專利名稱：：駱駝蓬屬種子總生物堿提取物及其有效單體成分和它們的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥，具體涉及駱駝蓬屬植物種子中總生物堿提取物及其有效單體成分和它們的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：駱駝蓬(戶egamw/wram/aL.)為蒺藜科(Zygophyllaceae)駱駝蓬屬CPeg朋w/w)多年生草本植物，廣布于舊大陸溫帶地區(qū)，在中國西北部擁有豐富的藥材資源。其味辛苦，性涼，有毒，是維吾爾、蒙古族民間沿用已久的習用藥材，已被列入維吾爾藥衛(wèi)生部藥品標準(WS3-BW-0080-98)，種子和全草均作藥用，主治咳嗽氣喘、無名腫痛等癥。其種子中的化學成分早在1841年就有報道，主要是去氫駱駝蓬堿(Harmine，HAR)、駱駝蓬堿(Harmaline，HAL)、去甲駱駝蓬堿(Harmalol)及哈爾滿(Harman)等生物堿，含量達3.92%-7.0%。駱駝蓬生物堿的藥理作用比較廣泛，具有抗菌、消炎、止癢、抗原蟲及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和對肌肉離子通道等多方面藥理作用。早在30年代HAR和HAL就作為單胺氧化酶(MAO)抑制劑用于巴金森氏病的治療。中國自70代首次將駱駝蓬總堿制劑用于治療消化道腫瘤，臨床治療21例有效率為85.7%。其抗癌作用引起廣泛重視。國際上對它的研究主要集中在它對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和單胺氧化酶(MAO)的抑制作用方面。近年來研究發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿還具有輻射防護作用和抗包蟲作用。駱駝蓬的抗腫瘤作用受到學者的重視，成為國內(nèi)外研究的熱點之一。中國專利文獻CN1104507A、CN1220162A、CN1299664A等報道了駱鴕蓬制劑及制備方法，CN1250560C、CN101229203A涉及到駱駝蓬總生物堿的制備方法和用途。目前已報道的駱駝蓬提取物制備方法主要有如下1)以5%的醋酸浸提駱駝蓬種子，用10%的氯化鈉將醋酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)辂}酸鹽然后冷熱反復(fù)處理得到駱駝蓬生物堿(Sanken.TheAlkaloid.1952)2)用乙醇滲漉，回收乙醇后的水液用乙醚脫脂，水層用氨水調(diào)pH6,5加入硫酸銨，用焦炭過濾，加入KI，再用含HI的焦炭處理，得到的生物堿鹽再用10%的氨水處理得到駱駝蓬總生物堿(Brit.CA.1964.61:9365h)。3)用5%的鹽酸浸提，酸液用陽離子交換樹脂交換，用氨水堿化樹脂，再用乙醚、氯仿或無水乙醇洗脫得到駱駝蓬總生物堿(李春杰.新疆醫(yī)學院學報，1987;10(1):27-30)。4)用95%的乙醇回流提取，濃縮至糖漿狀，用鹽酸轉(zhuǎn)溶，氯仿脫脂后的酸液用氨水堿化，析出沉淀，得到駱駝蓬總生物堿(利國威，中草藥，198819(1):2-4)。5)用氯仿氨水混合溶媒沉淀法分離提取駱駝蓬子中的生物堿得駱駝蓬總生物堿，并認為該法優(yōu)于陽離子樹脂法和氯仿提取法。(張學農(nóng)，新疆醫(yī)學院學報，1993;16(4):350-351)。6)用乙醇提取，提取液用氯化滎處理后去氫駱駝蓬堿和駱鴕蓬堿以復(fù)合物沉淀下來，然后用H2S處理得到駱駝蓬生物堿(Munir,Fitoterapia,1995;66(1):73-76)。7)用堿性乙醇浸潤后回流提取，經(jīng)堿化游離、甲酸乙酯、乙酸乙酯等回流分離、硅藻土與活性碳減壓過濾、回收溶劑、烘干、再用醇溶液回流提取、然后用水沉、冷藏、板框過濾、噴霧干燥，得到駱駝蓬總生物堿(CN1250560Q。8)采用二氧化碳超臨界萃取脫脂、堿水冷浸除雜后再用酸性醇溶液提取，減壓濃縮干燥后再用鹽酸浸泡，過濾，濾液中加氨水堿化，冷藏、過濾、干燥即得駱駝蓬總生物堿。(CN101229203A)。但上述方法有一些不足之處1)法雖然工藝簡單，但提取率不高，只分離去氫駱駝蓬堿而丟失了其它生物堿，且醋酸鹽與鹽酸鹽轉(zhuǎn)化不徹底；2)法用乙醚萃取脫脂，且使用KI和HI處理，增加了成本，不宜工業(yè)化生產(chǎn)。3)法用陽離子交換樹脂處理生物堿，樹脂再生及預(yù)處理復(fù)雜(易中毒不易再生)，后續(xù)處理中用乙醚和氯仿，對環(huán)保不利。4)法用稀鹽酸轉(zhuǎn)溶時不易進行，因為駱駝蓬種子中含有大量粘液質(zhì)、樹脂、樹膠、脂肪油等，用稀鹽酸不能充分接觸生物堿，即使攪拌也較困難，而且酸溶液過濾困難；5)法用氯仿氨水溶合溶媒萃取，對環(huán)保不利。6)法用到重金屬(HgS)和H2S處理，易導(dǎo)致環(huán)境污染和重金屬殘留損害人體健康。7)法用堿液浸潤提取，不易過濾，處理過程用有機溶劑，而且提取分離過程過于復(fù)雜。8)法用二氧化碳超臨界萃取脫脂，工業(yè)化成本增加，且用酸性乙醇提取后不易過濾。而且上述方法提取過程后剩余的堿水液中仍然殘留大量的生物堿，造成植物資源的大量浪費。因此，這些方法難以規(guī)?；瘜嵤?。另外，駱駝蓬屬植物有駱駝蓬(戶./flr/wfl/flL.)、多裂駱駝蓬(戶./mz/他ecft/w(Maxim.)Bobr)、駱駝蒿(i5."/ge/o^wmBeg.)，它們種子中總生物堿含有去氫駝駱蓬堿(harmine)、駱駝蓬堿(harmaline)、鴨嘴花堿(vasicine)、脫氧鴨嘴花堿(deoxyvasicine)、鴨嘴花酮堿(vasicinone)、脫氧鴨嘴花酮堿(deoxyvasicinone)、哈馬酚(harmalol)等成分。但目前僅局限于駱駝蓬的研究，未對駱駝蓬屬多裂駱駝蓬和駱駝蒿加以利用。藥理研究顯示駱駝蓬具有抗癌、鎮(zhèn)痛、消炎、殺菌、驅(qū)蟲和抑制單胺氧化酶等多種生物活性。而現(xiàn)在多集中在抗腫瘤方面的研究和應(yīng)用，對其它方面的作用未予深入。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計方法簡便，宜于工業(yè)化生產(chǎn)的駱駝蓬總生物堿的制備方法。本發(fā)明提供一種駱駝蓬屬種子中總生物堿提取物及其有效單體成分。本發(fā)明所述駱駝蓬屬植物種子為駱駝蓬(戶.A"rma/aL.;)、多裂駱駝蓬(,附w/"'se"ww(Maxim.)Bobr)或駱馬它蒿(P."/ge/aWn/附Beg.)的種子。本發(fā)明所述的總生物堿提取物的主要有效單體成分為去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿，含有化合物l(鴨嘴花酮堿，vasicinone)、化合物2(鴨嘴花堿，vasicine)、化合物3(去氫駱駝蓬堿，harmine)、化合物4(脫氧鴨嘴花酮堿，deoxyvasicinone)、化合物5(脫氧鴨嘴花堿，deoxyvasicine)、化合物6(駱駝蓬堿，harmaline)、化合物7(哈爾醇，harmol)、化合物8(哈馬酚，harmalol)、化合物9(nigelastrine1)、化合物10(nigelastrine2)。其中nigelastrine1和nigelastrine2是本發(fā)明得到的新化合物。化合物結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>化合物1一10的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下化合物l:白色短柱狀結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):203.6[W](100);'H-NMR(400MHz，CDCU)5ppm:8.30(1H，d,7-H)，7.75(2H，m，4-H，5-H)，7.49(1H，m，6-H)，5.25(1H，q，3-H)，4.37(1H，m，1陽H)，4.02(1H，m,l-H)，2.67(1H，m，2-H)，2.30(1H，m，2-H);"C-NMR(IOOMHz，CDC13)Sppm:29.4(2-C),43.4(1-C),71.9(3-C)，121.0(3a-C)，126.6(6-C)，126.7(4-C)，126.9(5-C)，134.4(7-C)，148.6(7a-C)，160.3(4a陽C)，160.6(C=O)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為鴨嘴花酮堿(vasicinone)。化合物2:白色針簇狀結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):189.6[W](100);力-NMR(400MHz，CDC13)Sppm:7.14(2H，m，4-H，5-H)，6.97(1H，t，6-H)，6.87(1H，d，7陽H)，4.75(1H，m，3-H),4.53(2H，d，8-H)，3.48(1H，m，l-H)，3.42(1H，m，l-H)，2.38(1H，m，2-H)，2.10(1H，m,2-H);13C-NMR(100MHz,CDC13)Sppm:29.6(2-C)，47.2(1-C)，48.5(8-C)，71.4(3-C),121.0(3a-C)，125.9(6-C)，126.6(4-C)，126.8(5-C)，128.5(7-C)，142.1(7a-C)，163.7(4a-C)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為鴨嘴花堿(vasicine)。化合物3:近無色棱柱結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):213.4[Nf](100);'H-NMR(500MHz，CDClrCD3OD)Sppm:8.16(1H，d，3陽H)，7.95(1H，d，5-H)，7.71(1H，d,4陽H)，7.00(1H，d，8-H)，6.88(1H，dd，6-H)，3.92(3H，s，C7-OCH3)，2.77(3H，s，Ci-CH3);13C-NMR(100MHz，CDCl3-CD3OD)5ppm:19.1(d-CH3)，55.4(C7-OCH3)，94.7(8-C)，109.3(6國C)，112.1(12-C)，115.4(4-C)，122.4(5-C)，128.6(1l-C)，134.8(10-C)，137.3(3陽C)，140.9(13-C)，142.3(1-C)，160.7(7-C)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為去氫駱駝蓬堿(harmine)。化合物4:白色針簇狀結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):187.7[W](100);'H-NMR(400MHz，CDCb05ppm:8.29(1H，dd，7-H)，7.73(1H，m，5-H)，7.65(1H，dd，4-H)，7.45(1H，m，6-H)，4.22(2H，t，l誦H)，3.18(2H，t，3-H)，2.29(2H，m，2-H);13C-NMR(100MHz,CDCla)5ppm:19.6(2-C)，32.5(3-C)，46.5(1-C)，120.6(3a-C)，126.2(6陽C)，126.4(4-C)，126.8(5-C)，134.2(7-C)，149.2(7a-C)，151.0(4a-C)，159.4(C=0)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為脫氧鴨嘴花酮堿(deoxyvasicinone)?；衔?:白色針簇狀結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):173.6[W](100);'H-NMR(500MHz，CD3OD)5ppm:7.32(1H，m，7-H)，7.24(2H，m，4-H，5-H)，7.03(1H，m，6-H)，4.85(2H，s，8-H)，3.78(2H，t，l國H)，3.07(2H，t，3-H),2.30(2H，m，2-H);13C-NMR(100MHz，CD3OQ)Sppm:19.7(2-C)，3L4(3陽C),47.5(1-C)，55.3(8-C)，118.1(3a陽C)，118.4(6-C)，128.4(4-C)，128.5(5-C)，130.7(7-C),132.6(7a-C)，164.8(4a-C)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為脫氧鴨嘴花堿(deoxyvasicine)。化合物6:鮮黃色塊狀結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):215.4[W](100);^-麗R(400MHz，DMSO-d6)Sppm:1L13(1H，br.s，N-H)，7.43(1H，d，5-H)，6.86(1H，d，8鄰，6.71(1H,d，6-H)，3.79(3H，s，C7-OCH3)，3.65(2H，t，3誦H)，2.69(2H，t,4-H)，2.24(3H，s，d-CH3);13C-NMR(IOOMHz，CDCla)Sppm:19.1(C廣CH3),21.9(4-C)，47.5(3曙C),55.1(C7-OCH3)，94.6(8-C)，110.2(6陽C)，114.6(1l-C)，119.4(12陽C)，120.3(5-C)，128.4(10-C)，137.5(13-C)，156.8(1-C)，157.1(7-C)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為駱駝蓬堿(harmaline)。化合物7:淡黃色針狀結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):199.6[M+](100);1H-NMR(400MHz，DMSO誦d6)Sppm:1L22(1H，s，N-H)，9.72(1H，br.s，C7-OH)，8.11(1H，br.s，3-H)，7.92(1H，d，J=8.5Hz，5-H)，7.73(1H，d，J=4.8Hz，4陽H)，6.91(1H，d，J=1.8Hz，8-H)，6.70(1H，dd，J=9.2Hz，6-H)，2.69(3H，s，C1-CH3);13C-NMR(100MHz，CDC13〕Sppm:20.0(C1-CH3)，96.5(8-C)，109.6(6-C)，111.6(4-C)，113.7(12-C)，122.4(5-C)，127.5(1l-C)，134.5(10-C)，137.2(3-C)，140.7(1-C)，142.3(13-C)，158.2(7-C)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為哈爾醇(harmol)?；衔?:白色針狀結(jié)晶，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):201.6(100);iH-NMR(400MHz,CDCl。Sppm:12.17(1H，s，N-H)，10.18(1H，br.s，C7-OH)，7.57(1H，d，J=8.8Hz，5-H),6.85(1H，d，J=1.8Hz,8-H)，6.75(1H，dd，6-H)，3.80(2H，t,3-H),3.11(2H，t，4隱H)，2.64(3H，s，Ci-CH3);13C-NMR(100MHz,CDCla)Sppm:18.3(Ci-CH3)，19.0(4-C)，41.5(3-C)，96.1(8-C)，114.3(6-C)，118.1(1l隱C)，123.0(12-C)，124.7(5-C),125.2(10-C)，143.0(13-C)，159.2(1-C)，164.4(7-C)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻報道相符，故該化合物結(jié)構(gòu)鑒定為哈馬酚Omrmalol)?；衔?:白色粉末，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):383.5[M+](100);^-NMR(500MHz，CD3OD)Sppm:8.23(1H，5-H)，8.20(1H，4，-H)，8.16(1H，6，鄰，7.23(2H，7-H，8-H)，7.13(1H，6-H)，7.13(1H，6-H)，7.03(1H，8，陽H)，6.96(1H，7，-H)，6.87(1H，9，-H)，5.09(1H，9-H)，3.74(1H，11-H)，3.09(3H，2，C-CH3)，2.49(1H，IO-H)，2.08(1H，10-H);13C-NMR(100MHz,CD3OD〕5ppm:17.4(C2-CH3)，30.7(10-C)，55.9(1l-C)，72.6(9-C)，109.4(9，-C)，114.4(7，-C)，115.2(6，a-C)，115.9(5,-C),118.0(8,-C),122.3(2-C)，127.0(6，-C)，128.5(6-C，8-C)，128.7(7-C)，130.6(5，a-C)，131.7(2，a-C)，132.7(4，a-C)，135.0(5-C)，145.5(5a-C)，162.2(8a-C)，165.1(C=0)。根據(jù)以上光譜數(shù)據(jù)，鑒定其結(jié)構(gòu)并命名為nigelastrine1。化合物10:白色粉末，與Dragendorff試劑作用顯橙紅色。ESI-MSm/z(%):385.4[W](100);化NMR(500MHz，CD3OD〕Sppm:8.28(1H，5-H)，8.20(1H，6，-H),7.21(2H，7-H，8-H)，7.20(1H，6-H)，7.00(1H，8，-H)，6.90(1H，7，-H)，6.86(1H，9，-H)，5.18(1H，9-H)，3.65(1H，ll隱H)，3.21(1H，5,-H)，3.09(3H，2，C-CH3)，2.52(1H，10-H)，L91(1H，10-H);13C-NMR(100MHz，CD3OD〕5ppm:17.1(C2-CH3)，30.9(10-C)，31.6(5，-C)，56.0(11-C)，57.8(4，-C)，73.2(9-C),108.9(9，-C)，114.7(7，-C)，115.3(6,a-C)，117.8(8，-C)，122.3(2-C)，127.2(6,-C)，128.2(6-C，8-C)，128.5(7-C)，130.5(5，a-C)，131.2(2，a-C)，133.1(5-C)，162.7(8a-C)，164.2(C=0)。根據(jù)以上光譜數(shù)據(jù)，鑒定其結(jié)構(gòu)并命名為nigelastrine2。本發(fā)明的另一目的是提供了駱駝蓬屬植物種子中總生物堿提取物及其有效單體成分的制備方法，該方法包括下列步驟(一)制備總生物堿提取物(1)取駱駝蓬種子粉碎，加駱駝蓬種子8_10倍量w/v70%—90%的乙醇加熱回流提取1一3次，每次2小時，過濾，合并濾液；(2)在常壓下或減壓(壓力-0.08—-0.lMPa),溫度40-50。C條件下回收濾液中的乙醇至相對密度1.1—1.3的稠膏；(3)趁熱減壓(溫度40_50°C，壓力-0.08_-0.lMPa)或趁熱攪拌或超聲溶解下加入l一3倍量藥材重量的2-10%鹽酸酸化(pHl—2)捏溶，冷卻至室溫，過濾；(4)濾液加入濃氨水堿化，使pH值9.0_11.0，室溫靜置24小時，析出沉淀；(5)沉淀經(jīng)過濾后經(jīng)減壓(溫度60—80。C、壓力-0.08_-0.lMPa)或噴霧干燥(溫度60—8(TC)后即得總生物堿提取物。(6)上述步驟(4)氨水堿化后的濾液，經(jīng)大孔吸附樹脂進一步吸附純化制得主要成分為去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿不同比例的總生物堿含量在50%以上的提取物。其最佳條件吸附pH值為9，吸附溫度為30'C，上樣流速為1.5BV七—1，HAL飽和上樣量為32.34mg.g";洗脫溶劑為70%乙醇，洗脫流速為1.5BV.h—1，洗脫用量為16.7BV。所述的大孔吸附樹脂的型號為DlOl、LSA-21、LSA-IO、LAS-8b、LSA-5b、XDA-1及其它類似型號和性質(zhì)的樹脂。其中以LSA-5b的效果最佳。(二)有效單體成分的分離取上述步驟(5)制備的總生物堿14g，硅藻土拌樣上硅膠柱，氯仿-甲醇(20:i;io:i;5:i;i:i;o:i)梯度洗脫得不同流份a、b、c、d、e。流份A再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法及甲醇重結(jié)晶分離得到化合物1;流份B再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物2、3、4、5、6;流份C再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物7;流份D再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物8;流份e再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物9和化合物10。本發(fā)明人利用波譜技術(shù)鑒定了上述10個化合物的結(jié)構(gòu)，分別為化合物l(鴨嘴花酮堿，vasicinone)、化合物2(鴨嘴花堿，vasicine)、化合物3(去氫駱駝蓬堿，harmine)、化合物4(脫氧鴨嘴花酮堿，deoxyvasicinone)、化合物5(脫氧鴨嘴花堿，deoxyvasicine)、化合物6(駱駝蓬堿，harmaline)、化合物7(哈爾醇，harmol)、化合物8(哈馬酚，harmalol)、化合物9(nigelastrine1)、化合物10(nigelastrine2)。其中nigelastrine1和nigelastrine2為新化合物。本發(fā)明方法所述步驟(3)中"趁熱減壓(或趁熱攪拌或超聲溶解)下加入2-10%鹽酸酸化捏溶"是關(guān)鍵步驟之一，可確保有效成分的充分溶解，并避免使用有機溶劑進行脫脂。所述步驟(4)中"濾液加入氨水堿化使pH值9.0—11.0"是關(guān)鍵步驟之二，可以保證生物堿充分析出沉淀，提高產(chǎn)率。所述步驟(6)的大孔吸附樹脂法制備駱駝蓬總生物堿的的最佳條件是最佳吸附pH值為9，最佳吸附溫度為3(TC，最佳上樣流速為1.5BV*h"，HAL飽和上樣量為32.34mg*g";最佳的洗脫溶劑為70%乙醇，最佳洗脫流速為1.5BW1，洗脫用量為16.7BV。所述的大孔吸附樹脂的型號為DlOl、LSA-21、LSA-IO、LAS-8b、LSA-5b、XDA-1及其它類似型號和性質(zhì)的樹脂。其中以LSA-5b的效果最佳?？蛇M一步制得主要成分為去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿不同比例的總生物堿提取物，總生物堿含量在50%以上。大孔樹脂適用于生產(chǎn)中富集純化駱駝蓬總生物堿。本發(fā)明方法得到的總生物堿主要含有去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿；其中去氫駱駝蓬堿的含量為41-59%，提取率達到38-86%;駱駝蓬堿的含量為12-24%，提取率達到16-50%。以兩種生物堿之和為總生物堿計，總生物堿的提取率為30-70%,總生物堿的含量為50-83%。其中去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿的比例分別為0.18:1_4.301。本發(fā)明方法使用無毒溶劑，操作流程簡潔方便，提取結(jié)果較為理想，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的又一目的在于提供駱駝蓬屬植物種子總生物堿提取物及其有效單體成分在制備抗乙酰膽堿酯酶活性藥物與治療神經(jīng)退行性疾病(帕金森氏癥、抑郁癥和老年癡呆癥等)藥物中的應(yīng)用。所述駱駝蓬屬植物種子總生物堿提取物及其有效單體成分包括去氫駝駱蓬堿(harmine)、駱駝蓬堿(harmaline)、鴨嘴花堿(vasicine)、脫氧鴨嘴花堿(deoxyvasicine)、鴨嘴花酮堿(vasicinone)、脫氧鴨嘴花酮堿(deoxyvasicinone)、哈馬酚(harmalol)、哈爾醇(harmol)、nigelastrinel(新化合物)和nigelastrine2(新化合物)等成分。其中以去氫駝駱蓬堿(harmine)和駱駝蓬堿(harmaline)的乙酰膽堿酯酶抑制活性最強，哈馬酚(harmalol)、哈爾醇(harmol)、新化合物nigelastrine1和nigelastrine2次之。鴨嘴花堿(vasicine)、脫氧鴨嘴花堿(deoxyvasicine)、鴨嘴花酮堿(vasicinone)、脫氧鴨嘴花酮堿(deoxyvasicinone)較差。新化合物nigelastrine1和nigelastrine2分別是駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿與鴨嘴花酮堿縮合的二聚體，具有明顯的結(jié)構(gòu)特征。由本發(fā)明上述1個或2個或多個化合物與藥學上可以接受的載體或其它適宜的賦型劑相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成經(jīng)口服給藥的內(nèi)用劑型和非口服給藥的注射劑或其它劑型，可以在臨床上用于抗乙酰膽堿酯酶活性藥物與治療神經(jīng)退行性疾病(帕金森氏癥、抑郁癥和老年癡呆癥等)的治療。本發(fā)明通過薄層色譜-生物自顯影技術(shù)對駱駝蓬(P.L.)或多裂駱駝蓬(戶.ww/toe"w/w(Maxim.)Bobr)或駱鴕蒿(尸.《/ge/aWnwBeg.)的種子中具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化合物進行了研究，并對不同的提取物和化合物抗乙酰膽堿酯酶的活性進行了評價。結(jié)果顯示了由駱鴕蓬CP./fl7Mfl/flL.)或多裂駱鴕蓬CP.wmW犯c^m(Maxim.)Bobr)或駱駝蒿CP.w/ge/a欲wwBeg.)的種子制備的去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿比例分別為0.18:1_4.30:1的總生物堿提取物及其有效單體成分按任意比例配伍組成的混合物可作為活性成分在制備抗乙酰膽堿酯酶活性藥物與神經(jīng)退行性疾病(帕金森氏癥、抑郁癥和老年癡呆癥等)治療中的應(yīng)用。圖1駱駝蓬、多裂駱駝蓬、大籽駱駝蒿(sp)和駱駝蒿單體成分的薄層色譜一生物自顯影圖(可見光下檢視)。S:由上至下分別為a:去氫駱駝蓬堿；d:駱駝蓬堿；1:駱駝蓬(P060901);2:駱駝蓬(P060809);3:駱駝蓬(P060801);4:多裂駱駝蓬(D060824);5:多裂駱鴕蓬(D060828);6:多裂駱鴕蓬(D060906);7:大籽駱鴕蒿(sp)(H(sp)060906);8:大籽駱駝蒿(sp)(H(sp)060902);9:大籽駱駝蒿(sp)(H(sp)060827);10:駱鴕蒿(H060906);11:駱鴕蒿(H060903);12:駱鴕蒿(H060905);圖2.單體化合物乙酰膽堿酯酶抑制作用的最低檢測限測定(a:加蘭他敏；b:鴨嘴花酮堿；c:鴨嘴花堿；d:去氫駱駝蓬堿；e:脫氧鴨嘴花酮堿；f:脫氧鴨嘴花堿；g:駱駝蓬堿；h:哈爾醇；i:哈馬酚；j:nigelastrinel;k:nigelastrine2;1:H-fei-e;Ci:lmol/L;C2:O.lmol/L;C3:0.01mol/L;C4:0.001mol/L;C5:0.0001mol/L);圖3.駱駝蓬CP./ar附a/flLinn)(a);多裂駱駝蓬(P.wmW犯"m/w(Maxim.)Bobr)(b);大籽駱駝蒿(尸.w/ge//aWramBunge)(c)和駱駝蒿(尸.Bunge)(d)的HPLC指紋圖譜?；衔镒R別峰2:鴨嘴花堿酮堿；峰3:脫氧鴨嘴花堿酮堿；峰8:脫氧鴨嘴花堿；峰10:鴨嘴花堿(+);峰ll:鴨嘴花堿(-);峰13:哈馬酚；峰16:哈爾醇；峰18:哈爾滿;峰19:nigelastrine1;峰20:nigelastrine2;峰21:駱鴕蓬堿；峰22:脫氫駱鴕蓬堿具體實施例方式實施例i、駱駝蓬(p./^w^"/flL.)種子制備總生物堿提取物取駱駝蓬種子粉碎成粗粉，取50g分別按表1中的條件加入8倍藥材量(W/W)70—90%的乙醇加熱回流提取l-3次，每次2小時，過濾，合并濾液，回收乙醇至稠膏，趁熱減壓(或趁熱攪拌或超聲溶解)下加入1、2、3倍于藥材重量的2-10%鹽酸酸化(pH值1.0—2.0)捏溶，冷卻過濾，濾液加入氨水堿化使pH值9.0—11.0，沉淀經(jīng)過濾后減壓(真空、噴霧)干燥即得主要含有不同比例的脫氫駱駝蓬堿與駱駝蓬堿的總生物堿提取物(見下表1)。最優(yōu)工藝為取駱駝蓬種子粉碎，加8倍量85%的乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，過濾，合并濾液，回收乙醇至稠膏，趁熱減壓(或趁熱攪拌或超聲溶解)下加入10%鹽酸酸化捏溶，冷卻過濾，濾液加入氨水堿化使pH值=11.0，沉淀經(jīng)過濾后減壓(真空、噴霧)干燥即得。實驗10為最佳工藝，結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表中HAL為駱駝蓬堿，HAR為去氫駱駝蓬堿，總堿含量為兩者之和。實施例2、多裂駱駝蓬(戶.ff7w/toecft/附(Maxim.)Bobr)和駱駝蒿CP.w/ge/flWn/mBeg.)種子總生物堿提取物的制備按照實例1所述的最佳工藝，取50g多裂駱駝蓬種子粉碎，加8倍量85%的乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，過濾，合并濾液，回收乙醇至稠膏，趁熱減壓(或趁熱攪拌或超聲溶解)下加入10%鹽酸酸化捏溶，冷卻過濾，濾液加入氨水堿化使pH值二ll.O，沉淀經(jīng)過濾后減壓(真空、噴霧)干燥即得。制備得到多裂駱駝蓬CP.mM/toecm/(Maxim.)Bobr)種子總生物堿提取物，結(jié)果見表2。表2多裂駱駝蓬總生物堿提取物的制備藥材重量~~ii"""ii酸水量~"ph實驗結(jié)果(含量％)(g)度次數(shù)(bv)值halo/,haro/o~總堿含總堿得比值_量0/0率0/。HAR/HAL實驗50853311.034.9821.3256.304.500.611實驗5()85331l026.4739.2365.702.731.482實驗50853311.036.6630.5167.173.790.83按照實例1所述的最佳工藝，取駱駝蒿種子粉碎，加8倍量85%的乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，過濾，合并濾液，回收乙醇至稠膏，趁熱減壓(或趁熱攪拌或超聲溶解)下加入10%鹽酸酸化捏溶，冷卻過濾，濾液加入氨水堿化使pH值=11.0，沉淀經(jīng)過濾后減壓(真空、噴霧)干燥即得。制備得到駱駝蒿CP.w/ge/flrframBeg.)種子總生物堿提取物，結(jié)果見表3。表3駱駝蒿總生物堿提取物的制備藥材重量(g)醇濃度提取次數(shù)酸水量(bv)pH倌實驗結(jié)果(含量％)hal%har0/'總堿含量％總堿得率％比值HAR/HAL實驗150853311.047.8322.2670.094.400.47實驗50853311.055.9110.4466.344.030.19實驗350853311.064.9011.8976.794.300.18實施例3、駱駝蓬總生物堿提取物中單體成分的分離與制備取總生物堿14g，硅藻土拌樣上硅膠柱，氯仿-甲醇(20:1;10:1;5:1;1:1;0:1)梯度洗脫得不同流份A、b、c、d、E。流份A再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法及甲醇重結(jié)晶分離得到化合物1;流份B再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物2、3、4、5、6;流份C再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物7;流份d再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物8;流份E再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物9和化合物10。利用波譜技術(shù)參考文獻鑒定了10個化合物的結(jié)構(gòu)，分別為化合物l(鴨嘴花酮堿，vasicinone)、化合物2(鴨嘴花堿，vasicine)、化合物3(去氫駱駝蓬堿，harmine)、化合物4(脫氧鴨嘴花酮堿，deoxyvasicinone)、化合物5(脫氧鴨嘴花堿，deoxyvasicine)、化合物6(駱駝蓬堿，harmaline)、化合物7(哈爾醇，harmol)、化合物8(哈馬酚，harmalol)、化合物9(nigelastrine1)、化合物10(nigelastrine2)。其中nigelastrine1和nigelastrine2為新化合物。實施例4、駱駝蓬對乙酰膽堿酯酶的抑制作用分別取駱駝蓬、多裂駱駝蓬和駱駝蒿種子樣品，粉碎成細粉。分別稱取粉末各0.05g，加入15ml甲醇，超聲20min，過濾，5000min"離心10min，取上清液作為供試品溶液。吸取樣品溶液各l.Onl，分別點于同一硅膠薄層板上。吸取去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿的混合對照品溶液2^U，點于同一硅膠薄層板上。以乙酸乙酯-甲醇-氨水(10:1.5:0.5)為展開劑，展開、取出、干燥。薄層板C應(yīng)用薄層色譜-生物自顯影技術(shù)將TLC板浸入裝有0.05mol/L(pH-7.8)的Tris酶緩沖液的表面器皿中，取出，適當干燥。然后將TLC板放置在37'C的水槽中保溫20分鐘。將已浸過乙酰膽堿酯酶的TLC板再在5mla-乙酸萘酯與201111FastBlueBSalt的混合溶液中浸板后，取出，適當干燥。TLC板在l2min后顯示紫色的背景，可見光下檢視，拍攝照片見圖l。從圖1中可以看出，去氫駱駝蓬堿(a)和駱駝蓬堿(d)是駱駝蓬藥材的主要抗乙酰膽堿酯酶活性成分，其它生物堿亦顯示出了抗乙酰膽堿酯酶活性。實施例5、駱駝蓬提取物單體成分對乙酰膽堿酯酶的抑制作用分別稱取陽性對照藥加蘭他敏及從駱駝蓬中分離得到的化合物鴨嘴花酮堿、鴨嘴花堿、去氫駱駝蓬堿、脫氧鴨嘴花酮堿、脫氧鴨嘴花堿、駱駝蓬堿、哈馬酚、哈爾醇、新化合物nigelastrine1、新化合物nigelastrine2和化合物H-fei-e，加甲醇制成lmol/L的儲備液。加甲醇進行稀釋，分別制成0.1,0.01，0.001,0.0001mol/L的稀釋液，在4'C保存。分別吸取上述化合物的不同濃度的系列樣品溶液各1^1，點于同一薄層板上。薄層板應(yīng)用薄層色譜-生物自顯影技術(shù)，對各化合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性的最低檢測限進行測定和活性評價，在可見光下檢視，拍攝照片見圖2。從圖2可以看出，陽性對照藥加蘭他敏、去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿及哈爾醇對乙酰膽堿酯酶活性抑制作用的最低檢測濃度均達到0.01mol/L，鴨嘴花堿、哈馬酚的最低檢測濃度達到0.1mol/L，鴨嘴花酮堿、脫氧鴨嘴花酮堿、脫氧鴨嘴花堿及新化合物nigelastrine1、nigelastrine2在1mol/L時顯示出對乙酰膽堿酯酶的抑制活性，而化合物H-fei-e在濃度為lmol/L時沒有表現(xiàn)出對乙酰膽堿酯酶的抑制活性。實施例6駱駝蓬總生物堿提取物中單體成分的確證取由駱駝蓬、多裂駱駝蓬和駱駝蒿種子制備得到的總生物堿提取物樣品粉末0.1g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入20%甲醇50mL,密塞，超聲25min，放冷，靜置，取上清液，以0.45pm的微孔濾膜濾過，即得，測定指紋圖譜結(jié)果見圖3。測定條件為流動相為乙腈(A)-醋酸銨緩沖液(B)，Omin時4%A，70min時30%A的線性梯度；檢測波長280nm;流速O/ZmL'min-1,柱溫30°C,理論塔板數(shù)按駱駝蓬堿計算應(yīng)不低于2000。從指紋圖譜可以看出，駱駝蓬、多裂駱駝蓬和駱駝蒿的總生物堿提取物中均包含化合物l(鴨嘴花酮堿，vasicinone)、化合物2(鴨嘴花堿，vasicine),化合物3(去氫駱駝蓬堿，harmine)、化合物4(脫氧鴨嘴花酮堿，deoxyvasicinone)、化合物5(脫氧鴨嘴花堿，deoxyvasicine)、化合物6(駱駝蓬堿，harmaline)、化合物7(哈爾醇，harmol)、化合物8(哈馬酚，harmalol)、化合物9(nigelastrinel)和化合物10(nigelastrine2)。權(quán)利要求1、一種駱駝蓬屬種子中總生物堿提取物及其單體成分，其特征在于所述總生物堿提取物包括的單體成分如下化合物1鴨嘴花酮堿、化合物2鴨嘴花堿、化合物3去氫駱駝蓬堿、化合物4脫氧鴨嘴花酮堿、化合物5脫氧鴨嘴花堿、化合物6駱駝蓬堿、化合物7哈爾醇、化合物8哈馬酚、化合物9nigelastrine1、化合物10nigelastrine2；各化合物結(jié)構(gòu)如下化合物1化合物2鴨嘴花酮堿鴨嘴花堿化合物3化合物6去氫駱駝蓬堿駱駝蓬堿化合物4化合物5脫氧鴨嘴花酮堿脫氧鴨嘴花堿化合物7化合物8哈爾醇哈馬酚化合物9化合物10。2、一種如權(quán)利要求1所述的駱駝蓬屬種子中總生物堿提取物及其單體成分的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(一)制備總生物堿提取物(1)取駱駝蓬種子粉碎，加駱駝蓬種子8—10倍量w/v70。/。一90。/。的乙醇加熱回流提取1一3次,每次2小時，過濾，合并濾液；(2)常壓下或減壓壓力-O.08—-0.lMPa，溫度40-50'C條件下，回收濾液中的乙醇至相對密度1.1—1.3的稠膏；(3)趁熱減壓溫度40—5(TC，壓力-O.08_-0.1Mpa或趁熱攪拌或超聲溶解下加入l一3倍量藥材重量的2-l(P/。鹽酸酸化pHl—2、捏溶，冷卻至室溫贅過濾；(4)濾液加入濃氨水堿化，使pH值9.0—11.0，室溫靜置24小時，析出沉淀；(5)沉淀經(jīng)過濾后經(jīng)減壓溫度60_80°C、壓力-O.080.IMPa或溫度60—80。C噴霧干燥后，即得總生物堿提取物；(二)單體成分的分離取上述步驟(5)制備的總生物堿，硅藻土拌樣上硅膠柱，氯仿-甲醇20:1;io:i;5:i;i:i;o:i(v/v)梯度洗脫得不同流份a、b、c、d、e;流份a再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法及甲醇重結(jié)晶分離得到化合物1;流份B再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物2、3、4、5、6;流份C再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物7;流份D再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物8;流份E再經(jīng)凝膠柱層析和薄層制備法分離并經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物9和化合物10。3、根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法其特征在于所述步驟(4)氨水堿化后的濾液，經(jīng)大孔吸附樹脂進一步吸附純化制得主要成分為去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿不同比例的總生物堿含量在50%以上的提取物；其吸附純化條件吸附pH值為9，吸附溫度為30°C，上樣流速為1.5BV七人HAL飽和上樣量為32.34mg*g";洗脫溶劑為70%乙醇，洗脫流速為1.5BV'h—1，洗脫用量為16.7BV。4、根據(jù)權(quán)利要求3的方法其特征在于所述大孔吸附樹脂為D101、LSA-21、LSA-IO、LAS-8b、LSA-5b或XDA-1。5、根據(jù)權(quán)利要求3的方法其特征在于所述大孔吸附樹脂為LSA-5b。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種駱駝蓬屬種子中總生物堿提取物及其單體成分，其特征在于所述駱駝蓬屬植物種子為駱駝蓬、多裂駱駝蓬或駱駝蒿的種子。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種駱駝蓬屬種子中總生物堿提取物及其單體成分的制備方法，其特征在于所述制得的總生物堿提取物中總生物堿的含量為50-83%;其中去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿比例分別為0.18:1_4.30:1。8、一種如權(quán)利要求1所述駱駝蓬屬種子中總生物堿提取物在制備抗乙酰膽堿酯酶活性藥物與神經(jīng)退行性疾病治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述總生物堿提取物作為活性成分與藥學上可以接受的載體相結(jié)合制成經(jīng)口服給藥的內(nèi)用劑型和非口服給藥的注射劑或其它劑型。9、一種如權(quán)利要求1所述駱駝蓬屬種子中總生物堿提取物的單體成分在制備抗乙酰膽堿酯酶活性藥物與神經(jīng)退行性疾病治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述單體成分為化合物1鴨嘴花酮堿、化合物2鴨嘴花堿、化合物3去氫駱駝蓬堿、化合物4脫氧鴨嘴花酮堿、化合物5脫氧鴨嘴花堿、化合物6駱駝蓬堿、化合物7哈爾醇、化合物8哈馬酚、化合物9nigelastrine1、化合物10nigelastrine2的1個或2個或多個化合物作為活性成分與藥學上可以接受的載體相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成經(jīng)口服給藥的內(nèi)用劑型和非口服給藥的注射劑或其它劑型。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9的應(yīng)用，其特征在于所述神經(jīng)退行性疾病治療藥物為帕金森氏癥、抑郁癥或老年癡呆癥治療藥物。全文摘要本發(fā)明公開了駱駝蓬屬植物種子中總生物堿提取物及其有效成分的制備與應(yīng)用。駱駝蓬屬植物(包括駱駝蓬、多裂駱駝蓬和駱駝蒿)種子用乙醇加熱回流提取、趁熱溶解加入2-10％鹽酸酸化、氨水堿化析出沉淀、經(jīng)干燥后即得主要含去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿的比例為0.18∶1-4.30∶1、總生物堿含量大于50％的總生物堿提取物?？偵飰A提取物經(jīng)色譜法分離得到去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿等10個有效單體成分。通過薄層色譜-生物自顯影分析顯示本發(fā)明制備的總生物堿提取物及其有效單體成分具有抗乙酰膽堿酯酶活性，可用于制備治療抗乙酰膽堿酯酶活性藥物與神經(jīng)退行性疾病的藥物。文檔編號A61P25/16GK101433565SQ20081020338公開日2009年5月20日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日發(fā)明者力劉,周吉燕,王崢濤,王長虹,程雪梅,婷趙,鄭希元申請人:上海中醫(yī)藥大學;上海中藥標準化研究中心