專利名稱：制備卵囊的改進(jìn)方法
本申請是申請日為2002年8月29日，申請?zhí)枮?2816605.1，發(fā)明名稱為“制備卵囊的改進(jìn)方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。相關(guān)申請資料
本申請要求2001年8月30日提出的美國臨時申請?zhí)?0/316310的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本說明書中。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明提供制備來源于原生動物的卵囊的方法和組合物；特別地，本發(fā)明提供制備艾美蟲(Eimeria)卵囊的方法和組合物。
本
背景技術(shù)：
家禽球蟲病是艾美蟲屬原生動物寄生蟲所致的疾病。艾美蟲類的卵囊普遍存在于環(huán)境并且在家禽垃圾中持續(xù)存活多個月。食入卵囊能以種特異性方式導(dǎo)致消化道多個部位的感染。這些生物體在消化道內(nèi)的增殖超過數(shù)日，結(jié)果使其下一代卵囊排泄于糞便中。重復(fù)周期感染導(dǎo)致免疫，并且當(dāng)家禽接受早期感染且家禽之間的劑量均一，經(jīng)過幾個周期接觸后可以形成相當(dāng)鞏固的免疫力。
相反，當(dāng)禽類未以均一的方式接受感染，可能引起從未感染過的禽類受到突然、嚴(yán)重感染的情形，導(dǎo)致飲食轉(zhuǎn)化能力以及體重增加的降低，以及較高的二次感染的危險。目前，家禽工業(yè)中用于控制球蟲病的最常見方法不是疫苗接種，而是在食物中給予抗球蟲藥。接種率低常常是由于通過操作便利的飲食或飲水或通過孵化場噴灑接種的給藥均一性不可靠，這些是傳統(tǒng)的給藥途徑和時間。對改善孵化場給藥期間的給藥均一性的關(guān)注正在逐漸增加。
近來，已建立的卵內(nèi)接種技術(shù)適用于以活卵為基礎(chǔ)的球蟲疫苗給藥(WO96/40234和WO96/40233；Pfizer，Inc.)。這種卵內(nèi)給藥途徑提供了一種對仍在禽卵中的各個胚胎給予均一劑量的疫苗的便捷方法。卵內(nèi)給予禽疫苗現(xiàn)在應(yīng)用于美國每年生產(chǎn)的90億只童子雞中的約85％，以及百分比漸增的在美國之外每年生產(chǎn)210億童子雞(例見，美國專利號4458630)。因此，活的、卵內(nèi)給藥的球蟲疫苗的潛在市場顯著大于孵化后給予球蟲疫苗的當(dāng)今市場。
采用于球蟲活疫苗的卵囊來源于原先嚴(yán)重富含污染微生物的雞糞。通常，管理單位要求卵內(nèi)給藥疫苗應(yīng)當(dāng)表明基本不存在污染微生物。為最徹底地保證終產(chǎn)品中的生物負(fù)荷水平最小，在卵囊制備過程的各步驟中采用有效控制微生物污染水平的組合物和方法是有益的，包括收集和孢子形成步驟以及滅菌步驟。
目前疫苗制備中制備卵囊的方法的缺陷在于經(jīng)常使用對設(shè)備有害或腐蝕的材料。
因此，本領(lǐng)域內(nèi)需要一種改進(jìn)的由原生動物制備卵囊的方法，尤其是用于制備疫苗。
本發(fā)明概述 本發(fā)明涉及改進(jìn)的制備原生動物卵囊(例如，艾美蟲)的方法和組合物，例如用于制備疫苗。尤其在家禽疫苗方面，本發(fā)明適合于制備孵化后或卵內(nèi)使用的疫苗。同樣，該疫苗可以用于童子雞、蛋雞、種雞、火雞、小馬和/或家禽產(chǎn)業(yè)。
相應(yīng)地，第一個方面，本發(fā)明提供一種用于制備卵囊的組合物，其包括過氧化合物和有機(jī)酸，所述組合物具酸性pH值。該組合物可以用于原生動物卵囊的收集、孢子形成和/或滅菌。
由此，另一方面，本發(fā)明提供一種收集動物糞便中的原生動物卵囊的方法，其包括步驟(a)提供原生動物感染的動物，其中動物在其糞便中排泄源自原生動物的卵囊，和(b)使來源于感染動物的含卵囊的糞便與包括過氧化合物和有機(jī)酸的組合物接觸。
在特定的上述實施方案中，從組合物中撤除或者過氧化合物或者有機(jī)酸，特別是當(dāng)被用作收集介質(zhì)的時候。
另一方面，本發(fā)明提供一種使原生動物卵囊形成孢子的方法，其包括步驟(a)提供一種包括原生動物卵囊的組合物，和(b)在適合孢子形成的條件下使卵囊在包括過氧化合物和有機(jī)酸的組合物中持續(xù)一定時間形成孢子。
再一方面，本發(fā)明提供一種使原生動物卵囊消毒的方法，其包括(a)提供一種包括原生動物卵囊的制品，和(b)在足以達(dá)到對所述制品的需要消毒水平的條件下在包括過氧化合物和有機(jī)酸的組合物中使卵囊消毒一定時間。
又一方面，本發(fā)明提供一種用于純化原生動物卵囊的浮選介質(zhì)，其包括高密度、非離子溶液和聚陽離子。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供一種用于純化原生動物卵囊的浮選介質(zhì)，其包括高密度、非離子溶液和油。
本發(fā)明也提供一種通過浮選而純化原生動物卵囊的方法，其步驟包括(a)在上述浮選介質(zhì)和大量原生動物卵囊之間形成懸浮液，(b)讓懸浮液分層，和(c)從分層的懸浮液中收獲原生動物卵囊。
本發(fā)明上述方面的一種特定實施方案中，原生動物包括艾美蟲屬的物種并且動物對象為禽類。
再一方面，本發(fā)明提供一種由禽類制備原生動物卵囊的方法，其步驟包括(a)用原生動物感染禽類足夠時間，使原生動物卵囊在感染禽類對象糞便中排出，(b)從感染禽類對象收集含卵囊的糞便，以及(c)在所述收集步驟之前至少約1天以及在所述收集步驟的至少部分階段以平均大粒徑的食物喂飼感染的禽類對象。在特定實施方案中，原生動物包括艾美蟲屬物種。
在以下說明書中更加詳細(xì)地闡述本發(fā)明的上述和其它方面。
本發(fā)明詳述 現(xiàn)參照本發(fā)明之優(yōu)選實施方案描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可以以不同的形式實現(xiàn)并且不表明受本說明書所提出的實施方案限制。此外，提供這些實施方案是使本公開充分徹底，并向本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員完整表達(dá)本發(fā)明之范圍。
除另有說明外，本發(fā)明中所采用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的一般技術(shù)人員的常規(guī)理解具有相同的意思。在本發(fā)明說明書中所采用的術(shù)語的目的僅僅是描述特定實施方案而無意于限制本發(fā)明。
本說明書提及的全部出版物、專利申請、專利、以及其它參考文獻(xiàn)均以其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本說明書中。
本發(fā)明說明書中所采用的術(shù)語的目的是僅僅是描述特定實施方案而無意于限制本發(fā)明。本發(fā)明說明書及所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”、“一種”和“該(所述)”意思也包括復(fù)數(shù)形式，除非正文另有明確說明。
本發(fā)明適用于藥用和獸用。術(shù)語“動物”和“動物對象”包括但不限于哺乳動物和禽類對象，優(yōu)選是禽類對象。
合適的哺乳動物對象包括但不限于人、猿、豬、牛、山羊、馬、貓、綿羊、犬、小鼠和兔類(lagamorph)對象。
本說明書所用術(shù)語“禽類”和“禽類對象”或“鳥類”和“鳥類對象”包括雄性和雌性任何禽類或鳥類，但主要是包括目的是獲得禽卵、禽肉或作為寵物的商業(yè)飼養(yǎng)的家禽。因此，術(shù)語“禽類”和“禽類對象”或“鳥類”和“鳥類對象”優(yōu)選包括雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉雞、長尾鸚鵡、鸚鵡、美冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鹋等。雞和火雞為優(yōu)選的禽類或鳥類對象，以雞為最優(yōu)選。
本發(fā)明總體涉及制備原生動物卵囊的方法和組合物。已發(fā)現(xiàn)這些方法和組合物可用作例如制備疫苗的方法。許多原生動物具有被稱作為“卵囊”的生活階段。本發(fā)明應(yīng)用于從任何原生動物物種制備卵囊，包括但不限于艾美蟲屬、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、弓形體屬、瘧原蟲和等孢子球蟲屬。在本發(fā)明的實施方案中，本發(fā)明用于制備艾美蟲卵囊。
術(shù)語“原生動物”、“卵囊”、“孢子囊”、“子孢子”和“裂殖子”具有它們在本領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的意思。除另有說明外，這些術(shù)語的意思指活的原生動物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子，盡管本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠理解可以采用滅活的(或減毒的)原生動物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子制備疫苗。
術(shù)語“艾美蟲”是指艾美蟲屬的一個或一個以上的物種。這些艾美蟲物種包括那些存在于雞的種類，包括禽艾美蟲(E.tenella)，堆形艾美蟲(E.acervulina)，巨型艾美蟲(E.maxiam)，尼氏艾美蟲(E.necatrix，)和緩艾美蟲(E.mitis)，塞前艾美蟲(E.praecox)，E.mivati和波氏艾美蟲(E.brunetti)，以及那些存在于火雞的種類，其包括E.meleagrimitis，E.adenoeides，E.gallopavonis，E.dispersa，E.innocua和E.subrotunda。術(shù)語“艾美蟲”還包括感染其它鳥類或哺乳動物物種的艾美蟲屬的品系或物種。此外，術(shù)語“艾美蟲”包括上述艾美蟲屬物種的所有品系，包括但不限于野生型品系、早熟型或其它選育品系、減毒品系以及已經(jīng)減毒的卵囊，例如通過輻照、化學(xué)處理等減毒。而且，術(shù)語“艾美蟲”還包括任何新發(fā)現(xiàn)的艾美蟲品系或物種。最后，術(shù)語“艾美蟲”包括活的和滅活的艾美蟲，盡管除另有說明外是指活的艾美蟲。
包括艾美蟲卵囊的組合物發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于抗球蟲病的鳥類免疫方法?？骨蛳x病的鳥類接種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括卵內(nèi)(例如，國際專利公開WO 96/40234和WO 9640233；PizerInc.)和孵化后(例如，Edgar的美國專利號3147186；McDonald等的美國專利號5055292；以及Shirley等的美國專利號4438097)的接種方法。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠理解卵囊可以進(jìn)一步處理以給予其它生命階段(例如子孢子或孢子囊)以用于最終疫苗組合物，或制備符合接種目的原生動物蛋白。
此外，術(shù)語“原生動物”包括野生型品系、早熟型或其它選育品系、減毒品系、以及已經(jīng)減毒的卵囊，例如經(jīng)過輻照、化學(xué)處理等。而且，術(shù)語“原生動物”還包括任何新發(fā)現(xiàn)的原生動物品系或物種。最后，術(shù)語“原生動物”涵蓋活的和滅活的原生動物，盡管除另有說明外是指活的原生動物。
術(shù)語卵囊的“制備”包括感染動物(例如鳥)和收集含有卵囊的糞便、形成孢子、純化和/或消毒卵囊等步驟。因此，術(shù)語“制備”是指從動物中收獲卵囊以及從糞便材料中純化卵囊的全過程或指該過程中的單個步驟(或一個從屬步驟)。
除另有說明外，用于本說明書的卵囊制備方面的術(shù)語“純化”是指從含有卵囊的制品中分離或去除碎屑或其它不需要的物質(zhì)。這些術(shù)語意思是指提高從存在于糞便的其它物質(zhì)中提取或分離卵囊的程度，并非從卵囊制品中絕對去除所有其他物質(zhì)。類似地，卵囊制品可以含有一定程度的污染微生物，只要其最終制品適合其預(yù)定用途(例如，作為疫苗)。在疫苗擬用于卵內(nèi)給予鳥類的情況下，在特定實施方案中，其制品應(yīng)當(dāng)完全沒有可檢測到的微生物污染，尤其是對胚胎有致病作用(即，導(dǎo)致顯著的疾病或死亡)的微生物。
根據(jù)情況，“純化”過程可以是指從糞便中純化卵囊以制備適合疫苗接種目的的制品的全過程?；蛘?，“純化”過程可以是指全部純化流程中的任何從屬步驟甚或單一步驟。
本發(fā)明提供制備卵囊(例如，艾美蟲卵囊)的方法和組合物。所制備的卵囊一般具有充分的感染性、活性和純度以生產(chǎn)用于免疫接種的免疫原性組合物。本發(fā)明的方法和組合物可以與本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它方法結(jié)合使用。類似地，本發(fā)明之各種方法和組合物可以單獨(dú)或相互結(jié)合使用。
卵囊例如艾美蟲卵囊的制備方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(例見，Edgar的美國專利號3147186；Davis等的美國專利號4544548和4863731；國際專利公開WO 00/50072(Pizer Inc.)，以及國際專利公開WO02/37961(Novus International，Inc.)；Hammond等，(1994)Amer.J.Vet.Res.570；Hill等，(1961)J.Parasit.47357；Jackson，(1964)Parasitology5487，Lotze等，(1961)J.Parasit.47588；Schmatz等，(1984)，J.Protozool.31181；Whitlock，(1959)Aust.Vet.J.35310)。一般地，這些方法涉及以相應(yīng)的原生動物感染動物，收集含有卵囊的感染動物糞便，通過一系列分離步驟純化卵囊例如過篩、離心、過濾和/或密度浮選從糞便性材料純化卵囊，使卵囊形成孢子，任選添加分離步驟，以及任選對形成孢子的卵囊進(jìn)行消毒以滅活污染微生物(包括細(xì)菌、霉菌、真菌、酵母和病毒)。不同卵囊制品(例如，來源于不同種類或品系)可以聯(lián)合組成最終產(chǎn)品，例如，抗多種原生動物(例如，艾美蟲)的疫苗。
術(shù)語“微生物污染”或“被微生物污染”是指存在可檢測的有害的活體微生物，其包括但不限于細(xì)菌、霉菌、真菌、酵母和病毒。在特定實施方案中，其卵囊制品基本沒有可檢測的污染微生物，即在制品中檢測不到顯著水平的污染微生物。
縮略詞“v/v”是指“體積/體積”。類似地，縮略詞“w/v”是指“重量/體積”。
下文更詳細(xì)地描述本發(fā)明的各個方面。
免疫原性組合物 采用本發(fā)明方法制備的免疫原性組合物可以給予動物對象以免疫接種抗原生動物病?？梢越o予含有采用本發(fā)明方法制備的卵囊的免疫原性組合物(例如，疫苗)以引起免疫反應(yīng)。典型地，該免疫原性組合物包括與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合的本說明書公開的免疫劑量的卵囊?！懊庖邉┝俊笔锹涯业膭┝孔阋砸鸹蚣ぐl(fā)免疫原性組合物給藥對象的免疫反應(yīng)。如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所理解的，免疫原性組合物可以用活的、減毒的和/或滅活的生物體配制。在卵內(nèi)給予活的球蟲疫苗情況下，其卵囊劑量一般足以產(chǎn)生相對低水平的初始感染，其后繼以多輪再感染，通過反復(fù)多次感染導(dǎo)致免疫。上述討論針對卵囊，但也適用于其它生命體，例如，子孢子或孢子囊。
以“藥學(xué)上可接受的”表示一種并非生物學(xué)或其他方面不希望的物質(zhì)，即，該物質(zhì)可以給予對象而不產(chǎn)生任何不希望的生物學(xué)作用。因此，這種藥用組合物可以用于例如制備免疫用組合物。生理學(xué)和藥學(xué)上可接受的載體可以包括其它化合物，包括但不限于本領(lǐng)域內(nèi)已知的穩(wěn)定劑、鹽、緩沖劑、佐劑和/或防腐劑(例如，抗菌、抗真菌和抗病毒劑)。藥學(xué)上可接受的載體并非必須無菌，盡管其通常被卵內(nèi)給予禽類胚胎。
可以采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的免疫原性組合物的任何給藥途徑，只要能激發(fā)抗原生動物的活性免疫反應(yīng)(優(yōu)選保護(hù)性免疫反應(yīng))。當(dāng)對象為鳥類時，該免疫原性組合物可以卵內(nèi)或孵化后給予。實例性給藥途徑有孵化后口服給藥或卵內(nèi)注射到羊膜中。在特定的本發(fā)明實施方案中，用自動注射裝置卵內(nèi)給藥。
術(shù)語“接種”或“免疫”是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。例如術(shù)語接種或免疫可以理解為一種增強(qiáng)對象對抗原的免疫反應(yīng)的過程，并由此增強(qiáng)其對抗或克服感染的能力。對抗艾美蟲的鳥類卵內(nèi)免疫方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(例如，國際專利公開WO 96/40234和WO 9640233；Pfizer，Inc.)。
本說明書中使用的術(shù)語“保護(hù)性免疫”或“保護(hù)性免疫反應(yīng)”是指寄主動物建立起針對疫苗的免疫反應(yīng)，由此在其后接觸或被攻擊時，該動物能夠抗擊感染。因此，在處理動物中保護(hù)性免疫反應(yīng)將減少以后接觸病原體時的發(fā)病和死亡事件。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠理解在商業(yè)性動物飼養(yǎng)體系中，評價所產(chǎn)生的保護(hù)性免疫反應(yīng)是評價疫苗接種在全體禽或獸群中的作用，例如，在極少數(shù)免役接種動物中可能仍然有疾病或發(fā)病以及死亡的現(xiàn)象。
“活性免疫反應(yīng)”其意思是在以后接觸原生動物或原生動物抗原后對對象群體具有一定益處的任何水平的保護(hù)作用，無論其形式是降低發(fā)病、減少病變、改善食物轉(zhuǎn)化率、或減少疾病的任何其它有害作用等等，無論其預(yù)防作用是部分的還是完全的?！盎钚悦庖叻磻?yīng)”或“活性免疫力”的特征是“參與接觸免疫原后的寄主組織和細(xì)胞。其涉及淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)中的免疫活性細(xì)胞的分化和增殖，其導(dǎo)致抗體合成或促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)活性或兩者兼有”。Herbert B.Herscowitz，ImmunophysiologyCell Function and Cellular Interaction in AntibodyFormation(免疫生理學(xué)抗體形成中的細(xì)胞功能與細(xì)胞間相互作用)，見IMMUNOLOGYBASIC PROCESSES(免疫學(xué)基本過程)117(Joseph A.Bellanti主編，1985)。換句話說，活性免疫反應(yīng)是通過感染，或如本發(fā)明情況下，通過接種使寄主接觸免疫原之后建立起來的。活性免疫力可以與被動免疫力相區(qū)別，后者通過“從已被主動免疫的寄主把預(yù)先形成的物質(zhì)(抗體、轉(zhuǎn)移因子、胸腺移植物、白介素-2)到未免疫寄主”獲得的。
卵囊收集與孢子形成 卵囊典型地收集于感染動物的糞便，然后在獲得感染力之前在氧氣存在下形成孢子。根據(jù)多種常規(guī)方法，卵囊在含有2.5％重鉻酸鉀的溶液中收集并形成孢子。重鉻酸鉀充當(dāng)抗菌溶液并作為卵囊孢子形成的氧氣來源。然而，重鉻酸鉀是有害物質(zhì)并且作為有害廢物需要特殊處理。根據(jù)常規(guī)方法，從卵囊制品中去除重鉻酸鉀以制備基本不含這種有害化合物的最終產(chǎn)品。
根據(jù)先有技術(shù)方法，含有卵囊的糞便在各個物種的產(chǎn)出高峰期期間以含有重鉻酸鉀的干燥或液體介質(zhì)收集(例如，在接種艾美蟲后約三、四或五天至約六至九天)。在收集階段之后，然后采用例如過篩或密度浮選技術(shù)將卵囊從糞便雜物中初步分離，然后置于新鮮的重鉻酸鉀介質(zhì)中，攪拌，并通氣48至72小時以促進(jìn)孢子形成過程。
在Edgar的美國專利號3147186中，描述的艾美蟲卵囊孢子形成是采用1％至4％重鉻酸鉀作為孢子形成介質(zhì)。該專利申明“該化合物滿足作為抗細(xì)菌、抗真菌、和抗病毒劑并且還在孢子形成期間及其后為卵囊提供氧氣以保持其活力的多重目的(Col.11，47-50行)”。
Ryley等(1976)Parisitology 73(3)311-326，描述了采用2.5％的重鉻酸鉀溶液作為收集、孢子形成、和長期貯藏介質(zhì)。
Cost 89/820，生物技術(shù)，球蟲病研究技術(shù)指南，Eckert，J.，R.Braun，M.W.Shirly，及P.Coudert，編著，1995，歐洲委員會，董事會總則XII，科學(xué)、研究和發(fā)展，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，盧森堡，第8頁，也描述了在卵囊制備中采用2.5％的重鉻酸鉀。
本發(fā)明提供一種收集卵囊的介質(zhì)，該收集介質(zhì)包括過氧化合物和有機(jī)酸。該收集介質(zhì)優(yōu)選具有控制有害微生物生長的酸性pH值(例如，低于約pH 7、6、5、4或3)并且還可以含有其它抗微生物化合物。在特定實施方案，收集介質(zhì)的pH值在約pH 1至約pH 3范圍內(nèi)。
卵囊可以從感染動物的糞便、盲腸核、腸內(nèi)層等之中收集。然而，由于商業(yè)目的，其卵囊典型地收集于糞便。這些糞便與收集介質(zhì)接觸，后者可以達(dá)到一種或一種以上的目的，例如，其可能具有抗微生物(例如，抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等)特性和/或提供氧氣以保持卵囊活力。收集介質(zhì)中的氧氣還可以在收集期間誘導(dǎo)孢子形成并且可能縮短或甚至取消獨(dú)立的孢子形成步驟。
糞便或卵囊“收集”于本發(fā)明收集介質(zhì)中，其并非必須將糞便/卵囊直接收集于收集介質(zhì)?？梢允占案傻摹奔S便/卵囊然后轉(zhuǎn)移到本發(fā)明之收集介質(zhì)中。在本發(fā)明實施方案中，在糞便產(chǎn)生后約0.25、0.5、1、2、4、12、24、36或48小時之內(nèi)將糞便/卵囊轉(zhuǎn)移到本發(fā)明之收集介質(zhì)中。在描述性實施方案中，以傳送帶或傾斜表面接受含有卵囊的糞便然后轉(zhuǎn)移到含有本發(fā)明之收集介質(zhì)的收集容器中。在轉(zhuǎn)移(即在傳送帶或傾斜表面上)到收集容器期間可以用收集介質(zhì)噴灑糞便。
糞便與收集介質(zhì)的比率沒有限定，只要其足以控制微生物生長并且，如果需要的話，引起孢子形成過程。糞便與收集介質(zhì)的實例性比率是約1:0.25、約1:0.5、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、或約1:10(v/v)。
本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何過氧化合物均可用于收集介質(zhì)。實例性化合物包括過氧化氫、過硼酸鈉(例如，一水或四水化物形式)、過碳酸鈉、過氧化鎂、過氧化鈣、過氧化鋅、過氧化脲、以及它們的組合。所用的過氧化合物可以含有或不含激活劑如四乙?；叶?TAED)。TAED典型地采用約1-3％的濃度。
存在于收集介質(zhì)中的過氧化合物濃度足以達(dá)到預(yù)計作用(例如，抗微生物作用和/或形成孢子)，但不足以導(dǎo)致卵囊過分損傷。這些過氧化合物的濃度可以低至約0.05、0.1、0.25、0.5或1％(v/v)或(w/v)以及高至約0.5％、1％、3％、5％、10％、15％(v/v)或(w/v)或更高。當(dāng)過氧化合物為過氧化氫時，其典型的介質(zhì)濃度從約0.1％、0.25％或0.5％(v/v)至約1％、3％或5％(v/v)。
其有機(jī)酸可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的的任何有機(jī)酸，包括檸檬酸、乙酸、丙酸、或其它任何單-或多聚-乙酸、或它們的組合。介質(zhì)中的有機(jī)酸濃度可以是約0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％、8％、或10％(v/v)或(w/v)，或更高。有機(jī)酸的濃度可以進(jìn)一步低于約25％、20％、15％、12％、10％(v/v)或(w/v)，或更低。在特定實施方案中，所含有機(jī)酸的濃度是約1-15％或約3-10％(v/v)或(w/v)。
在其它特定實施方案中，除過氧化合物外，所述組合物含有從約1％至約20％或從約2.5％至約10％或15％檸檬酸以及從約0.05％至約1％或從約0.1％至約0.5％的丙酸。
該收集介質(zhì)可以另含其它組分，包括緩沖劑、鹽、抗微生物劑等。在本發(fā)明特定實施方案中，包括消泡劑。采用消泡劑可以有益于減少起沫和卵囊團(tuán)聚。
正如本領(lǐng)域內(nèi)可以理解的，有機(jī)酸可能相對昂貴。因此，在某些實施方案中可以省去收集介質(zhì)中的有機(jī)酸。
類似地，在收集階段存在某些可能需要避免采用過氧化合物的情況。因此，在特定的本發(fā)明實施方案中，收集介質(zhì)中省去了過氧化合物。
在特定實施方案中，過氧化合物和/或有機(jī)酸可以與更常規(guī)的含有重鉻酸鉀的收集或孢子形成介質(zhì)結(jié)合使用。在其它特定實施方案中，本發(fā)明之收集和孢子形成介質(zhì)不含重鉻酸鉀并且比使用含有重鉻酸鉀的介質(zhì)更安全和更容易處理。
本發(fā)明含有過氧化合物和有機(jī)酸(分別如上文所述)的過氧介質(zhì)可以選擇，或另外，用作孢子形成介質(zhì)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)該過氧介質(zhì)被用作收集介質(zhì)時，在收集期間有顯著百分比的艾美蟲卵囊形成孢子。在特定實施方案中，至少有約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的卵囊在收集期間(即，在任何純化步驟之前)形成孢子。
在某些實施方案中，該過氧介質(zhì)在獨(dú)立的孢子形成步驟中用作孢子形成介質(zhì)以完成孢子形成過程。此外，如果不采用本發(fā)明收集介質(zhì)(例如，如果采用重鉻酸鉀收集介質(zhì))，其可能將進(jìn)行特定的孢子形成步驟以實現(xiàn)卵囊制品孢子的充分形成。
相應(yīng)地，在特定實施方案中，本發(fā)明提供卵囊(例如，艾美蟲卵囊)孢子形成的方法，其步驟包括提供含有卵囊的組合物，以及在適合孢子形成條件下使卵囊在本發(fā)明的孢子形成介質(zhì)中一定時間形成孢子。
在收集階段之后實現(xiàn)孢子形成時，其糞便典型地收集于動物，并且再任選經(jīng)過純化步驟例如過篩、過濾等。然后將該卵囊轉(zhuǎn)移至孢子形成介質(zhì)，并且通常允許孢子形成在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行約24-96小時，例如，約48-72小時。例如，在孢子形成過程中其溶液可以攪動或攪拌和通氣。
當(dāng)收集和孢子形成步驟之間不需要更換過氧介質(zhì)時，為了商業(yè)制造之目的，其間一般有一個或一個以上的純化步驟并且在孢子形成步驟之前需添加新鮮的孢子形成介質(zhì)。
在其它實施方案中，其孢子形成過程與收集和/或消毒(下文所述)步驟同時進(jìn)行。
固體與收集介質(zhì)的比率沒有嚴(yán)格限定，只要其足以達(dá)到所需孢子形成水平和控制微生物生長。糞便與收集介質(zhì)的實例性比率為約1:0.25，約1:0.5，約1:1，約1:2，約1:3，約1:4，約1:5，或約1:10(v/v)。
例如，在一個說明性的實施方案中，將含卵囊的糞便收集于本發(fā)明收集/孢子形成介質(zhì)中。采用過篩、密度浮選和/或過濾技術(shù)從糞便原料中純化卵囊。然后通過離心使卵囊聚集并且重新懸浮于新鮮的收集/孢子形成介質(zhì)中，并且孢子形成是在合適的條件(例如，攪拌和/或通氣)下繼續(xù)48-72小時。
然后形成孢子的原生動物可以任選經(jīng)過其它純化步驟和/或消毒(下文所述)。
采用本發(fā)明介質(zhì)作為收集和/或孢子形成介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是可以防止卵囊變干，減少從收集階段開始的生物負(fù)荷，提供較高的孢子形成率，以及可以比含有重鉻酸鉀的常規(guī)介質(zhì)更容易處理。
孢子形成之后，可以進(jìn)行除去過氧化合物的步驟，例如，采用酶解處理、透析和/或過濾。例如，可以采用催化降解(例如，酶解處理或化學(xué)處理例如用二氧化錳)、透析和/或過濾除去過氧化合物。在使用過氧化氫的情況下，可以采用過氧化氫酶減少或清除殘留的過氧化氫。
卵囊消毒 消毒步驟作為一個任選步驟而典型地采用于作為卵內(nèi)疫苗以及在某些時候也用作孵化后疫苗的卵囊制備方法中。如本領(lǐng)域內(nèi)所已知，用于疫苗制品的卵囊通常采用次氯酸鈉溶液消毒，其可以導(dǎo)致卵囊壁的損傷，損害卵囊結(jié)構(gòu)并且可能降低無菌卵囊在貯存期間的長時程活力。
Vettering，J.M.((1969)J.Parasitology 55(2)412-417)描述了采用次氯酸介質(zhì)的無菌卵囊制備方法。
Jackson，A.R.B.((1964)Parasitology 5487-93)也描述了采用次氯酸鹽作為消毒介質(zhì)的活球蟲子孢子的分離方法。
Nyberg和Knnap((1970)Proceeding of the Helminthology Societyof Washington 3732-36)描述了電子顯微鏡顯示的次氯酸鈉對禽艾美蟲卵囊壁的影響。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上述包括過氧化合物和有機(jī)酸的收集/孢子形成介質(zhì)也可以用作消毒(滅菌)介質(zhì)。在特定實施方案中，消毒介質(zhì)將進(jìn)一步包括次氯酸鹽(例如，漂白劑)或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它消毒劑。
孢子形成(上文所述)之后，其卵囊制品可以經(jīng)過其它純化步驟(例如，密度過濾、浮選等)，繼而消毒。另外，消毒步驟可以在孢子形成步驟之前或同時使用。然而，一般來說，接近純化步驟結(jié)束時的消毒有優(yōu)勢，因為消毒之后的步驟是采用滅菌步驟或試劑來進(jìn)行的。
“消毒”的意思是減少卵囊制品中的污染微生物負(fù)荷(例如，活的污染微生物，如上文定義)。卵囊制品絕對沒有微生物污染是沒有必要的，只要最終制品符合其預(yù)計用途(例如，作為疫苗)。對于擬用于卵內(nèi)給予鳥類的疫苗，其制品一般應(yīng)當(dāng)基本沒有可檢測的微生物污染(即，檢測不到顯著水平的污染微生物)。在另一種實施方案中，與未消毒時相比，可檢測的污染微生物水平至少減少約50％、60％、75％、85％、90％、95％、99％或更多。
檢測微生物的方在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且以被檢測的微生物類型為基礎(chǔ)。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種卵囊消毒的方法，其步驟包括提供含有卵囊的組合物，以及在足以達(dá)到該組合物所需消毒水平的條件下使卵囊在本發(fā)明之消毒介質(zhì)(如上文所述)中消毒一定時間。在本發(fā)明實施方案中，消毒處理產(chǎn)生適合給予動物對象(例如，卵內(nèi)接種方法)的微生物污染水平的制品。該消毒步驟可以進(jìn)行任何合適的時間長度，其典型地為約1小時至約12、24或48小時。
在其它特定實施方案中，孢子形成和消毒處理同時進(jìn)行。
消毒處理的溫度沒有嚴(yán)格限定并且通常在從約4℃至約40℃的溫度下進(jìn)行。卵囊優(yōu)選不經(jīng)過冷凍或長時間暴露于高溫(例如，暴露于40℃下通常應(yīng)當(dāng)少于數(shù)小時或甚至少于1小時)。在一種實例性實施方案中，消毒是在約30℃下進(jìn)行約24至72小時。
卵囊制品對消毒介質(zhì)的比率沒有嚴(yán)格限定，只要足以將微生物生長水平降低到所需水平。糞便對收集介質(zhì)的實例性比率為約1:0.25、約1:0.5、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、或約1:10(v/v)。
消毒之后，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行去除過氧化合物的步驟，例如，采用催化降解(例如，酶解處理或化學(xué)處理例如以二氧化錳)、稀釋、透析和/或過濾。例如，在過氧化氫情況下，可以采用過氧化氫酶減少或去除殘留的過氧化氫。
作為另一個任選步驟，其卵囊制品可以接觸(例如，噴灑、漂洗或混合)一種降低卵囊間聚集的組合物，例如含有蛋白質(zhì)、肽、蛋白水解物和/或氨基酸的溶液(例如，水溶液)。示例性化合物包括但不限于大豆蛋白、大豆水解物、酪蛋白、酪蛋白水解物、溶解酵素、白蛋白、牛血清白蛋白、乳蛋白、氨基酸(例如，精氨酸、苯丙氨酸和/或天冬氨酸)、胎牛血清、雞血清、全乳、等等。在一種特定實施方案中，抗聚集溶液包括帶正電荷的氨基酸、帶負(fù)電荷的氨基酸以及中性氨基酸。
典型地，溶液中各組分的濃度為約0.01M至10M、約0.05M至5M或約0.05M至約2M。
溶液pH值可以根據(jù)介質(zhì)中采用的特定組分選擇，并且可以在酸性、中性、或堿性范圍中。在特定實施方案中，抗聚集溶液的pH在中性范圍內(nèi)。例如，該溶液可以用磷酸緩沖液(pH 7)或Hank平衡鹽溶液(pH 7)緩沖。
還可以采用其它化合物減少聚集，例如，消泡劑(如，消泡凈A)。
卵囊可以在純化過程中的任何一個希望減少卵囊間聚集的點(diǎn)接觸抗聚集介質(zhì)。在消毒過程之后采用可能有優(yōu)勢。在特定實施方案中，沒有消毒步驟(例如，在某些孵化后疫苗產(chǎn)品中)，此過程可以用于減少終產(chǎn)物的聚集?；蛘撸摽咕奂芤嚎梢蕴砑拥阶罱K制劑中以減少其中的卵囊聚集。
卵囊分離的浮選介質(zhì) 一種用于從糞便物質(zhì)及其它不需要的雜物中純化卵囊的傳統(tǒng)技術(shù)是依賴于通過高密度介質(zhì)如飽和氯化鈉或蔗糖溶液的卵囊密度浮選并回收含有卵囊的部分。浮選方法可以用于孢子形成之前和/或之后。離子溶液如氯化鈉可能在長時暴露時損傷卵囊(Ryley和Ryley，(1978)Parasitology 7733-39)。非離子溶液，例如蔗糖濃溶液，也被用于浮選步驟。任何固體試劑例如氯化鈉或蔗糖的缺點(diǎn)之一是它們在使用前必須溶解于一種水溶液中。
在Davis等的美國專利號4544548和4863731中，提出了一種控制禽類球蟲病的方法。這些專利描述了鹽浮選過程的用途，即，在濃鹽溶液中采用離心浮選并且隨后稀釋并在二次離心步驟中回收卵囊。
Ryley等((1976)Parisitology 73(3)311-326)描述了采用蔗糖、氯化鈉、和硫酸鋅浮選從糞便中分離卵囊的方法。
Vetterling J.M.((1969)J.Parisitology 55(2)412-417)描述了連續(xù)流離心技術(shù)在高密度蔗糖溶液中浮選、以水稀釋、再次離心回收卵囊。
Marquardt W.C.((1961)J.Parisitology 47248-250)描述了通過梯度離心從糞便雜物中分離線蟲卵的方法。Patnaik B.等((1966)Indian Vet.J.43414-422)公開了通過修正的Marquardt法從雞糞中獲得純化狀態(tài)的球蟲卵囊的技術(shù)。
Shama和Reid((1963)J.Parisitology 49159-160)公開了一種采用密度梯度沉降的球蟲卵囊的凈化方法。
國際專利公開WO 00/50072(Pfizer，Inc.)描述了硫酸鈉浮選處理的用途。
Dulski等(1988)Avian Diseases 32235，描述了膠體二氧化硅懸浮液(PercollTM)在卵囊密度浮選中用途。
本發(fā)明提供一種從不需要的物質(zhì)中純化卵囊的浮選介質(zhì)，其包括高密度、非離子液體和聚陽離子分子或顆粒。該高密度、非離子液體可以是具有約1.08、1.1、1.12、1.14、1.16、1.18或1.2g/ml密度的任何含水液體。典型地，該密度不能更高，因為大多數(shù)商業(yè)離心設(shè)備不用于高密度溶液離心。在本發(fā)明的實施方案中，高密度、非離子溶液為甘油、山梨糖醇、蔗糖、高果糖玉米糖漿、羥甲基纖維素、或它們的聯(lián)合。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)聚陽離子分子或顆粒可以用于改善非離子浮選介質(zhì)的雜物去除特性。本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何合適的聚陽離子均可包括于浮選介質(zhì)。示例性聚陽離子包括精氨酸、組氨酸、賴氨酸、二乙基氨基乙基-纖維素(DEAE-纖維素)，以及多價金屬離子(例如，鐵或鋁鹽如硫酸鋁和氯化鐵)。聚陽離子的濃度沒有嚴(yán)格限定，但優(yōu)選足夠高以促進(jìn)雜物絮凝，但不足以過分損傷卵囊。介質(zhì)中聚陽離子的實例性濃度是從約0.01M、0.05M或0.1M至約0.5M、1M、3M或更高。
浮選介質(zhì)可以含有其它組分例如緩沖劑或抗微生物劑。在特定實施方案中，該浮選介質(zhì)包括非離子去垢劑(例如，土溫-20)和/或消泡劑(消泡凈A)以降低卵囊形成凝塊的可能性。
本發(fā)明還包括采用密度浮選步驟的卵囊純化方法。在特定實施方案中，該方法包括將含有卵囊的制品懸浮于包括高密度、非離子液體和聚陽離子的組合物中以在形成足以產(chǎn)生卵囊浮選的條件的懸浮液，以及從懸浮液中回收卵囊。一般地，使含有卵囊的物質(zhì)與浮選溶液混合，并允許溶液分層，其卵囊保留在上清液部分而糞便雜物形成沉淀。可以采用離心以易化或促進(jìn)分層。
本發(fā)明者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)將油加到包括高密度非離子浮選介質(zhì)(有或無聚陽離子)中可以改進(jìn)浮選步驟。這種油可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何合適的油，包括但不限于玉米油、紅花油、花生油、雙低油菜籽油、大豆油、等。油的加入可以改善雜物除去并且在無高速離心時達(dá)到更好的分離水平并且甚至可以不需要離心。
浮選步驟中的油的濃度沒有特別限制。用于浮選介質(zhì)的油的濃度一般為浮選溶液總體積的約1％至約10％或約3％至約7％。
此外，油浮選步驟可以在上文所述含有聚陽離子的高密度非離子溶液浮選之前或之后。
浮選步驟之后，含有卵囊的回收部分可以進(jìn)一步通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何合適的方法進(jìn)行加工。例如，這部分可以經(jīng)過本領(lǐng)域內(nèi)已知的或本說明書公開的其它純化程序、和/或孢子形成和/或消毒。
可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法從卵囊中除去浮選介質(zhì)，包括離心/洗滌步驟、透析和離心(例如，切向流動過濾)。
食物制備 特別考慮到以鳥類生產(chǎn)卵囊，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在卵囊被排泄到糞便時或其前后時間里鳥類進(jìn)食可以影響卵囊從糞便物質(zhì)中的分離過程。按照傳統(tǒng)方法，在卵囊(例如，艾美蟲卵囊)被排泄到糞便的全部階段通常禽類被喂以完全磨碎或粉碎的食物。在含有卵囊的糞便物質(zhì)被收集后，其初始純化步驟依賴于大量處理技術(shù)如篩分和/或過濾。常規(guī)的禽類食物含有非常精細(xì)的顆粒，其可能難以從卵囊中分離。據(jù)本發(fā)明者所知，本說明書所述研究首先定位于闡明食物對從動物糞便純化卵囊過程的影響。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)通過維持感染動物的大顆粒食物，即，食物具有較大的平均粒徑可以促進(jìn)(即，改善)從糞便物質(zhì)中分離卵囊。該食物典型含有的主要組分的配料未經(jīng)碾粉(即，完整顆粒)或僅部分碾粉或經(jīng)過壓制或提取。實例性配料包括碎裂玉米、壓制大豆、完整燕麥，以及它們的組合。在部分實施方案中，顆粒經(jīng)篩分而去掉細(xì)粉。在本發(fā)明特定實施方案中，該大顆粒食物中含有少于約40％(w/w)、少于約30％(w/w)、少于約20％(w/w)、少于約10％(w/w)、少于約5％(w/w)、或甚至更少的碾粉飼料或食物(例如碾粉的玉米、大豆、魚或骨粉飼料等)。在另一種實施方案中，大顆粒食物基本不含碾粉的飼料組分。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠理解維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、和其它微量營養(yǎng)成分將典型地添加到食物的顆粒狀預(yù)混配方中。
示例性的禽類食物含有至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高(w/w)的壓制大豆、碎裂玉米、整粒燕麥、和/或其它未碾粉或僅部分碾碎、壓制、榨取的本領(lǐng)域內(nèi)已知的飼料組分，以及保持鳥類的營養(yǎng)健康的任何維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和鹽。在一種特定實施方案中，喂飼雞的食物基本上由45-55％(w/w)壓制大豆、35-40％(w/w)碎裂玉米、和5-15％(w/w)的整粒燕麥、以及以及保持鳥類的營養(yǎng)健康的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和鹽組成。
大體上，在收集期間維持大顆粒食物的鳥類所產(chǎn)生的糞便中至少有約30％、35％、40％、50％、60％、70％(w/w)或更多能夠留存于0.5mm篩?；蛘撸辽儆屑s40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％(w/w)或更多的糞便留存于0.075毫米篩。
鳥類可以從孵化后開始喂飼大顆粒食物?；蛘撸B類開始喂飼常規(guī)禽類食物然后在收集階段的某一時間或之前，例如收集前至少約七天、五天、三天、兩天、一天或十二小時，或者，在收集開始時，轉(zhuǎn)而喂飼大顆粒食物。一般在整個收集階段維持鳥類的大顆粒食物。只要發(fā)現(xiàn)純化過程有某些改善或改進(jìn)，鳥類喂飼大顆粒食物可以少于完整的收集階段。
含有排泄卵囊的糞便典型地收集于各物種的最高產(chǎn)出期間，根據(jù)其種屬，典型地起始于感染后三、四或五天并且在其后連續(xù)收集約兩至四天。在本發(fā)明的實施方案中，收集階段發(fā)生在感染后約3-9或約4-8天的某一時間。
本發(fā)明的大顆粒食物制備可以導(dǎo)致雜物去除更容易、改善卵囊產(chǎn)率、和/或降低生產(chǎn)成本。
下列實施例的提出是對本發(fā)明的闡述，而不能被解釋成是對它們的限制。
實施例1 制備卵囊的食物 該實施例描述一種由大顆粒和典型的食物添加劑(維生素、礦物質(zhì)、微量營養(yǎng)素)聯(lián)合組成的生產(chǎn)卵囊的食物。該大顆粒組分可以包括碎裂玉米、壓制大豆、和/或整粒谷物如燕麥。在保持鳥類合理的營養(yǎng)的同時開發(fā)這種食物以改進(jìn)卵囊的產(chǎn)量和產(chǎn)率并且易化卵囊的分離。其方案可以包括采用常規(guī)禽類食物直至收集階段剛開始之前，在卵囊產(chǎn)出階段期間轉(zhuǎn)而以大顆粒食物喂飼鳥類。這種食物的優(yōu)點(diǎn)是更容易地通過過篩和過濾去除雜物，其改善卵囊產(chǎn)率，以及其減少生產(chǎn)成本。
過篩處理常規(guī)采用于卵囊純化中。通過采用高百分比的留存于篩的大顆粒而開發(fā)出來的食物配方能夠使過篩處理更容易。以常規(guī)禽類食物作為對照研究四種實驗性食物的卵囊產(chǎn)出。采用Cobb x Cobb童子雞生產(chǎn)巨型艾美蟲卵囊。每種處理各采用五個平行樣本。此實施例中，大顆粒食物喂飼于整個實驗期間，沒有補(bǔ)充常規(guī)禽類食物。糞便樣本收集于高峰產(chǎn)出階段(管飼后5至8天)并且達(dá)到體積標(biāo)準(zhǔn)、充分混合并采集卵囊計數(shù)和測定雜物的子樣本。然后各樣本以35目篩(約0.5mm)過篩，使之達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)體積，充分混合并采集卵囊計數(shù)和測定雜物的子樣本。結(jié)果見表1所示。
表1 這些實驗結(jié)果表明采用常規(guī)禽類食物時雜物初始水平最高。食物2-5(大顆粒食物)產(chǎn)生的起始雜物水平低于常規(guī)禽類食物，并且全部實驗食物是類似的。過35目篩后對于大顆粒食物其卵囊回收率(91至99％)高于常規(guī)禽類食物(85％)。最后，采用大顆粒食物時35目篩去除高達(dá)46％的雜物，相比之下當(dāng)采用常規(guī)禽類食物時過35目篩僅去除5％的雜物。
實施例2 生產(chǎn)卵囊的食物的小規(guī)模使用預(yù)試 采用籠養(yǎng)童子雞(共計540只)生產(chǎn)巨型艾美蟲卵囊。主要喂飼實施例1所述食物5(大顆粒食物)；在食物5喂飼期間也提供標(biāo)準(zhǔn)禽類食物的補(bǔ)充碟。經(jīng)口管飼至嗉囊給予接種卵囊(每只雞20000個形成孢子的卵囊)。接種后5至8天將糞便收集到10％檸檬酸、0.25％丙酸溶液中(每盆2升)。
收獲后，每批均進(jìn)行下列步驟 ·匯聚；測量匯聚樣本體積；采集子樣本。
·采用振蕩篩過一組18目(1mm)和60目(～0.25mm)篩。
·采用振蕩篩過200目(～0.25mm)篩。
·采用McMaster方法計數(shù)卵囊。
·通過離心少量樣品測定雜物水平并測量沉淀固體體積與離心總體積的比率。
其結(jié)果總結(jié)于下列表2中 表2 該結(jié)果表明食物5的卵囊回收率平均為86-88％而CVs(變異系數(shù))<15％。平均有72％的初始固體在過篩步驟中被除去。
實施例3 以過氧和有機(jī)酸為基礎(chǔ)的介質(zhì)用于卵囊收集和孢子形成 本實施例，以及其后的兩個實施例，描述收集/孢子形成/消毒介質(zhì)，其防止卵囊干化、減少收集階段開始時的生物負(fù)荷、產(chǎn)生較高的孢子形成率、比重鉻酸鉀容易處理、以及是比次氯酸鹽更溫和的消毒劑。
開發(fā)可以用作卵囊收集和孢子形成介質(zhì)的一種由0.75％過氧化氫、10％檸檬酸、0.25％丙酸和0.1％消泡凈A組成的介質(zhì)。該液體介質(zhì)防止卵囊干化、在收集過程中充當(dāng)抗微生物介質(zhì)以殺滅病毒和防止細(xì)菌或霉菌積累、以及促進(jìn)收集過程中的孢子形成。加入消泡凈A是防止糞便懸浮液中的過量泡沫，并且用于減少卵囊聚集。然而，介質(zhì)中的消泡凈A是任選的?？梢圆捎闷渌^氧化合物如過硼酸鈉(其一水合物或四水合物形式)或替代或聯(lián)用過氧化氫。
由雞產(chǎn)生多種球蟲物種的卵囊并在各物種之產(chǎn)出高峰階段收集到介質(zhì)中。以約2至3升的收集介質(zhì)收集8至10只鳥的糞便。在收集階段結(jié)束時，采用過篩和密度浮選技術(shù)純化卵囊。然后將卵囊放入新配制的孢子形成介質(zhì)中，攪拌并通氣72小時。在收集之后以及再次在過篩、浮選、以及3天的孢子形成處理過程之后立即采用標(biāo)準(zhǔn)顯微技術(shù)測定孢子形成率。結(jié)果見表3所示。
表3 當(dāng)以新介質(zhì)收集卵囊時，孢子形成過程主要見于處理之前，并且發(fā)現(xiàn)所有被檢測的艾美蟲種系的最終孢子形成率均很高。這些結(jié)果提示所提出的收集和孢子形成介質(zhì)提供了一種在卵囊收集階段，甚至在孢子形成過程之前平均48-72小時達(dá)到高水平的孢子形成率的有效方法。
實施例4 以過氧和有機(jī)酸為基礎(chǔ)的消毒介質(zhì)的抗真菌和殺真菌性質(zhì)的證實 進(jìn)行實驗評價用于實施例3所述之收集和孢子形成介質(zhì)的試劑的抗真菌和殺真菌性質(zhì)。采用胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)進(jìn)行初步無菌實驗。通過Scopulariopsis brumptil培養(yǎng)菌刮出物懸浮在25mL PBS中建立真菌培養(yǎng)母液并且以粗Swinney濾器(～100μm)過濾該物質(zhì)。將200μL真菌液接種于三份TSB培養(yǎng)瓶以備處理(處理組2-11)。
處理評價實施例3所述收集/孢子形成/消毒介質(zhì)之各種組分，或單獨(dú)或聯(lián)合。除丙酸外還評價了丙酸鈉。評價室溫下28天的處理作用；然后，在孵育28天時，所有被處理培養(yǎng)瓶每份取1mL放入含有氯霉素(50μg/mL)和青霉素G(100U/mL)的麥芽精瓊脂(MEA)培養(yǎng)皿中并在室溫下培養(yǎng)14天。如果發(fā)現(xiàn)在28天的TSB培養(yǎng)瓶培養(yǎng)中沒有生長(-)并且當(dāng)培養(yǎng)瓶介質(zhì)被轉(zhuǎn)移到MEA培養(yǎng)皿時發(fā)現(xiàn)其生長則認(rèn)為該試劑是抗真菌的。如果發(fā)現(xiàn)在TSB培養(yǎng)瓶(-)或在轉(zhuǎn)移到MEA培養(yǎng)皿時均無生長則認(rèn)為該試劑是殺真菌的。結(jié)果見于表4。
表4 與預(yù)期相同，在此實驗中培養(yǎng)基對照組的真菌生長保持陰性而真菌對照組為陽性。在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿試驗中，丙酸鈉(0.25％和0.50％)均不能抑制真菌生長。丙酸處理(0.25％)培養(yǎng)基(處理組4)是抗真菌的；其抑制培養(yǎng)瓶中的真菌生長，但不影響MEA培養(yǎng)皿。其它處理組(除對照組外)顯然是殺真菌的，其真菌未見生長于培養(yǎng)瓶也不生長于培養(yǎng)皿。這些結(jié)果表明用于推薦配方(處理組9)的試劑的強(qiáng)效抗真菌和殺真菌性質(zhì)。
實施例5 以過氧和有機(jī)酸為基礎(chǔ)的消毒介質(zhì)在卵囊生產(chǎn)中的應(yīng)用 進(jìn)行該試驗以評價實施例3所述孢子形成介質(zhì)作為消毒劑的效用。以童子雞生產(chǎn)巨型艾美蟲卵囊并采用密度浮選技術(shù)純化。采用10％檸檬酸、0.25％丙酸、0.75％過氧化氫、和1mL/L消泡凈A使卵囊孢子形成72小時。孢子形成后，離心卵囊并重新懸浮于無菌過濾的孢子形成介質(zhì)(10％檸檬酸、0.25％丙酸、0.75％過氧化氫、和1mL/L消泡凈A)并在室溫下攪拌培養(yǎng)過夜。消毒后，先后采用200mM磷酸鉀(pH7)和沒有防腐劑的PBS通過二次過濾進(jìn)行緩沖液更換。其批量樣品以約1/3的容量貯存于4℃下的玻璃瓶中。最終產(chǎn)品的子樣本送到商業(yè)檢測實驗室根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部(USDA)指導(dǎo)原則檢測其純度。采用過氧基礎(chǔ)介質(zhì)消毒后的9CFR無菌檢測結(jié)果見表5所示。
表5 所有試驗結(jié)果表明無菌過濾的孢子形成介質(zhì)可以用作卵囊消毒的次氯酸鈉的有效替代物。
實施例6 以過氧和有機(jī)酸為基礎(chǔ)的介質(zhì)用于消毒卵囊 制備兩批實驗用巨型艾美蟲卵囊(批次A和批次B)。每批均通過采用過篩和浮選步驟純化。然后將每批分開并且試驗兩種消毒方法(次氯酸鈉和過氧化氫與檸檬酸和丙酸)。對各試驗樣本進(jìn)行多項純度檢測包括9CFR檢測和兩種病毒檢測的PCR方法。其結(jié)果見表6所示 表6 純度檢測結(jié)果表明全部消毒物質(zhì)均沒有污染微生物，并且過氧化氫消毒溶液與次氯酸鹽一樣有效。
實施例7 在以甘油為基礎(chǔ)的溶液中浮選巨型艾美蟲 以下兩個實施例描述采用帶多個正電荷的分子或顆粒(例如，0.1M精氨酸)分離卵囊的浮選介質(zhì)。這些分子可以用于增強(qiáng)非離子浮選介質(zhì)(例如，蔗糖、甘油、高果糖玉米糖漿)的雜物去除特性，并且可以采用添加劑如非離子去垢劑(例如，土溫-20)或消泡劑(例如消泡凈A)以減少卵囊聚集并因此優(yōu)化浮選過程。這些浮選介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)包括促進(jìn)雜物去除，非離子溶液對卵囊的損傷可能小于鹽溶液，且正電荷可以充當(dāng)輔助絮凝劑使小雜物顆粒結(jié)合到一起并在離心期間獲得更有效的雜物顆粒沉淀。
采用五種不同介質(zhì)處理含有巨型艾美蟲卵囊的雞糞。起始材料包括來源于約150只雞的匯聚物。該匯聚物采用機(jī)械過篩設(shè)備既而以細(xì)目篩過篩。過篩樣品在750mL水中離心使卵囊沉淀。棄上清液并且采用1)20％硫酸鈉，2)60％甘油，3)60％甘油+0.1M精氨酸，4)60％甘油+10g/L DEAE-纖維素，或5)60％甘油+0.1M精氨酸+10g/LDEAE-纖維素重新懸浮沉淀。采用5倍沉淀體積的各介質(zhì)重新懸浮3份沉淀其代表約2250mL過篩樣品。20％硫酸鈉介質(zhì)在10℃下以1000rpm離心10分鐘，其它所有處理物在10℃下以3000rpm離心10分鐘。浮選結(jié)果總結(jié)于表7中。
表7
在這些試驗中，所有浮選介質(zhì)均產(chǎn)生很好的卵囊回收率，其范圍從78.4％至103.6％。所有以甘油為基礎(chǔ)的介質(zhì)均比硫酸鈉介質(zhì)更有效地去除雜物。硫酸鈉介質(zhì)減少固形物的百分比為63.8％，而甘油基礎(chǔ)介質(zhì)的范圍為從79.6％至96.7％。添加帶陽離子電荷分子(精氨酸)或顆粒(DEAE-纖維素)比單用甘油改進(jìn)了雜物的去除。標(biāo)準(zhǔn)硫酸鈉浮選方法中每mL固體中卵囊產(chǎn)率提高2.7倍，而采用60％甘油+0.1M精氨酸方法每mL固體中卵囊產(chǎn)率提高了28.8倍。
實施例8 在以甘油和蔗糖為基礎(chǔ)的介質(zhì)中浮選巨型艾美蟲卵囊 采用童子雞生產(chǎn)的含有巨型艾美蟲的雞糞檢驗其它浮選介質(zhì)。雞糞收集前采用36小時斷食階段。盡管甘油-精氨酸介質(zhì)在卵囊回收和雜物去除方面非常有效，但更大規(guī)模下的昂貴的甘油可能是不能承受的。為利用精氨酸和雞糞雜物之間的電荷相互作用，研究非離子密度促進(jìn)劑的作用。在該試驗中，比較了基于甘油或蔗糖非離子化合物的各種配方。
浮選前，雞糞通過粗和細(xì)篩處理以去除大的雜物顆粒。過篩樣品在700mL水中離心沉淀卵囊。去上清液并采用下文所述試驗配方重懸沉淀。各試驗介質(zhì)采用近似相等的試樣。各介質(zhì)以5倍沉淀體積懸浮3份相當(dāng)于約2100mL過篩樣品的沉淀?；旌系闹貞页恋硗ㄟ^粗篩以保證聚集物重新懸浮。以少量合適的浮選介質(zhì)漂洗聚集物過篩。
浮選介質(zhì) A.60％甘油，0.1M精氨酸 B.60％甘油，0.1M精氨酸，0.2％土溫-20，1mL/L消泡凈A C.1.5M蔗糖，0.1M精氨酸 D.1.5M蔗糖，0.1M精氨酸，0.2％土溫-20，1mL/L消泡凈A E.1.5M蔗糖，0.1M精氨酸，0.2％土溫-20，1mL/L消泡凈A，0.1％黃原膠。
浮選處理的結(jié)果總結(jié)于表8中。
表8
有或沒有添加劑的甘油-精氨酸均產(chǎn)生很好的卵囊回收率并改善了卵囊的純化(每mL固體中的卵囊比前一步驟改善約19倍)。而單用蔗糖-精氨酸介質(zhì)產(chǎn)生很好的卵囊回收率(90％)并且很好地去除雜物(比前一步驟改善約18倍)，添加0.2％土溫-20和1mL/L消泡凈使所進(jìn)行的兩項檢測值均有輕微減少。以黃原膠增加蔗糖-精氨酸-土溫-20-消泡凈A介質(zhì)的粘度對卵囊回收基本沒有影響但對雜物清除有相反作用。
因此，當(dāng)采用非離子浮選介質(zhì)時正電荷分子(例如精氨酸)或正電荷顆粒(例如DEAE-纖維素)可以促進(jìn)雜物的去除。非離子浮選介質(zhì)包括如甘油水溶液、蔗糖水溶液、高果糖玉米糖漿水溶液、或其它類似溶液的配方。正電荷部分可能充當(dāng)了浮選輔助劑，使負(fù)電荷雜物顆粒結(jié)合到一起，并因此在離心過程中使雜物更容易聚集成塊。促進(jìn)卵囊回收和雜物去除的作用可以通過采用其它添加劑如土溫-20或消泡凈A而優(yōu)化。
實施例9 油促進(jìn)的卵囊浮選技術(shù) 此實施例描述所設(shè)計的調(diào)查油在卵囊浮選處理中的作用試驗。以油為基礎(chǔ)的處理可以改善從固體中分離卵囊并且使該處理能夠在1×g下進(jìn)行因而避免采用更高離心力下的昂貴的離心設(shè)備。
所進(jìn)行的試驗是檢驗溫和的連續(xù)浮選技術(shù)是否可以用于從糞便雜物中分離卵囊。完成分離工作可以利用不同的密度條件，采用連續(xù)攪拌處理使卵囊緩慢上升到介質(zhì)上層，在此可以將它們撇取而從糞便雜物中回收。
在試驗開始時采用部分純化(過篩和浮選)的批量巨型艾美蟲卵囊。采用數(shù)種聯(lián)合的高果糖玉米糖漿(HFCS)，CornSweet55(ADM，Illinois)和氯化鈉鹽作為增加密度的試劑。將材料置于1L聚丙烯燒杯中并采用IKA Labortechnik Batch混合器使之與HFCS及NaCl緩慢混合。從懸浮液上層，然后從近容器底部取樣。取樣后加入添加的HFCS，進(jìn)一步使材料緩慢混合，然后取出第二批樣品。
采用25mL移液管或塑料藥勺將上層樣品(F-1，F(xiàn)-2)收集到50mL聚丙烯試管中(每個樣品25mL)。采用25mL移液管移取底部樣品(S-1，S-2)到50mL聚丙烯試管中(每個樣品25mL)。所有樣品均以蒸餾水稀釋10倍并轉(zhuǎn)移到250mL玻瓶中。從每個玻瓶中取兩份子樣本并以1×PBS緩沖液稀釋10倍。采用McMaster方法計數(shù)這些稀釋的次級樣品中的卵囊。此試驗結(jié)果見表9所示。
表9 數(shù)據(jù)表明盡管卵囊明顯富集在懸浮液的上層，但在任何實驗條件下卵囊都沒能有效懸浮以及形成清晰的上層(即，在沒有離心時)。研究中HFCS與NaCl比例或進(jìn)一步稀釋糞便懸浮液不影響浮選。試驗發(fā)現(xiàn)試驗的懸浮液的上層液取樣是困難的。
在此實驗之后，將原料顯著稀釋或引入漂浮促進(jìn)劑顯然有益于易化卵囊在糞便原料中的運(yùn)動。進(jìn)行實驗檢測利用植物油作為浮選促進(jìn)劑的作用。
在1L聚丙烯燒杯中，采用IKA分次式混合器使500mL的卵囊懸浮原液與含有160g高果糖玉米糖漿+40g NaCl+50mL紅花油的500mL水混合。混合器按下列次序操作快-慢-停-慢-停。將上層液(50mL)舀至盛有200mL水的250mL玻瓶中。將玻瓶內(nèi)所含物徹底混合。在幾分鐘內(nèi)清楚地形成三層。從每一層中取兩個小樣并以McMaster室計數(shù)。其結(jié)果如表10所示。
表10 這些結(jié)果表明油易化了浮選實質(zhì)步驟。油輔助浮選處理的優(yōu)點(diǎn)之一是無須離心，此即1×g下，快速形成卵囊層。典型地，卵囊浮選處理采用2000×g或更高的離心力以實現(xiàn)卵囊層與雜物的分離。
上述實施例是對本發(fā)明的說明，而不能被當(dāng)作是對它們的限制。本發(fā)明通過下列權(quán)利要求進(jìn)行說明，權(quán)利要求的等同實施方案包括在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.一種用于制備卵囊的組合物，其包括過氧化合物和有機(jī)酸，所述組合物具有酸性pH值。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物的pH值從約pH 1至約pH 3。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述過氧化合物的濃度從約0.1％至約10％(v/v)或(w/v)。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述過氧化合物選自過氧化氫、過硼酸鈉、過碳酸鈉、過氧化鎂、過氧化鈣、過氧化鋅、過氧化脲以及它們的組合。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述過氧化合物是過氧化氫。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述組合物中的過氧化氫濃度是從約0.1％(v/v)至約3％(v/v)。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物中的過氧化氫濃度是從約0.25％(v/v)至約1％(v/v)。
8.權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步含有消泡劑。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物中的有機(jī)酸濃度是從約1％至約15％(v/v)或(w/v)。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述有機(jī)酸至少包括檸檬酸。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述有機(jī)酸至少包括丙酸。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述有機(jī)酸包括檸檬酸和丙酸。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是無菌的。
14.權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步包括原生動物卵囊。
15.一種收集動物糞便中的原生動物卵囊的方法，其步驟包括:
(a)提供被原生動物感染的動物，其中動物在其糞便中排泄原生動物卵囊；
(b)以權(quán)利要求1的組合物接觸含有卵囊的來自感染動物的糞便。
16.權(quán)利要求15的方法，其中原生動物包括屬于艾美蟲(Eimeria)屬的物種。
17.權(quán)利要求16的方法，其中艾美蟲屬物種選自巨型艾美蟲(E.maxima)、和緩艾美蟲(E.mitis)、禽艾美蟲(E.tenella)、堆形艾美蟲(E.acervulina)、波氏艾美蟲(E.brunetti)、尼氏艾美蟲(E.necatrix)、塞前艾美蟲(E.praecox)、E.mivati以及它們的組合。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述動物是鳥。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述鳥是火雞。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述鳥是雞。
21.一種用于制備卵囊的組合物，其包括過氧化合物，所述組合物具有酸性pH值。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述過氧化合物選自過氧化氫、過硼酸鈉、過碳酸鈉、過氧化鎂、過氧化鈣、過氧化鋅、過氧化脲、以及它們的組合。
23.一種收集動物糞便中的原生動物卵囊的方法，其步驟包括:
(a)提供被原生動物感染的動物，其中動物在其糞便中排泄原生動物的卵囊；
(b)以權(quán)利要求21的組合物接觸含有卵囊的來自感染動物的糞便。
24.一種用于制備卵囊的組合物，其包括有機(jī)酸，所述組合物具有酸性pH值。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述有機(jī)酸包括選自以下的有機(jī)酸:檸檬酸、丙酸、以及它們的組合。
26.一種收集動物糞便中的原生動物卵囊的方法，其步驟包括:
(a)提供被原生動物感染的動物，其中動物在其糞便中排泄原生動物的卵囊；
(b)以權(quán)利要求24的組合物接觸含有卵囊的來自感染動物的糞便。
27.一種使原生動物卵囊形成孢子的方法，其步驟包括:
(a)提供包括原生動物卵囊的組合物；
(b)在適合孢子形成的條件以及一定時間下使卵囊在權(quán)利要求1的組合物中形成孢子。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述原生動物包括艾美蟲屬的物種。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述艾美蟲屬物種選自巨型艾美蟲、和緩艾美蟲、禽艾美蟲、堆形艾美蟲、波氏艾美蟲、尼氏艾美蟲、塞前艾美蟲、E.mivati以及它們的組合。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述含原生動物卵囊的組合物包括從原生動物感染動物收集的糞便。
31.一種使原生動物卵囊消毒的方法，其包括:
(a)提供含有原生動物卵囊的制品；
(b)在足以達(dá)到所希望的所述制品的消毒水平的條件下使卵囊在權(quán)利要求1的組合物中消毒一定時間。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述原生動物包括艾美蟲屬物種。
33.權(quán)利要求32的方法，其中艾美蟲屬物種選自巨型艾美蟲、和緩艾美蟲、禽艾美蟲、堆形艾美蟲、波氏艾美蟲、尼氏艾美蟲、塞前艾美蟲、E.mivati以及它們的組合。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述消毒步驟之后所述制品基本不含可檢測到的微生物污染。
35.權(quán)利要求31的方法，其中所述消毒步驟進(jìn)行約12至約48小時。
36.一種純化原生動物卵囊的浮選介質(zhì)，其包括高密度非離子溶液和聚陽離子。
37.權(quán)利要求36的浮選介質(zhì)，其中高密度非離子溶液選自甘油、山梨糖醇、蔗糖、高果糖玉米糖漿、羥甲基纖維素、以及它們組合。
38.權(quán)利要求36的浮選介質(zhì)，其中所述聚陽離子選自精氨酸、組氨酸、賴氨酸、二乙基氨基乙基纖維素、多價金屬離子、以及它們的組合。
39.權(quán)利要求38的浮選介質(zhì)，其中所述聚陽離子包括精氨酸。
40.權(quán)利要求36的浮選介質(zhì)，其中在浮選介質(zhì)中的聚陽離子濃度是從約0.05M至約1M。
41.權(quán)利要求36的浮選介質(zhì)，其中所述浮選介質(zhì)進(jìn)一步含有非離子去垢劑。
42.權(quán)利要求36的浮選介質(zhì)，其中所述浮選介質(zhì)進(jìn)一步含有消泡劑。
43.權(quán)利要求36的浮選介質(zhì)，其中所述浮選介質(zhì)進(jìn)一步含有油。
44.一種純化原生動物卵囊的浮選介質(zhì)，其包括高密度非離子溶液和油。
45.一種通過浮選純化原生動物卵囊的方法，其步驟包括:
(a)在權(quán)利要求36的浮選介質(zhì)和大量原生動物卵囊之間形成懸浮液，
(b)讓所述懸浮液分層，
(c)從分層的懸浮液中回收原生動物卵囊。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述形成步驟包括將浮選介質(zhì)與大量原生動物卵囊混合并且所述讓懸浮液分層的步驟包括離心。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述原生動物包括艾美蟲屬物種。
48.權(quán)利要求47的方法，其中艾美蟲屬物種選自巨型艾美蟲、和緩艾美蟲、禽艾美蟲、堆形艾美蟲、波氏艾美蟲、尼氏艾美蟲、塞前艾美蟲、E.mivati以及它們的組合。
49.一種通過浮選純化原生動物卵囊的方法，其步驟包括:
(a)在權(quán)利要求44的浮選介質(zhì)和大量原生動物卵囊之間形成懸浮液，
(b)讓所述懸浮液分層，
(c)從分層的懸浮液中回收原生動物卵囊。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述形成步驟包括使浮選介質(zhì)與大量原生動物卵囊混合并且所述讓懸浮液分層步驟包括離心。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述原生動物包括艾美蟲屬物種。
52.權(quán)利要求51的方法，其中艾美蟲屬物種選自巨型艾美蟲、和緩艾美蟲、禽艾美蟲、堆形艾美蟲、波氏艾美蟲、尼氏艾美蟲、塞前艾美蟲、E.mivati以及它們的組合。
53.由禽類對象制備原生動物卵囊的方法，其步驟包括:
(a)以原生動物感染禽類對象，感染時間足以使原生動物的卵囊排泄于被感染的禽類對象的糞便中，
(b)收集來源于被感染的禽類對象的含有卵囊的糞便，
(c)在所述收集步驟的至少前一天以及所述收集步驟期間以大平均粒徑的食物喂飼被感染的禽類對象。
54.權(quán)利要求53的方法，其中包括至少約50％(w/w)的食物組分選自未碾碎谷粒、部分碾碎的谷粒、壓制谷粒、榨取的谷粒或它們的組合。
55.權(quán)利要求53的方法，其中包括至少約58％(w/w)的食物組分選自未碾碎谷粒、部分碾碎的谷粒、壓制谷粒、榨取的谷粒或它們的組合。
56.權(quán)利要求53的方法，其中至少約35％(w/w)的收集糞便留存于0.5毫米篩上。
57.權(quán)利要求53的方法，其中至少約60％的糞便留存于0.075毫米篩上。
58.權(quán)利要求53的方法，其中具有大的平均粒徑的食物包括低于約20％(w/w)的碾碎食物。
59.權(quán)利要求53的方法，其中所述原生動物包括艾美蟲屬物種。
60.權(quán)利要求59的方法，其中艾美蟲屬物種選自巨型艾美蟲、和緩艾美蟲、禽艾美蟲、堆形艾美蟲、波氏艾美蟲、尼氏艾美蟲、塞前艾美蟲、E.mivati以及它們的組合。.
61.權(quán)利要求53的方法，其中所述禽類對象是火雞。
62.權(quán)利要求53的方法，其中所述禽類對象是雞。
63.一種減少原生動物卵囊間聚集的水性組合物，其包括選自以下的化合物:蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、消泡劑、以及上述化合物的任何組合。
64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述組合物包括酪蛋白水解產(chǎn)物或大豆蛋白水解產(chǎn)物。
65.權(quán)利要求63的組合物，其中所述組合物包括精氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。
66.權(quán)利要求63的組合物，其進(jìn)一步包括大量的原生動物卵囊。
67.一種制備原生動物卵囊的方法，其步驟包括使原生動物卵囊制品與減少卵囊間聚集的水性組合物接觸。
68.權(quán)利要求67的組合物，其中所述組合物包括選自以下的化合物:蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、消泡劑、以及上述化合物的任何組合。
69.權(quán)利要求67的方法，其中所述接觸步驟在所述消毒步驟之后進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備卵囊的改進(jìn)方法。具體地說，本發(fā)明提供改進(jìn)的制備卵囊的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明制備的卵囊用于制備疫苗。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供制備艾美蟲卵囊的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明制備的含有艾美蟲卵囊、孢子囊和/或子孢子的疫苗用于卵內(nèi)或孵化后的鳥類抗球蟲免疫。
文檔編號A61K39/012GK101381681SQ20081014928
公開日2009年3月11日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月30日
發(fā)明者J·E·哈欽斯, J·K·蒂切科斯基 申請人:恩布里克斯公司