專利名稱：：間充質(zhì)干細(xì)胞作為制備抑制血管移植后慢性排斥藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種血管移植后慢性排斥藥物，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞作為制備抑制血管移植后慢性排斥藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在眾多器官移植慢性排斥反應(yīng)中，移植物血管的病變是突出而共同的損害路徑，其導(dǎo)致管壁炎癥增厚，管腔狹窄閉塞，終致移植器官失活，因此科學(xué)家正努力尋找一種可減輕血管移植后的慢性排斥反應(yīng)藥物，以提高器官移植的成活率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，而提供一種可減輕血管移植后的慢性排斥反應(yīng)的間充質(zhì)干細(xì)胞作為制備抑制血管移植后慢性排斥藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的間充質(zhì)千細(xì)胞作為制備抑制血管移植后慢性排斥藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的抑制血管移植后慢性排斥藥物可以通過靜脈滴注的方式進(jìn)行。本發(fā)明的抑制血管移植后慢性排斥藥物于移植前12-24小時(shí)輸入受者體內(nèi)。本發(fā)明的抑制血管移植后慢性排斥藥物按體重1-5x1(T個(gè)/kg的用量。間充質(zhì)干細(xì)胞的制備3為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用實(shí)用來il明間充質(zhì)干細(xì)胞在作為抑制血管移植后慢性排斥藥物中的應(yīng)用。一間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分離培養(yǎng)及鑒定。*1、材料與方法*1.1實(shí)驗(yàn)動物及來源24只lewis雄鼠、24只BrownNorway雌鼠購自北京斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，體外培養(yǎng)骨髓MSC來源于SD大鼠。*1.2主要試劑及儀器分離器械止血鉗2支，眼科剪2把，培養(yǎng)mi2個(gè)(均需高壓)。培養(yǎng)試劑胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素為Gibco公司產(chǎn)品。*1.3培養(yǎng)方法*80gSD大鼠用10。/。水合氯醛0.3ml腹腔麻醉，浸泡于75%酒精中20min(頭露出)，于無菌條件下分離出雙側(cè)股骨和脛骨，置于無菌培^i中，移入超凈臺。*剪開骨干骺端，暴露骨髓腔，用無血清L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，將沖出的骨髓細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。1000rmp,離心5min,去上清，加入3ml含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基(100u/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)，輕輕吹打混勻重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約5x107/ml接種在塑料培養(yǎng)瓶里，置于37度，5。/。C02細(xì)胞培養(yǎng)箱.*48-72h首次全量換液，后2-3天(培養(yǎng)液顏色轉(zhuǎn)黃時(shí))換液一次，當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿瓶底90%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化，1:2傳代，傳代后細(xì)胞生長迅速，4-5天可再次傳代。*MSC流式鑒定*流式鑒定操作過程1、將細(xì)胞消化制備成單細(xì)胞懸液，每個(gè)樣品約需3x105個(gè)細(xì)胞。2、離心后以流式100微升流式buffer(或PBS)重懸。3、將重懸后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式檢測管中，加入流式抗體5微升。4、避光室溫孵育30分鐘。5、加入2毫升流式buffer,1000轉(zhuǎn)，離心5分鐘，棄上清，洗脫未結(jié)合上的流式抗體。6、加入300微升buffer,混勻送流式細(xì)胞儀檢測。流式鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*移植模型分為四組，每組六只，A:對照組，不估支任何處理；B:術(shù)前3天起口服CsA(5mg/kg/day)，每周減量1次，每次減5%，5周后停用。C:術(shù)前1天尾靜脈輸注MSC(3x106/0.5ml)。D:術(shù)前1天起口服CsA(用法同B組)+術(shù)前1天尾靜樂K輸注MSC(3x106/0.5ml)術(shù)后56天取移植血管，切片，HE染色。*MSC輸注后實(shí)a^結(jié)果*一般情況體重A組移植后大鼠體重下降，約術(shù)后6-7天開始回升，10天可升至術(shù)前水平。B、C、D組移植后大鼠體重約術(shù)后2-3天開始回升，一周后可升至術(shù)前水平。*精神狀態(tài)A組移植后大鼠精神萎靡，出現(xiàn)掉毛，平均3天后可恢復(fù)正常。B、C、D組大鼠術(shù)后1天精神即可恢復(fù)，未見明顯掉毛現(xiàn)象。*生存情況A組兩只大鼠分別于術(shù)后第2、3天死亡，D組兩只大鼠于術(shù)后第二天出現(xiàn)腹瀉癥狀，考慮為術(shù)后腹腔感染所致，予腹腔注射慶大霉素3天(2萬U/day)后腹瀉癥狀消失，其余大鼠均存活良好直至d56處死。*血管病理結(jié)果參見圖1-10。結(jié)論如圖所示，注射MSC后移植鼠及注射MSC同時(shí)口服環(huán)孢素A的移植鼠血管內(nèi)膜增厚程度明顯低于單純移植組及口服環(huán)孢素A移植組，而血管內(nèi)膜增厚是慢性排斥反應(yīng)的重要表現(xiàn)之一。因此，MSC具有抑制慢性排斥反應(yīng)的作用，其功效甚至優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫抑制劑。綜上所述的，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于使用間充質(zhì)干細(xì)胞作為抑制血管移植后慢性排斥藥物，可使血管內(nèi)膜增厚程度明顯減輕，淋巴細(xì)胞浸潤減少。圖l是正常胸主動脈切片，HE染色x40倍圖。圖2是正常胸主動脈切片，HE染色xlOO倍圖。圖3是移植血管病理切片，HE染色A組x40倍圖。圖4是移植血管病理切片，HE染色A組xIOO倍圖。圖5是移植血管病理切片，HE染色B組x40倍圖。圖6是移植血管病理切片，HE染色B組xIOO倍圖。圖7是移植血管病理切片，HE染色C組x40倍圖。圖8是移植血管病理切片，HE染色C組xIOO倍圖。圖9是移植血管病理切片，HE染色D組x40倍圖。圖IO是移植血管病理切片，HE染色D組xIOO倍圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。實(shí)施例1間充質(zhì)干細(xì)胞作為制備抑制血管移植后4曼性排斥藥物的應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞的制備與使用1、無菌條件局麻下抽取骨髓懸液約80100mL(自體或異體)，注入含肝素抗凝無菌離心管中，于無菌超凈臺離心，1OOOrmp,5min。2、棄上清，骨髓細(xì)胞沉淀用等量的含2%-5°/。同血型血漿的生理鹽水稀釋后加至淋巴細(xì)胞分離液上離心分離，2000rmp，20min,吸取中間毛玻璃樣的單核細(xì)胞層加至含2%-5%同血型血漿的生理鹽水中，離心洗滌2次，1000rpm,5min,棄上清。3、加入培養(yǎng)液，調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度為5xlOVml,4妻種于培養(yǎng)并瓦。(擴(kuò)增、消化、傳代方法同下大鼠MSC培養(yǎng))4、傳至3-4代后，收集MSC細(xì)胞，加入含10%-20%同血型血漿的生理鹽水制成單細(xì)胞懸液，用帶4號半針頭的注射器抽取細(xì)胞懸液，注入無菌輸血袋中，調(diào)整細(xì)胞密度l-3x107L,將無菌輸血袋在熱合機(jī)下嚴(yán)密封口后，送至病房備移植用，同時(shí)取少許細(xì)胞懸液滴在血培養(yǎng)亞中做無菌實(shí)驗(yàn)。5、仔細(xì)檢查MSC懸液，確認(rèn)無細(xì)胞團(tuán)塊后，通過輸血器緩慢將細(xì)胞從靜脈回輸入患者體內(nèi)，期間監(jiān)測患者心電圖、脈搏和血壓等生命體征。全過程應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。權(quán)利要求1.間充質(zhì)干細(xì)胞作為制備抑制血管移植后慢性排斥藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞作為制備抑制血管移植后慢性排斥藥物的應(yīng)用。該產(chǎn)品可使血管內(nèi)膜增厚程度明顯減輕，淋巴細(xì)胞浸潤減少。文檔編號A61P37/06GK101496814SQ20091011127公開日2009年8月5日申請日期2009年3月13日優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日發(fā)明者林艷娟申請人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院