專利名稱：：抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
：桔青霉素(CTN)是青霉屬和曲霉屬的某些菌株產(chǎn)生的真菌毒素，于1931年首次被分離純化。它能引起顯著的腎臟毒性，并有致畸、致癌作用。由于產(chǎn)桔青霉素的真菌在自然界廣泛分布，常引起農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料等霉變。近年來，桔青霉素在食品中的污染問題越來越引起世界各國的關(guān)注。1991年國際生命科學(xué)院自然毒素檢測委員會歐洲分會將其列為必須檢測的毒素之一。桔青霉素傳統(tǒng)的分析方法如高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜法，雖然這些方法測定結(jié)果準確，但需要貴重儀器，對于樣品的前處理操作繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場簡單快速和大批量樣品殘留檢測的要求。因而使用受到限制。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)是近年來發(fā)展起來的新方法，由于具有較高的靈敏度和特異性。對樣品的純度要求不高，特別適合于大批量樣品的檢測，近年來被廣泛應(yīng)用于桔青霉素的檢測。1995年Abramson(AbramsonD，UsleberE，MartlbauerE.Anindirectenzymeimmunoassayforthemycotoxincitrinin[J],JApplEnvironMicrobiol,1995,61(5):2007-2009.)采用桔青霉素與匙孔貝血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)制成的人工抗原免疫得到的兔抗血清，用桔青霉素與葡萄糖氧化酶的偶聯(lián)物作為包被抗原，制成間接競爭酶聯(lián)免疫試劑測定桔青霉素，其檢測下限為l13ng/ml，加入樣品中的2002000ng/g桔青霉素的回收率為89%104%，變異系數(shù)為6.9%13%。1996年他再次采用多克隆抗體制成的直接競爭酶聯(lián)免疫試劑和間接競爭酶聯(lián)免疫試劑測定了大麥中桔青霉素的含量，釆用10y。的甲醇PBS溶液對樣品進行抽提，直接競爭法采用桔青霉素與辣根過氧化酶偶聯(lián)作為標記抗原，檢測下限為24ng/ml，加到大麥中的5002000ng/g桔青霉素的回收率為108%111%，變異系數(shù)為8.4%26.9%。間接競爭法的檢測下限為0.40.8ng/ml，1002000ng/g加入大麥樣品中的桔青霉素的回收率為105%112%，變異系數(shù)為4.5%12%(AbramsonD.Determinationofcitrinininbarleybyindirectanddirectenzymeimmunoassay[J].JAOACInt,1996,79(6):1325-1329.)。1999年，他采用了碳酸鈉溶液抽提樣品的簡易方法，用間接競爭酶聯(lián)免疫法對加入到玉米中的2002000ng/g桔青霉素進行測定，回收率為53.2%67.2%，變異系數(shù)為18.4%51.5%(AbramsonD,UsleberE,MartlbauerE.Rapiddeterminationofcitrininincornbyfluorescenceliquidchromatographyandenzymeimmunoassay[J].JAOACInt,1999,82(6):1353-1356.)。2000年Vrabcheva等建立的免疫學(xué)方法的檢測下限是5ng/g(VrabchevaT，UsleberE,DietrichR,etal.Co-occurrenceofochratoxinAandcitrininincerealsfromBulgarianvillageswithahistoryofBalkanendemicnephropathy[J].JAgricFoodChem，2000,48(6):2483-2488.)，而Heber在2001年建立的間接競爭酶聯(lián)免疫試劑的檢測下限卻只有15|_lg/g(HeberD,LembertasA,LiuQY.etal.AnanalysisofnineproprietaryChineseredyeastricedietarysupplements[J].JalternComplementMed,2001,7(2):133-139.)。2006年Kononenko等用間接競爭ELISA法對小麥等多個試樣進行檢測，這些樣品的桔青霉素含量在20500ng/g之間，回收率為91%108%，變異系數(shù)為11.2°/。16.0%(G.P.Kononenko，A.A.Burkin.ImmunoenzymeMethodforthedeterminationofcitrinin[J],JournalofAnalyticalchemistry,2007,62(7):691-696.)。劉4二榮等(劉仁榮,余宙，何慶華等.抗桔青霉素單克隆抗體的研制與鑒定[J].衛(wèi)生研究，2007，36(2):190-193.)通過制備抗桔青霉素單克隆抗體后建立了分析桔青霉素的間接競爭ELISA法，方法的線性范圍為201000ng/ml，檢出限為10ng/ml。在小麥樣品中的加標回收率為95%112%，變異系數(shù)為9.1%18.6%。而由于雞卵黃抗體(IgY)具有以下優(yōu)點母雞易于飼養(yǎng)；收集雞蛋方便，無需抽動物血，無損傷，符合現(xiàn)代動物保護原則；產(chǎn)率高、成本低、穩(wěn)定性好、特異性強等。在免疫診斷、疾病預(yù)防等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。國內(nèi)外現(xiàn)有抗孟加拉眼鏡蛇毒雞卵黃抗體及其制備(孔天翰，劉四紅，董偉華，黃熱平，黃劭，覃媛。專利號CN1858064),抗幽門螺桿菌菌體和細胞毒素雞卵黃抗體產(chǎn)品、制備及其應(yīng)用(林剛。專利號CN101058607),抗性病特異性復(fù)合卵黃抗體及其在性病治療上的應(yīng)用(許承杰，嚴維。專利號CN1477127),Yolkantibody-containinghaircareproduct(Noji'ri，etal.USPatent:5976519),IsolationofIgY(.DELTA.Fc)antibodies(Chiou.USPatent:6608172)等雞卵黃抗體(IgY)制備和應(yīng)用的專利報道。但未見抗桔青霉素雞卵黃抗體制備方法和應(yīng)用的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn)的，包括以下步驟(1)合成桔青霉素人工抗原；(2)將桔青霉素人工抗原乳化后注入雞體內(nèi)進行免疫，免疫4次后持續(xù)收集雞蛋12個月；(3)提取抗桔青霉素雞卵黃抗體。所述的步驟(1)中采用羰基二咪唑法合成桔青霉素免疫抗原的合成方法為桔青霉素0.5mg溶于100~200)aL甲醇中，加入lmg的羰基二咪唑，混合均勻后，室溫反應(yīng)15~60min，自然揮千，用200nL的二甲基亞砜DMS0溶解后，滴入2mL5mg/mL牛血清白蛋白BSA(10mgBSA溶于2mL0.lmol/L碳酸鈉溶液)溶液中，37°C反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物用0.01mol/L碳酸鈉溶液及蒸餾水4'C透析3天，期間換液多次，真空冷凍干燥，于-2(TC保存。取lmg桔青霉素人工抗原粉末溶于lmLO.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBSpH7.4)中，并與福氏佐劑按l:1(V/V)充分乳化制得免疫抗原。所述的步驟(l)中采用碳二亞胺法合成桔青霉素包被抗原的合成方法為桔青霉素0.5mg溶于50(^L二甲基甲酰胺(DMF)中，先后加入lmg碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及l(fā)mgN-羥基丁二酰亞胺(NHS),混合均勻后，磁力攪拌下避光室溫反應(yīng)4~6h，然后往混合液中逐滴滴入2mL5mg/mL卵清白蛋白OVA(lOmgOVA溶于2mLpH7.40.lmol/L磷酸鹽緩沖液)溶液中，室溫反應(yīng)46h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBSpH7.4)及蒸餾水4'C透析3天，期間換液多次，真空冷凍干燥，于-2(TC保存。所述的步驟(2)中桔青霉素人工抗原免疫雞的方式為取22周齡的產(chǎn)蛋母雞4只，將乳化好的桔青霉素免疫抗原經(jīng)雞的皮下、雙翼、大腿、胸肌多位點注射。首次免疫采用福氏完全佐劑，以后免疫均采用福氏不完全佐劑。兩周后免疫第2次，以后每隔l-2周免疫一次，每次免疫的劑量為0.5mL/只。并于第4次免疫后的第2周收集雞蛋，持續(xù)收集1~2個月。收集的雞蛋編號后于4"C保存，并留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。所述的步驟(3)中抗桔青霉素雞卵黃抗體的提純方法為:先從收集的免疫蛋中分離出卵黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的2~4倍加入4%PEG6000，混合均勻，按蛋黃體積的0.2~0.5倍加入氯仿。攪拌均勻，靜置24h。將稀釋液于低溫高速離心機以800012000rpm離心10min。將分離所得的上清液紗布過濾。測量h清液的體積，按此體積比的0.2~0.5倍在磁力攪拌下逐滴滴加40%PEG6000。靜置2~4h。將稀釋液于低溫高速離心機以800012000rpm離心10min。傾去上清液，沉淀部分即為抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY粗提物,IgY粗提物用蒸餾水洗脫純化，洗脫后產(chǎn)品用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得純抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY干粉成品，將所制得的IgY干粉分裝保存于-2(TC。本發(fā)明提供的抗桔青霉素雞卵黃抗體制備方法，利用該方法可制備出成本低、產(chǎn)量大、特異性高的抗桔青霉素雞卵黃抗體，該抗體可用于研發(fā)膠體金標記抗體，建立快速、靈敏、特異的桔青霉素的快速檢測技術(shù)，在農(nóng)產(chǎn)品、食品安全檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景及社會經(jīng)濟效益。具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施實例對本發(fā)明進行具體的闡述，但是本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。實施例一抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備(1)桔青霉素免疫抗原合成準確稱取桔青霉素0.5mg溶于20(VL甲醇中，加入lmg的羰基二咪唑，混合均勻后，室溫反應(yīng)30min，自然揮干，用200pL的DMSO溶解后，滴入牛血清白蛋白BSA溶液中，37。C反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物裝于透析袋中用0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液(PBSpH7.4)4'C透析,期間換液4次，再改用蒸餾水透析，期間換液4次，真空冷凍干燥，于-2(TC保存。取lmg桔青霉素人工抗原粉末溶于lmLO.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBSpH7.4)中，按l:1(V/V)加入福氏佐劑，充分乳化制得免疫抗原。(2)用桔青霉素免疫抗原免疫母雞取22周齡的萊杭母雞4只，將乳化好的桔青霉素免疫抗原經(jīng)雞的大腿、胸肌多位點注射。首次免疫采用福氏完全佐劑，以后免疫均采用福氏不完全佐劑。兩周后免疫第2次，以后每隔10天免疫一次，每次免疫的劑量為0.5mL/只。并于第4次免疫后的第2周開始持續(xù)收集雞蛋，收集的雞蛋編號后于4'C保存，并留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。(3)抗桔青霉素雞卵黃抗體的提純。先從收集的免疫蛋中分離出卵黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的3倍加入4。/。PEG6000，混合均勻，按蛋黃體積的0.3倍加入氯仿(去除脂蛋白)。攪拌均勻，靜置2h。將稀釋液于低溫高速離心機以10000rpm離心10min。將分離所得的上清液紗布過濾。測量上清液的體積，按此體積比的0.3倍在磁力攪拌下逐滴滴加40Q/QPEG6000。靜置2h。將稀釋液于低溫高速離心機以10000rpm離心10min。傾去上清液，沉淀部分即為抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY粗提物，IgY粗提物用蒸餾水洗脫純化，洗脫后產(chǎn)品用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得純抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY干粉成品，將所制得的IgY干粉分裝保存于-20。C。實施例二抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備(1)桔青霉素包被抗原合成-桔青霉素0.5mg溶于50(VL二甲基甲酰胺(DMF)中，先后加入lmg碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及l(fā)mgN-羥基丁二酰亞胺(NHS)，混合均勻后，磁力攪拌下避光室溫反應(yīng)4h，然后往混合液中逐滴滴入2mL5mg/mL卵清白蛋白0VA(10mgOVA溶于2mLpH7.40.lmol/L磷酸鹽緩沖液)溶液中，磁力攪拌下避光室溫反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物裝于透析袋中用磷酸鹽緩沖液PBS4'C透析,期間換液4次，再改用蒸餾水透析,期間換液4次，真空冷凍干燥，于-20'C保存。(2)用桔青霉素免疫抗原免疫母雞取22周齡的萊杭母雞4只，將乳化好的桔青霉素免疫抗原經(jīng)雞的皮下、雙翼、大腿、胸肌多位點注射。首次免疫采用福氏完全佐劑，以后免疫均采用福氏不完全佐劑。首次免疫后，兩周后免疫第2次，以后每隔10天免疫一次，每次免疫的劑量為0.5mL/只。并于第4次免疫后的第2周開始持續(xù)收集雞蛋，收集的雞蛋編號后于4'C保存，并留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。(3)提取、純化抗桔青霉素雞卵黃抗體。先從收集的免疫蛋中分離出卵黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的3倍加入4。/。PEG6000，混合均勻，按蛋黃體積的0.3倍加入氯仿(去除脂蛋白)。攪拌均勻，靜置2h。將稀釋液于低溫高速離心機以10000rpm離心10min。將分離所得的上清液紗布過濾。測量上清液的體積，按此體積比的0.3倍在磁力攪拌下逐滴滴加40。/。PEG6000。靜置2h。將稀釋液于低溫高速離心機以10000rpm離心10min。傾去上清液，沉淀部分即為抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY粗提物，抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY粗提物用蒸餾水洗脫純化，洗脫后產(chǎn)品用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，即制得純抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY干粉成品，將所制得的抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY干粉分裝保存于-2(TC?？菇矍嗝顾仉u卵黃抗體的鑒定ELISA競爭抑制實驗證明所制備的雞卵黃抗體為抗桔青霉素特異性抗體在96孔酶標條內(nèi)每孔加入100|_iL用pH9.60.05mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋的桔青霉素包被抗原，內(nèi)含l叫桔青霉素包被抗原，37'C恒溫孵育lh后，移置4'C冰箱包被過夜。取出甩干后用PBST洗滌3次(PBS0.Olmol/L'0.5%Tween-20，pH7.4)'拍干。每孔加入2CK^L含有3%脫脂奶粉的PBS封閉。37。C恒溫孵育lh，取出甩干后用PBST洗滌3次，拍干。將純化好的抗體和桔青霉素標準液用含O.5y。脫脂奶粉的PBS稀釋成125ng/mL和(0，40，80，160，320,640，1280)ng/mL。兩者充分混合后，37。C恒溫孵育lh。將孵育后的混合物100pL每孔，3個平行加入已封閉好的酶標條中，37'C恒溫孵育lh。取出甩干后用PBST洗滌3次，拍干。每孔加入100pL兔抗雞酶標二抗(1:5000)。37。C恒溫孵育lh。取出甩干后用PBST洗滌3次，拍干。接著每孔加入100pL底物液(含0.4mg/mlOPD的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液+lpL/mLH202)，37'C恒溫孵育15min。然后每孔加入50pL2mol/LH2S04終止反應(yīng)。觀察顏色變化，在酶標儀讀取0D492。實驗結(jié)果如下競爭抑制ELISA實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>競爭抑制ELISA實驗結(jié)果證明上述所制備的雞卵黃抗體為抗桔青霉素特異性抗體?？蓱?yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品、食品中桔青霉素污染檢測，也可做為進一歩研究開發(fā)膠體金試紙或試劑盒。權(quán)利要求1.一種抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)合成桔青霉素人工抗原；(2)將桔青霉素人工抗原乳化后注入雞體內(nèi)進行免疫，免疫4次后持續(xù)收集雞蛋1～2個月；(3)提取抗桔青霉素雞卵黃抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:所述的步驟(1)中桔青霉素人工抗原的合成方法為采用羰基二咪唑法或碳二亞胺法，以牛血清蛋白或卵清白蛋白為載體合成桔青霉素免疫抗原或包被抗原。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于采用羰基二咪唑法合成桔青霉素免疫抗原的合成方法為桔青霉素0.5mg溶于100200pL甲醇中，加入lmg的羰基二咪唑，混合均勻后，室溫反應(yīng)1560min，自然揮干，用200pL的二甲基亞砜DMSO溶解后，滴入2mL5mg/mL牛血清白蛋白BSA(10mgBSA溶于2mL0.1mol/L碳酸鈉溶液)溶液中，37。C反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物用0.01mol/L碳酸鈉溶液及蒸餾水4X:透析3天，期間換液多次，真空冷凍干燥，于-2(TC保存；取lmg桔青霉素人工抗原粉末溶于lmL0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBSpH7.4)中，并與福氏佐劑按h1(V/V)充分乳化制得免疫抗原。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于:采用碳二亞胺法合成桔青霉素包被抗原的合成方法為桔青霉素0.5mg溶于500)iL二甲基甲酰胺(DMF)中，先后加入lmg碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及l(fā)mgN-羥基丁二酰亞胺(NHS)，混合均勻后，磁力攪拌下避光室溫反應(yīng)46h，然后往混合液中逐滴滴入2mL5mg/mL卵清白蛋白OVA(10mgOVA溶于2mLpH7.40.1mol/L磷酸鹽緩沖液)溶液中，磁力攪拌下避光室溫反應(yīng)46h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBSpH7.4)及蒸餾水4。C透析3天，期間換液多次，真空冷凍干燥，于-2(TC保存。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中桔青霉素人工抗原免疫雞的方式為取22周齡的萊杭母雞4只，將乳化好的桔青霉素免疫抗原經(jīng)雞的皮下、雙翼、大腿、胸肌多位點注射；首次免疫采用福氏完全佐劑，以后免疫均采用福氏不完全佐劑；兩周后免疫第2次，以后每隔12周免疫一次，每次免疫的劑量為0.5mL/只；并于第4次免疫后的第2周收集雞蛋，持續(xù)收集1~2個月；收集的雞蛋編號后于fC保存，并留取免疫前的雞蛋作為陰性對照。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中抗桔青霉素雞卵黃抗體的提取方法，采用聚二乙醇二步法提純卵黃抗體，先從收集的免疫蛋中分離出卵黃，攪拌均勻；測量所得的蛋黃的體積，按此體積的24倍加入4%PEG6000，混合均勻，按蛋黃體積的0.20.5倍加入氯仿,攪拌均勻，靜置24h;將稀釋液于低溫高速離心機以800012000rpm離心lOmin;將分離所得的上清液紗布過濾，測量上清液的體積，按此體積比的0.2~0.5倍在磁力攪拌下逐滴滴加40%PEG6000，靜置2~4h，將稀釋液于低溫高速離心機以800012000rpm離心10min，傾去上清液，沉淀部分即為抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY粗提物，抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY粗提物用蒸餾水洗脫純化，洗脫后產(chǎn)品用真空冷凍干燥機進行冷凍千燥，即制得純抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY干粉成品，將所制得的抗桔青霉素雞卵黃抗體IgY干粉分裝后保存于-2(TC。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗桔青霉素雞卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟(1)制備桔青霉素人工抗原；(2)將桔青霉素人工抗原注入雞體內(nèi)進行免疫，免疫4次后持續(xù)收集雞蛋1～2個月；(3)提取抗桔青霉素雞卵黃抗體；所得的抗桔青霉素卵黃抗體制備成本低、產(chǎn)量大、特異性高，可研發(fā)膠體金標記抗體，建立快速、靈敏、特異的桔青霉素快速檢測技術(shù)，在農(nóng)產(chǎn)品、食品安全檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號C07K16/02GK101434655SQ20081021988公開日2009年5月20日申請日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者焜張,方巖雄,林壯森,趙肅清,高燕紅,黃寶華申請人:廣東工業(yè)大學(xué)