專利名稱：一種可用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中有用的化合物及其作用機制和用途。

背景技術(shù)：
創(chuàng)傷修復(fù)(wound healing)是指機體遭受外力作用，皮膚等組織出現(xiàn)離斷或缺損后的愈合過程，是一個眾多可溶性媒介因子、血細胞、胞外基質(zhì)和皮膚細胞參與，包含止血，炎癥發(fā)生，皮膚及附屬各組織的再生和膠原蛋白的合成以及肉芽組織增生、瘢痕形成等時序交叉的一個復(fù)雜的動態(tài)過程(Williamson，D.and K.Harding，Wound Healing.MEDICINE，2004；Singer，A.J.and R.A.F.Clark，Cutaneous Wound Healing.The New England Journal of Medicine，1999.341(10)p.738-746.)。
據(jù)統(tǒng)計，中國每年皮膚創(chuàng)傷(如燒傷等)患者達到1500萬人，隨著近年來人們對創(chuàng)傷修復(fù)和組織恢復(fù)了解的加深，治療手段有了一定的提高，但創(chuàng)傷愈合速度較慢以及瘢痕增生仍然是困擾患者的兩大問題。目前外科手段主要是組織工程皮膚或患者自體皮膚的移植，但由于相關(guān)產(chǎn)品在生產(chǎn)、運輸、保存、使用等環(huán)節(jié)上還存在較大的技術(shù)難度，生產(chǎn)和臨床應(yīng)用成本也居高不下，其前景并不十分令人樂觀。另一方面，生物學(xué)治療的主要焦點是選擇局部應(yīng)用FGF、EGF、PDGF、TGF等生長因子的載體，使之能持續(xù)、有效地在創(chuàng)傷處發(fā)揮作用，但是蛋白類產(chǎn)品因穩(wěn)定性不佳和制備成本較高的特點其臨床應(yīng)用也受到很大限制。
因此，本領(lǐng)域還需要進一步研究和開發(fā)對于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)有用，且穩(wěn)定性好、成本低的物質(zhì)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中非常有用的化合物，其具有穩(wěn)定性好，成本低廉的特點。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的組合物；
其中，R獨立地選自氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、C1-C4烷氧基、鹵素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H； n為選自0-4的整數(shù)(即n選自0、1、2、3或4)。
在另一優(yōu)選例中，各個R相同或不同，R在不同的取代位置相同或不同。
在另一優(yōu)選例中，R獨立地選自氫、羥基、C1-C2烷基、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；或者 n為選自1-3的整數(shù)。
在另一優(yōu)選例中，所述的化合物具有式(II)結(jié)構(gòu)
其中，R的定義同前述。
更佳地，所述化合物具有式(II’)結(jié)構(gòu)
在另一優(yōu)選例中，所述的化合物具有式(III)結(jié)構(gòu)
其中，R的定義同前述。
更佳地，所述化合物具有式(III’)結(jié)構(gòu)
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于減少創(chuàng)傷后瘢痕形成。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于促進細胞遷移。
在另一優(yōu)選例中，所述的細胞選自皮膚細胞，角質(zhì)形成細胞，或上皮細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于促進β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)降解。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于促進細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌。
在另一優(yōu)選例中，所述的基質(zhì)金屬蛋白酶選自基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，或基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的方法，包括步驟給需要的對象施用有效量的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中，R獨立地選自氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、C1-C4烷氧基、鹵素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H； n為選自0-4的整數(shù)。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。



圖1A顯示了有熊去氧膽酸(UDCA)處理的HaCat細胞體外創(chuàng)傷實驗(Invitro scratch assay)中細胞遷移的活動。
圖1B用圖表量化了圖1A中HaCat細胞遷移引起的劃傷區(qū)域的變化。
圖2顯示了UDCA及熊膽粉提取物對HaCat細胞中β-catenin蛋白降解的調(diào)控，以β-肌動蛋白作為上樣量對照。
圖3顯示了UDCA對HaCat細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9，MMP-2分泌的影響。

具體實施例方式 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從許多種化合物中首次篩選到一種具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物，具有非常優(yōu)異的促進皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的效果。所述的式(I)化合物還能夠明顯地促進皮膚細胞(特別是角質(zhì)形成細胞)的遷移；減少創(chuàng)傷后瘢痕形成；促進β-連環(huán)蛋白蛋白降解；以及促進細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
化合物 本文所用的術(shù)語“烷基”指直鏈或支鏈飽和的、含有1-4個碳原子(較佳地1-2個碳原子)的脂族烴類基團。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基。所述的“烷氧基”指的是含氧的烷基。
本文所用的術(shù)語“鏈烯基”包括含有至少一個碳碳雙鍵和2-4個碳原子(較佳地2-3個碳原子)的直鏈和支鏈烴基。
本文所用的術(shù)語“鏈炔基”包括含有至少一個碳碳三鍵和2-4個碳原子(較佳地2-3個碳原子)的直鏈和支鏈烴基。
本文所用的術(shù)語“鹵素”指F、Cl、Br、或I。
其中，烷基、鏈烯基、鏈炔基、烷氧基等均可以含有或不含有取代基。例如，它們可以被含有1-3個(更佳地1-2個)選自(但不限于)C1-4的烷基，C2-4鏈烯基，C2-4鏈炔基，鹵素，-COORa，-NRaRb，-ORa，-CORa，-CONRaRb，＝O，-SRa，-SO3Ra，-SO2NRaRb，-SORa，SO2Ra，-NO2，-CN的基團所取代(其中Ra，Rb可以選自氫，C1-4烷基，C2-4鏈烯基，C2-4鏈炔基)。本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，這些烷基、鏈烯基、鏈炔基、烷氧基等還可以被進一步地被取代。
本文所用的術(shù)語“異構(gòu)體”包括幾何異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體(如順反異構(gòu)體，構(gòu)象異構(gòu)體)。
本發(fā)明首先提供了一種如結(jié)構(gòu)式(I)所示的化合物
其中，R獨立地選自氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、C1-C4烷氧基、鹵素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；n為選自0-4的整數(shù)。
較佳地，式(I)化合物中，R獨立地選自氫、羥基、C1-C2烷基、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；或者n為選自1-3的整數(shù)。
如

的表示方法是本領(lǐng)域人員熟知的，其表示基團R可以取代在環(huán)上的任意一個或多個可被取代的位置。并且，在不同的取代位置上，R的選擇可以是不同的。
本發(fā)明還包括上述化合物的異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體，只要它們也具有修復(fù)皮膚創(chuàng)傷、促進細胞遷移等作用。所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指一類化合物與無機酸、有機酸、堿金屬或堿土金屬等反應(yīng)生成的鹽。這些鹽包括(但不限于)(1)與如下無機酸形成的鹽如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)與如下有機酸形成的鹽，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、馬來酸、或精氨酸。其它的鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以酯、氨基甲酸酯，或其它常規(guī)的“前體藥物”的形式?；衔锞哂幸粋€或多個不對稱中心。所以，這些化合物可以作為外消旋的混合物、單獨的對映異構(gòu)體、單獨的非對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體混合物、順式或反式異構(gòu)體存在。
所述的“化合物的前體”指當(dāng)用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ煤?，該化合物的前體在病人體內(nèi)進行代謝或化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)式(I)的一種化合物，或化學(xué)結(jié)構(gòu)式(I)的一個化合物所組成的鹽或溶液。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的化合物具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選地，所述的化合物具有式(II’)所示的結(jié)構(gòu)。

作為本發(fā)明的一種更優(yōu)選方式，所述的化合物具有式(III)所示的結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選地，所述的化合物具有式(III’)所示的結(jié)構(gòu)。它們具有非常優(yōu)異的皮膚創(chuàng)傷修復(fù)效果。

此外，一種式(I)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的形式例如式(IV)所示。

本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，在得知了本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)以后，可通過多種本領(lǐng)域熟知的方法、利用公知的原料，來獲得本發(fā)明的化合物，比如化學(xué)合成或從生物(如動物或植物)中提取的方法，這些方法均包含在本發(fā)明中。
合成化學(xué)改造、保護官能團方法學(xué)(保護或去保護)對合成應(yīng)用化合物是很有幫助的，并且是現(xiàn)有技術(shù)中公知的技術(shù)，如R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser，F(xiàn)ieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1995)中都有公開。
一些式(I)化合物也可自生物(如動物或植物)中提取、分離和純化。例如，式(II’)化合物可以從熊膽(或熊膽粉、熊膽汁)中提取獲得，如互為差向異構(gòu)體的熊去氧膽酸(即式(III’)化合物，化學(xué)名為3α-，7β-二羥基膽烷酸)和鵝去氧膽酸(化學(xué)名為3α-，7α-二羥基膽烷酸)。
用途 基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了式(I)所示的化合物或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體的用途，用于制備修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的藥物(或組合物)；或用于制備減少創(chuàng)傷后瘢痕形成的藥物；或用于制備促進細胞(特別是皮膚細胞，更特別是角質(zhì)形成細胞)遷移的藥物；或用于制備促進β-連環(huán)蛋白蛋白降解的藥物；或用于制備促進細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶分泌的藥物。
在本發(fā)明的具體實例中，本發(fā)明人使用人類角質(zhì)形成細胞進行細胞遷移試驗。角質(zhì)形成細胞作為構(gòu)成皮膚表皮、毛囊的主要細胞成分，全程參與創(chuàng)傷后從炎癥發(fā)生到組織重建的過程，它們的增殖速度，遷移程度，細胞因子和金屬蛋白酶的分泌都關(guān)系到整個愈合過程。而角質(zhì)形成細胞的遷移作為上皮重建中的重要事件(Li，J.，J.Chen，and R.Kirsner，Pathophysiology of acute woundhealing.Clinics in Dermatology，2007.25(1)p.9-18.)，影響因素包括胞外基質(zhì)、整合素受體、基質(zhì)金屬蛋白酶和生長因子，而其遷移的方向則主要受創(chuàng)傷部位新合成的V型膠原蛋白和細胞表面整合素受體的結(jié)合影響。促進角質(zhì)形成細胞的遷移。
在本發(fā)明的具體實例中，本發(fā)明人還驗證了本發(fā)明的化合物對于細胞膜蛋白β-連環(huán)蛋白的影響。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物可非常有效地促進β-連環(huán)蛋白降解，從而可破壞上皮中的細胞黏連，促進細胞遷移。
在本發(fā)明的具體實例中，本發(fā)明人還驗證了本發(fā)明的化合物對于細胞金屬蛋白酶分泌的影響。金屬蛋白酶MMPs不僅通過降解V型膠原蛋白和細胞表面整合素受體之間的黏連來影響細胞遷移的方向，并通過水解細胞合成的膠原蛋白來控制愈合后瘢痕的形成(Parks，W.C.，Matrix metalloproteinases in repair.1999.p.423-432.)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物可非常有效地促進細胞分泌金屬蛋白酶，特別是促進MMP-9和MMP-2的分泌。
由于具有較少瘢痕的功效，本發(fā)明所述的化合物也可以作為一種對于美容有效的成分。
組合物 如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的組合物”通常是藥物組合物，其含有式(I)化合物或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體作為修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的活性成分；以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述的組合物也可以是一種美容制劑。
本發(fā)明中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。
本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的式(I)化合物或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體傳送給動物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。適用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
本發(fā)明還提供了制備修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的組合物的方法，包括使用式(I)所示的化合物。可將有效量的式(I)化合物與藥學(xué)上可接受的載體混合獲得本發(fā)明的組合物，活性成分在組合物中的重量比例例如可以是0.0001-50wt％；較佳地可以是0.001-20wt％。
本發(fā)明的組合物也可以是一種中藥提取物，其中含有本發(fā)明的式(I)化合物作為活性成分，提取可以采用一些已知的方法。例如通過中國專利《一種從熊膽粉中提取純化熊總膽酸的方法》(申請?zhí)?00610027330.5)經(jīng)水解、酸化、沉淀、結(jié)晶等步驟得到的總膽酸中，大量地含有熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸。所述的熊膽粉可以通過商購的途徑獲得。
本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到達哺乳動物患處的劑型都是可以的。從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是一種外用的制劑。比如可選自搽劑、膏劑、凝膠劑、氣霧劑、栓劑、粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、溶液、或懸浮液。其中式(I)化合物或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體可以存在于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中。本發(fā)明的組合物中可以加入制備不同劑型時所需要的各種常規(guī)載體或輔料，如填充劑、矯味劑、抗氧化劑、香料、色素、潤滑劑、助流劑、潤濕劑、乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。這些添加劑都是本領(lǐng)域人員所熟知的。
本發(fā)明還提供了一種修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的方法，包括步驟給需要的對象施用有效量的式(I)化合物?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。當(dāng)外用時，本發(fā)明所述的化合物的安全有效量通常約0.1納克/cm2-1毫克/cm2皮膚；較佳的約1納克/cm2-0.1毫克/cm2皮膚。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、用藥者健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
所述的組合物也可存在于膜狀載體(如由無紡布制成)等載體上，從而可被施加于哺乳動物皮膚表面。此外，本發(fā)明所述的化合物還可與其他活性成分或治療劑(如殺菌劑、消炎劑、抗生素等)一起使用。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 (1)本發(fā)明的化合物不僅可以促進皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)，還可控制愈合后瘢痕的增生，以盡可能少影響皮膚傷后美觀的手段。
(2)本發(fā)明的化合物在創(chuàng)傷后組織再生的細胞遷移過程中和肉芽組織向瘢痕轉(zhuǎn)化過程中都具有使創(chuàng)傷向良性發(fā)展的作用。
(3)本發(fā)明的化合物完全可以通過人工合成的方式生產(chǎn)，這相對于臨床現(xiàn)行的皮膚創(chuàng)傷愈合藥物表皮生長因子(hEGF)等蛋白制品，大大降低了成本，簡化了藥物保存和運輸?shù)臈l件。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人的《分子克隆實驗室手冊》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件來完成。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
實施例1 式(III)化合物在HaCat細胞的體外創(chuàng)傷修復(fù)模型中促進細胞遷移 即式(III)化合物即熊去氧膽酸，購自上海寧銀商務(wù)發(fā)展有限公司，規(guī)格BR，純度99.9％(w/w)。
本實施例中使用的HaCat細胞(人類角質(zhì)形成細胞細胞系，HumanKetinocyte cell line，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC))以含10％胎牛血清(四季青)的RMPI 1640(Gibco)培養(yǎng)。
取生長于對數(shù)期的細胞以15×104/孔接種于12孔板(Corning)上，待細胞貼壁生長至形成鋪滿孔底的單細胞層時，在每個孔標(biāo)記的位置以20μL的移液器吸頭以相同手法快速在單細胞層上劃出一條劃痕，并以無血清的RMPI 1640培液洗去細胞碎片。換液，分別以0.5％胎牛血清的RMPI 1640配制的濃度為0和1μM的熊去氧膽酸處理，37℃ 0.5％CO2條件下培養(yǎng)12小時后，倒置顯微鏡下記錄細胞群的遷移情況，在培養(yǎng)14小時的時間點上在相同標(biāo)記處再記錄一次遷移情況直至實驗結(jié)束，并用Image Pro Plus(Meida Cybernetics，Inc.)測量遷移引起的劃傷區(qū)域的面積變化。
結(jié)果如圖1A和圖1B所示。圖1A結(jié)果顯示，劃傷形成12小時后，熊去氧膽酸處理的HaCat細胞向劃傷區(qū)域遷移的程度高于不用藥物處理的對照組，14小時的照片亦有同樣的結(jié)論。而圖1B則通過用Image Pro Plus比較不同處理時間劃傷區(qū)域占計時開始時劃傷區(qū)域面積的比例，更直觀地體現(xiàn)熊去氧膽酸對HaCat在體外劃傷條件下遷移的促進作用，并且這種影響在劃傷發(fā)生后的12小時內(nèi)即產(chǎn)生明顯促進遷移的作用。
實施例2 熊膽粉提取物、熊去氧膽酸對β-catenin蛋白的降解作用 1.熊膽粉提取物A和B的制備 按照中國專利《一種從熊膽粉中提取純化熊總膽酸的方法》(申請?zhí)?00610027330.5)的方法，進行兩次獨立的提取過程，分別獲得熊膽粉提取物A和熊膽粉提取物B。
2.熊膽粉提取物對β-catenin蛋白的影響 本實施例中使用的免疫蛋白印跡檢測(Western Blot)的方法參考《分子克隆實驗室手冊》，具體方案如下 將HaCat細胞接種于40mm細胞培養(yǎng)皿中37℃ 0.5％CO2培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期后，分別以濃度為1μM的熊去氧膽酸，濃度為1μM的熊膽粉提取物A和濃度為1μM的熊膽粉提取物B來處理，同時設(shè)無藥物添加的RMPI 1640培液繼續(xù)培養(yǎng)作為空白對照。培養(yǎng)12h后，以胰酶消化細胞，WIP細胞裂解液(20mM的Tris-HCl，150mM的NaCl和1％v/v的Triton X-100，pH 7.5)裂解細胞得到蛋白樣品。
Bradford法進行蛋白定量后，樣品以SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜。硝酸纖維膜以5％的脫脂奶粉封閉，Santa Cruz公司的β-catenin抗體作為一抗，晶美公司的抗兔的二抗的作為二抗進行免疫印跡。然后采用ECL試劑盒(購自Amersham公司)顯色得到膠片，結(jié)果如圖2所示。
由跨膜蛋白E-cadherin和膜蛋白β-catenin等蛋白成分形成的緊密黏連結(jié)構(gòu)是維持上皮結(jié)構(gòu)的重要細胞骨架，但是在細胞遷移過程中它們需要被降解。圖2結(jié)果顯示，在兩種熊膽粉提取物和熊去氧膽酸的處理下，HaCat細胞中的β-catenin蛋白均有降解，這說明熊去氧膽酸可以通過降解β-catenin來破壞上皮中的細胞緊密黏連。
實施例3 式(III)化合物促進金屬蛋白酶的分泌 本實施例中使用明膠酶譜法(Gelatin Zymography)來檢測熊去氧膽酸影響下的MMP-9和MMP-2的在HaCat的分泌變化。
該實例中所用到的2×上樣緩沖液為0.5M Tris-HCl pH 6.8，甘油，10％SDS，0.1％溴酚藍四者以體積比5∶4∶8∶1混合而成。；Zymography Renaturing Buffer為2.5％(v/v)的Triton X-100溶于水；Zymography Developing Buffer為50mmol/LTris-堿，0.2M NaCl，5mmol/L CaCl2·(2H2O)和0.2％(w/v)Brij的水溶液 具體方案如下 按照2×104/孔的密度將HaCat細胞接種在96孔板上，待細胞貼壁后，分別以濃度為10μM，1μM和0的熊去氧膽酸處理。37℃ 0.5％CO2培養(yǎng)12小時后，收集細胞上清并-80℃保存。
按照《分子克隆實驗室手冊》的方法制作含明膠濃度為1mg/mL的SDS-PAGE，每個處理的樣品取相同體積與2×上樣緩沖液等體積混合并放置10min，樣品勿煮沸，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后凝膠須以ZymogramRenaturing Buffer室溫下洗脫不少于15min×3次，而后Zymography DevelopingBuffer 37℃條件下過夜孵育。過夜處理得到的凝膠用考馬斯亮藍R250染色得到負染的MMP-9，MMP-2條帶。結(jié)果如圖3所示。
圖3結(jié)果顯示，u M級的熊去氧膽酸即可促進HaCat細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2的分泌，從而促進了上皮再生和細胞遷移過程中基底膜和半橋粒的降解(Singer，A.J.and R.A.F.Clark，Cutaneous Wound Healing.TheNew England Journal of Medicine，1999.341(10)p.738-746.)，并通過對膠原蛋白的降解實現(xiàn)組織重建完成后瘢痕的控制。
實施例4 式(IV)化合物的制備及功能 采用如中國專利申請CN01108398.0的方法制備?；切苋パ跄懰徕c(結(jié)構(gòu)式IV化合物，化學(xué)名稱為3α-，7β-二羥基膽烷酸-N-?；撬徕c，分子式為C26H44O6NSNa)
采用如實施例3所述的方法驗證式(IV)化合物對細胞金屬蛋白酶分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，式(IV)化合物能夠顯著地促進細胞金屬蛋白酶分泌。
綜上所述，本發(fā)明的化合物可以促進皮膚角質(zhì)形成細胞在體外創(chuàng)傷下的細胞遷移，這種促進作用在創(chuàng)傷發(fā)生后短時間內(nèi)即顯著發(fā)生。本發(fā)明的化合物對細胞遷移的促進作用可以通過調(diào)節(jié)細胞黏連蛋白β-catenin的降解以及增加基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、MMP-2的分泌，但不僅僅局限于上述的途徑來發(fā)生。本發(fā)明的化合物同時可以但不局限于通過調(diào)節(jié)組織重建過程中基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌來控制愈后瘢痕的生成。
本發(fā)明通過多個實例證明，本發(fā)明的化合物作為一味保肝利膽的中草名藥，亦能通過參與皮膚創(chuàng)傷后的組織再生、重建和瘢痕生成等病理過程在傷后愈合中起到加速愈合和減輕瘢痕增生的功效。且相對于現(xiàn)行的創(chuàng)傷治療手段，其具有生產(chǎn)簡單，運輸保存方便，給藥方式簡單等優(yōu)點，可非常好地進行臨床應(yīng)用。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的組合物；
其中，R獨立地選自氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、C1-C4烷氧基、鹵素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；
n為選自0-4的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，R獨立地選自氫、羥基、C1-C2烷基、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；或者
n為選自1-3的整數(shù)。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物具有式(II)結(jié)構(gòu)
其中，R的定義同權(quán)利要求1。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物具有式(III)結(jié)構(gòu)
其中，R的定義同權(quán)利要求1。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于減少創(chuàng)傷后瘢痕形成。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于促進細胞遷移。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于促進β-連環(huán)蛋白降解。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于促進細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的基質(zhì)金屬蛋白酶選自基質(zhì)金屬蛋白酶9，或基質(zhì)金屬蛋白酶2。
10.一種修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的方法，其特征在于，包括步驟給需要的對象施用有效量的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中，R獨立地選自氫、羥基、C1-C4烷基、C2-C4鏈烯基、C2-C4鏈炔基、C1-C4烷氧基、鹵素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；
n為選自0-4的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的化合物，所述的化合物具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)所述化合物具有非常優(yōu)異的促進皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的效果，同時能夠明顯地促進皮膚細胞的遷移；減少創(chuàng)傷后瘢痕形成；促進β-連環(huán)蛋白蛋白降解；以及促進細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌。所述化合物效果良好，可完全通過人工方式合成，且制備、儲藏、運輸成本低廉。
文檔編號A61P17/00GK101732325SQ200810203429
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者翟鈺棟, 張曉坤, 曾錦章, 儲瑞藹 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 上海生茂投資有限公司