專利名稱：兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
兔病毒性出血癥是1984年首次在我國(guó)蘇南地區(qū)爆發(fā)的一種兔的烈性傳染病。主 要危害青年和成年兔，死亡率高達(dá)90%以上，而對(duì)2月齡以下的幼年兔不致病。該病的病理 變化以全身各實(shí)質(zhì)器官出血為特征，尤其以氣管、肺、肝、腎最為明顯。該病流行期間，在疫 區(qū)兔場(chǎng)使用各類抗菌素，磺胺類藥物進(jìn)行治療，均未能降低發(fā)病率和死亡率。目前在疫區(qū)采 集、分離、鑒定、選育得到了一株免疫原性良好的兔病毒性出血癥病毒CD85—2株，用于滅活疫 苗的生產(chǎn)，在四川地區(qū)使用有很好的預(yù)防效果。 兔巴氏桿菌病是由兔多殺性巴氏桿菌引起的兔的出血性敗血癥。引起家兔出血 性敗血癥死亡的多殺性巴氏桿菌的血清型是A型，目前全國(guó)各廠家生產(chǎn)預(yù)防該病的疫苗較 多，使用菌株差異很大。由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管、供應(yīng)的兔源莢膜A群多殺性巴 氏桿菌C『17作生產(chǎn)用菌種，實(shí)踐證明該菌種的免疫原性良好。然而根據(jù)現(xiàn)有疫苗的制備方 式，將病毒毒株或者菌株滅活后制備而成的疫苗，常常存在生物安全性差、副反應(yīng)大、產(chǎn)品 質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。目前世界上很多國(guó)家已經(jīng)停止使用滅活疫苗，也禁止從使用滅活疫苗 的國(guó)家進(jìn)口畜產(chǎn)品。 隨著養(yǎng)兔業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展，其他幾大阻礙養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的傳染病仍然流行， 如巴氏桿菌病、魏氏梭菌病等嚴(yán)重威脅養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了 滿足養(yǎng)兔業(yè)疾病防治的需要，需要研制出針對(duì)巴氏桿菌病和兔病毒性出血癥均為有效的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一目的是提供了一種制備安全性好的兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌 病二聯(lián)滅活疫苗的方法。 本發(fā)明提供了一種制備兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的方 法，該方法包括以下步驟 a.首先將兔病毒出血癥毒株CDsH接種于家兔，采集接種后24-96小時(shí)以內(nèi)死亡 家兔的心、肝、脾、肺或腎，并剔除心、肝、脾、肺或腎上的結(jié)締組織； b.將剔除結(jié)締組織的死亡家兔的心、肝、脾、肺或腎搗碎、過(guò)濾后配成乳劑，并對(duì)該 乳劑進(jìn)行滅活； c.將兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17菌株進(jìn)行復(fù)活，再將復(fù)活后的菌株進(jìn)行增 殖培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17菌液進(jìn)行滅活；
d.將步驟c得到的滅活后的菌液與佐劑進(jìn)行混合，靜止，得到含有兔源莢膜A群多 殺性巴氏桿菌C『17的菌液； e.將步驟b得到的滅活乳劑和步驟d得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌
4。51—17的菌液混合，得到兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗。
優(yōu)選地，在所述的步驟d和步驟e之間還包括以下步驟將所述的含有兔源莢膜A 群多殺性巴氏桿菌C『u的菌液進(jìn)行濃縮，使得該菌液中兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C『17 的濃度為濃縮前的1. 5倍。 滅活后的菌液進(jìn)行濃縮，使得A型多殺性巴氏桿菌C『17的濃度為濃縮前的1.5倍。
本發(fā)明中的兔病毒性出血癥病毒CD^2是發(fā)明人從四川滎經(jīng)、酉陽(yáng)、雅安和成都郊 區(qū)四個(gè)疫區(qū)采集回?cái)?shù)個(gè)自然感染毒，從血凝價(jià)、特異性、毒力、免疫原性、純凈性方面進(jìn)行鑒 定，篩選出的毒力強(qiáng)、免疫原性好、血凝價(jià)高的菌株。所述兔病毒性出血癥病毒(拉丁名 Rabbit hemorrhagicdisease virus) CD85—2，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 2705，該病毒毒株已于 2008年10月14日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽(yáng) 區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)進(jìn)行了生物材料保藏。
引起家兔出血性敗血癥死亡的多殺性巴氏桿菌的血清型是A型，目前全國(guó)各廠家 生產(chǎn)預(yù)防該病的疫苗較多，使用菌株差異很大。所述兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌(拉 丁名Rabbit Pasteurella. multocida capsularserotypes A)C51—17菌株，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 2704，該菌株已于2008年10月14日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心(CGMCC，北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)進(jìn)行了生 物材料保藏。所述的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌的簡(jiǎn)稱為兔多殺巴氏桿菌。
優(yōu)選地，在所述的步驟d或步驟e之后還包括以下步驟向步驟d得到的含有兔源 莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17的菌液或步驟e得到的混合菌液中添加防腐劑。
該防腐劑優(yōu)選為硫柳汞。 優(yōu)選地，兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗中含有0. 05-0. 07g/ 頭份的搗碎家兔的心、肝、脾、肺或腎和50-103億個(gè)菌/頭份的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿 菌C『17。在該滅活疫苗中，每頭份的量為lml。因?yàn)樵谠撘呙缰袑?duì)搗碎家兔的心、肝、脾、肺 或腎的量有要求，在該疫苗中，只要搗碎家兔的心、肝、脾、肺或腎的量在0. 05-0. 07g/頭份 范圍內(nèi)就可以滿足要求。同樣對(duì)于該疫苗中的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C『17，只要該 菌種的量在50-103億個(gè)菌/頭份就可以滿足要求。 優(yōu)選地，所述的步驟a為將兔病毒性出血癥毒株CD85—2用生理鹽水作10倍稀釋， 接種體重1. 5-2. 0kg的家兔，每只皮下注射lml，無(wú)菌采集接種后24-96小時(shí)以內(nèi)死亡時(shí)間 在1小時(shí)內(nèi)家兔的具有組織病理變化的心、肝、脾、肺或腎。 優(yōu)選地，無(wú)菌采集接種后24-96小時(shí)以內(nèi)死亡時(shí)間在1小時(shí)內(nèi)家兔的具有組織病 理變化的肝或脾。 優(yōu)選地，家兔選自2月齡以上的1. 5-2. 0kg體重的兔病毒出血癥抗體為陰性的家 兔。本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)家兔的年齡只要在2月齡以上均可，即使老年的家兔不受影響。
兔病毒性出血癥病毒只對(duì)2月齡以上家兔易感染，對(duì)其他動(dòng)物不感染，同時(shí)難以 在細(xì)胞培養(yǎng)方面取得突破，因此采用兔病毒性出血癥毒株CD85—2增殖病毒用易感家兔來(lái)生 產(chǎn)病毒，其標(biāo)準(zhǔn)為來(lái)自非疫區(qū)的未經(jīng)免疫的，體重在1. 5kg-2. 0kg的健康抗體陰性家兔。通 過(guò)在實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)和中試的規(guī)?；a(chǎn)中，一直采用此要求的家兔生產(chǎn)病毒，生產(chǎn)病毒技 術(shù)穩(wěn)定，病毒增殖滴度始終可保持在21Q個(gè)菌/ml以上。 優(yōu)選地，步驟b為將剔除結(jié)締組織的死亡家兔的心、肝、脾、肺或腎用生理鹽水搗
5碎，過(guò)濾后配成乳劑，乳劑中搗碎的心、肝、脾、肺或腎與生理鹽水重量比為i : 9。 優(yōu)選地，步驟b加入按乳劑重量計(jì)0. 4%的甲醛，在30-40。C滅活36-48小時(shí)。
更優(yōu)選地，在37t:滅活36小時(shí)，在滅活時(shí)每間隔4_6小時(shí)攪拌一次。
發(fā)明人分別用濃度為O. 2%、0. 3%、0. 4%和0. 5%的甲醛溶液，37"滅活36、48小 時(shí)，滅活結(jié)束后用二只易感家兔作滅活檢驗(yàn)。當(dāng)甲醛濃度為0. 2-0. 3%時(shí)，37t:滅活36或 48小時(shí)，經(jīng)滅活檢驗(yàn)證明不能將病毒完全滅活；當(dāng)甲醛濃度為0. 4%時(shí)，接種家兔無(wú)任何不 良反應(yīng)，證明確實(shí)滅活；當(dāng)甲醛濃度為0. 5%時(shí)，部分家兔有短暫停食現(xiàn)象，表明甲醛過(guò)量。 因此采用乳劑重量為0. 4%的甲醛在37t:滅活36小時(shí)。 優(yōu)選地，步驟c將兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17菌株接種于含0. 1 %裂解血 球全血的馬丁肉湯中，37t:培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行復(fù)活，再將復(fù)活的菌株接種于含0. 1%裂解血 球全血及4%健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)，在36-37t:下，增殖培養(yǎng) 18-24小時(shí)。 優(yōu)選地，在步驟d中向增殖得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17的菌液 中加入其總重量O. 15%的甲醛，在30_40"滅活10-15小時(shí)。
更優(yōu)選在37"滅活12小時(shí)。 經(jīng)檢驗(yàn)合格的A型多殺性巴氏桿菌液，經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)按總量的0. 15%加 入甲醛溶液，于37t:滅活12小時(shí)，其間攪拌數(shù)次。滅活結(jié)束后用馬丁瓊脂作滅活檢驗(yàn)，無(wú)菌 生長(zhǎng)，證實(shí)該菌已經(jīng)滅活。 優(yōu)選地，步驟e中的佐劑為鋁鹽，滅活后的菌液和鋁鹽的重量比為5 : 1。 優(yōu)選地，步驟a中的兔病毒性出血癥病毒CD85—2毒株和步驟c中的兔源莢膜A群多
殺性巴氏桿菌C51—17菌株均為繼代3代以內(nèi)的菌株。 發(fā)明人通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)菌株的傳代研究和鑒定，以及對(duì)生產(chǎn)用菌株的鑒定，A型多殺性 巴氏桿菌基礎(chǔ)種子傳代次數(shù)7代，生產(chǎn)菌種采用傳代7代后繼代不超過(guò)3代的菌種；兔病毒 性出血癥CD85—2基礎(chǔ)毒種傳代次數(shù)為6代，生產(chǎn)毒種采用傳代6代后繼代不超過(guò)3代的菌 種，可保證疫苗的免疫效果。 與現(xiàn)有技術(shù)不同的是本發(fā)明沒有直接采用兔病毒性出血癥毒株CD85—2制備疫苗， 而是首先將其接種于家兔，采集接種后24-96小時(shí)以內(nèi)死亡家兔的心、肝、脾、肺或腎，并剔 除心、肝、脾、肺或腎上的結(jié)締組織，將剔除結(jié)締組織的死亡家兔的心、肝、脾、肺或腎搗碎、 過(guò)濾后配成乳劑，并滅活該乳劑，將滅活的乳劑和培養(yǎng)得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴 氏桿菌C『17的滅活菌液混合得到本發(fā)明的疫苗。相對(duì)于直接將兔病毒性出血癥毒株CD^2 和兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C『17滅活后制成的滅活疫苗，按此方法得到的疫苗的安全 性更好，同時(shí)也可以保證疫苗的免疫效果。進(jìn)行本發(fā)明采用本發(fā)明方法獲得的兔病毒性出 血癥、A型多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗經(jīng)安全性檢驗(yàn)皮下或肌肉注射接種于1月齡的 易感染家兔，與接種生理鹽水的家兔對(duì)照，免疫注射的家兔精神狀態(tài)無(wú)異常、食欲正常、體 溫?zé)o變化，注射部位無(wú)不良反應(yīng)。同時(shí)接種于懷孕健康的母兔進(jìn)行安全性檢測(cè)，結(jié)果表明免 疫后的妊娠母兔，經(jīng)過(guò)觀察，妊娠母兔的精神狀態(tài)無(wú)異常、食欲正常、體溫?zé)o變化，注射部位 無(wú)不良反應(yīng)，產(chǎn)仔正常，因此通過(guò)本發(fā)明方法制備而成的疫苗是安全的。
本發(fā)明方法獲得的疫苗的免疫效力檢驗(yàn)通過(guò)本發(fā)明方法制備而成的6批實(shí)驗(yàn) 室產(chǎn)品分別免疫經(jīng)抗體檢測(cè)均為陰性的健康斷奶仔兔及成年兔進(jìn)行免疫，免疫后分別對(duì)斷
6奶仔兔及成年兔進(jìn)行攻毒，其結(jié)果表明疫苗后斷奶仔兔，對(duì)兔病毒性出血癥保護(hù)率均為 100%，對(duì)兔多殺巴氏桿菌有75%的保護(hù)率；用該疫苗免疫成年兔，對(duì)兔病毒性出血癥保護(hù) 率均為100% ;對(duì)兔多殺巴氏桿菌有75%以上的保護(hù)率。 關(guān)于疫苗的免疫期，用實(shí)驗(yàn)室制備疫苗在兔場(chǎng)進(jìn)行免疫期試驗(yàn)，結(jié)果表明該疫苗 的免疫期兔病毒性出血癥為12個(gè)月，兔多殺巴氏桿菌病免疫期5個(gè)月。這可滿足臨床上 對(duì)家兔的免疫要求。 關(guān)于疫苗的保存期，將采用本發(fā)明方法制備而成的疫苗存放在2-8t:陰暗處達(dá)到 12個(gè)月及20-25t:條件下存放10天。以1個(gè)使用劑量對(duì)1. 5-2. Okg健康易感家兔進(jìn)行免 疫，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，均得到保護(hù)，這充分證實(shí)在上述保存條件和保存期內(nèi)，疫苗質(zhì)量沒 有發(fā)生改變。 關(guān)于疫苗的最小免疫劑量，發(fā)明人在研制過(guò)程中進(jìn)行了疫苗對(duì)家兔的最小免疫劑 量的測(cè)定，同時(shí)設(shè)相應(yīng)非免疫兔作為對(duì)照。免疫后14、21天分別進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果證 實(shí)該疫苗最小免疫劑量為0. 5ml?？紤]臨床注射的方便及生產(chǎn)成本、免疫效果保證，將該疫 苗使用劑量定為lml。


本發(fā)明提供的兔病毒性出血癥病毒(拉丁名Rabbit hemorrhagicdisease virus)CDsH，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 2705，該病毒毒株已于2008年10月14日在中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物 研究所，郵編100101)進(jìn)行了生物材料保藏。 所述兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌(拉丁名Rabbit Pasteurella. multocida c即sular serotypes A) C51—17菌株，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 2704，該菌株已于2008年10 月14日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)進(jìn)行了生物材料保藏。 圖1表示制備本發(fā)明的兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的流程 圖。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 兔病毒出血癥CD^2毒株的傳代培養(yǎng) 將保藏后的兔病毒性出血癥毒株CD^2用生理鹽水作10倍稀釋，接種于二月齡的， 來(lái)自非疫區(qū)的未經(jīng)免疫的，體重在1. 5kg的健康抗體陰性家兔。每只皮下注射lml，在該 家兔中的病毒滴度可保持在2"個(gè)菌/ml以上。無(wú)菌采集接種后24-96小時(shí)內(nèi)死亡的體重 1. 5kg的家兔，無(wú)菌采集死亡時(shí)間不超過(guò)1小時(shí)的家兔且具有組織病理變化的心、肝、肺、脾 或腎，并剔除其上的結(jié)締組織，本例中選肝作為毒種。 采用傳3代的毒株CD^2接種，將剔除結(jié)締組織的死亡兔的心、肝、肺、脾或腎，優(yōu)選 肝加生理鹽水搗碎、過(guò)濾配制成搗碎的內(nèi)臟器官與生理鹽水的體積比為1 : 9的組織乳劑， 再分別加入濃度為0. 2%、0. 3%、0. 4%和0. 5%的甲醛溶液進(jìn)行滅活，滅活條件為37t:滅 活36小時(shí)，間隔4-6小時(shí)攪拌一次，滅活結(jié)束后用二只易感家兔作滅活檢驗(yàn)。當(dāng)甲醛濃度為0. 2-0. 3%時(shí)，371:滅活36、48小時(shí)，經(jīng)滅活檢驗(yàn)證明不能將病毒完全滅活；當(dāng)甲醛濃度 為0. 4%時(shí)，接種家兔無(wú)任何不良反應(yīng)，證明確實(shí)滅活；當(dāng)甲醛濃度為0. 5%時(shí)，部分家兔有 短暫停食現(xiàn)象，表明甲醛過(guò)量。所以選擇的滅活條件為用濃度為0.4%的甲醛進(jìn)行滅活， 滅活溫度為37°C ，持續(xù)的滅活時(shí)間36小時(shí)，并且在滅活時(shí)每隔4小時(shí)攪拌一次，得到滅活的 乳劑。 將保藏的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17菌株接種于含0. 1 %裂解血球全血的 馬丁肉湯中，37t:培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行復(fù)活，再將復(fù)活的菌株接種于含0. 1%裂解血球全血及 4%健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)，在361:下，增殖培養(yǎng)18小時(shí)。本實(shí) 施例中的含O. 1%的裂解血球全血的馬丁肉湯購(gòu)自于青島生命科學(xué)院青島高科園海博生物 技術(shù)公司，商品名為改良馬丁液體培養(yǎng)基。含O. 1%的裂解血球全血及4%健康動(dòng)物血清的 改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基由本單位自行配制，其配方如下改良馬丁肉湯1000ml，5g蛋白 胨，10g瓊脂。 向增殖培養(yǎng)得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17菌液中加入其總重量 0. 15%的甲醛，在371:滅活12小時(shí)。滅活結(jié)束后用馬丁瓊脂作滅活檢驗(yàn)，無(wú)菌生長(zhǎng)，確認(rèn)已 滅活，將滅活后的菌液5體積份加入滅菌鋁鹽1體積份，靜止靜置2-3日，去除上清液，使其 進(jìn)行濃縮，濃縮后菌液中的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌的濃度為濃縮前兔源莢膜A群多 殺性巴氏桿菌濃度的1.5倍，即為制疫苗用菌液抗原。再向該菌液抗原中加入相對(duì)于兔源 莢膜A群多殺性巴氏桿菌菌液體積比為1 : 1的CD^2的滅活乳劑，按菌液和乳劑總重量的 0.01%加入硫柳汞，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制成兔病毒性出血癥、兔巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗。經(jīng) 檢驗(yàn)，該疫苗中含有0. 05g/頭份的搗碎家兔的內(nèi)臟和50億個(gè)菌/頭份的兔源莢膜A群多 殺性巴氏桿菌C『17。 按以上工藝我們生產(chǎn)了六批實(shí)驗(yàn)室制品和六批臨床試驗(yàn)用疫苗共150萬(wàn)頭份，合 格率100%，證實(shí)該工藝是完善和可行的。
實(shí)施例2 將保藏后的兔病毒性出血癥毒株CD85—2用生理鹽水作10倍稀釋，接種于5年齡的， 來(lái)自非疫區(qū)的未經(jīng)免疫的，體重在2. Okg的健康抗體陰性家兔。每只皮下注射lml，在該家 兔中的病毒滴度可保持在21Q以上。無(wú)菌采集接種后24-96小時(shí)內(nèi)死亡的體重2. Okg的家 兔，無(wú)菌采集死亡時(shí)間不超過(guò)1小時(shí)的家兔且具有組織病理變化的心、肝、肺、脾或腎，并剔 除其上的結(jié)締組織，本例中選脾作為毒種。 采用傳3代的毒株CD85—2接種，將剔除結(jié)締組織的死亡兔的心、肝、肺、脾或腎，選 脾加生理鹽水搗碎、過(guò)濾配制成搗碎的內(nèi)臟器官與生理鹽水的體積比為1 : 9的組織乳劑， 再分別加入濃度為0. 2%、0. 3%、0. 4%和0. 5%的甲醛溶液進(jìn)行滅活，滅活條件為37t:滅 活36小時(shí)，間隔4-6小時(shí)攪拌一次，滅活結(jié)束后用二只易感家兔作滅活檢驗(yàn)。當(dāng)甲醛濃度 為0. 2-0. 3%時(shí)，371:滅活36、48小時(shí)，經(jīng)滅活檢驗(yàn)證明不能將病毒完全滅活；當(dāng)甲醛濃度 為0. 4%時(shí)，接種家兔無(wú)任何不良反應(yīng)，證明確實(shí)滅活；當(dāng)甲醛濃度為0. 5%時(shí)，部分家兔有 短暫停食現(xiàn)象，表明甲醛過(guò)量。所以選擇的滅活條件為用濃度為0.4%的甲醛進(jìn)行滅活， 滅活溫度為37°C ，持續(xù)的滅活時(shí)間36小時(shí)，并且在滅活時(shí)每隔6小時(shí)攪拌一次，得到滅活的 乳劑。 將保藏的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17菌株接種于含0. 1 %裂解血球全血的馬丁肉湯中，37t:培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行復(fù)活，再將復(fù)活的菌株接種于含0. 1%裂解血球全血及 4%健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)，在361:下，增殖培養(yǎng)18小時(shí)。本實(shí) 施例中的含O. 1%的裂解血球全血的馬丁肉湯購(gòu)自于青島生命科學(xué)院青島高科園海博生物 技術(shù)公司的商品名為改良馬丁液體培養(yǎng)基。含O. 1%的裂解血球全血及4%健康動(dòng)物血清 的改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基自行配制，其配方如下改良馬丁肉湯1000ml，5g蛋白胨，10g 瓊脂。 向增殖培養(yǎng)得到的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C『17菌液中加入其總重量 0. 15%的甲醛，在371:滅活12小時(shí)。滅活結(jié)束后用馬丁瓊脂作滅活檢驗(yàn)，無(wú)菌生長(zhǎng)，確認(rèn)已 滅活，將滅活后的菌液5體積份加入滅菌鋁鹽1體積份，靜止靜置2-3日，去除上清液，使其 進(jìn)行濃縮，濃縮后菌液中的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌的濃度為濃縮前的1.5倍，即為制 疫苗用菌液抗原。再向該菌液抗原中加入其重量的0. 02%的硫柳汞，再向該菌液抗原中加 入相對(duì)于A型多殺性巴氏桿菌菌液體積比為1 : 1的CD^2的滅活乳劑，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?成兔病毒性出血癥、兔巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗。經(jīng)檢驗(yàn)，該疫苗中含有0. 05g/頭份的搗 碎家兔的心、肝、脾、肺或腎和50億個(gè)菌/頭份的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17。
按以上工藝我們生產(chǎn)了六批實(shí)驗(yàn)室制品和六批臨床試驗(yàn)用疫苗共150萬(wàn)頭份，合 格率100%，證實(shí)該工藝是完善和可行的。
實(shí)施例3
疫苗的安全性檢驗(yàn) 將按照實(shí)施例1方法或得到的疫苗皮下或肌肉單劑量lml接種1月齡健康易感家 兔進(jìn)行安全性試驗(yàn)將試制的疫苗皮下或肌肉接種1月齡健康易感家兔各4只，lml/只，另 外向4只家兔同時(shí)注射lml/只的滅菌生理鹽水的非免疫對(duì)照，測(cè)定體溫，觀察10日。結(jié)果 免疫注射后，精神狀態(tài)無(wú)異常，食欲正常，體溫?zé)o明顯變化，注射部位無(wú)炎癥等不良反應(yīng)。
皮下或肌肉單劑量lml重復(fù)接種1月齡健康易感家兔的安全性試驗(yàn)將試制的疫 苗皮下或肌肉接種1月齡健康易感家兔各4只，lml/只，7天后重復(fù)接種一次，另設(shè)4只家 兔同時(shí)注射并重復(fù)注射lml/只滅菌生理鹽水的非免疫對(duì)照，測(cè)定體溫，觀察10日。結(jié)果免 疫注射后，精神狀態(tài)無(wú)異常，食欲正常，體溫?zé)o明顯變化，注射部位無(wú)炎癥等不良反應(yīng)。
皮下或肌肉超劑量4ml接種1月齡健康易感家兔的安全性試驗(yàn)將試制的疫苗皮 下或肌肉接種1月齡健康易感家兔各4只，4ml/只，另設(shè)4只家兔同時(shí)注射4ml/只滅菌生 理鹽水的非免疫對(duì)照，測(cè)定體溫，觀察IO日。結(jié)果免疫注射后，精神狀態(tài)無(wú)異常，食欲正常， 體溫?zé)o明顯變化，注射部位無(wú)炎癥等不良反應(yīng)。 皮下或肌肉兩倍劑量2ml接種懷孕健康易感妊娠10-15天母兔的安全性試驗(yàn)將
試制的疫苗皮下或肌肉接種妊娠10-15天健康易感家兔各4只，2ml/只，另設(shè)4只同時(shí)并重
復(fù)注射lml/只滅菌生理鹽水的非免疫對(duì)照，測(cè)定體溫，觀察產(chǎn)仔情況等。結(jié)果免疫注射后，
精神狀態(tài)無(wú)異常，食欲正常，體溫?zé)o明顯變化，注射部位無(wú)炎癥等不良反應(yīng)，產(chǎn)仔情況正常。 以上試驗(yàn)結(jié)果表明該疫苗是安全的。 實(shí)施例4 疫苗效力的檢驗(yàn)6批實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品(0201001、0202002、0202003、0202004、0202005、0202006)分別免
疫經(jīng)抗體檢測(cè)均為陰性的健康斷奶仔兔及成年兔各4只/組，lml/只，免疫后14、21天，
9將條件相同的對(duì)照兔和斷奶仔兔及成年兔一起分別進(jìn)行攻毒，其結(jié)果0201001-0202006 批疫苗分別免疫斷奶仔兔，對(duì)兔病毒性出血癥保護(hù)率均為100%，對(duì)照死亡率為15/16 ; 兔巴氏桿菌保護(hù)率分別為3/4、 3/4、 3/4、 3/4即約有75 %的保護(hù)率，對(duì)照保護(hù)率為0 % 。 0201001-0202006批疫苗分別免疫成年兔，對(duì)兔病毒性出血癥保護(hù)率均為100%，對(duì)照死亡 14/16 ;兔巴氏桿菌保護(hù)率分別為4/4、3/4、3/4、3/4即有75%以上的保護(hù)率，對(duì)照保護(hù)率為 0%。 由此我們確定該疫苗成品檢驗(yàn)中對(duì)兔病毒性出血癥攻毒免疫保護(hù)4/4，對(duì)兔多殺 性巴氏桿菌病攻毒免疫保護(hù)3/4，因此本發(fā)明方法制備而成的疫苗對(duì)兔病毒性出血癥和兔 多殺性巴氏桿菌病均有保護(hù)效力。
實(shí)施例5
疫苗免疫期 用實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的6批疫苗(0201001、0202002、0202003、0202004、0202005、 0202006)在定點(diǎn)自繁兔場(chǎng)進(jìn)行免疫期試驗(yàn)，每批疫苗分5組，每組各接種10只1. 5-2. 0kg 易感家兔和1月齡斷奶仔兔，每只皮下注射1個(gè)使用劑量，各組分兩部分，同時(shí)設(shè)立5只非 免疫兔作為空白對(duì)照。經(jīng)免疫120日、180日、240日、300日、360日后，作攻毒保護(hù)試驗(yàn)，其 結(jié)果兔病毒性出血癥免疫保護(hù)一直為100%，兔巴氏桿菌病150天免疫保護(hù)仍有75%的保 護(hù)率。 因此規(guī)定該疫苗的免疫期兔病毒性出血癥為12個(gè)月，兔巴氏桿菌病免疫期5個(gè)
月。這可滿足臨床上對(duì)家兔的免疫要求。 實(shí)施例6 疫苗保存期試驗(yàn) 將四批實(shí)驗(yàn)室制品存放在2-8t:陰暗處9個(gè)月、12個(gè)月、15個(gè)月、18個(gè)月及 20-25t:條件下存放IO天。以1個(gè)使用劑量對(duì)1. 5-2. Okg健康易感家兔進(jìn)行免疫，分別在免 疫后14、21天分別進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，均得到保護(hù)，充分證實(shí)在上述保存條件和保存期內(nèi)， 疫苗質(zhì)量沒有發(fā)生改變。因此該疫苗在2-8t:的保存條件下，保存期為可以達(dá)到12個(gè)月。
實(shí)施例7 關(guān)于疫苗最小免疫劑量的確定 我們?cè)谘兄七^(guò)程中進(jìn)行了疫苗對(duì)家兔的最小免疫劑量的測(cè)定，結(jié)果證實(shí)采用將 疫苗以0. 25ml、0. 5ml、0. 75ml、lml四種不同劑量組免疫1. 5kg左右健康易感家兔，同時(shí)設(shè) 相應(yīng)非免疫兔作為對(duì)照。免疫后14、21天分別進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，其結(jié)果0. 25ml組兔病 毒性出血癥免疫保護(hù)3/4，兔巴氏桿菌免疫保護(hù)為2/4 ;0. 5ml、0. 75ml、lml組兔病毒性出血 癥免疫保護(hù)均為4/4，兔巴氏桿菌病免疫保護(hù)為3/4、3/4、3/4。通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)該疫苗最小免 疫劑量定為O. 5ml。
10
權(quán)利要求
一種制備兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的方法，該方法包括以下步驟a.首先將兔病毒性出血癥毒株CD85-2接種于家兔，采集接種后24-96小時(shí)以內(nèi)死亡家兔的心、肝、脾、肺或腎，并剔除心、肝、脾、肺或腎上的結(jié)締組織；b.將剔除結(jié)締組織的死亡家兔的心、肝、脾、肺或腎搗碎、過(guò)濾后配成乳劑，并對(duì)該乳劑進(jìn)行滅活；c.將兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51-17菌株進(jìn)行復(fù)活，再將復(fù)活后的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51-17菌液進(jìn)行滅活；d.將步驟c得到的滅活后的菌液與佐劑進(jìn)行混合，靜止，得到含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51-17的菌液；e.將步驟b得到的滅活乳劑和步驟d得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51-17的菌液混合，得到兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，優(yōu)選地，在所述的步驟d和步驟e之間還包括以下步驟將所述的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51-17的菌液進(jìn)行濃縮，使得該菌液中兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51-17的濃度為濃縮前的1.5倍。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述的步驟d或步驟e之后還包括以下步驟 向步驟d得到的含有兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17的菌液或步驟e得到的混合菌液 中添加防腐劑，該防腐劑優(yōu)選為硫柳汞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的方法，其中步驟e得到的兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿 菌病二聯(lián)滅活疫苗中含有0. 05-0. 07g/頭份的搗碎家兔的心、肝、脾、肺或腎和50-103億個(gè) 菌/頭份的兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的步驟a為將兔病毒性出血癥 毒株CD85—2用生理鹽水作10倍稀釋，接種體重1. 5-2. Okg的家兔，每只皮下注射lml，無(wú)菌 采集接種后24-96小時(shí)以內(nèi)死亡時(shí)間在1小時(shí)內(nèi)家兔的具有組織病理變化的心、肝、脾、肺 或腎，優(yōu)選地，無(wú)菌采集接種后24-96小時(shí)以內(nèi)死亡時(shí)間在1小時(shí)內(nèi)的家兔的具有組織病理 變化的肝或脾。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中的家兔選自2月齡以上的1.5-2.0kg 體重的兔病毒性出血癥抗體為陰性的家兔。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中的步驟b為將剔除結(jié)締組織的死亡家 兔的心、肝、脾、肺或腎用生理鹽水搗碎，過(guò)濾后配成乳劑，乳劑中搗碎的心、肝、脾、肺或腎 與生理鹽水重量比為1:9。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b加入按乳劑重量計(jì)0.4X的甲 醛，在30-4(TC滅活36-48小時(shí)，優(yōu)選在37。C滅活36小時(shí)并且在滅活時(shí)每間隔4_6小時(shí)攪 拌一次。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟c將兔源莢膜A群多殺性巴氏桿 菌C51—17菌株接種于含0. 1%裂解血球全血的馬丁肉湯中，371:培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行復(fù)活，再將 復(fù)活的菌株接種于含0. 1%裂解血球全血及4%健康動(dòng)物血清的改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)，在36-37t:下，增殖培養(yǎng)18-24小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟d中向增殖培養(yǎng)得到的含有兔 源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51—17的菌液中加入其總重量0. 15%的甲醛，在30-4(TC滅活10-15小時(shí)，優(yōu)選在37'C滅活12小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中歩驟e中的佐劑為鋁鹽，滅活后的菌 液和鋁鹽的體積比比為5 : 1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗的方法，該方法包括以下步驟首先將兔病毒性出血癥毒株CD85-2毒株接種于家兔，無(wú)菌采集24-96小時(shí)內(nèi)死亡家兔的心、肝、脾、肺或腎，并剔除其上的結(jié)締組織；再將其搗碎、過(guò)濾后配成乳劑，并對(duì)該乳劑進(jìn)行滅活；將兔源莢膜A群多殺性巴氏桿菌C51-17菌株進(jìn)行復(fù)活，再將復(fù)活后的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的含有A型多殺性巴氏桿菌菌株的C51-17菌液進(jìn)行滅活；將滅活后的菌液與佐劑進(jìn)行混合并濃縮，得到含有A型多殺性巴氏桿菌C51-17的菌液，再將其與滅活乳劑混合，得到所述的二聯(lián)滅活疫苗。本發(fā)明方法獲得的二聯(lián)滅活疫苗具有安全性好、免疫效力高、保存期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101732704SQ20081022710
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者嚴(yán)石, 何信群, 劉平, 呂品, 孫勇, 王珍芹, 申詠紅, 龔文波 申請(qǐng)人:中牧實(shí)業(yè)股份有限公司