專利名稱：速效型核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在將核酸給予來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞或生物時(shí)能將核酸 高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的、毒性低且安全性高的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物、 以及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
背景技術(shù)：
近年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理活
性功能的核酸。例如，已知siRNA ( small interfering RNA:小干涉RN A)可引起存在于細(xì)胞內(nèi)的靶基因的mRNA分解，阻礙靶基因表達(dá)(R NA interference: RNA干涉)。由RNA干涉產(chǎn)生的阻礙耙基因表達(dá)的 功能對(duì)緩解或治療由特定的基因或基因組的異常表達(dá)而引起的疾病有 用，故人們期待將siRNA開發(fā)用作治療藥。但是，為了將以siRNA為 首的核酸用作治療藥，重要的是使siRNA在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，因此， 確立^f吏核酸有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至耙細(xì)胞內(nèi)的4支術(shù)必不可少。
作為將外源性核酸分子或基因轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)，已知有利用載 體(運(yùn)載體)的技術(shù)。運(yùn)載體包括病毒性運(yùn)載體和非病毒性運(yùn)載體。病 毒性運(yùn)載體顯示出高基因?qū)胄剩琟f旦病原性、免疫原性、細(xì)胞毒性等 在安全性方面存在許多不明之處。因此期望開發(fā)安全性更高的非病毒運(yùn) 載體。
目前為止，作為促進(jìn)siRNA等核酸向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的非病毒性核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用載體，例如專利文獻(xiàn)1中公開了一種具有特定結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子性脂 質(zhì)。但是，專利文獻(xiàn)l中公開的陽(yáng)離子性脂質(zhì)具有在給予培養(yǎng)細(xì)胞或生 體時(shí)呈現(xiàn)毒性的缺點(diǎn)。另外，專利文獻(xiàn)2中，作為毒性較低、可將siRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的載體組合物，公開了含有兩親性化合物及聚陽(yáng)離子的組 合物。但是，即使是專利文獻(xiàn)2中公開的組合物，在將充分量的siRNA
4導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，由于其對(duì)細(xì)胞的毒性變得明顯，所以在安全性方面依然
存在問(wèn)題。
以上述現(xiàn)有技術(shù)為背景，人們期待開發(fā)出毒性低、能夠使以siRNA 為代表的核酸高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。 專利文獻(xiàn)l:特表2002 - 529439號(hào)公才艮 專利文獻(xiàn)2:特表2005 - 508394號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。具體而 言，本發(fā)明的目的在于提供一種在將siRNA等核酸給予來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞 或動(dòng)物時(shí)能使核酸高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，且顯示出低毒性和高安全性的 核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物；并提供一種含有該載體組合物和核酸的核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用組合物。另外，本發(fā)明的其他目的在于提供一種能以高安全性將核 酸高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的、向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入核酸的方法。
本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合含有 (A) 二酰基磷脂酰膽堿、(B )膽固醇及/或其衍生物及(C )脂肪族 伯胺的組合物，毒性低、顯示出高安全性，且能有效地使核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì) 胞內(nèi)，作為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體是有用的。另外發(fā)現(xiàn)，特別是通過(guò)將含有上 述成分(A) ~ (C)的組合物制成脂質(zhì)體形態(tài)進(jìn)行使用，能夠同時(shí)具 有更加優(yōu)異的安全性及核酸導(dǎo)入性。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)，通過(guò)進(jìn)一 步反復(fù)研究而完成的。
即，本發(fā)明提供下述發(fā)明
項(xiàng)1、 一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其特征在于，含有(A) 二酰 基磷脂酰膽堿、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(C)月旨
肪族伯胺。
項(xiàng)2、如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(A)為 ?；糠值奶荚訑?shù)為4 23的二?；字Ｄ憠A。
項(xiàng)3、如項(xiàng)1或2所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(B)
為膽固醇。項(xiàng)4、如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(C)為 碳原子數(shù)為10 ~ 20的烷基胺。
項(xiàng)5、如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(A)是 選自二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽 堿中的至少一種，成分(B)為膽固醇，且成分(C)為硬脂胺。
項(xiàng)6、如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(A): (B)成分(C)成分的摩爾比為5~9: 1~5: 1。
項(xiàng)7、如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，是siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。
項(xiàng)8、如項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，是由成分(A) ~ (C) 形成脂質(zhì)體膜的脂質(zhì)體制劑。
項(xiàng)9、 一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，含有核酸及項(xiàng)1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用 載體組合物。
項(xiàng)10、如項(xiàng)9所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸為siRNA。 項(xiàng)ll、如項(xiàng)9所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，是脂質(zhì)體制劑。
項(xiàng)12、 一種核酸導(dǎo)入方法，包括通過(guò)使項(xiàng)9所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合
物與細(xì)胞接觸，使核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的步驟。
項(xiàng)13、如項(xiàng)12所述的核酸導(dǎo)入方法，其中，細(xì)胞為培養(yǎng)細(xì)胞、從
生物體分離得到的細(xì)胞或存在于生物體內(nèi)的細(xì)胞。
項(xiàng)14、含有(A) 二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生
物中的至少一種及(C)脂肪族伯胺的組合物在制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中
的應(yīng)用。
項(xiàng)15、如項(xiàng)14所述的應(yīng)用，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體為siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)
用載體。
點(diǎn)，即，能夠有效地將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)能夠有效地發(fā)揮核 酸的有用功能，且毒性低、安全性高。因此，上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合 物及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物對(duì)治療由導(dǎo)入核酸引起的各種疾病、特別是治療 對(duì)用低分子化合物等難以治療的難治性疾病有用。
另外，特別是，由于本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物能有效地抑制作為siRNA副作用的干擾素的表達(dá)誘導(dǎo)，所以特別 適用于將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。
進(jìn)而，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可進(jìn)行凍干處理，因此還具有可 在凍干狀態(tài)下保存的優(yōu)點(diǎn)。


為表示試驗(yàn)例1的結(jié)果，即評(píng)價(jià)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的細(xì)胞安 全性的結(jié)果的圖。為表示評(píng)價(jià)在試-驗(yàn)例2中將各核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中的siRNA 導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的結(jié)果的圖。圖2的縱軸表示每1個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的平均值。為表示評(píng)價(jià)在試驗(yàn)例2中在核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中改變核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用載體的構(gòu)成脂質(zhì)(DSPC、膽固醇和硬脂胺)濃度、將siRNA導(dǎo)入 細(xì)胞內(nèi)的結(jié)果的圖。為表示評(píng)價(jià)在試驗(yàn)例3中含有siRNA的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的 干擾素誘導(dǎo)抑制的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
以下，詳細(xì)地i兌明本發(fā)明。 核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的特征在于，含有(A) 二?；?脂酰膽堿、(B)膽固醇及/或其衍生物及(C)脂肪族伯胺。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物可以用作用于將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)(導(dǎo)入) 細(xì)胞內(nèi)的核酸載體。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物適用的核酸只要是必需轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì) 胞內(nèi)的核酸即可，對(duì)核酸的種類及結(jié)構(gòu)沒(méi)有特別限定。作為該核酸的具 體例，可以舉出siRNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 cDNA、 miRNA (微 RNA)、核酶、反義寡核苷酸、誘何寡核苷酸、質(zhì)粒DNA、肽核酸、 三鏈形成性寡核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide, TFO)、適體(aptamer)、基因等。其中，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物具有抑制 作為siRNA的副作用的干擾素的表達(dá)誘導(dǎo)的有利特征，因此在將siRNA 向細(xì)月包內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)方面特別有用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體適用的核酸可以 是來(lái)自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通過(guò)化 學(xué)合成制備得到的核酸。進(jìn)而，上述核酸可以是單鏈、雙鏈或三鏈中的 任一種，并且對(duì)其分子量也沒(méi)有特別限定。另外，在本發(fā)明中，核酸也 可以是被化學(xué)物質(zhì)、酶或肽修飾的核酸。在本發(fā)明中，核酸可以單獨(dú)使 用一種，另外，也可以適當(dāng)?shù)亟M合兩種以上進(jìn)行4吏用。
作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中使用的二?；字Ｄ憠A
(以下有時(shí)也記作"成分(A)，，)，只要藥理學(xué)上允許即可，沒(méi)有特別 限定，例如可以舉出酰基部分的碳原子數(shù)為4~23的二?；字Ｄ?堿。需要說(shuō)明的是，構(gòu)成該二?；字Ｄ憠A的兩個(gè)酰基的碳原子數(shù)可 以斗目同也可以不同。
作為本發(fā)明中使用的二?；字Ｄ憠A的具體例，可以舉出二月桂 酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂 酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰棕 櫚酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰硬脂酰磷脂酰膽 堿、二丁酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿、二庚酰磷脂酰膽堿、二癸 酰磷脂酰膽堿、二苯二曱酰磷脂酰膽堿(diphthanoylphosphatidylcholin e) 、 二月桂基磷脂酰膽堿、二花生酰磷脂酰膽堿、二 (二十一烷?；? 磷脂酰膽堿、二芥酸酰磷脂酰膽堿、二花生四烯酸酰磷脂酰膽堿及雙(二 十三烷二酰基)磷脂酰膽堿(bis(tricosadinoyl)phosphatidylcholine)等。 其中，優(yōu)選可以舉出?；糠值奶荚訑?shù)為12~18的二?；字Ｄ?堿；更優(yōu)選舉出二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂 酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰椋櫚酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰膽 堿和棕櫚酰硬脂酰磷脂酰膽石威等?；糠值氖以訑?shù)為13 ~ 17的二酰 基磷脂酰膽堿；特別優(yōu)選舉出二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰 膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿；最優(yōu)選舉出二硬脂酰磷脂酰膽堿。上述二 酰基磷脂酰膽堿可以單獨(dú)使用一種，或者也可以組合兩種以上使用。
8作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中使用的膽固醇及/或其衍生物(以下有時(shí)也記作"成分(B)")，只要藥理學(xué)上允許即可，沒(méi)有 特別限定。所謂膽固醇的衍生物，是指具有膽固醇骨架的陽(yáng)離子性脂質(zhì)， 具體而言可以舉出3|3- [N- (N，， N，-二甲基氨基乙烷)-氨基曱酰 基]膽固醇(DC-Chol) 、 3(3- [N，， N，， N，-三甲基氨基乙烷]碘 化膽固醇(TC-Chol) 、 (N，， N-雙胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-膽 固醇(bis (g腿idinium) - tren - cholesterose) ( BGTC ) 、 N-膽甾烯 基氧基羰基-3， 7-二氮雜壬烷-1, 9-二胺、p-丙氨酸-二乙醇胺 -月旦固醇、N4-精胺膽固醇氨基曱酸酯(GL-67; N4-spermine choles teryl carbamate) 、 N [ N4 - 3 -氨基丙基亞精胺]膽固醇氨基曱酸酯(G L-78; N[N4 - 3 - aminopropylspermidine] cholesteryl carbamate) 、 N4 一升青胺月旦固醇甲酰胺(GL —90; N4-spermine cholesteryl carboxamide )、 N1, N8-雙(精氨酸曱酰胺)-N4-亞精胺膽固醇氨基曱酸酯(GL-9 5; N1， N8 - Bis ( argininc carboxamide) -N4- spermidine cholestery ca rbamate) 、 N- [N1, N4, N8 -三(3-氨基丙基)亞精胺]膽固醇氨 基甲酸酯(GL-96; N-[N1， N4， N8 — Tris ( 3 - aminopropyl) spermidi ne]cholesteryl carbamate)。在本發(fā)明中，作為優(yōu)選的成分(B),可以 舉出膽固醇。本發(fā)明作為成分(B)可以單獨(dú)使用膽固醇及其衍生物中 的一種，或者也可以組合兩種以上^f吏用。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中使用的脂肪族伯胺(以下有 時(shí)也記作"成分(C)"),只要藥理學(xué)上允許即可，沒(méi)有特別限定，例 如可以舉出烷基部分的碳原子數(shù)為10~20的烷基胺。作為本發(fā)明中使用的脂肪族伯胺的具體例，可以舉出月桂胺、肉豆 蔻胺、棕櫚胺、硬脂胺、油胺、癸酰胺、苯二曱酰胺(phthanoylamine) 等。其中，優(yōu)選舉出烷基部分的碳原子數(shù)為12~18的烷基胺；更優(yōu)選 舉出硬脂胺、油胺和椋櫚酰胺，特別優(yōu)選舉出硬脂胺。上述脂肪族伯胺 可以單獨(dú)^吏用一種，或者也可以組合兩種以上〗吏用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物可以組合含有上述成分(A) ~ (C)，從通過(guò)采用下述組合方案進(jìn)一步提高核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率及低毒性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選以下列舉的組合(A)?；糠值奶荚?數(shù)為4~23的二?；字Ｄ憠A、(B)膽固醇及/或其衍生物以及(C) 碳原子數(shù)為10 20的烷基胺的組合；更優(yōu)選(A)二肉豆蔻酰磷脂酰膽 堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿及/或二硬脂酰磷脂酰膽堿、(B)膽固醇、 以及(C)硬脂胺的組合。另外，在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中，對(duì)成分(A) ~ (C) 的配合比率，沒(méi)有特別限定，例如可以舉出成分(A):成分(B): 成分(C)的摩爾比為5~9: 1~5: 1，優(yōu)選為6 ~ 9: 1~4: 1，更優(yōu)選 為7 8: 2~3: 1。通過(guò)滿足上述比率，可以進(jìn)一步提高核酸向細(xì)胞內(nèi) 的轉(zhuǎn)運(yùn)效率及低毒性。另外，作為相對(duì)于本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的總量的成分(A) ~ (C)的總量，例如可以舉出1~100重量％、優(yōu)選為20~90重量％、 更優(yōu)選為30 ~ 70重量％ 。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物除了上述成分(A) ~ (C)之外 還可以含有其他陽(yáng)離子性脂質(zhì)。作為上述陽(yáng)離子性脂質(zhì)，具體而言可以舉出角鯊胺(Squalamine) 、 3a, 7a, 12a-三(3-氨基丙氧基)- 5(3 -月旦烷-24- (N, N-雙(3 —氨基丙基)胺(3a, 7a， 12a — Tris(3- aminopropoxy) - 5(3 - cholan - 24 _ (N， N - bis ( 3 - aminopropyl) a mine) 、 3a, 7a, 12a-三(3-氨基丙氧基)-5(3-膽烷_24- (N-(N- (3-氨基丙基))-3-氨基丙基)-胺(3a， 7a, 12a-Tris(3 _ aminopropoxy) - 5b - cholan -24- (N- (N- (3- aminopropyl)) -3 - aminopropyl) — amine) 、 3a， 7a, 12a -三(3 -疊氮基丙氧基) -5p-膽烷-24- (N, N-雙(2-氰基乙基)胺)(3a， 7a, 12a-T ris ( 3 - azidopropoxy) _ 5b - cholan _ 24 - (N， N - bis ( 2 - cyanoethy 1) amine) ) 、 3a, 7a， 12a-三(3-疊氮基丙氧基)-5卩-膽烷-24- (N-(節(jié)氧基羰基)-N-(羥基丙基)-胺)(3a, 7a, 12a-Tr is ( 3 - azidopropoxy) - 5b - cholan - 24 - (N - (benzyloxycarbonyl)- N - ( 3 - hydroxypropyl) - amine))等甾族化合物結(jié)合的陽(yáng)離子性 脂質(zhì)；傘狀精胺復(fù)合體(Umbrella - spermine conjugates )等膽酸結(jié)合的陽(yáng)離子性脂質(zhì)；甾醇糖苷結(jié)合的陽(yáng)離子性脂質(zhì)；甾類皂苷結(jié)合的陽(yáng)離子 性脂質(zhì)；二曱基二 (十八烷基)溴化銨鹽(DDAB) 、 1， 2-二肉豆蔻 酰基-3-三甲基銨丙烷、1， 2-二油酰基-3-三曱基銨丙烷(DOTA P) 、 1, 2-二油?；?3-三曱基銨丙烷甲基硫酸鹽、1, 2-二棕櫚酰 基_3-三甲基銨丙烷、1, 2-二硬脂酰基-3-三曱基銨丙烷、N- (1 -(2, 3-雙(油酰基氧基)丙基)-N, N， N-三甲基銨鹽酸鹽(D OTMA ) 、 二肉豆蔻?；趸趸u基乙基溴化銨鹽(DMRIE)、 二油?；趸趸u基乙基溴化銨(DORIE) 、 二曱基(二)十 二烷基溴化銨、N- (a-三曱基銨基乙?；?-(二)十二烷基-D-谷氨酰胺鹽酸鹽、N- (a-三曱基銨基乙?；?-O, O，-雙-(1H， 1H, 2H, 2H-全氟癸基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、0, O，-二(十二烷 酰基)-N- (a-三曱基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、曱基烯丙基二 (十二烷基)溴化銨、N-{p- (w-三曱基銨基丁基氧基)-苯曱酰 基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、9- (w-三曱基銨基丁 基)-3, 6-雙(十二烷?；??？ㄟ蜾寤?、二曱基二(十八烷基)銨 鹽酸鹽、N-w-三曱基銨基十二烷酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰 胺溴化物、N-{p- (w-三曱基銨基己基氧基)-苯曱?；鶀-二(十 四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p- (w-三曱基銨基癸基氧基)-p， -辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-1-0810) 、 p-(w- (b-羥基乙基) 二曱基-銨基-癸基氧基)-p，-辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-08 10) 、 O， O，， 0"-三(十二烷?；?-N- (w-三甲基-銨基癸酰 基)-三(羥基曱基)氨基曱烷溴化物鹽(TC-1-12) 、 1， 2-二月 桂基-甘油-3-乙基磷酸膽堿、1, 2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基 磷酸膽堿、1, 2-二棕櫚?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1， 2-二硬 脂酰基_甘油-3 -乙基磷酸膽堿、1 ， 2 - 二油酰基-甘油-3 -乙基磷 酸膽堿、1 -棕櫚酰-2 -油酰基-甘油-3 -乙基磷酸膽堿等季銨鹽型 陽(yáng)離子性脂質(zhì)等。在本發(fā)明中，含有除成分(A) ~ (C)之外的其他陽(yáng)離子性脂質(zhì) 時(shí)，作為該陽(yáng)離子性脂質(zhì)的比例，只要不影響本發(fā)明的效果即可，沒(méi)有特別限定，可以舉出下述比例，即相對(duì)于100重量份上述成分(A) ~ (C)的總量，該陽(yáng)離子性脂質(zhì)為1~10重量份、優(yōu)選為2 8重量份、 更優(yōu)選為4 ~ 6重量份。進(jìn)而，根據(jù)需要本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物也可以含有油性基 劑。配合油性基劑，利用其特性，由此能控制核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的 核酸導(dǎo)入效率。例如通過(guò)配合油性基劑調(diào)節(jié)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的比 重，可以控制細(xì)胞與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的接觸性，改善體外的導(dǎo)入 效率。另外，例如通過(guò)配合具有溫度感受性功能的基劑作為油性基劑， 能夠在規(guī)定的溫度條件下使核酸載體組合物的芯破碎，從而誘發(fā)細(xì)胞表 面的波動(dòng)，提高核酸的導(dǎo)入效率。進(jìn)而，例如通過(guò)配合具有外部刺激破 碎性的基劑作為油性基劑，可以通過(guò)外部刺激使核酸載體組合物的芯破 碎，從而誘發(fā)細(xì)胞表面的波動(dòng)，提高核酸的導(dǎo)入效率。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中配合的油性基劑，例如可以 舉出全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、 大豆油、精制大豆油、氫化大豆油、大豆油非皂化物、角鯊烯、蓖麻油、 丁香油、失水山梨醇三油酸酯、松節(jié)油、紅花油、紅花油脂肪酸、油酸、 椰子油、菜子油、雜醇油、橄欖油、亞麻仁油、芝麻油、葉綠素油、巴 豆油、佛手油、雪^>油、；險(xiǎn)油、茴香油、桉^"油、玉米油、熏衣草油、 香馬郁蘭油、檸檬油、棉籽油、蛋黃油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花 生油、山茶油、白樟油、春黃菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生 姜油、羅馬春黃菊油、蛇油、留蘭香油、向日葵油、可可脂、小麥胚芽 油、氧化鋅油、氫化油、氫化植物油、輕質(zhì)液體石蠟、液體石蠟、中鏈 脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻 油、聚氧乙烯氫化蓖麻油IO、聚氧乙烯氫化蓖麻油100、聚氧乙烯氫化 蓖麻油20、聚氧乙烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油5、聚氧乙烯 氫化蓖麻油50、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蓖麻油聚烴氧酯35、操作油 等。在上述油性基劑中，全氟戊烷具有溫度感受性、具有在29.5。C下通 過(guò)沸騰氣化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷及全氟三丁基胺具 有下述特性，即具有外部刺激破碎性，在由超聲波照射產(chǎn)生的刺激等來(lái)自外部的刺激作用下，使載體組合物的芯產(chǎn)生空腔，使其破碎。當(dāng)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物含有該油性基劑時(shí)，作為該油性基劑的比 例，只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒(méi)有特別限定，例如可以為下述比例，即相對(duì)于IOO重量份上述成分(A) ~ (C)的總量，該油性基材 為0.1 50重量份、優(yōu)選為1 30重量份、更優(yōu)選為5 20重量份。進(jìn)而，根據(jù)需要本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中也可以含有膜融 合性脂質(zhì)(輔助脂質(zhì))。通過(guò)含有上述膜融合性脂質(zhì)，可以進(jìn)一步提高 核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。作為上述膜融合性脂質(zhì)，例如可以舉二油酰 基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰膽堿、反式磷脂酰基磷脂?；掖及贰?1, 2-雙(IO, 12-二十三烷二?；?-磷酸乙醇胺、1， 2-二反油酰 基磷酸乙醇胺、1， 2-二 (十六烷基)磷酸乙醇胺、1, 2-二己酰基磷 酸乙醇胺、1, 2-二月桂?；姿嵋掖及贰?, 2-二亞油?；姿嵋掖?胺、1， 2-二肉豆蔻?；姿嵋掖及?、1， 2-二油?；姿嵋掖及?、1, 2-二棕櫚油?；姿嵋掖及?、1， 2-二棕櫚?；姿嵋掖及贰?， 2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1, 2-二硬脂?；姿嵋掖及贰-棕櫚?；?2 -油酰基磷酸乙醇胺、1-棕櫚?；?2- (10， 12-二十三烷二?；? 磷酸乙醇胺、1, 2-二油?；姿嵋掖及?N-己酰胺、1, 2-二棕櫚 酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N， N-二曱基-1, 2-二油?；姿嵋?醇胺、N, N-二曱基-l， 2-二棕櫚酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷?；?-1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?、N-十二烷酰基-1， 2-二油?；?酸乙醇胺、1, 2-二油?；姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1, 2-二棕 櫚?；姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1， 2-二油酰基磷酸乙醇胺-N -戊二酰、1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-戊二酰、1， 2-二油酰 基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1， 2-二油?；姿嵋掖及?N-[4 (p-馬 來(lái)酰亞胺曱基)環(huán)己烷-羧酸鹽、二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-[4 (p -馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽、1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[4 (p-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酰胺、1, 2-二油?；姿嵋掖及?N -[4 (p-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸鹽]、N-曱基-l, 2-二油?；姿?乙醇胺、N-曱基-二棕櫚?；姿嵋掖及?、1， 2-二油?；姿嵋掖及?N-[3- (2-吡啶二石克)丙酸鹽、1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[3- (2-吡咬二碌J丙酸鹽、N-(琥珀酰)-1， 2-二油酰基磷 酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及返取Ｆ渲?， 在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物中優(yōu)選使用二油?；字Ｒ掖及?。 當(dāng)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物含有該膜融合性脂質(zhì)時(shí)，作為該膜融合性 脂質(zhì)的比例，只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒(méi)有特別限定，可以舉出 下述比例，即相對(duì)于100重量份上述成分(A) ~ (C)的總量，該膜 融合性脂質(zhì)為1 ~ 500重量份、優(yōu)選為10 ~ 250重量份、更優(yōu)選為25 ~ 100重量份。
根據(jù)使用形態(tài)，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物可以含有等滲劑、 賦形劑、稀釋劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等各種添加劑；精 制水、糖水溶液、緩沖液、生理鹽水、高分子水溶液、RNase free水等 水性載體。上述添加劑和水性載體的配合量可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的 使用形態(tài)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的形態(tài)只要能夠包含成為轉(zhuǎn)運(yùn)至 細(xì)胞內(nèi)的對(duì)象的核酸即可，沒(méi)有特別限定，優(yōu)選脂質(zhì)體形態(tài)。
將本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物制成脂質(zhì)體形態(tài)時(shí)，上述成分 (A) ~ (C)及根據(jù)需要添加的其他脂質(zhì)形成脂質(zhì)體膜。制成脂質(zhì)體 形態(tài)時(shí)，可以為小單層脂質(zhì)體(smallunilamellar, vesicles: SUV)、大單 層月旨質(zhì)體(large unilamellar vesicles: LUV)、及多層月旨質(zhì)體(multilamellar vesicles: MLV)中的任一種。另外，對(duì)于其粒徑，可以根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象的 細(xì)胞種類等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，例如可以舉出為SUV時(shí)粒徑為20~100nm、 為L(zhǎng)UV時(shí)粒徑為200 ~ 1000nm、為MLV時(shí)粒徑為400 ~ 3500nm左右。 脂質(zhì)體的粒徑是根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射法而測(cè)定得到的。
脂質(zhì)體的制備及其粒徑的調(diào)節(jié)按照本領(lǐng)域公知的方法實(shí)施。即， 可以使用含有上述成分(A) ~ (C)的油相和水相(水性載體)，通 過(guò)薄膜法、逆向蒸發(fā)法、醚注入法、表面活性劑法、加熱法等形成脂質(zhì) 體。另外，可以通過(guò)^^壓法、French press法、均質(zhì)化法等調(diào)節(jié)粒徑。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物如下配制混合上述成分(A)、
14成分(B)及根據(jù)需要混合的其他成分，根據(jù)目的形態(tài)適當(dāng)?shù)刂苿┗?br> 核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物
酸。即，該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物用于將在該組合物內(nèi)含有的核酸導(dǎo)入作為 轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)。
核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物為脂質(zhì)體形態(tài)時(shí)，在該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物 中，核酸可以以被封入在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中的狀態(tài)存在，或也可以以通 過(guò)離子鍵或疏水鍵鍵合在脂質(zhì)體膜的內(nèi)側(cè)或外側(cè)的狀態(tài)存在。另外，核 酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物為脂質(zhì)體以外的形態(tài)時(shí)，在該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物 中，只要核酸與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的配合成分通過(guò)離子鍵或疏水鍵 形成復(fù)合體即可。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物通過(guò)混合上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物 與核酸制成所期望的形態(tài)，或以任意順序混合核酸及上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載 體組合物的配合成分制成所期望的形態(tài)而進(jìn)行制備。
在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中，作為核酸與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合 物的配合比率，根據(jù)使用的核酸或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的種類或?yàn)楹怂徂D(zhuǎn)運(yùn) 對(duì)象的細(xì)胞的種類等而不同，例如可以舉出下述比例，即相對(duì)于核酸轉(zhuǎn)
運(yùn)用載體組合物中所含的成分(A) ~ (C)的總量100重量份，核酸 為l.OxlO—5-1.0重量份、優(yōu)選為l.OxlO.4 ~ 1.0x10"重量份、更優(yōu)選為1.
0><10—3~ I.OXIO'2重量份。
另外，作為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中含有的成分(A) ~ (C)的總量， 相對(duì)于該組合物的總量，例如可以舉出10~90重量％、優(yōu)選為30~80 重量％、更優(yōu)選為40~60重量％。
根據(jù)其使用形態(tài)，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以含有等滲劑、賦 形劑、稀釋劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等各種添加劑；精制 水、葡萄糖水溶液、緩沖液、生理鹽水等水性載體。上述添加劑和水性 載體的配合量可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的使用形態(tài)而適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。
在本發(fā)明中，作為轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的細(xì)胞，可以舉出培養(yǎng)細(xì)胞、從生物體 中萃取的細(xì)胞(包括株化的細(xì)胞)、存在于人等生物體內(nèi)的細(xì)胞等。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的使用狀態(tài)，只要能使適量的該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與作為核酸導(dǎo)入對(duì)象的細(xì)胞接觸即可，沒(méi)有特別限定。例如，向人等生物體內(nèi)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)核酸時(shí)，例如可以舉出向組織中直
接注入；向靜脈、皮下、肌肉、腹腔、眼內(nèi)、消化器官內(nèi)、牙內(nèi)等注射；從鼻腔、口腔、肺等吸入給予；口服給予；通過(guò)皮膚的透皮給予；及通過(guò)口腔粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜的經(jīng)粘膜給予等。另外，在向培養(yǎng)細(xì)胞或從生物體萃取的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)核酸時(shí)，可以舉出培養(yǎng)時(shí)將適量的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物預(yù)先加到培養(yǎng)基中，在該狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞的方法。需要說(shuō)明的是，向培養(yǎng)細(xì)胞或從生物體萃取的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)核酸時(shí)，即使在血清存在下也可以將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。
另外，相對(duì)于作為核酸導(dǎo)入對(duì)象的細(xì)胞，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的使用量，根據(jù)使用的核酸種類、該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的種類、作為對(duì)象的細(xì)胞的種類等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象為人體內(nèi)的細(xì)胞時(shí)，對(duì)期待通過(guò)給予核酸得到治療效果的患者可以給予治療有效量的本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
實(shí)施例
以下，基于實(shí)施例等詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。需要說(shuō)明的是，在以下實(shí)施例等中，二硬脂酰磷脂酰膽堿記作"DSPC"、二棕櫚酰磷脂酰膽堿記作"DPPC"、 二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿記作"DMPC"。另外，在以下試驗(yàn)例1及2中使用GL3-siRNA (相對(duì)于靶向螢火蟲熒光素酶的siRNA; Dharmacon公司，Boulder, CO， USA;有意義5，-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT、反義5， - UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)作為siRNA。另夕卜，在試驗(yàn)例3中，使用人MMP-9-siRNA (Samchully Pharm. Co" Ltd, Korea;有意義5'-CCAACUAUGACCAGGAUAAdTdT-3，，反義5， - UUAUCCUGGUCAUAGUUGGdTdT - 3，)作為siRNA。
實(shí)施例1含有DSPC的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的配制
稱量DSPC、膽固醇和硬脂胺使其以摩爾比為DSPC:膽固醇硬脂胺=7: 3: 1,用茄型瓶使之溶解于氯仿中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使之減壓干燥，形成脂質(zhì)薄膜。向其中加入DEPC-處理水(Ambion公司制；Rnase free水)使以DSPC濃度計(jì)為30mg/mL后，用擠壓機(jī)通過(guò)lOOnm孔徑的膜來(lái)調(diào)節(jié)粒徑，制備為陽(yáng)離子性脂質(zhì)體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。
實(shí)施例2含有DPPC的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的制備
除使用DPPC代替DSPC之外，采用與上述實(shí)施例1同樣的方法，制備陽(yáng)離子性脂質(zhì)體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。實(shí)施例3含有DMPC的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物的制備
除使用DMPC代替DSPC之外，采用與上述實(shí)施例1同樣的方法，制備陽(yáng)離子性脂質(zhì)體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。實(shí)施例4含有DSPC的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的制備
使用利用DEPC -處理水(Ambion公司制；Rnasefree水)將20xTris — EDTA ( TE)緩沖液(Invitrogen公司制)稀釋20倍的溶液，配制以2|iM的濃度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后，等量混合實(shí)施例1的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物與siRNA溶液，形成脂質(zhì)體復(fù)合物(復(fù)合體)，制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。實(shí)施例5含有DPPC的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的制備
使用以DEPC -處理水(Ambion公司制；Rnasefree水)將20xTris-EDTA (TE)緩沖液(Invitrogen公司制)稀釋20倍的溶液，配制以2pM的濃度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后，等量混合實(shí)施例2的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物與siRNA溶液，形成脂質(zhì)體復(fù)合物(復(fù)合體)，配制核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。實(shí)施例6含有DMPC的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的配制
使用利用DEPC -處理水(Ambion公司制；Rnasefree水)將20xTris _ EDTA ( TE)緩沖液(Invitrogen公司制)稀釋20倍的溶液，配制以2jiM的濃度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后，等量混合實(shí)施例3的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物與siRNA溶液，形成脂質(zhì)體復(fù)合物(復(fù)合體)，配制核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。試驗(yàn)例1細(xì)胞安全性的評(píng)價(jià)試驗(yàn)
利用MTS試驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)價(jià)。MTS試驗(yàn)利用Promega公司制的"CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay"進(jìn)4亍。具體而言，在96孔板上將A594細(xì)胞(ATCC， USA)以3.16xl()4cells/孔接種在200pL含有10容量％胎牛血清(FBS )的Dulbecco，s Modification ofEagle's培養(yǎng)基(DMEM)中，在37。C下培養(yǎng)24小時(shí)。用Hank's緩沖鹽溶液(HBSS )洗滌3次后，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM，向每1孔中分別加入20pL上述實(shí)施例4 ~ 6的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，在37°C 、5。/。C02條件下培養(yǎng)4小時(shí)。然后，將孔中的培養(yǎng)上清液更換為含有10容量。/。FBS的DMEM，進(jìn)一步在37°C、 5%0)2條件下培養(yǎng)20小時(shí)。然后，向各孔中加入20]iL MTS (曱烷硫代磺酸酯)試劑及l(fā)OOpL含有10容量％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)2小時(shí)后，測(cè)定在492nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率(cellviability)。需要說(shuō)明的是，細(xì)胞存活率是以不添加核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物在上述條件下培養(yǎng)時(shí)測(cè)定的490nm處的吸光度為100%計(jì)算得到的。
所得結(jié)果示于圖1。由圖l可知，實(shí)施例4~6的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物均顯示出低細(xì)胞毒性、高安全性。特別是，能夠確認(rèn)使用DSPC或DPPC作為二酰基磷脂酰膽石咸的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物(實(shí)施例4或5 )的安全性明顯高。
試驗(yàn)例2 siRNA向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率的評(píng)價(jià)試驗(yàn)
通過(guò)使用流式細(xì)胞儀測(cè)定標(biāo)記在siRNA上的FITC的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入。需要說(shuō)明的是，本試驗(yàn)使用的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物是使用在siRNA上預(yù)先進(jìn)行FITC標(biāo)記的siRNA配制得到的。具體而言，在24孔板上將A594細(xì)胞(ATCC， USA)以5xl()5cells/孔接種至500jaL含有10容量％ FBS的DMEM中，在37°C 、 5 % C02條件下培養(yǎng)24小時(shí)。用HBSS洗滌3次后，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM，進(jìn)一步向每1孔中分別加入0.05mL上述實(shí)施例4~6的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，在37°C、 5%(^02條件下培養(yǎng)4小時(shí)。然后，將孔中的培養(yǎng)上清液更換為含有10容量。/。FBS的DMEM，進(jìn)一步在37。C、 5%(302條件下培養(yǎng)20小時(shí)。將各孔用HBSS洗滌1次后，加入0.2mL CellScrubBuffer ( GeneTherapy Systems, Inc.制),在37。C、 5 %C02條件下培養(yǎng)15分鐘。進(jìn)而，用HBSS洗滌2次后，使用胰蛋白酶剝?nèi)「街诳椎撞康募?xì)胞，通過(guò)離心分離回收細(xì)胞，使所得細(xì)胞懸浮于HBSS中。使上述懸浮液通過(guò)41|im孔徑的膜。用流式細(xì)胞4義測(cè)定加入核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物2小時(shí)后及24小時(shí)后的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。另外，作為對(duì)照，使用下述對(duì)照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，與上述相同地測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，所述對(duì)照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物如下制備以容量比l: 1混合用OptiMEM培養(yǎng)基將市售的常用作基因運(yùn)載體的Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司制)稀釋至O.lmg/mL的溶液、和用TE緩沖液以2pM的濃度稀釋siRNA的siRNA溶液。
所得結(jié)果示于圖2。由上述結(jié)果可以確認(rèn)，為實(shí)施例4~6的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的任意一種的情況下，siRNA均能被高效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。特別是，也能夠表明使用DSPC或DMPC作為二酰基磷脂酰膽堿的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物(實(shí)施例4及6),在加入2小時(shí)后siRNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入與市售的常用作基因運(yùn)載體的Lipofectamine 2000相比較顯著，具有速效性優(yōu)異的有利特征。
另夕卜，使用DSPC、膽固醇和硬脂胺(以摩爾比計(jì)DSPC:膽固醇硬脂胺=7: 3: 1，以下，統(tǒng)稱為"核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的構(gòu)成脂質(zhì)")，基于實(shí)施例1所述的方法制備DSPC的濃度為7.5 ~ 30mg/mL的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。然后，等量混合該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體與含有200nM的siRNA的TE緩沖液，形成脂質(zhì)體復(fù)合物(復(fù)合體)，制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。使用上述制備得到的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，采用與上述同樣的方法評(píng)價(jià)siRNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入。結(jié)果示于圖3。結(jié)果表明，如果改變核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的構(gòu)成脂質(zhì)的濃度，則利用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入核酸的量相應(yīng)地發(fā)生變化。另外，表明核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體構(gòu)成脂質(zhì)為任何濃度時(shí)，導(dǎo)入siRNA的量在加入24小時(shí)后的值^f氐于在加入2小時(shí)后的值，并且在加入24小時(shí)后siRNA開始消失。即，由上述結(jié)果還可以確認(rèn)，通過(guò)組合DSPC、膽固醇和硬脂胺用作核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，可以在加入2小時(shí)
19后的短時(shí)間內(nèi)將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，速效性優(yōu)異。 試驗(yàn)例3干擾素誘導(dǎo)抑制的評(píng)價(jià)試驗(yàn)
在24孔板上將A594細(xì)胞(ATCC, USA)以5xl()5cells/孔接種在 500|iL含有10容量％ FBS的DMEM中，在37°C 、 5 % C02條件下培養(yǎng) 24小時(shí)。用HBSS洗滌3次后，向各孔中加入450pL不含F(xiàn)BS的DMEM 培養(yǎng)基，再向各孔中加入50pL上述實(shí)施例4的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，在 37°C、 5。/。C02條件下培養(yǎng)4小時(shí)。然后，將孔中的培養(yǎng)上清液更換為 含有10容量。/。FBS的DMEM,進(jìn)一步在37。C、 5%0)2條件下培養(yǎng)20 小時(shí)。進(jìn)而，用HBSS洗滌3次后，使用胰蛋白酶剝?nèi)「街诳椎撞康?細(xì)月包，通過(guò)離心分離回收細(xì)胞。使用Rneasy Plus Mini (Qiagen^^司制) 從得到的細(xì)胞中萃取RNA,使用QutantiTect Reverse Transcription (Qiagen公司制)轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用所得cDNA、 QutantiTectPrimer Assay ( Qiagen公司制)和iCycler iQ ( Bio - RAD公司制)，通過(guò)實(shí)時(shí) 熒光定量PCR (real-time PCR)對(duì)作為干擾素誘導(dǎo)基因的IFIT-1的 mRNA進(jìn)行定量。作為對(duì)照，使用下述對(duì)照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，與上 述同樣地定量IFIT-1的mRNA,所述對(duì)照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物如下制 備以容量比l: 1混合用OptiMEM培養(yǎng)基將市售的常用作基因運(yùn)載體 的Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司制)稀釋至0.1mg/mL的溶液、 和用TE緩沖液以濃度為2pM稀釋siRNA的siRNA溶液。用于定量校 正的管家基因使用18rRNA。另外，作為空白，不添加核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合 物在上述條件下定量IFIT - 1的mRNA。
所得結(jié)果示于圖4。使用DSPC的實(shí)施例4的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與 使用Lipofect amine 2000的對(duì)照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物相比，顯示出明 顯低的干擾素誘導(dǎo)。上述結(jié)果表明通過(guò)使用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合 物，可以抑制作為siRNA的副作用的干擾素誘導(dǎo)。
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權(quán)利要求
1、一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其特征在于，含有(A)二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(C)脂肪族伯胺。
2、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(A)為酰基部分的碳原子數(shù)為4~23的二?；字Ｄ憠A。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(B) 為膽固醇。
4、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(C)為碳原子數(shù)為10 ~ 20的烷基胺。
5、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(A)是選自二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽石威和二硬脂酰磷脂酰膽堿中的至少一種，成分(B)為膽固醇，且成分(C)為硬脂胺。
6、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，其中，成分(A):成分(B):成分(C)的摩爾比為5~9: 1-5: 1。
7、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，是siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用載體u
8、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物，是由成分(A) ~(C) 形成脂質(zhì)體膜的脂質(zhì)體制劑。
9、 一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，含有核酸及權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體組合物。
10、 如權(quán)利要求9所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸為siRNA。
11、 如權(quán)利要求9所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，是脂質(zhì)體制劑。
12、 一種核酸導(dǎo)入方法，包括通過(guò)使權(quán)利要求9所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸，使核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的步驟。
13、 如權(quán)利要求12所述的核酸導(dǎo)入方法，其中，細(xì)胞為培養(yǎng)細(xì)胞、從生物體分離得到的細(xì)胞或存在于生物體內(nèi)的細(xì)胞。
14、 含有(A) 二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(c)脂肪族伯胺的組合物在制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的應(yīng)用。
15、如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體為siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種在將siRNA等核酸給予來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞或動(dòng)物時(shí)能使核酸高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)、且毒性低、安全性高的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體、以及含有該載體與核酸的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。本發(fā)明通過(guò)組合(A)二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(C)脂肪族伯胺，將其配合，制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體。另外，通過(guò)混合該核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體與核酸來(lái)制備核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK101646443SQ20088001003
公開日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者中野浩士, 豐福秀一, 平安幸, 竹內(nèi)洋文 申請(qǐng)人:竹內(nèi)洋文;大塚制藥株式會(huì)社