具有降血糖活性的成分已知的就有多種，并且化學(xué)性質(zhì)各不相同，此外，苦瓜中還有某些具有降血糖的活性成分是未知的。所以，已有的文獻(xiàn)、專利或產(chǎn)品，其局限性也是明顯的。 美國專利(US 6391854B1)和中國專利(CN 98805001，苦瓜中的口服活性成分，其活性肽，及它們治療糖尿病的用途； <申請人>美國卡里克斯治療公司提供了苦瓜的一種水溶性提取物稱為MC6， MC6的特征中它含有三種肽，它的制備方法的特征是離心澄清的苦瓜汁依次通過30kDal， 10kDal及3kDal的超濾膜。MC6分子量小于10kDal，能夠通過10kDal超濾膜，而為3kDal濾膜截留。有活性的MC6的特征是在SDS-PAGE凝膠電泳上以單一條帶形式遷移，分子量小于10kDal，包含三種肽。同時(shí)提供的還有MC6的肽成分，稱為MC6.1，以及MC6.1的衍生物和模擬物?；钚訫C6， MC6.1， MC6.2，MC6.3有降血糖作用，尤其是糖尿病，其中優(yōu)選口服給予這些活性藥物。在這一專利中，所利用的苦瓜降血糖活口服給藥后也有這種活性。同時(shí)提供的還有利用這些活性藥
6物治療高血糖疾病的方法性成分僅僅是夠透過超濾膜的水溶性蛋白(多肽)。專利申請者 描述，MC6沒有提高模型動(dòng)物血漿中胰島素水平的活性。 —?jiǎng)t國際專利申請(PCT/IN99/00052 1999.9.28)的發(fā)明，提供了一種高效降血糖 多肽-k，它提取自苦瓜。專利申請者介紹的多肽-k制備方法是用非極性溶劑處理苦瓜 種子(或果實(shí))，去除不需要的油脂、黃酮類和皂苷配基，然后用含水80%的丙酮提取殘 留物中的蛋白質(zhì)，最后選擇性地結(jié)晶分離出多肽-k。申請者描述，多肽-k不溶于水，其 降血糖的作用機(jī)理是激活血液中無活性的胰島素。 很明顯，MC6與多肽-k都是苦瓜中具有降血糖活性的蛋白質(zhì)，但是，MC6溶 于水，而多肽-k不溶于水，按照MC6的制備方法，則損失了苦瓜中的多肽-k;而按照多 肽-k的制備方法，同樣損失了苦瓜中的MC6。 還有一些中國專利公開了從苦瓜中提取降糖物質(zhì)或制成中藥的內(nèi)容
1、 <申請?zhí)?gt;99115925<發(fā)明名稱>一種苦瓜降糖膠囊及其制備工藝，該發(fā)明 是以新鮮苦瓜為原料，經(jīng)清洗冷凍，低溫制漿，壓濾，將濾渣經(jīng)烘干過IOO目篩，制成 苦瓜渣粉；濾液澄清再過濾，經(jīng)酸性(pH3.0)乙醇在15t:條件下攪拌3小時(shí)，靜置沉淀 12小時(shí)，過濾后將沉淀物經(jīng)低溫干燥，過100目篩，制成苦瓜蛋白；過濾液經(jīng)6(TC真空 濃縮，加2倍水溶解，加2倍乙醚脫脂，5(TC真空濃縮回收乙醚，6(TC真空回收乙醇制成 粗苦瓜總皂苷，再經(jīng)無水丙酮在4t:條件下沉淀洗滌數(shù)次，3(TC以下真空濃縮制成苦瓜總 皂苷，最后將總皂苷，苦瓜蛋白粉和苦瓜渣按IO : 2 : 88重量比經(jīng)混勻，裝入膠囊制成 苦瓜降糖膠囊。具有原料來源廣泛，工藝簡單，服用方便，價(jià)格便宜，無毒副作用的優(yōu) 點(diǎn)，可做為治療糖尿病的輔助制劑。 2、 <申請?zhí)?gt;98110802<授權(quán)公告日>2001年08月15日 <發(fā)明名稱>天然苦 瓜素降糖藥及其制備方法，發(fā)明公開了一種天然苦瓜素降糖藥的制作方法，包括下述步 驟a.將成熟苦瓜切成片，并進(jìn)行干燥處理；b.把干燥的苦瓜片浸泡于水中，并提取浸 液；C.把苦瓜浸液濃縮成濃縮液；d.將濃縮液進(jìn)行生物酶解，得高活性降解液；e.把降 解液進(jìn)行恒溫干燥噴粉制粒；f.將顆粒裝入膠囊成藥；該方法工藝設(shè)備簡單，符合大規(guī) 模生產(chǎn)要求，產(chǎn)品得率高，治療效果好，無毒副作用。 3、 <申請?zhí)?gt;95103732<發(fā)明名稱>治療糖尿病的中藥及其生產(chǎn)方法，該發(fā)明是 一種治療糖尿病的中藥，該中藥的主要成分是動(dòng)物胰臟、苦瓜、南瓜、黃芪，山藥，生 產(chǎn)方法是動(dòng)物胰臟粉碎千燥，與用水提法或醇析法得到的苦瓜、南瓜、黃芪提取物混合 再加入山藥粉得到，該藥物具有益氣生津，健脾潤燥，滋陰降火功率效，并有提高機(jī)體 免疫功能，促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖作用。 4、〈申請?zhí)枴?3119351.6〈發(fā)明名稱〉植物降血糖活性蛋白新組份PA及其制備， 該發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。從植物材料苦瓜中提取降血糖活性蛋白新組分PA，制備工藝 中材料凈化處理-低溫冰凍-破碎-酸醇浸漬-高速勻漿-酸醇提取-抽濾-離心凈化-沉 淀-重新溶解-Sephadex凝膠過柱-紫外檢測分部收集-濃縮-干燥的苦瓜降血糖活性蛋白 新組份PA的制備方法，其特點(diǎn)是采用了等電點(diǎn)沉淀和凝膠過柱、紫外檢測分部收集的方 法。發(fā)明人認(rèn)為該物質(zhì)具有分離提取簡便、消耗有機(jī)溶劑少、得率高等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)動(dòng)物試 驗(yàn)證明降血糖效果明顯。 5、 <申請?zhí)?gt;02102754<發(fā)明名稱>一種快速高效提取植物類胰島素的方法，苦瓜種子含有較豐富的植物類胰島素，是目前治療糖尿病的一種有效成分。發(fā)明技術(shù)特征 是苦瓜種子脫殼，種仁粉碎過60或100目篩，然后采用酸性乙醇進(jìn)行萃取，離心取上 清液，加入NaCl占體積3 % 5 % ，用1 5Mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液至pH值7.0 ± 7.5溶液變 渾濁、離心、去上液，用丙酮洗滌沉淀部分三次，真空干燥，得到植物類胰島素粗品。 用0.1MTris.cl溶液(pH7.5)溶解進(jìn)行凝膠親和層析，收集洗脫峰溶液，用丙酮或乙醇濃縮 真空干燥得到植物類胰島素精品。該方法可以提取制備高純度的植物類胰島素成分，可 用于糖尿病的治療。 6、 <申請?zhí)?gt;98102198.0<發(fā)明名稱>一種苦瓜含片及其制備方法，該發(fā)明為一 種苦瓜含片及其制備方法。本苦瓜含片主要含有苦瓜粉、糊精、檸檬酸和甘露醇等，制 備時(shí)，先將鮮苦瓜經(jīng)榨汁、過濾、冷凍干燥制得苦瓜凍干粉，再與其它成分進(jìn)行混合， 并壓制成片。采用本發(fā)明的制備方法科學(xué)合理，充分保留了苦瓜中的多種營養(yǎng)成分，所 制含片常溫下不失苦瓜的活性，具有清熱解毒、寬胸利氣、生津止渴、降低血糖、提高 免疫力、抑制癌細(xì)胞等功效，是日常生活，特別是在災(zāi)區(qū)救援、軍事行動(dòng)、以及旅游、 探險(xiǎn)活動(dòng)中，可迅速補(bǔ)充體力，提高免疫力的方便必需品。主權(quán)項(xiàng)(A61K35/78)要求是 一種苦瓜含片，其特征是含有苦瓜粉、糊精、甘露醇、香料、色素及硬脂酸鎂。
已有的研究表明，苦瓜中除蛋白質(zhì)之外，皂苷也是一種極為有效的降血糖活性 的成分。 —些科技文獻(xiàn)報(bào)道，苦瓜皂苷為四環(huán)三菇類化合物，有多個(gè)不同成分，均難 溶于水，可用乙醇從干燥的苦瓜果實(shí)中提取出(常鳳崗苦瓜化學(xué)成分研究，中草藥， 1995， 26(10)507-510)?？喙显碥詹⒉挥绊懯茉噭?dòng)物模型血漿中胰島素含量，主要是促進(jìn) 增加肌糖原和肝糖原的合成(王先遠(yuǎn)，金宏，許志勤等苦瓜皂苷降血糖作用及機(jī)制初 探，氨基酸和生物資源，2001， 23(3): 42-45)，因而具有顯著的降血糖作用(孫淑卿，苦 瓜的藥理和臨床研究概況，中藥材，1997， (8): 428-429)，動(dòng)物試驗(yàn)證明，其血糖降低 幅度甚至優(yōu)于"優(yōu)降糖"(孫寶瑩等，苦瓜皂苷的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，河南中醫(yī)藥學(xué)刊， 1994， 9(6) : 19—21)。 水溶多肽MC6、水不溶的多肽-k及苦瓜皂苷，由于它們化學(xué)性質(zhì)的差異，因而 屬于彼此不同的物質(zhì)。 并且，苦瓜降血糖活性成分并不僅僅是已知的皂苷和蛋白質(zhì)。
從新鮮苦瓜的水煮液中分離出了可溶于乙醚和不溶于乙醚的兩個(gè)未知的成分， 已經(jīng)鑒定不為皂苷、黃酮和生物堿，這兩種成分都表現(xiàn)出明顯的降血糖活性(王勇慶苦 瓜降血糖作用研究，湖南中醫(yī)藥雜志，1998， (C6): 51-52)。由此證明，苦瓜中降血糖成 分除皂苷和植物蛋白之外，還有其它的降糖活性化合物。 將苦瓜的幾種不同方法提取物對四氧嘧啶誘導(dǎo)的化學(xué)性糖尿病模型小鼠的降糖 效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，苦瓜的未被加熱的直接壓榨的果汁較其它方法提取的有效部 位的降血糖效果更好，并推斷其降血糖活性物可能為水溶性的受熱易被破壞的成分(范 玉玲；崔福德，苦瓜有效部位降糖活性的比較研究，沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)2001， 18(1): 50-52)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，鮮苦瓜汁能使能使四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠已經(jīng)受損傷的胰 島P細(xì)胞得到修復(fù)，并再生出新的13細(xì)胞，提高了血漿中的胰島素含量(Ahmed， I.，Adeghate， E， Sharma， A.K.， Pallot， D丄et al.Effects of Momordica charantia fruit juice on islet morphology in the pancreas of the streptozotocin-diabetic rat.Diabetes research and clinical practice. 1998， 40， 145-151)。 體內(nèi)和離體的進(jìn)一步研究表明，鮮苦瓜汁的這種作用機(jī)理 是減輕了糖尿病小鼠的胰腺，RIN細(xì)胞及胰島的脂質(zhì)過氧化，并降低了RIN細(xì)胞中四氧 嘧啶誘導(dǎo)的apoptosis，從而對RIN細(xì)胞，胰島及胰腺13細(xì)胞的起保護(hù)作用(Sitasawad， S丄.，Shewade.Ye， Bhonde， Ro， Role of bittergourd fruit juice in stz-induced diabetic state in vivo and in vitro.Journal of Ethno-pharmacology， 2000， 73(1): 71-79)。而在苦瓜的已知 降糖活性化合物中，尚未能確定具有這種修復(fù)或再生胰島細(xì)胞，提高胰島素水平的生物 活性。 由上述事實(shí)可知，苦瓜的降血糖功能活性物，有已知的，也還有屬于未知的， 苦瓜的降血糖功能，實(shí)際是其中所含的多種具有降血糖活性的成分協(xié)同作用的結(jié)果。就 已知的活性成分而言，因其化學(xué)性質(zhì)不同，很難用一種溶劑將它們同時(shí)提取出來。此 外，在苦瓜的降血糖活性物中，包含有不耐熱的成分，其提取的過程不應(yīng)當(dāng)受熱。
用磨漿的辦法將新鮮的苦瓜果肉組織細(xì)胞充分破碎，細(xì)胞的所有內(nèi)含物，包括 溶于水與難溶于水的降血糖活性成分，都將被釋放到果漿中。將果漿中的粗纖維(來自 于果肉細(xì)胞壁)濾去，然后冷凍干燥，這種苦瓜汁的凍干制品無疑包含了比較全面的降 血糖活性成分。但是，苦瓜汁中降血糖活性物的含量其實(shí)很低，直接凍干成本昂貴，另 一方面，苦瓜汁中存在的糖類物質(zhì)極易潮解，使這種凍干制品根本無法在正常條件下分 裝、貯藏和使用。加入大量的干燥助劑或防潮劑雖然可以解決苦瓜汁的凍干制品的潮解 問題，但將無法制得高含量的苦瓜降血糖制品。 綜上所述，文獻(xiàn)和專利公開的苦瓜有效成分的制備，基本上是采用物理法和化 學(xué)法提取某個(gè)或若干個(gè)明確的化學(xué)成分為主，或者是苦瓜在加熱條件下的某種溶媒(如 水，乙醇或其混合物)的總提取物，它們或者未提及如何利用苦瓜中那些化學(xué)性質(zhì)未知的 降血糖活性成分，或者未明確苦瓜中某些熱敏性降血糖活性物的受熱破壞問題。
99115925號中國發(fā)明專利， 一種苦瓜降糖膠囊及其制備工藝提出了苦瓜蛋白與 苦瓜皂苷的利用，但在制備過程使用了乙醇，丙酮，乙醚等有機(jī)溶劑。98110802號專 利，天然苦瓜素降糖藥及其制備方法中提到將苦瓜濃縮液進(jìn)行生物酶解，得高活性降解 液，但未提及生物酶解中采用的是什么酶。98102198.0號專利， 一種苦瓜含片及其制備 方法中使用的是冷凍干燥苦瓜汁工藝，但它沒有考慮去除苦瓜中已知的不具有降血糖活 性的成分的問題。 基于上述原因，開發(fā)一套能全面利用苦瓜中理化性質(zhì)不同的各類降血糖活性 物，并且活性成分含量高，所以對于充分而合理地利用并開發(fā)苦瓜資源，也是十分必要 的。 多肽可以通過基因工程的方法或者化學(xué)合成的方法得到。基因工程的方法在獲 取長肽(氨基酸殘基長度大于50)或蛋白質(zhì)上比化學(xué)方法有優(yōu)勢，但是多肽的化學(xué)合成方 法尤其是在固相合成策略出現(xiàn)后，在制備氨基酸殘基長度小于40的多肽或小肽上有基因 工程方法難以比擬的靈活性、多樣性和高效性等。1963年Merrifield創(chuàng)立并開發(fā)了固相 合成多肽的方法。固相多肽合成一般有兩種策略即Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略和 Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，Merrifield創(chuàng)立的固相合成法即為Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略。但是，Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略中存在一些缺點(diǎn)，如副反應(yīng)多、條 件苛刻以及在延長肽鏈的過程中多肽鏈會從固相上丟失等。而隨后出現(xiàn)的Fmoc/tBu正 交保護(hù)固相合成策略則反應(yīng)條件溫和的多。當(dāng)近年來微波技術(shù)運(yùn)用于多肽的固相合成中 后，使多肽的合成技術(shù)產(chǎn)生了一個(gè)飛躍。微波促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)是由于其使極性分子在微波 場中快速旋轉(zhuǎn)，使得一些反應(yīng)速率較常規(guī)加熱方法快10到1000倍，而且產(chǎn)率大大提高。 1986年Gedye等人首次報(bào)道了將微波應(yīng)用于有機(jī)合成中，微波可以促進(jìn)許多化學(xué)反應(yīng)， 如Diels-Alder反應(yīng)，皂化反應(yīng)等，可以顯著地加快反應(yīng)速率并提高收率。在1992年， Hui-mingYu等首先報(bào)道了將微波應(yīng)用于多肽固相合成領(lǐng)域中，他們完成了?；d體蛋白 片斷十肽(acyl carrier protein, ACP 65 74)的合成。 如何高效的合成長肽(大于20肽)在世界上仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槎嚯碾S著肽 鏈的增加，其合成難度成倍增加。用傳統(tǒng)的固相方法合成長肽，其收率往往很低雜質(zhì)較 多純化困難，從而從實(shí)用的角度上說失去了合成的意義。其次合成周期長，在中間不出 現(xiàn)困難肽序的情況下30肽一般需要近一個(gè)星期時(shí)間才能完成合成周期，如果出現(xiàn)困難 肽序，往往就無法合成得到目標(biāo)多肽。而使用微波促進(jìn)固相合成多肽，可以克服困難肽 序，合成傳統(tǒng)固相方法無法得到的多肽，而且合成時(shí)間大大縮短，且顯著提高多肽粗品 純度及收率，使得產(chǎn)品的純化大大方便，只要經(jīng)過一次制備型HPLC就能得到純度較高 的產(chǎn)品；此外還可以非常方便的用D型氨基酸及非天然氨基酸等對多肽進(jìn)行定點(diǎn)修飾， 去尋找活性更高、生物半衰期更長的多肽，這更是基因工程技術(shù)無法做到的。因此， 我們在苦瓜降血糖(MC-JJ6221)多肽類似物的合成中采用此種方法快速高效的合成得到 MC-JJ6221系列類似物。 多肽可以通過基因工程的方法或者化學(xué)合成的方法得到?；蚬こ痰姆椒ㄔ讷@ 取長肽(氨基酸殘基長度大于50)或蛋白質(zhì)上比化學(xué)方法有優(yōu)勢，但是多肽的化學(xué)合成方 法尤其是在固相合成策略出現(xiàn)后，在制備氨基酸殘基長度小于40的多肽或小肽上有基因 工程方法難以比擬的靈活性、多樣性和高效性等。1963年Merrifield創(chuàng)立并開發(fā)了固相 合成多肽的方法。固相多肽合成一般有兩種策略即Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略和 Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，Merrifield創(chuàng)立的固相合成法即為Boc/Bzl正交保護(hù)固 相合成策略。但是，Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略中存在一些缺點(diǎn)，如副反應(yīng)多、條 件苛刻以及在延長肽鏈的過程中多肽鏈會從固相上丟失等。而隨后出現(xiàn)的Fmoc/tBu正 交保護(hù)固相合成策略則反應(yīng)條件溫和的多。當(dāng)近年來微波技術(shù)運(yùn)用于多肽的固相合成中 后，使多肽的合成技術(shù)產(chǎn)生了一個(gè)飛躍。微波促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)是由于其使極性分子在微波 場中快速旋轉(zhuǎn)，使得一些反應(yīng)速率較常規(guī)加熱方法快10到1000倍，而且產(chǎn)率大大提高。 1986年Gedye等人首次報(bào)道了將微波應(yīng)用于有機(jī)合成中，微波可以促進(jìn)許多化學(xué)反應(yīng)， 如Diels-Alder反應(yīng)，皂化反應(yīng)等，可以顯著地加快反應(yīng)速率并提高收率。在1992年， Hui-mingYu等首先報(bào)道了將微波應(yīng)用于多肽固相合成領(lǐng)域中，他們完成了?；d體蛋白 片斷十肽(acyl carrier protein, ACP 65 74)的合成。 如何高效的合成長肽(大于30肽)在世界上仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槎嚯碾S著肽 鏈的增加，其合成難度成倍增加。用傳統(tǒng)的固相方法合成長肽，其收率往往很低雜質(zhì)較 多純化困難，從而從實(shí)用的角度上說失去了合成的意義。其次合成周期長，在中間不出 現(xiàn)困難肽序的情況下30肽一般需要近一個(gè)星期時(shí)間才能完成合成周期，如果出現(xiàn)困難肽序，往往就無法合成得到目標(biāo)多肽。而使用微波促進(jìn)固相合成多肽，可以克服困難肽 序，合成傳統(tǒng)固相方法無法得到的多肽，而且合成時(shí)間大大縮短，且顯著提高多肽粗品 純度及收率，使得產(chǎn)品的純化大大方便，只要經(jīng)過一次制備型HPLC就能得到純度較高 的產(chǎn)品；此外還可以非常方便的用D型氨基酸及非天然氨基酸等對多肽進(jìn)行定點(diǎn)修飾， 去尋找活性更高、生物半衰期更長的多肽，這更是基因工程技術(shù)無法做到的。因此， 我們在苦瓜降血糖(MC-JJ6221)多肽類似物的合成中采用此種方法快速高效的合成得到 MC-JJ6221系列類似物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明有兩個(gè)目的第一個(gè)母的是從具降血糖活性的藥食同源植物苦瓜中得到多 肽進(jìn)行修飾得到降血糖活性更高的MC-JJ6221多肽類似物。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了 MC-JJ6221衍生物的固相制備方法，本發(fā)明采用 微波促進(jìn)Fmoc旭u正交保護(hù)固相合成策略高效快速地合成得到系列MC-JJ6221類似物。
其特征在于采用微波促進(jìn)Fmoc旭u正交保護(hù)固相合成策略，于固相載體上先 合成得到載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂，茚三酮法檢測為陰性后脫去Fmoc保護(hù)基 得到載有第一個(gè)氨基酸殘基的樹脂；再進(jìn)入下一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的 保護(hù)氨基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護(hù)的步驟，依次延長所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng) 多肽的樹脂，最后用裂解劑將多肽從樹脂上切割下來得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級高效 液相色譜純化，凍干得多肽純品。 載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂的制備方法，其特征是通過在微波照射條件 下Fmoc保護(hù)氨基酸先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入1-羥基-苯并 三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有機(jī)堿中和反應(yīng)的酸性。載有第一個(gè)Fmoc 保護(hù)氨基酸的樹脂所使用的固相載體是Rink樹脂、Wang樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂。 活化劑是二環(huán)己基碳二亞胺(DCQ、 N， N' -二異丙基碳二亞胺(DIC)、 N， N〃 -羰基 二咪唑(CDI)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、 2-(7-偶氮苯并 三氮唑)-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N， N， N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或使用的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥 基琥珀酰亞胺(HOSU)、 l-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羥基-l， 2， 3-苯并三 嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。有機(jī)堿為三乙胺(TEA)、 N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺 (DIEA);微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng)時(shí)間為5 15min。 Fmoc保護(hù)基的脫除是通過使用含有O.lmol丄-1的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT) 的六氫吡啶溶液在微波促進(jìn)下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲亞砜(DMSO)、或 N-甲基吡咯烷酮(NMP)為反應(yīng)溶劑。微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度 20 100°C，反應(yīng)時(shí)間為1 10min。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1.提出的一種MC-JJ6221類似物可以在保留降糖活性的基礎(chǔ)上，提高M(jìn)C-JJ6221 的穩(wěn)定性，延長作用時(shí)間。 2.微波促進(jìn)固相合成MC-JJ6221類似物大大的提高了偶合反應(yīng)速率，常規(guī)固相合成方法充分偶合一個(gè)氨基酸到樹脂上去，往往需要2小時(shí)到20小時(shí)不等，甚至更長。 而微波促進(jìn)則平均只需要10分鐘左右；常規(guī)固相合成方法脫Fmoc保護(hù)基，往往需要30 分鐘到l小時(shí)不等，而微波促進(jìn)則平均只需要5分鐘左右，這極大的提高了多肽合成的效 率，縮短了合成周期。 3.微波促進(jìn)固相合成MC-JJ6221類似物合成得到的粗品的純度大于80%，較常 規(guī)固相合成方法大大提高，這方便了后續(xù)的純化工作，只需要經(jīng)過一次制備液相純化， 凍干即可得到目標(biāo)純品。 4.微波促進(jìn)固相方法合成MC-JJ6221類似物，其成本低，由于偶合效率較高， 所需要保護(hù)氨基酸平均只需要2倍過量，較常規(guī)固相合成方法需要4到5倍過量大為降 低。 5.微波促進(jìn)固相合成MC-JJ6221類似物方法易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、大規(guī)?；?，這使
其更適合工業(yè)化生產(chǎn)。 因此用本發(fā)明提供的微波促進(jìn)固相合成技術(shù)制備的MC-JJ6221類似物，收率 高、合成周期短、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動(dòng)化生產(chǎn)。制備得到的 MC-JJ6221類似物，比天然MC-JJ6221更加穩(wěn)定，適合作為治療糖尿病藥物的活性成分。
具體實(shí)施例方式在本說明書全文中采用以下縮寫 Et3N :三乙胺；NMM : N-甲基嗎啉；DIEA : N， N' - 二異丙基乙胺； DMF: 二甲基甲酰胺；DM SO: 二甲亞砜；DCM: 二氯甲烷；Fm0C : N-9荷甲氧羰 基；DIC : N， N， - 二異丙基碳二亞胺；CDI : N， N，-羰基二咪唑；DMAP : 4- 二甲 氨基吡啶；HOSU : N-羥基琥珀酰亞胺；EDC.HC1 : 1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二
亞胺鹽酸鹽；HATU: 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯； HBTU:苯并三氮唑-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU: 6-氯苯并三氮 唑-l， 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT: l-羥基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT: 1-羥基-苯并三氮唑；PyBOP :六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC : 高效液相色譜；ESI-MS:電噴霧質(zhì)譜；Gly :甘氨酸；Ser :絲氨酸；Ala:丙氨酸； Thr :蘇氨酸；Val :纈氨酸；lie :異亮氨酸；Leu :亮氨酸；Tyr :酪氨酸；Phe :苯
丙氨酸；His:組氨酸；Pro:脯氨酸；Asp:天門冬氨酸；Met:蛋氨酸；Ghl :谷氨
酸；Trp :色氨酸；Lys :賴氨酸；Arg :精氨酸。Asn :天冬酰胺；Gin :谷氨酰胺。
本發(fā)明是通過下列實(shí)施列來進(jìn)行說明的，但這些實(shí)施例不做任何限制本發(fā)明的 解釋。 實(shí)施例1 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 2)的微波促進(jìn)固相合成 [OO49](1)樹脂的溶脹 稱取Fmoc-rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，經(jīng)7mL DCM溶脹 30min，抽濾去DCM，再用10mL NMP溶脹30min，最后分別用NMP， DCM， NMP 7mL
沖洗干凈。[OO51 ] (2)微波促進(jìn)Fmoc保護(hù)基的脫除 將溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0.1M HOBT的25 %哌啶/NMP(V/V) 溶液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)lmin，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在5(TC以內(nèi)，使用空 氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25%哌啶/ NMP(V/V)溶液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在5(TC， 使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初 始連接的Fmoc保護(hù)基的樹脂。(3)微波促進(jìn)Fmoc-Ser-rink amide-MBHA Resin的合成將Fmoc-Ser-OH(0.04mmol)， HBTU(0.04mmo1)， HOBT(0.04mmo1)和 DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應(yīng)器中 反應(yīng)7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在5(TC，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反 應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹脂3次。
(4)偶合效率的檢測 用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入 下一個(gè)偶合循環(huán)。 茚三酮法取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙 醇、KCN吡啶溶液(2ml0.001MKCN稀釋于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴， 于10(TC加熱5分鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽性。溴酚蘭法取少量樹脂顆粒用二甲酰 乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴1%的溴酚藍(lán)二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分 鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽性。
(5)肽鏈的延長 按照AlarMC-JJ6221-(1 21)-NH2的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步驟 依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進(jìn)反應(yīng)時(shí)間5 20min不等。得到連有 Alai-MC-JJ6221-(l 21)-NH2的樹脂。 [OOSO] (6)樹脂上多肽的裂解 將上述得到的連有Alai-MC-JJ6221-(l 21)-NH2的樹脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂 解劑Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT， 82.5 :5:5:5: 2.5， V/V)10mL，先 在0t:下振搖30min，再在常溫下反應(yīng)3h。 反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌 三次，合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多 肽的粗品。最終得到Alai-MC-JJ6221-(l 21)-NH2粗品63.2mg，收率為94.3% 。
(7)Alai-MC-JJ6221-(l 21)-NH2粗品的純化 將上面得到的Alal-MC-JJ6221-(l 21)-NH2粗品，溶于少量的水中，用島津制備 型反相HPLC純化粗品。純化中采用C18反相制備柱(340mmX28mm， 5 y m);流動(dòng) 相A : 0.1 % TFA/水(V/V)，流動(dòng)相B : 0.1 % TFA/乙腈(V/V);流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B 20% 65%， 40min;流速為6mL/min ;檢測波長為214nm。 收集的溶液凍干得純品， 最終得到純品29.7mg。 理論相對分子質(zhì)量2174.572 ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 725.9， [M+4H]4+ 544.6， [M+5H]5+ 435.9 ; calu[M+3H]3+ 725.8， [M+4H]4+ 544.6， [M+5H]5+ 435.8 ; 根據(jù)實(shí)施例l所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實(shí)施例2 41的多肽，通過電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)確證各自的分子量。
實(shí)施例2 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 3);理論相對分子質(zhì)量2320.725.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 774.6， [M+4H]4+ 581.2， [M+5H]5+ 465.1 ; calu[M+3H]3+ 774.5， [M+4H]4+581.3， [M+5H]5+ 465.0 ;
實(shí)施例3 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 4);理論相對分子質(zhì)量2211.636.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 738.2， [M+4H]4+ 553.9， [M+5H]5+ 443.3 ; calu[M+3H]3+ 738.4， [M+4H]4+ 553.9， [M+5H]5+ 443.4 ; 實(shí)施例4 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Ala-Tyr-Ser-Ile-Lys-L ys-Ser(SEQ.ID NO : 5);理論相對分子質(zhì)量2185.6.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 729.5， [M+4H]4+ 547.4， [M+5H]5+438.1 ; calu[M+3H]3+ 729.6， [M+4H]4+ 547.5， [M+5H]5+ 438.0 ; 實(shí)施例5 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Ala-Ser-Ile-Lys-L ys-Ser(SEQ.ID NO : 6);理論相對分子質(zhì)量2185.6.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 729.5， [M+4H]4+ 547.4， [M+5H]5+438.1 ; calu[M+3H]3+ 729.3， [M+4H]4+ 547.4， [M+5H]5+ 438.0 ; 實(shí)施例6 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Ala-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 7);理論相對分子質(zhì)量2220.603.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 741.2， [M+4H]4+ 556.2， [M+5H]5+ 445.1 ; calu[M+3H]3+ 741.3， [M+4H]4+ 556.3， [M+5H]5+ 445.0 ; 實(shí)施例7 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Al a-Ser(SEQ.ID NO : 8);理論相對分子質(zhì)量2220.603.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 741.2， [M+4H]4+ 556.2， [M+5H]5+ 445.1 ; calu[M+3H]3+ 741.0， [M+4H]4+ 445.0， [M+5H]5+ 556.0 ; 實(shí)施例8 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 9);理論相對分子質(zhì)量2197.609.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 733.5， [M+4H]4+ 550.4， [M+5H]5+ 440.5 ; calu[M+3H]3+ 733.6， [M+4H]4+ 550.5， [M+5H]5+ 440.6 ; 實(shí)施例9 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Tyr-Ser-Ile-Ly s-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 10);理論相對分子質(zhì)量2171.573.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+724.9， [M+4H]4+ 543.9， [M+5H]5+435.3 ; calu[M+3H]3+ 724.8， [M+4H]4+ 543.8， [M+5H]5+
435.2 ; 實(shí)施例10 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Gly-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 11);理論相對分子質(zhì)量2171.573.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 724.9， [M+4H]4+ 543.9， [M+5H]5+ 435.3 ; calu[M+3H]3+ 724.8， [M+4H]4+ 543.8， [M+5H]5+ 435.5 ; 實(shí)施例11 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 12);理論相對分子質(zhì)量2206.576.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 736.5， [M+4H]4+ 552.6， [M+5H]5+ 442.3 ; calu[M+3H]3+ 736.6， [M+4H]4+ 552.6， [M+5H]5+
442.3 ; 實(shí)施例12 Lys-Thr-Ala-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Gl y-Ser(SEQ.ID NO : 13);理論相對分子質(zhì)量2206.576.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 736.5， [M+4H]4+ 552.6， [M+5H]5+ 442.3 ; calu[M+3H]3+ 736.5， [M+4H]4+ 552.5， [M+5H]5+ 442.3
實(shí)施例13 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 14);理論相對分子質(zhì)量2188.599.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 730.5， [M+4H]4+ 548.1， [M+5H]5+ 438.7 ; calu[M+3H]3+ 730.6， [M+4H]4+ 548.0， [M+5H]5+ 438.8 ; 實(shí)施例14Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Ala-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 15);理論相對分子質(zhì)量2162.563.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+721.9， [M+4H]4+ 541.6， [M+5H]5+ 433.5 ; calu[M+3H]3+ 721.8， [M+4H]4+ 541.6， [M+5H]5+ 433.5 ; 實(shí)施例15 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Ala-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 16);理論相對分子質(zhì)量2162.563.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+721.9， [M+4H]4+ 541.6， [M+5H]5+ 433.5 ; calu[M+3H]3+ 721.7， [M+4H]4+ 541.6， [M+5H]5+ 433.5 ; 實(shí)施例16 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Ala-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 17);理論相對分子質(zhì)量2197.566.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 733.5， [M+4H]4+ 550.4， [M+5H]5+ 440.5 ; calu[M+3H]3+ 733.5， [M+4H]4+ 550.4， [M+5H]5+ 440.5 ; 實(shí)施例17 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Al a-Ser(SEQ.ID NO : 18);理論相對分子質(zhì)量2197.566.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 733.5，
15[M+4H]4+ 550.4， [M+5H]b+ 440.5 ; calu[M+3H]針733.6， [M+4H]4+ 550.5， [M+5H]b+
440.6 ; 實(shí)施例18 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 19);理論相對分子質(zhì)量2174.572.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 725.9， [M+4H]4+ 544.6， [M+5H]5+ 435.9 ; calu[M+3H]3+ 725.8， [M+4H]4+ 544.6， [M+5H]5+ 435.8 ; 實(shí)施例19Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 20);理論相對分子質(zhì)量2148.536.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+717.1， [M+4H]4+ 538.1， [M+5H]5+ 430.7 ; calu[M+3H]3+717.0， [M+4H]4+ 538.8， [M+5H]5+ 430.8 ; 實(shí)施例20 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Gly-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 21);理論相對分子質(zhì)量2148.536.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+717.1， [M+4H]4+ 538.1， [M+5H]5+ 430.7 ; calu[M+3H]3+717.0， [M+4H]4+ 538.0， [M+5H]5+
430.7 ; 實(shí)施例21 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 22);理論相對分子質(zhì)量2183.539.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 728.8， [M+4H]4+ 546.9， [M+5H]5+ 437.7 ; calu[M+3H]3+ 728.9， [M+4H]4+ 546.8， [M+5H]5+
437.8 ; 實(shí)施例22 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Gl y-Ser(SEQ.ID NO : 23);理論相對分子質(zhì)量2183.539.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 728.8， [M+4H]4+ 546.9， [M+5H]5+ 437.7 ; calu[M+3H]3+ 782.9， [M+4H]4+ 546.8， [M+5H]5+ 437.8 ; 實(shí)施例23 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 24);理論相對分子質(zhì)量2197.609.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 733.5， [M+4H]4+ 550.4， [M+5H]5+ 440.5 ; calu[M+3H]3+ 733.5， [M+4H]4+ 550.4， [M+5H]5+ 440.5 ; 實(shí)施例24 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Ala-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 25);理論相對分子質(zhì)量2171.573.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 724.9， [M+4H]4+ 543.9， [M+5H]5+ 435.3 ; calu[M+3H]3+ 724.8， [M+4H]4+ 543.8， [M+5H]5+ 435.3 ; 實(shí)施例25 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Ala-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 26);理論相對分子質(zhì)量2171.573.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 724.9， [M+4H]4+ 543.9， [M+5H]5+ 435.3 ; calu[M+3H]3+ 724.8， [M+4H]4+ 543.9， [M+5H]5+ 435.3 ; 實(shí)施例26 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Ala-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 27);理論相對分子質(zhì)量2206.576.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 736.5， [M+4H]4+ 552.6， [M+5H]5+ 442.3 ; calu[M+3H]3+ 736.5， [M+4H]4+ 552.6， [M+5H]5+ 442.3 ; 實(shí)施例27 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Al a-Ser(SEQ.ID NO : 28);理論相對分子質(zhì)量2206.576.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 736.5， [M+4H]4+ 552.6， [M+5H]5+ 442.3 ; calu[M+3H]3+ 736.5， [M+4H]4+ 552.6， [M+5H]5+ 442.3 ; 實(shí)施例28 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 29);理論相對分子質(zhì)量2183.582.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 728.9， [M+4H]4+ 546.9， [M+5H]5+ 437.7 ; calu[M+3H]3+ 728.8， [M+4H]4+ 546.8， [M+5H]5+ 437.8 ; 實(shí)施例29 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 30);理論相對分子質(zhì)量2157.546.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 720.2， [M+4H]4+ 540.4， [M+5H]5+ 432.5 ; calu[M+3H]3+ 720.0， [M+4H]4+ 540.4， [M+5H]5+ 432.6 ;
實(shí)施例30 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Gly-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 31);理論相對分子質(zhì)量2157.546.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 720.2， [M+4H]4+ 540.4， [M+5H]5+ 432.5 ; calu[M+3H]3+ 720.4， [M+4H]4+ 540.6， [M+5H]5+ 432.6 ; 實(shí)施例31 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 32);理論相對分子質(zhì)量2192.549.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+731.8， [M+4H]4+ 549.1， [M+5H]5+ 439.5 ; calu[M+3H]3+731.9， [M+4H]4+ 549.0， [M+5H]5+ 439.6 ; 實(shí)施例32 Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Gl y-Ser(SEQ.ID NO : 33);理論相對分子質(zhì)量2192.549.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+731.8， [M+4H]4+ 549.1， [M+5H]5+ 439.5 ; calu[M+3H]3+731.8， [M+4H]4+ 549.0， [M+5H]5+ 439.6 ; 實(shí)施例33
Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Ala-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 34);理論相對分子質(zhì)量2148.536.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+717.1， [M+4H]4+ 538.1， [M+5H]5+ 430.7 ; calu[M+3H]3+717.1， [M+4H]4+ 538.0， [M+5H]5+ 430.8 ; 實(shí)施例34 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Ala-Ser-Ile-Lys-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 35);理論相對分子質(zhì)量2148.536.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+717.1， [M+4H]4+ 538.1， [M+5H]5+ 430.7 ; calu[M+3H]3+717.0， [M+4H]4+ 538.0， [M+5H]5+ 430.8 ; 實(shí)施例35 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Ala-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 36);理論相對分子質(zhì)量2183.539.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 728.8， [M+4H]4+ 546.9， [M+5H]5+ 437.7 ; calu[M+3H]3+ 728.9， [M+4H]4+ 546.8， [M+5H]5+ 437.8 ; 實(shí)施例36 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Al a-Ser(SEQ.ID NO : 37);理論相對分子質(zhì)量2183.539.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 728.8， [M+4H]4+ 546.9， [M+5H]5+ 437.7 ; calu[M+3H]3+ 728.9， [M+4H]4+ 546.9， [M+5H]5+ 437.8 ; 實(shí)施例37 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Ly s-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 38);理論相對分子質(zhì)量2160.545.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 721.2， [M+4H]4+541.1， [M+5H]5+ 433.1 ; calu[M+3H]3+721.0， [M+4H]4+541.0， [M+5H]5+ 433.0 ;
實(shí)施例38 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Tyr-Ser-Ile-Ly s-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 39);理論相對分子質(zhì)量2134.509.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 712.5， [M+4H]4+ 534.6， [M+5H]5+ 427.9 ; calu[M+3H]3+712.6， [M+4H]4+ 534.7， [M+5H]5+ 427.8 ;
實(shí)施例39 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Gly-Ser-Ile-Ly s-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 40);理論相對分子質(zhì)量2134.509.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 712.5， [M+4H]4+ 534.6， [M+5H]5+ 427.9 ; calu[M+3H]3+712.6， [M+4H]4+ 534.7， [M+5H]5+ 427.8 ;
實(shí)施例40 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ly s-Ser(SEQ.ID NO : 41);理論相對分子質(zhì)量2169.512.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 724.2， [M+4H]4+ 534.4， [M+5H]5+ 434.9 ; calu[M+3H]3+ 724.0， [M+4H]4+ 534.4， [M+5H]5+ 434.9 ;
實(shí)施例41 Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Gl y-Ser(SEQ.ID NO : 42);理論相對分子質(zhì)量2169.512.ESI-MSm/z : found[M+3H]3+ 724.2， [M+4H]4+ 543.4， [M+5H]5+ 434.9 ; calu[M+3H]3+ 724.0， [M+4H]4+ 534.4， [M+5H]5+ 434.9 ;
實(shí)施例42 MC-JJ6221及其類似物體內(nèi)降糖活性實(shí)驗(yàn) 取IO周齡雄性昆明小鼠(體重lS 22g)，隨機(jī)分組，每組6只。尾靜脈注射四
氧嘧啶給藥建模，給藥劑量為60mg/kg， 72小時(shí)后，小鼠禁食5 6小時(shí)測血糖挑選血糖值
范圍在13 23的小鼠隨機(jī)分組，每組6只。成模后的小鼠連續(xù)10d腹腔注射MC-JJ6221
多肽及其類似物。在0， 30， 60， 90， 120用血糖儀測定血糖值。 如表1所示，MC-JJ6221多肽及其類似物的降血糖活性強(qiáng)于二甲雙胍。 表1MC-JJ6221及其類似物降血糖的效應(yīng)
Omin30min60min90min120min
陰性空白4.60±2.384.68±2.364.62 ±1.944.46±2.024.12±1.64
陽性空白25.32±1.7722.78±2.2621.68±2.8219.16±1.0017.58±2.08
二甲雙胍23.15±11.4820.45±5.9718.03±6.24*16.01±3.84*14.23±5.77*
SEG.IDNO : 216.45±3.5314.58±2.36,13.36±5.65***11.47±3.46***9.44±5.69**
SEG.IDNO : 417.55±3.5716.36±6.13**15.36±5.79**14.64±8.58**13.36±4.53*
SEG.IDNO : 719.44± 11.5317.53±7.4615.47±6.53**13.34±4.52***12.43±2.49
SEG.IDNO : 821.53±0.4519.37±4.55*16.58±5.42**13.59±6.83***12.51±7.08
SEG.IDNO : 920.55±5.4618.46±1.84*17.35±4.17*16.18±7.45*12.51±5.06
SEG.IDNO : 1118.81±4.4316.28±4.42**16.44±0.67*11.67±4.89**
SEG.IDNO : 1317.45±7.3715.58±4.43**14.55±3.67,13.82±2.56**10.72±2.79***
SEQ.IDNO : 2220.93±3.7818.55±1.64*16.62±3.29*14.44±2.57**14.28±1.65*
SEQ.IDNO : 2622.48±1.6616.47±2.75**13.44±4.68***11.83±0.41***8.23±0.67***
SEQ.IDNO : 3117.69±0.4816.38±1.57**15.49±2.66*14.58±4.5713.66±3.74 n = 6， x±s.*P < 0.05， "P < 0.01， ***P < 0.001 vs saline 序列表 <110>中國藥科大學(xué) <120>微波促進(jìn)固相合成苦瓜MC-JJ6221多肽類似物及其應(yīng)用
19
<160>91<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是Asn，Ala，Gly或D-Ala<220><221>合成構(gòu)建體<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是Ala，Gly，His或D-Ala<220><221>合成構(gòu)建體<222>(13)..(13)<223>第13位的Xaa是Ala，Gly，His或D-Ala<220><221>合成構(gòu)建體<222>(15)..(15)<223>第15位的Xaa是Ala，Gly，Tyr或D-Ala<220><221>合成構(gòu)建體<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Ala，Gly，Tyr或D-Ala<220><221>合成構(gòu)建體<222>(19)..(19)<223>第19位的Xaa是Ala，Gly，Lys或D-Ala<220><221>合成構(gòu)建體<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Ala，Gly，Lys或D-Ala<400>1Lys Thr Xa^ Met Lys Xaaa Met Ala GlyAla Ala Gly Xaa3 Pro Xaa4 Xaa5 Ser lie Xaae Xaa7 Ser
1 5101520<210>2<211>90<212>PRT
<213>人工序列 <220> <221>合成構(gòu)建體 <222>(3)..(3) <223>第3位的Xaa是Asn <400>2 Lys Thr Asn Met Lys Gly Met Ala Gly Ala Ala Gly Ala Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Lys Ser15 10 15 20 <210>3 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>3 Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Lys Ser 1 5 10 15 20 <210>4 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>4 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly Ala Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Lys Ser 1 5 10 15 20 <210>5 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>5 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Ala Tyr Ser lie Lys Lys Ser1 5 10 15 20 <210>6 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>6 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Ala Ser lie Lys Lys Ser
1 5 10 15 20 <210>7 <211>21 <212>PRT
21
<213>人工序列 <400>7 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Ala Lys Ser15 10 15 20 <210>8 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>8 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Ala Ser15 10 15 20 <210>9 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>9 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly Gly Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Lys Ser1 5 10 15 20 <210>10 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>10 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Tyr Ser lie Lys Lys Ser 1 5 10 15 20 <210>11 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>11 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Gly Ser lie Lys Lys Ser 1 5 10 15 20 <210>12 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>12 Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Gly Lys Ser 15 10 15 20<210>13 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>13
Lys Thr Ala Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Gly Ser
1 5 10 15 20
<210>14 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>14
Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala Ala Gly Ala Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Lys Ser
1 5 10 15 20
<210>15 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>15
Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Ala Tyr Ser lie Lys Lys Ser
1 5 10 15 20
<210>16 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>16
Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Ala Ser lie Lys Lys Ser
1 5 10 15 20
<210>17 <211>21 <212>PRT <213>人工序列 <400>17
Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Ala Lys Ser
1 5 10 15 20
<210>18 <211>21 <212>PRT <213>人工序列
23
<400>18Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala AlaGly His Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Ala Ser15 1015 20<210>19<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>19Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala AlaGly Gly Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Lys Ser15 1015 20<210>20<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>20Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala AlaGly His Pro Gly Tyr Ser lie Lys Lys Sei.15 1015 20<210>21<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>21Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala AlaGly His Pro Tyr Gly Ser lie Lys Lys Sei.15 1015 20<210>22<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>22Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala AlaGly His Pro Tyr Tyr Ser lie Gly Lys Ser15 1015 20<210>23<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>23Lys Thr Asn Met Lys Ala Met Ala Gly Ala AlaGly His Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Gly Ser15 1015 20<210>24
<212>PRT<213>人工序列<400>24
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly Ala Pro Tyr Tyr Ser 1510 15 20lie Lys Lys Ser<210>25<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>25
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Ala Tyr Ser 1510 15 20lie Lys Lys Ser<210>26<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>26
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Ala Ser lie Lys Lys Ser 15 10 15 20
<210>27<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>27
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser 1510 15 20lie Ala Lys Ser<210>28<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>28
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser 15 10 15 20lie Lys Ala Ser<210>29<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>29
25

Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly Gly Pro Tyr Tyr Ser 15 10 15lie Lys Lys Ser 20<210>30<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>30
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Tyr Ser 15 10 15lie Lys Lys Ser 20<210>31<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>31
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Gly Ser 1510 15 20lie Lys Lys Ser<210>32<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>32
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser 15 10 15 20lie Gly Lys Ser<210>33<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>33
Lys Thr Gly Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser 15 10 15 20lie Lys Gly Ser<210>34<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>34
Lys Thr Asn Met Lys Gly Met Ala Gly Ala Ala Gly His Pro Ala Tyr Ser 1510 15 20lie Lys Lys Ser<210>35<211>21
<212>PRT<213>人工序列<400>35Lys Thr Asn Met Lys Gly Met AlaGly Ala Ala Gly His Pro Tyr Ala Ser lie Lys Lys Ser1 510 15 20<210>36<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>36Lys Thr Asn Met Lys Gly Met AlaGly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Ala Lys Ser1 510 15 20<210>37<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>37Lys Thr Asn Met Lys Gly Met AlaGly Ala Ala Gly His Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Ala Ser1 510 15 20<210>38<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>38Lys Thr Asn Met Lys Gly Met AlaGly Ala Ala Gly Gly Pro Tyr Tyr Ser lie Lys Lys Ser1 510 15 20<210>39<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>39Lys Thr Asn Met Lys Gly Met AlaGly Ala Ala Gly His Pro Gly Tyr Ser lie Lys Lys Ser1 510 15 20<210>40<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>40Lys Thr Asn Met Lys Gly Met AlaGly Ala Ala Gly His Pro Tyr Gly Ser lie Lys Lys Ser
1 5 10 1520<210>41<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>41Lys Thr Asn Met Lys Gly Met Ala Gly Ala Ala Gly HisPro Tyr Tyr Ser lie Gly Lys Ser15 10 1520<210>42<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>42Lys Thr Asn Met Lys Gly Met Ala Gly Ala Ala Gly HisPro Tyr Tyr Ser lie Lys Gly Ser15 10 1520
權(quán)利要求
一種具有降血糖活性的含有式I(SEQ.ID NO1)結(jié)構(gòu)的苦瓜MC-JJ6221多肽類似物，得到的苦瓜MC-JJ6221多肽類似物；其特征在于其結(jié)構(gòu)具有以下形式Lys-Thr-Xaa1-Met-Lys-Xaa2-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Xaa3-Pro-Xaa4-Xaa5-Ser-Ile-Xaa6-Xaa7-Ser(SEQ.ID NO1)Xaa1Asn，Ala或Gly；Xaa2Ala，Gly或His；Xaa3Ala，Gly或His；Xaa4Ala，Gly或Tyr；Xaa5Ala，Gly或Tyr；Xaa6Ala，Gly或Lys；Xaa7Ala，Gly或Lys。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，具有如下序列Lys-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-Ala-Pro-Tvr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 2)Lys-Thr-A§n-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 3)Lvs-Thr-Ala-Met-Lvs-His-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-Ala-Pro-Tvr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 4)Lys-Thr-Ala-Met-Lvs-His-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Ala-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 5)Lys-Thr-Ak-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Ak-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 6)Lys-Thr-Ak-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Ak-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 7)Lys-Thr-Ak-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ak-Ser(SEQ.ID NO : 8)Lys-Thr-Ak-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-幽-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 9)Lys-Thr-Ala-Met-Lvs-His-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Glv-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 10)Lys-Thr-Ak-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-幽-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 11)Lys-Thr-Ak-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Gly-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 12)Lys-Thr-Ak-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-fiiy-Ser(SEQ.ID NO : 13)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-Ala-Pro-Tvr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.ID NO : 14)Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ak-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Ak-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO : 15)Lys-Thr-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tyr-Ala-Ser-Ile-Lys-Lys-Se r(SEQ.ID NO : 16)Lys-Thr-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Tvr-Ser-Ile-Ala-Lvs-Ser (SEQ.IDNO : 17)Lys-Thr-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Tvr-Ser-Ile-Lvs-Ala-Ser (SEQ.ID NO : 18)Lys-Thr-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-Glv-Pro-Tvr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Se r(SEQ.ID NO : 19)Lys-Thr-Asn-Met-Lys-Ak-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Se r(SEQ.ID NO : 20)Lys-Thr-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Gly-Ser-Ile-Lys-Lys-Se r(SEQ.IDNO : 21)Lys-Thi.-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pi.o-Tyr-Tvr-Ser-Ile-Glv-Lvs-Sei. (SEQ.ID NO : 22)Lys-Thr-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Tw-Ser-Ile-Lvs-Glv-Ser (SEQ.ID NO : 23)Lys-Thr-Q]y-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ak-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO : 24)Lys-Thr-Qiy-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Ak-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO : 25)Lys-Thr-Qiy-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Ak-Ser-Ile-Lys-Lys-Sei. (SEQ.ID NO: 26)Lys-Thr-Qly-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Ak-Lys-Ser (SEQ.ID NO : 27)Lys-Thr-幽-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Ak-Ser (SEQ.ID NO : 28)Lvs-Thi.-Glv-Met-Lvs-His-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-Glv-Pi.o-Tvr-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Sei. (SEQ.ID NO : 29)Lys-Thr-fily-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-fily-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO : 30)Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Gly-Ser-Ile-Lys-Lys-Ser (SEQ.ID NO : 31)Lys-Thr-Qiy-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Tyr-Tyr-Ser-Ile-fily-Lys-Ser (SEQ.ID NO : 32)Lys-Thr-Gly-Met-Lys-His-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvi.-Tw-Ser-Ile-Lvs-Glv-Sei. (SEQ.ID NO: 33)Lys-Thr-Asn-Met-Lys-QbL-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-His-Pro-Ak-Tyr-Ser-Ile-Lys-Lys-Se r(SEQ.ID NO : 34)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Ala-Ser-Ile-Lvs-Lvs-Se r(SEQ.ID NO : 35)(SEQ.ID NO : 36)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Tvr-Ser-Ile-Lvs-Ala-Ser (SEQ.ID NO: 37)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-Glv-Pro-Tvr-Tvr-Ser-Ile-Lvs-Lvs-Se r(SEQ.ID NO : 38)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Glv-Tvr-Ser-Ile-Lvs-Lvs-Se r(SEQ.ID NO : 39)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Glv-Ser-Ile-Lvs-Lvs-Se r(SEQ.ID NO : 40)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Tvr-Ser-Ile-Glv-Lvs-Se r(SEQ.IDNO : 41)Lvs-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala-Glv-His-Pro-Tvr-Tvr-Ser-Ile-Lvs-Glv-Se r(SEQ.IDNO : 42)。
3. —種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1中所述的MC-JJ6221多肽類似物或 者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
4. 權(quán)利要求1中所述的MC-JJ6221多肽類似物或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接 受的載體或稀釋劑在制備用于治療糖尿病的藥物中的運(yùn)用。
5. 權(quán)利要求1中所述的MC-JJ6221多肽類似物的制備方法，其特征在于采用微波 促進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，于固相載體上先合成得到載有第一個(gè)Fmoc保護(hù) 氨基酸的樹脂，茚三酮法檢測為陰性后脫去Fmoc保護(hù)基得到載有第一個(gè)氨基酸殘基的 樹脂；再進(jìn)入下一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護(hù)氨基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護(hù) 的步驟，依次延長所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹脂，最后用裂解劑將 多肽從樹脂上切割下來得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級高效液相色譜純化，凍干得多肽純<formula>formula see original document page 4</formula>
6. 根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進(jìn)固相合成MC-JJ6221多肽類似物方法，其特征是載 有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂的制備方法，是通過在微波照射條件下Fmoc保護(hù)氨基 酸先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入l-羥基-苯并三氮唑(HOBT)或 其衍生物抑制消旋，并使用有機(jī)堿中和反應(yīng)的酸性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂的制備方法，其特征 在于使用的固相載體是Rink樹脂、Wang樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂；使用的活化劑 是二環(huán)己基碳二亞胺(DCQ、 N， N' - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、 N， N〃 -羰基二咪 唑(CDI)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、 2-(7-偶氮苯并三 氮唑)-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N， N， N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或6-氯苯并三氮唑-l， 1， 3， 3-四甲基脲六氟磷酸 酯(HCTU);使用的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥基琥珀酰亞胺(HOSU)、 l-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羥基-l， 2， 3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT);使用的有機(jī)堿為三乙胺(TEA)、 N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA);微波促進(jìn) 條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng)時(shí)間為5 15min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進(jìn)固相合成MC-JJ6221多肽類似物合成方法，其特征 是Fmoc保護(hù)基的脫除是通過使用含有O.lmol丄-1的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)的六氫 吡啶溶液在微波促進(jìn)下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲亞砜(DMSO)、或N-甲基 吡咯烷酮(NMP)為反應(yīng)溶劑；微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 IO(TC，反應(yīng)時(shí)間為1 lOmin。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型高效降血糖苦瓜MC-JJ6221多肽類似物及其微波促進(jìn)固相合成方法。通過對天然苦瓜多肽的2，4，5，8或9位點(diǎn)進(jìn)行改造得到具有更長藥理作用時(shí)間的MC-JJ6221多肽類似物；其化學(xué)合成是通過微波促進(jìn)固相合成方法而得以高效快速實(shí)現(xiàn)，粗品經(jīng)制備級高效液相純化，最后凍干得到MC-JJ6221多肽類似物。
文檔編號C07K1/06GK101691399SQ200910183318
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者張惠斌, 王敬杰, 紀(jì)劍峰, 趙鑫鑫, 金晶, 錢海, 陳巍, 陳鑫, 黃文龍 申請人:中國藥科大學(xué)