專利名稱：：表達(dá)harpin蛋白的重組載體pM43HF及其工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及表達(dá)harpin蛋白的重組載體pM43HF及其工程菌，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。是專用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的綠色環(huán)保多功能的生物制品，用于促進植物生長和無公害防治植物病蟲害，并提高作物產(chǎn)量。二
背景技術(shù)：
：harpin蛋白是植物病原細(xì)菌中—基因簇(hypersensitivereactionandpathogenicitygenecluster)中的某些(或某個)基因編碼的一種蛋白質(zhì),harpin蛋白為非特異性激發(fā)子，在非寄主植物中能誘導(dǎo)植物抗病性，還能啟動植物多種信號傳導(dǎo)途徑。如harpin通過水楊酸(salicylicacid,SA)信號途徑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性(systemicacquiredresistance,SAR)，通過乙烯調(diào)節(jié)信號途徑促進植物生長和抗逆性，通過茉莉酸(jasmonicacid,JA)調(diào)節(jié)信號通路誘導(dǎo)抗蟲性。1992年美國康乃爾大學(xué)Dr.ZhongminWei首次發(fā)現(xiàn)了梨火疫病菌(EnWm'aaw_y/owra)/wp基因簇中的/zr;W基因產(chǎn)物與植物的HR反應(yīng)有關(guān)，并將/w;7V基因編碼的蛋白命名為HarpinEa。目前該產(chǎn)品已經(jīng)進入商業(yè)運作并以商品messenger⑧于1999年在美國注冊登記。該產(chǎn)品于2000年4月被美國EPA(EnvironmentProtectionAgency)批準(zhǔn)上市，2001年7月被授予總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎，并被譽為植物生產(chǎn)和食品安全的一場綠色化學(xué)革命。迄今，已從多種植物病原細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了編碼Harpin的基因。如HarpinEa，由五nWw/aa附y(tǒng)/owra的hrpN編石馬；Harpi叩ss，由/^ewt/o附o"os"s戸'"gaepv.,/"g"e的ZzrpZ編石馬；HarpinRS，由W"/Won,flso/awacean/w的編石馬；HarpinXoo，由oryzaepv.的/w//編石馬；HarpinXooc，由X朋^2omowospv.的//^/2編石馬，后兩種Harpin蛋白及其編碼基因hrfl和hrf2是申請人所在的分子植物課題組從水稻黃單胞兩個致病變種克隆鑒定的，并已獲得授權(quán)專利。十五期間課題申請人在國家863計劃(2001AA246013)的資助下，我們已將編碼Harpinx。。和Harpinx。。c的基因/wy7(GenBankAY205561)和/w^2基因(GenBankAY875714)分別克隆于大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)(Novagen)上，構(gòu)建了harpin蛋白大腸桿菌表達(dá)載體，將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)中，最終構(gòu)建成了能夠誘導(dǎo)表達(dá)Harpin蛋白的大腸桿菌基因工程菌。通過多種廉價的簡單糖類誘導(dǎo)和篩選，多數(shù)培養(yǎng)基均可以誘導(dǎo)表達(dá)harpin蛋白，以工程菌BL21/pET30a(+):/^^2在乳糖的誘導(dǎo)下harpin蛋白的表達(dá)效率最高，總蛋白含量達(dá)40%左右，在發(fā)酵液中達(dá)到近1g/L。目前，我們己將harpin蛋白制劑開發(fā)成為生物農(nóng)藥，商品名暫定為"伊利特"。此外，我們還將/wZ/和/w^基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)基因載體，通過土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或花粉管通道法轉(zhuǎn)化水稻、油菜和大豆等多種作物，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過PCR、Southernblot、Northernblot和Westernblot分析，//基因在轉(zhuǎn)基因作物體內(nèi)能正常表達(dá)，并激活植物信號傳導(dǎo)途徑，促進植物生長和產(chǎn)生抗病性?？莶菅挎邨U菌(Bfld//^是重要的植物促生長根圍細(xì)菌(PlantGrowth-PromotingRhizobacteria，PGPR)，在植物病害生物防治中起重要的作用，目前已商品化的枯草芽孢桿菌制劑在國內(nèi)外己有很多，如國內(nèi)由本實驗室研制的枯草芽孢桿菌"B"系列微生物農(nóng)藥"菜豐寧"(B2菌株)和"麥豐寧"(B3菌株)，由中國農(nóng)大和云南農(nóng)大研制的"百抗"(B908菌株)，以及美國的"BioYield"和"Kodiak"等已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大面積使用并取得了較好的抗病和增產(chǎn)效果?？莶菅挎邨U菌的生防作用源于其能夠產(chǎn)生抗菌活性化合物，抗菌活性化合物按照合成途徑可分為兩類一類是由非核糖體途徑合成的，如脂肽化合物(lipopeptide)和聚酮化合物(polyketide)，脂肽化合物包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和泛革素(fengycin)，而聚酮化合物主要有bacillaene和difficidins;另一類是由核糖體途徑合成的，如TasA,subtilosin，sublancin和bacilysocin?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的重要的小分子抗菌化合物和其他生物活性物質(zhì)大多通過非核糖體途徑合成。而且，非核糖體途徑合成的脂肽化合物和聚酮化合物是最重要的生防活性物質(zhì)，具有的抗菌、免疫抑制、細(xì)胞生長抑制和抗腫瘤等生物活性，使其在植物病害生物防治和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。在與德國柏林理工大學(xué)生化所合作研究中，我們對本實驗室多個生防枯草芽孢桿菌菌株進行了鑒定。結(jié)果表明，B2菌株產(chǎn)生脂肽化合物surfactin，B3菌株產(chǎn)生fengycin和bacillomycinD。從B3菌株中克隆到具有調(diào)控脂肽化合物合成功能的基因組DNA片段，該DNA片段含有^/D、w;xS3、/jmS3和_ycz￡4個基因。將其中的/po53(編碼phospho-pantetheinyltransferase,PPTase)轉(zhuǎn)入不產(chǎn)生任何脂肽化合物的AwZ^fc168菌株中，構(gòu)建了高效表達(dá)脂肽化合物的生防工程菌GEB3。Harpin蛋白的研發(fā)被譽為植物生產(chǎn)和食品安全的一場綠色化學(xué)革命。而枯草芽孢桿菌是目前僅有的幾種可用于綠色蔬菜A級和AA級生產(chǎn)的微生物農(nóng)藥之一，并廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。所以，本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌，并將其開發(fā)成一種綠色環(huán)保多功能的生物制品，具有促進植物生長和防治植物病蟲害的作用，并提高植物產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供表達(dá)harpin蛋白的重組載體pM43HF及其構(gòu)建的工程菌，屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的綠色環(huán)保多功能的生物制品，可以在大田和保護地應(yīng)用，用于促進植物生長和防治植物病蟲害，并提高作物產(chǎn)量。技術(shù)方案表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌，是通過以下方法生產(chǎn)的，包括(一).枯草芽孢桿菌harpin蛋白表達(dá)載體pM43HF的構(gòu)建1、中間載體pMA5HF的構(gòu)建1)為了構(gòu)建中間載體pMA5HF，我們首先構(gòu)建了Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP。以水稻細(xì)菌性條斑病菌Rsl05(Xa"^ww"moo;zaepv.O>^co/fl)的harpin蛋白編碼基因(GenBankAY875714)為模板設(shè)計引物Pl和P2。引物Pl和P2分別在擴增片段的兩端引入I和^ZwI酶切位點，另外引物P2將基因的終止編碼子TAA改為AT，以便和酵母表達(dá)載體pPICZaA(Invitrogen公司)的6Xhis標(biāo)簽編碼序列融合。擴增片段大小為427bp，將純化的片段用五coiI和i2wI雙酶切，克隆到酵母表達(dá)載體pPICZaA相同的酶切位點，得到了Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP，該表達(dá)載體的特點是表達(dá)的重組Harpin蛋白的C端融合了6xHis標(biāo)簽。2)大腸桿菌一芽孢桿菌穿梭載體pMA5HF的構(gòu)建以Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP為模板設(shè)計引物P3和P4，擴增的基因片段大小為492bp，其編碼重組Harpin蛋白(C端融合了6xHis標(biāo)簽)，弓I物P3和P4在擴增的片段的兩端分別引入了MfcI和州"dm酶切位點，將擴增的片段用MfcI和歷mlIII雙酶切后，克隆到載體pMA5相應(yīng)的酶切位點，得到了大腸桿菌—芽孢桿菌穿梭載體pMA5HF。2、中間載體pMD18P43SP的構(gòu)建1)以枯草芽孢桿菌168的基因組為模板，引物P5和P6擴增P43啟動子片段(GenBankK02174)，擴增的片段大小為335bp。2)以枯草芽孢桿菌168的基因組為模板，用引物P7和引物P8擴增獲得"pr5信號肽編碼序列(GenBankM62845)。擴增獲得的片段大小為112bp。引物P8在擴增片段的3'端引入了/W/eI酶切位點。3)以上述擴增獲得的P43片段和w;^S信號肽編碼序列片段為模板，擴增引物為P5和P8，采用重迭PCR方法將兩種組件融合，得到P43+wpr5片段，該融合片段的大小為412bp。4)以載體pMA5為模板設(shè)計引物為P9和PIO，擴增包含We編碼基因(GenBankM19465)的片段。擴增片段大小為815bp。引物P9在擴增片段的5'端引入了5y7"BI酶切位點。5)以上述擴增獲得的W3+npr^和We片段為模板，引物為P9和P8，再次采用重迭PCR方法將兩個片段融合，得到的We+i^+w;^5片段的大小為1194bp。然后將純化的Z^屮PW+"pr5片段進行TA克隆反應(yīng)(TAcloningkit，TaKaRa,Japan),將片段克隆到測序載體pMD18T(TAcloningkit，TaKaRa,Japan)，然后挑選重組載體送到上海英俊測序公司(InvitrogenBiotechnologyCo.，Ltd.)測序，經(jīng)序列分析確認(rèn)所克隆的序列正確后，我們得到了重組載體pMD18P43SP。3、枯草芽孢桿菌Harpin蛋白表達(dá)載體pM43HF的構(gòu)建為了將載體pMA5的HpalI啟動子替換為P43啟動子和"pW信號肽編碼序列，用S朋BI和iVtfel對pMD18P43SP進行雙酶切，回收得到的We+iM3+甲r5片段克隆至IJpMAHF相應(yīng)的酶切位點，得到了重組載體pM43HF(圖1A)。為什么在構(gòu)建表達(dá)載體要選擇這樣一個復(fù)雜的過程基于以下點(先前的研究)1，HpaII啟動子的活性比較低。2，載體pMA5可利用的酶切位點較少，并且6/e基因前后的片段不能破壞，否則得到的重組載體不能轉(zhuǎn)化芽孢桿菌。(二)表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建選擇可遺傳轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌菌株WB800、0KB105、Gl和69，分別采用感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)harpin蛋白的表達(dá)載體pM43HF轉(zhuǎn)入上述枯草芽孢桿菌菌株中構(gòu)建表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌。(三)表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌生物制品的生產(chǎn)在發(fā)酵罐中配制發(fā)酵培養(yǎng)基按照每升培養(yǎng)液中含1020g葡萄糖或1020g蔗糖或2535g玉米漿，0.5lg酵母提取物(yeastextract),0.5g谷氨酸鈉，0.5gMgS04，0.5gKC1，lgKH2P04，0.15mgFe2S046H20，5.0mgMnS04H20，0.16mgCuS045H20,調(diào)pH范圍為6.87.0，加水至lL;按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%加入種子菌，溫度3037°C，轉(zhuǎn)速300800r/min，溶氧30%,發(fā)酵3036h，發(fā)酵結(jié)束后直接利用發(fā)酵液為生物制品或發(fā)酵液離心收集芽孢，收集的芽孢經(jīng)真空干燥，加入質(zhì)量比99%的玉米淀粉制成生物制品。(四)表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌生物制品的應(yīng)用將濃度為15xl0S—l5xl()ScfWml的基因工程菌芽孢制品進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，用于促進植物生長和防治植物病害，并顯著提高植物產(chǎn)量。有益效果本發(fā)明所提供的表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點和積極效果1.首次提供了表達(dá)harpin蛋白的載體pM43HF和表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌分別以檢索式"HarpinXooc(/^2或/zpai基因編碼的harpin蛋白)+Bad〃wsrato'fc"為檢索詞，通過對中國專利數(shù)據(jù)庫、美國專利和商標(biāo)局專利數(shù)據(jù)庫和歐洲專利局?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明表達(dá)harpin蛋白的重組載體pM43HF及其工程菌相同的內(nèi)容。這表明本發(fā)明提供的表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌具有創(chuàng)新性。2.首次提出表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌作為新型環(huán)保型生物制品使用Harpin蛋白的研發(fā)被譽為植物生產(chǎn)和食品安全的一場綠色化學(xué)革命。而枯草芽孢桿菌是目前僅有的幾種可用于綠色蔬菜A級和AA級生產(chǎn)的微生物農(nóng)藥之一，并廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。所以，本發(fā)明提供的表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌是一種綠色環(huán)保多功能的生物制品，具有促進植物生長和防治植物病蟲害的作用，并提高植物產(chǎn)量。3.首次提出了表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌制品作為新型環(huán)保型多功能生物制品的應(yīng)用方法突破了表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌還沒有在促進植物生長和防治植物病蟲害方面應(yīng)用的現(xiàn)狀。將濃度為1-5X1061—5X108cfu/ml的基因工程菌進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，用于促進植物生長和防治植物病害，并顯著提高植物產(chǎn)量，在不同種農(nóng)作物上防治效果達(dá)55%86%，增產(chǎn)8%22%。四圖1:表達(dá)harpin蛋白的載體pM43HF示意圖圖2:中間載體pMA5HF的構(gòu)建過程示意圖圖3:中間載體pMD18P43SP構(gòu)建過程示意圖圖4:表達(dá)載體pM43HF構(gòu)建過程示意圖圖5:表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌的免疫印跡分析用5%三氯乙酸將1ml的基因工程菌培養(yǎng)48h的上清液濃縮至100nl，各取5pl跑12%SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)化到尼龍膜(PVDF)上，用6xHis-tag多克隆抗體進行免疫雜交，用化學(xué)發(fā)光試劑(chemiluminescence)顯色。(A)工程菌OKB105的免疫印跡。泳道1,菌株OKB105;泳道2,OKBP5(菌株OKB105轉(zhuǎn)pMA5質(zhì)粒)；泳道3,OKBHF(菌株OKB105轉(zhuǎn)pM43HF質(zhì)粒，發(fā)酵24h);泳道4，OKBHF(菌株OKB105轉(zhuǎn)pM43HF質(zhì)粒，發(fā)酵36h);泳道5,分子量標(biāo)記；(B)工程菌WB800疫印跡。泳道1,菌株WB800;泳道2，WBP5(菌株WB800轉(zhuǎn)pMA5質(zhì)粒)；泳道3,分子量標(biāo)記；泳道4，WBHF(菌株WB800轉(zhuǎn)pM43HF質(zhì)粒)；泳道5，純化的harpin蛋白圖6:枯草芽孢桿菌基因工程菌表達(dá)的harpin蛋白誘導(dǎo)煙草過敏性反應(yīng)WB800—枯草芽孢桿菌菌株；WBHF—菌株WB800轉(zhuǎn)pM43HF質(zhì)粒；WBP5—菌株WB800轉(zhuǎn)pMA5質(zhì)粒；purifiedharpin—純化的harpin蛋白圖7:枯草芽孢桿菌基因工程菌表達(dá)的harpin蛋白誘導(dǎo)煙草防衛(wèi)基因的表達(dá)用工程菌株WBP5(菌株WB800轉(zhuǎn)pMA5質(zhì)粒)、WBHF(菌株WB800轉(zhuǎn)pM43HF質(zhì)粒)產(chǎn)生的蛋白和純harpin蛋白處理煙草誘導(dǎo)防衛(wèi)基因PR-la和PR-lb表達(dá)。EF-la(內(nèi)參基因)五具體實施方式(一)枯草芽孢桿菌Harpin蛋白表達(dá)載體pM43HF的構(gòu)建(圖14)1、中間載體pMA5HF的構(gòu)建(圖2)1)Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP構(gòu)建(圖2):以水稻細(xì)菌性條斑病菌Rsl05QTa加/zowcwaswjzaepv.wjz/co/a)的harpin蛋白編碼基因/w^2(GenBankAY875714)為模板，設(shè)計引物P1和P2:PlCCGAATTCATGAACTCTTTGAACACACAIP2TCTAGAATCTGCATTGATGCGCTGTCG勘I弓l物PI和P2分別在擴增片段的兩端引入I和JftflI酶切位點，另外引物P2將/w^2基因的終止編碼子TAA改為AT，以便和酵母表達(dá)載體pPICZaA(Invitrogen公司)的6Xhis標(biāo)簽編碼序列融合。PCR擴增條件為95°C，4min;94°C，45s;57°C，30s;72°C，30s;30個循環(huán)；72°C，10min。擴增片段大小為427bp，將純化的片段用￡coiI和JftaI雙酶切，克隆到酵母表達(dá)載體pPICZaA相同的酶切位點，得到了Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP(圖2)，該表達(dá)載體的特點是表達(dá)的重組Harpin蛋白的C端融合了6xHis標(biāo)簽。2)大腸桿菌一芽孢桿菌穿梭載體pMA5HF的構(gòu)建(圖2)以Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP為模板，設(shè)計引物P3和P4:P3CATATGAACTCTTTGAACACACAATTC廳IP4AAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGGTC倫dIII擴增的基因片段大小為492bp，其編碼重組Harpin蛋白(C端融合了6xffis標(biāo)簽)，引物P3和P4在擴增的片段的兩端分別引入了I和///wdIII酶切位點，擴增的條件為95°C，4min;94°C，45s;58°C，30s;72°C，30s;30個循環(huán)；72°C，10min。將擴增的片段用A^eI和所wdIII雙酶切后，克隆到載體pMA5(Dartois"a/.,1994.Geneticanalysisandoverexpressionoflipolyticactivityin5ac/〃twAppl.Environ.Microbiol.60:1670-1673)相應(yīng)的酶切位點，得到了大腸桿菌一芽孢桿菌穿梭載體pMA5HF(圖2)。2、中間載體pMD18P43SP的構(gòu)建(圖3)1)以枯草芽抱桿菌168(KunstW1997.Thecompletegenomesequenceofthegram-positivebacterium5ac/〃wNature.390:249國256)的基因組(何丹，2007，兩種生防活性蛋白Harpinx。。c和AiiA的表達(dá)及生物活性檢測.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文.49-50)為模板，引物P5和P6擴增P43啟動子片段(GenBankK02174),擴增的程序為95°C，4min;94°C，45s;62。C，30s;72°C，30s;30個循環(huán);72。C，10min。擴增的片段大小為335bp。P5GGTTTAAAGGTGGAGATTTGATAGGTGGTATGTTTP6CTTGGTCAAGTTGCGCATGTGTACATTCCTCTCTT2)以枯草芽孢桿菌168的基因組為模板，用引物P7和引物P8擴增獲得w;^5信號肽編碼序列(GenBankM62845)。擴增的程序為95°C，4min;94°C，30s;62°C，30s;72°C，45s;30個循環(huán)；72°C，10min。擴增的片段大小為112bp。引物P8在擴增片段的3'端引入了A^/eI酶切位點引物序列為P7AAGAGAGGAATGTACACATGCGCAACTTGACCAAGP8CATATGTGCTGCAGCTGAGGCATGTGTT廳I3)以上述擴增獲得的P43片段和wpr別言號肽編碼序列片段為模板，擴增引物為P5和P8，采用重迭PCR方》去(HoWa/"1989.Site—directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction.Gene77:51-59.)將兩種組件融合，得到P43+"http://"5片段，該融合片段的大小為412bp，擴增的程序為95。C，4min;94°C，45s;60°C，30s;72°C，30s;30個循環(huán);72°C，lOmin。4)以載體pMA5為模板，設(shè)計引物為P9和P10，擴增包含We編碼基因(GenBankM19465)的片段。擴增程序為95°C，4min;94°C，45s;61°C，45s;72°C，1min;30個循環(huán)；72°C，10min。擴增片段大小為815bp。引物P9在擴增片段的5'端引入了S朋BI。P9GGCGTACGTATTTATTAACTTCTCCTAGS""BIP10AAACATACCACCTATCAAATCTCCACCTTTAAACC5)以上述擴增獲得的iMJ+npr^和We片段為模板，引物為P9和P8，再次采用重迭PCR方法將兩個片段融合，擴增的程序為5°C，4min;94°C，45s;61°C，45s;72°C，1.3min;30個循環(huán)；72°C，10min。得到的We+PW+"jw^片段的大小為1194bp。然后將純化的We+尸43+"pr5片段進行TA克隆反應(yīng)(TAcloningkit，TaKaRa,Japan),將片段克隆到測序載體pMD18T(TAcloningkit，TaKaRa，Japan),然后挑選重組載體送到上海英俊測序公司(InvitrogenBiotechnologyCo.,Ltd.)測序，經(jīng)序列分析確認(rèn)所克隆的序列正確后，得到了重組載體pMD18P43SP9(圖3)。3、枯草芽孢桿菌Harpin蛋白表達(dá)載體pM43HF的構(gòu)建(圖4)為了將載體pMA5的HpaII啟動子替換為P43啟動子和";W信號肽編碼序列，用S朋BI和AWeI對pMD18P43SP進行雙酶切，回收得到的We+iM3+"jw^片段克隆到pMAHF相應(yīng)的酶切位點，得到了重組載體pM43HF(圖4)。(二)表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用實施例11.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌WB800的構(gòu)建選擇生防效果好的可遺傳轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌菌株WB800(WuandWong,2002.Engineeringofa5ac///wssw/rt/^strainwithadjustablelevelsofintracellularbiotinforsecretoryproductionoffunctionalstreptavidin.Appl.Environ.Microbiol.68:1102-1108.)，米用感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將harpin蛋白的芽孢桿菌表達(dá)載體pM43HF轉(zhuǎn)入OKB105菌株中，構(gòu)建表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌。2.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌WB800生物制品的生產(chǎn)在含有30%甘油的Landy培養(yǎng)基中一70。C保存的基因工程菌WB800菌株，首先在Landy平板上活化，然后，根據(jù)需要將活化的基因工程菌接種到含有Landy液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，在溫度33°C，轉(zhuǎn)速200r/min進行種子菌培養(yǎng)。在瑞士比歐30L發(fā)酵罐(NLF，BioengineeringAG)配制發(fā)酵培養(yǎng)基20L:按照每升培養(yǎng)液中含1020g葡萄糖或1020g蔗糖或2535g玉米漿，0.5lg酵母提取物，0.5g谷氨酸鈉，0.5gMgS04，0.5gKCl，lgKH2P04，0.15mgFe2S046H20，5.0mgMnS04H20，0.16mgCuS045H20，調(diào)pH范圍為6.87.0，加水至1L;按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%加入種子菌，溫度33°C，轉(zhuǎn)速500r/min，溶氧30%，發(fā)酵3036h，發(fā)酵結(jié)束后直接利用發(fā)酵液或離心收集芽孢，收集的芽孢經(jīng)真空干燥，加入99%的玉米淀粉制成生物制品。3.枯草芽孢桿菌基因工程菌WB800表達(dá)的harpin蛋白量檢測基因工程菌TO800菌株發(fā)酵36小時后，取發(fā)酵上清液1ml，濃縮10倍至100ul。取10ul跑SDS-PAGE電泳，可見24kDa特征性harpin蛋白條帶。免疫印跡結(jié)果也可以驗證有24kDa特征性harpin蛋白條帶。為了準(zhǔn)確測定harpin蛋白的含量，采用酶聯(lián)免疫法測定了發(fā)酵36小時harpin蛋白的表達(dá)量為53pg/ml。4.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌WB800生物制品的應(yīng)用表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌WB800生物制品在田間的使用方法見表1，用于促進植物生長和防治植物病蟲害，并提高作物產(chǎn)量。試驗表明，將濃度為1一5X106l—5X108cfu/ml的基因工程菌進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，在不同種農(nóng)作物上防治效果達(dá)57%82%，增產(chǎn)8%18%。如表1結(jié)果顯示，工程菌在水稻上應(yīng)用，對稻瘟病的防治效果為82%，增加產(chǎn)量13%;對紋枯病的防治效果為69%，增產(chǎn)11%。工程菌在小麥上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為75%，增產(chǎn)13.6%;對白粉病的防治效果為76%，增產(chǎn)9.6%;對赤霉病的防治效果為66%，增產(chǎn)9.1%。工程菌在番茄上應(yīng)用，對青枯病的防治效果為70%，增產(chǎn)18.2%;對早疫病的防治效果為81%，增產(chǎn)17.2%。工程菌在辣椒上應(yīng)用，對疫病的防治效果為76%，增產(chǎn)12.7%;對炭疽病的防治效果為71%，增產(chǎn)11.2%。對病毒病的防治效果為56%，增產(chǎn)8.1%。工程菌在黃瓜上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為74%，增產(chǎn)14.5%;對灰霉病的防治效果為82%，增產(chǎn)12.3%;對霜霉病的防治效果為71%，增產(chǎn)9.1%。工程菌在青菜上應(yīng)用，對霜霉病的防治效果為65%，增產(chǎn)8.1%;對蚜蟲的防治效果為57%，增產(chǎn)10.2%。實施例21.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌0KB105的構(gòu)建選擇生防效果好的可遺傳轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌菌株0KB105(NakanoWa/.1988.dentificationofageneticlocusrequiredforbiosynthesisofthelipopeptideantibioticsurfactininSad〃w;^wZ)rifc.J.Sacfer/o/.170:5662-5668.)，采用感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將harpin蛋白的芽孢桿菌表達(dá)載體pM43HF轉(zhuǎn)入0KB105菌株中，構(gòu)建表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌。2.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌0KB105生物制品的生產(chǎn)在含有30%甘油的Landy培養(yǎng)基中—7(TC保存的基因工程菌OKB105菌株，首先在Landy平板上活化，然后，根據(jù)需要將活化的基因工程菌接種到含有Landy液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，在溫度33'C，轉(zhuǎn)速200r/min進行種子菌培養(yǎng)。在瑞士比歐30L發(fā)酵罐(NLF，BioengineeringAG)配制發(fā)酵培養(yǎng)基20L:按照每升培養(yǎng)液中含10~20g葡萄糖或1020g蔗糖或2535g玉米漿，0.5lg酵母提取物，0.5g谷氨酸鈉，0.5gMgS04，0.5gKCl，lgKH2P04，0.15mgFe2S046H20，5.0mgMnS04H20，0.16mgCuS045H20,調(diào)pH范圍為6.87.0，加水至1L;按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%加入種子菌，溫度33°C，轉(zhuǎn)速500r/min，溶氧30%，發(fā)酵3036h，發(fā)酵結(jié)束后直接利用發(fā)酵液或離心收集芽孢，收集的芽孢經(jīng)真空十燥，加入99%的玉米淀粉制成生物制品。3.枯草芽孢桿菌基因工程菌OKB105表達(dá)的harpin蛋白量檢測基因工程菌OKB105菌株發(fā)酵36小時后，取發(fā)酵上清液lml，濃縮10倍至100ul。取10ul跑SDS-PAGE電泳，可見24kDa特征性harpin蛋白條帶。免疫印跡結(jié)果也可以驗證有24kDa特征性harpin蛋白條帶。為了準(zhǔn)確測定harpin蛋白的含量，采用酶聯(lián)免疫法測定了發(fā)酵36小時harpin蛋白的表達(dá)量為25pg/ml。4.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌OKB105生物制品的應(yīng)用表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌0KB105牛物制品在田間的使用方法見表2，用于促進植物生長和防治植物病蟲害，并提高作物產(chǎn)量。試驗表明，將濃度為1一5X10el—5X108cfu/ml的基因工程菌進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，在不同種農(nóng)作物上防治效果達(dá)55%86a/。，增產(chǎn)8%22%。如表2結(jié)果顯示，工程菌在水稻上應(yīng)用，對稻瘟病的防治效果為85%，增加產(chǎn)量11%;對紋枯病的防治效果為76%，增產(chǎn)8%。工程菌在小麥上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為82%，增產(chǎn)22%;對白粉病的防治效果為75%，增產(chǎn)12.6%;對赤霉病的防治效果為65%，增產(chǎn)8.1%。工程菌在番茄上應(yīng)用，對青枯病的防治效果為72%，增產(chǎn)18.2%;對早疫病的防治效果為80%，增產(chǎn)20.2°/。。工程菌在辣椒上應(yīng)用，對疫病的防治效果為78%，增產(chǎn)13.5%;對炭疽病的防治效果為75%，增產(chǎn)12.1%。對病毒病的防治效果為60%，增產(chǎn)8.2%。工程菌在黃瓜上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為72%，增產(chǎn)18.6%;對灰霉病的防治效果為86%，增產(chǎn)18.3對霜霉病的防治效果為77%，增產(chǎn)11.2%。工程菌在青菜上應(yīng)用，對霜霉病的防治效果為62%，增產(chǎn)7.6%;對岈蟲的防治效果為55%,增產(chǎn)9.7%。實施例31.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌Gl的構(gòu)建選擇生防效果好的可遺傳轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌菌株Gl(王帥等，2007.枯草芽孢桿菌脂肽類抗生素發(fā)酵和提取條件.中國生物防治.23(4):342—347.)，采用感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將harpin蛋白的芽孢桿菌表達(dá)載體pM43HF轉(zhuǎn)入Gl菌株中構(gòu)建表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌。2.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌G1生物制品的生產(chǎn)(同實施例1)3.枯草芽孢桿菌基因工程菌表達(dá)的harpin蛋白量檢測基因工程菌Gl菌株發(fā)酵36小時后，取發(fā)酵上清液1ml，濃縮10倍至100ul。取10ul跑SDS-PAGE電泳，可見24kDa特征性harpin蛋白條帶。免疫印跡結(jié)果也可以驗證有24kDa特征性harpin蛋白條帶。為了準(zhǔn)確測定harpin蛋白的含量，采用酶聯(lián)免疫法測定了發(fā)酵36小時harpin蛋白的表達(dá)量為36ng/ml。4.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因Gl工程菌生物制品的應(yīng)用表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌Gl菌株生物制品在ffl間的使用方法見表3，用于促進植物生長和防治植物病蟲害，并提高作物產(chǎn)量。試驗表明，將濃度為1一5X106l—5X108CfU/ml的基因工程菌進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，在不同種農(nóng)作物上防治效果達(dá)60%89%，增產(chǎn)9%22%。如表3結(jié)果顯示，工程菌在水稻上應(yīng)用，對稻瘟病的防治效果為86%，增加產(chǎn)量16.2%;對紋枯病的防治效果為72%，增產(chǎn)9%。工程菌在小麥上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為86%，增產(chǎn)21%;對白粉病的防治效果為79%，增產(chǎn)15.5%;對赤霉病的防治效果為66%，增產(chǎn)10.2%。工程菌在番茄上應(yīng)用，對青枯病的防治效果為76%，增產(chǎn)20.9%;對早疫病的防治效果為82%，增產(chǎn)22%。工程菌在辣椒上應(yīng)用，對疫病的防治效果為80%，增產(chǎn)21.2%;對炭疸病的防治效果為77%,增產(chǎn)14.3%。對病毒病的防治效果為68%，增產(chǎn)21.2%。工程菌在黃瓜上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為69%,增產(chǎn)15.5%;對灰霉病的防治效果為88%，增產(chǎn)19.8%;對霜霉病的防治效果為73%，增產(chǎn)13.6%。工程菌在青菜上應(yīng)用，對霜霉病的防治效果為67%,增產(chǎn)11.6%;對蚜蟲的防治效果為60%，增產(chǎn)10.4%。實施例41.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌69的構(gòu)建選擇生防效果好的可遺傳轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌菌株69(張學(xué)君等，1993.農(nóng)作物重要病原菌拮抗菌的篩選.生物防治通報.9(3):126-129)，采用感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)harpin蛋白的表達(dá)載體pM43HF轉(zhuǎn)入69菌株中構(gòu)建表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌。2.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌69生物制品的生產(chǎn)(同實施例1)3.枯草芽孢桿菌基因工程菌69表達(dá)的harpin蛋白量檢測基因工程菌69菌株發(fā)酵36小時后，取發(fā)酵h清液1ml，濃縮10倍至100ul。取10ul跑SDS-PAGE電泳，可見24kDa特征性harpin蛋白條帶。免疫印跡結(jié)果也可以驗證有24kDa特征性harpin蛋tl條帶。為了準(zhǔn)確測定harpin蛋白的含量，采用酶聯(lián)免疫法測定了發(fā)酵36小時harpin蛋白的表達(dá)量為36嗎/ml。4.表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌69生物制品的應(yīng)用表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌69菌株生物制品在田間的使用方法見表4，用于促進植物生長和防治植物病蟲害，并提高作物產(chǎn)量。試驗表明，將濃度為1一5X106l—5X108cfu/ml的基因工程菌進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，在不同種農(nóng)作物上防治效果達(dá)63%89%,增產(chǎn)8.7%24%。如表4結(jié)果顯示，工程菌在水稻上應(yīng)用，對稻瘟病的防治效果為89%,增加產(chǎn)量18%;對紋枯病的防治效果為76%，增產(chǎn)18%。工程菌在小麥上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為85%，增產(chǎn)20.4%;對白粉病的防治效果為72%，增產(chǎn)13.6%;對赤霉病的防治效果為63%，增產(chǎn)14.1%。工程菌在番茄上應(yīng)用，對青枯病的防治效果為79%，增產(chǎn)19.2%;對早疫病的防治效果為84%，增產(chǎn)20.7%。工程菌在辣椒上應(yīng)用，對疫病的防治效果為77%，增產(chǎn)15.6%;對炭疽病的防治效果為81%，增產(chǎn)16.4%。對病毒病的防治效果為61%，增產(chǎn)16.2%。工程菌在黃瓜上應(yīng)用，對根腐病的防治效果為77%，增產(chǎn)17.7%;對灰霉病的防治效果為82%，增產(chǎn)16.3%;對霜霉病的防治效果為74%，增產(chǎn)12.2%。工程菌在青菜上應(yīng)用，對霜霉病的防治效果為69%，增產(chǎn)9.6%;對蚜蟲的防治效果為63%，增產(chǎn)8.7%。上述所有實施例的試驗結(jié)果表明，將濃度為1—5X1061—5Xl(fcfu/ml的基因工程菌進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，在不同種農(nóng)作物上防治效果為55%89%，增產(chǎn)8%24%。表l表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌(WB800菌株)生物制品對作物病蟲防治作用及增產(chǎn)作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌(OKB105菌株)生物制品對作物病蟲防治作用及增產(chǎn)作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>種子處理和灌根各一次，后期噴霧2次，疫病7813.5辣椒使用濃度為l()8cfu/ml噴霧3次，使用濃度為10、fU/ml炭疽病7512.1噴霧3次，使用濃度為10、fii/ml病毒病608.2種子處理和灌根各一次，使用濃度為根腐病灰霉病728618.618.3黃瓜108cfu/ml噴霧3次，使用濃度為10、fU/ml噴霧3次，使用濃度為10、fU/ml霜霉病7711.2青菜噴霧3次，使用濃度為10、fb/ml霜霉病627.6噴霧3次，使用濃度為10、fU/ml蚜蟲559.7表3表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌(Gl菌株)生物制品對作物病蟲防治作用及增產(chǎn)作用作物使用方法防治對象防治效果(%)增產(chǎn)效果(%)水稻噴霧3次，使用濃度為10、fo/ml稻瘟病8616.2噴霧3次，使用濃度為10"cfii/ml紋枯病729.0種子處理和灌根各一次，使用濃度為根腐病8621小麥108cfu/ml噴霧3次，使用濃度為10、fu/ml白粉病7915.5噴霧3次，使用濃度為l(fcfii/ml赤霉病6610.2種子處理和灌根各一次，后期噴霧2次，胃禾古病7620.9番茄使用濃度為l()8cfu/ml噴霧3次，使用濃度為l()Scfli/ml早疫病8222種子處理和灌根各一次，后期噴霧2次，疫病8016.7辣椒使用濃度為l()Scfu/ml噴霧3次，使用濃度為10"cfU/ml炭疽病7714.3噴霧3次，使用濃度為10、fu/ml病毒病6821,2黃瓜種子處理和灌根各一次，使用濃度為108cfu/ml根腐病6915.5噴霧3次，使用濃度為10、fu/ml灰霉病8819.8噴霧3次，使用濃度為10"cfii/ml霜霉病7313.6青菜噴霧3次，使用濃度為10、fii/ml霜霉病6711.6噴霧3次，使用濃度為10"cfU/ml嫁蟲6010.4表4表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌(69菌株)生物制品對作物病蟲防治作用及增產(chǎn)作用作物使用方法防治對象防治效果(%)增產(chǎn)效果(%)水稻噴霧3次，使用濃度為10、fo/ml稻瘟病8924,0噴霧3次，使用濃度為10"cfu/ml紋枯病7618.0小麥種子處理和灌根各一次，使用濃度為108cfu/ml噴霧3次，使用濃度為10VfU/ml根腐病白粉病857220.413.6噴霧3次，使用濃度為10"cfb/ml赤霉病6314.1番茄種子處理和灌根各一次，后期噴霧2次，使用濃度為10Scfu/ml青枯病7919.2噴霧3次，使用濃度為l(A;fU/ml早疫病8420.7種子處理和灌根各一次，后期噴霧2次，疫病炭疽病778115.616.4辣椒使用濃度為10、fu/ml噴霧3次，使用濃度為10、fti/ml噴霧3次，使用濃度為10、fU/ml病毒病6116.2黃瓜種子處理和灌根各一次，使用濃度為108cfu/ml噴霧3次，使用濃度為10、fo/ml根腐病灰霉病778217.716.3噴霧3次，使用濃度為10"cfii/ml霜霉病7412.2青菜噴霧3次，使用濃度為l(fcfu/ml霜霉病699.6噴霧3次，使用濃度為10"cfb/ml頓蟲638.7序列表南京農(nóng)業(yè)大學(xué)表達(dá)harpin蛋白的重組載體pM43HF及其工程菌說明書002008-08-0110Patentlnversion3.1128薩人工合成引物P1(l)..(28)〈110〉<120>〈130〉〈140〉〈141〉<160〉〈170〉〈210〉〈211〉〈212><213>〈220〉<221><222><223><400>1ccgaattcatgaactctttgaacacaca28<210〉2〈211〉27<212>■<213〉人工合成<220><221>引物P2〈222〉(1)..(27)〈223>〈400〉2tctagaatctgcattga/tgcgctgtcg2了〈210〉327DNA人工合成〈211〉〈212〉〈213><220>〈221〉<222><223>〈400〉引物P3(1)…(27)3catatgaactctttgaacacacaattc27<210〉4<211〉30<212>DNA〈213〉人工合成<220>〈221>引物P4〈222〉(1)..(30)<223><400>4aagctttcaatgatgatgatgatgatggtc30〈210>5〈211>35〈212〉DNA〈213〉人工合成<220><221>引物P5<222>(1)..(35)<223〉〈400〉5ggtttaaaggtggagatttgataggtggtatgttt35〈210〉6〈211〉35<212>DNA〈213>人工合成<220〉<221>引物P6〈222〉(1)..(35)〈223〉<400>6cttggtcaagttgcgcatgtgtacattcctctctt35〈210>7〈211〉35<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物P7〈222〉(1)..(35)<223>〈400〉7aagagaggaatgtacacatgcgcaacttgacc肪g35<210>8<211>28<212〉DNA<213>人工合成<220><221>引物P8<222>(l)..(28)<223><400>8cata/tgtgctgcagctgaggcatgtgtt28<210〉9<211>28<212>DNA<213>人工合成<220>〈221〉引物P9<222〉(1)..(28)<223〉<400〉9ggcgtacgtatttattaacttctcctag28<210>10<211>35<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物PIO<222>(1)..(35)〈223〉<400〉10aaacataccacctatcaaatctccacctttaaacc3權(quán)利要求1.表達(dá)harpin蛋白的重組載體pM43HF，其特征在于，是通過以下方法構(gòu)建而成的id="icf0001"file="A2008100214590002C1.tif"wi="3"he="3"top="36"left="26"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>1)Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP構(gòu)建以登錄號為GenBankAY875714的harpin蛋白編碼基因hrf2為模板，設(shè)計引物P1和P2，P1CCGAATTCATGAACTCTTTGAACACACAEcoRIP2TCTAGAATCTGCATTGATGCGCTGTCGXbaIPCR擴增條件為95℃，4min；94℃，45s；57℃，30s；72℃，30s；30個循環(huán)；72℃，10min，擴增片段大小為427bp，將純化的片段用EcoRI和XbaI雙酶切，克隆到酵母表達(dá)載體pPICZaA相同的酶切位點，得到了Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP；2)大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體pMA5HF的構(gòu)建以Harpin蛋白酵母表達(dá)載體pPICZHP為模板，設(shè)計引物P3和P4，P3CATATGAACTCTTTGAACACACAATTCNdeIP4AAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGGTCIindIII擴增的條件為95℃，4min；94℃，45s；58℃，30s；72℃，30s；30個循環(huán)；72℃，10min；擴增的基因片段大小為492bp，將擴增的片段用NdeI和HindIII雙酶切后，克隆到載體pMA5相應(yīng)的酶切位點，得到了大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體pMA5HF；2、中間載體pMD18P43SP的構(gòu)建1)以枯草芽孢桿菌168的基因組為模板，用引物P5和P6擴增登錄號為GenBankK02174的P43啟動子片段，擴增的程序為95℃，4min；94℃，45s；62℃，30s；72℃，30s；30個循環(huán)；72℃，10min；擴增的片段大小為335bp；P5GGTTTAAAGGTGGAGATTTGATAGGTGGTATGTTTP6CTTGGTCAAGTTGCGCATGTGTACATTCCTCTCTT2)以枯草芽孢桿菌168的基因組為模板，用引物P7和引物P8擴增登錄號為GenBankM62845的nprB信號肽編碼基因序列，擴增的程序為95℃，4min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，45s；30個循環(huán)；72℃，10min；擴增獲得的nprB信號肽編碼基因片段大小為112bp；P7AAGAGAGGAATGTACACATGCGCAACTTGACCAAGP8CATATGTGCTGCAGCTGAGGCATGTGTTNdeI3)以上述擴增獲得的P43片段和nprB信號肽編碼序列片段為模板，用引物為P5和P8，采用重迭PCR方法將兩種組件融合，得到P43+nprB片段，該融合片段的大小為412bp，擴增的程序為95℃，4min；94℃，45s；60℃，30s；72℃，30s；30個循環(huán)；72℃，10min；4)以載體pMA5為模板，設(shè)計引物為P9和P10，擴增包含ble編碼基因(GenBankM19465)的片段，擴增程序為95℃，4min；94℃，45s；61℃，45s；72℃，1min；30個循環(huán)；72℃，10min；擴增的ble編碼基因片段大小為815bp；P9GGCGTACGTATTTATTAACTTCTCCTAGSnaBIP10AAACATACCACCTATCAAATCTCCACCTTTAAACC5)以上述擴增獲得的P43+nprB和ble片段為模板，引物為P9和P8，再次采用重迭PCR方法將兩個片段融合，擴增的程序為5℃，4min；94℃，45s；61℃，45s；72℃，1.3min；30個循環(huán)；72℃，10min；得到的ble+P43+nprB片段的大小為1194bp；然后將純化的ble+P43+nprB片段進行TA克隆反應(yīng)，將片段克隆到測序載體pMD18T，測序正確后，得到了重組載體pMD18P43SP；3、枯草芽孢桿菌Harpin蛋白表達(dá)載體pM43HF的構(gòu)建為了將載體pMA5的HpaII啟動子替換為P43啟動子和nprB信號肽編碼序列，用SnaBI和NdeI對pMD18P43SP進行雙酶切，回收得到的ble+P43+nprB片段克隆到pMAHF相應(yīng)的酶切位點，得到了重組載體pM43HF。2.用權(quán)利要求1所述的表達(dá)harpin蛋白的載體pM43HF所構(gòu)建的工程菌。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用載體pM43HF所構(gòu)建的的工程菌，其特征在于，采用感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)harpin蛋白的表達(dá)載體pM43HF轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌菌株WB800、枯草芽孢桿菌菌株0KB105、枯草芽孢桿菌菌株Gl或枯草芽孢桿菌菌株69中構(gòu)建表達(dá)harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌。4.用權(quán)利要求2或3所述工程菌制備的生物制品。5.用權(quán)利要求2或3所述工程菌制備生物制品的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基:按照每升培養(yǎng)液中含1020g葡萄糖或1020g蔗糖或2535g玉米漿，0.5lg酵母提取物，0.5g谷氨酸鈉，0.5gMgS04，0.5gKCl，lgKH2P04，0.15mgFe2S04.6H20，5.0mgMnS04.H20，0.16mgCuS04'5H20，調(diào)pH范圍為6.87.0，加水至1L;按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的13%加入權(quán)利要求2或3所述基因工程菌種子菌，溫度3037°C，轉(zhuǎn)速300800r/min，溶氧30%，發(fā)酵3036h，發(fā)酵結(jié)束后直接利用發(fā)酵液，即為生物制品；或?qū)l(fā)酵液離心收集芽孢，收集的芽孢經(jīng)真空干燥，加入質(zhì)量比99%的玉米淀粉制成生物制品。6.權(quán)利要求4或5所述生物制品的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述生物制品的應(yīng)用，其特征在于將濃度為l5xl06_l5xl08cfWml的權(quán)利要求4或5所述的生物制品進行植物種子處理，灌根或噴施植物表面13次，用于促進植物生長和防治水稻稻瘟病、水稻紋枯病、小麥根腐病、小麥白粉病、小麥赤霉病、番茄青枯病、番茄早疫病、辣椒疫病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、黃瓜根腐病、黃瓜灰霉病、黃瓜霜霉病和青菜霜霉病以及岈蟲。全文摘要本發(fā)明涉及表達(dá)harpin蛋白的重組載體pM43HF及其工程菌，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。將harpin蛋白編碼基因hrf2克隆到表達(dá)載體pMA5中構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)harpin蛋白的載體pM43HF，將pM43HF轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中構(gòu)建能夠表達(dá)和分泌harpin蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌。將基因工程菌在Landy等多種培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵液和芽孢制品用于處理植物根部和葉片，能夠顯著促進植物生長和防治植物病蟲害，并增加植物產(chǎn)量，是應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的綠色環(huán)保多功能生物制品。在大田和保護地用于植物病蟲害的無公害防治的使用方法，在不同種農(nóng)作物上防治效果達(dá)55％～89％，增產(chǎn)8％～24％。文檔編號C12N1/21GK101338319SQ200810021459公開日2009年1月7日申請日期2008年8月15日優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日發(fā)明者喬俊卿,伍輝軍,帥王,王金生,敏邵,高學(xué)文申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)