專利名稱：腸癌富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸癌富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗及其制備方法。
(二)
背景技術(shù)：
已知細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)作用在抗腫瘤免疫中起主要作用。 但不同的肺瘤有不同突變的CTL表位，故CTL作用不具備通用性，且其 分離和鑒定也較困難。近年來發(fā)現(xiàn)某些伴侶蛋白分子如多種熱休克蛋白 (HSP)在肺瘤抗原遞呈中的作用。熱應(yīng)激下大量合成的這類伴侶分子， 具有結(jié)合肺瘤細(xì)胞內(nèi)各種由突變產(chǎn)生的腫瘤抗原多肽(CTL表位)的特 性。由此形成HSP-抗原肽復(fù)合物。通過與抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的 HSP受體結(jié)合而進(jìn)入APC。與通常的APC對(duì)外源性抗原的處理不同，此 時(shí)的腫瘤抗原肽主要由MHC I分子途徑以"多肽-HSP-MHC I"復(fù)合物提 呈在APC表面供CD8+T細(xì)胞識(shí)別并活化。從而誘導(dǎo)特異的抗腫瘤CTL 反應(yīng)。這個(gè)過程，目前發(fā)現(xiàn)由多種伴侶分子蛋白如HSP70， HSP90, HSPllO， gp96, grpl70，在多環(huán)節(jié)、途徑，相互協(xié)調(diào)完成。伴侶分子蛋 白瘤苗的制備不必分離和鑒定腫瘤抗原。此外，HSP還具有誘導(dǎo)樹突狀 細(xì)胞(DC)成熟活化，促分泌細(xì)胞因子，傳遞信號(hào)和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫 原性等作用。實(shí)驗(yàn)和臨床肺瘤治療也證明了其諸多優(yōu)越性。
但目前的研究多著眼于某一種伴侶分子蛋白，不能充分考慮到多種 HSP分子協(xié)調(diào)作用，也沒兼顧到不同的腫瘤抗原在不同環(huán)節(jié)需要不同的 伴侶分子；而且伴侶分子一抗原肽量少和弱免疫原性，影響著療效。這些 都限制了伴侶分子一抗原肽瘤苗的臨床效果。故伴侶分子在誘導(dǎo)機(jī)體抗癌免疫特別是特異性抗癌免疫中起重要作用。提取伴侶分子制備的瘤苗攜帶 個(gè)體腫瘤的抗原肽庫(kù)，成為多價(jià)瘤苗，因無MHC-I類抗原限制，也無須 分離抗原肽(抗原肽已結(jié)合在伴倡分子上)，而具有獨(dú)特優(yōu)越性。
為此，提高肺瘤細(xì)胞的免疫原性，考慮伴侶分子之間的協(xié)調(diào)性以及獲 取足夠的肺瘤抗原，對(duì)于伴侶分子瘤苗抗腫瘤免疫是非常重要的。近年發(fā) 現(xiàn)中藥提取物欖香烯能提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性腫，從而提高腫瘤抗原肽
的合成；放療以及模擬熱療的熱應(yīng)激不僅能提高肺瘤細(xì)胞的免疫原性，更 可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞大量合成熱休克蛋白等伴侶分子；在先前的實(shí)驗(yàn)中，我們 發(fā)現(xiàn)伴侶分子局部密度提高有利于抗腫瘤特異性免疫形成；又鑒于腫瘤特 異性免疫的形成需多伴侶分子在多環(huán)節(jié)協(xié)調(diào)起作用，本發(fā)明以欖香烯、非 致死量射線照射和不同溫度的熱應(yīng)激處理結(jié)腸癌細(xì)胞，提取已知的在抗癌 特異性免疫形成中具有重要作用的主要伴侶分子，去除部分可能抑制抗癌 免疫的蛋白分子，濃縮制備富伴侶分子一抗原肽復(fù)合物的瘤苗。可望一定 程度解決腫瘤抗原肽的量、密度及其呈遞中對(duì)多伴侶分子的要求。
進(jìn)一步地，綜合治療是腸癌治療的發(fā)展方向，如何進(jìn)行綜合治療并 取得最佳協(xié)同效果一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在本發(fā)明中，欖香烯因其直 接抑制腫瘤生長(zhǎng)而作為化療藥物已應(yīng)用于臨床；放療、熱療因能大量殺滅 腫瘤細(xì)胞而成為臨床常用的的抗腫瘤手段，所以，預(yù)期該實(shí)驗(yàn)有助于形成 一種有效的綜合治療腸癌的新方法欖香烯全身給藥抗癌(新輔助化療)， 同時(shí)術(shù)前局部熱療，然后外科手術(shù)治療；最后利用切除的大腸癌組織制備 富伴侶分子抗原肽復(fù)合物，以其活化DC細(xì)胞回輸病人，進(jìn)一步治療并預(yù) 防癌癥復(fù)發(fā)。
腸癌是常見的惡性腫瘤，位居前三，近年來其發(fā)病又呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)。 腸癌治療難點(diǎn)是癌細(xì)胞化療耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)；免疫治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，對(duì)化療后轉(zhuǎn)移或耐藥的癌細(xì)胞更為有效可靠。本發(fā)明正是從中凝練出來的 應(yīng)用開發(fā)性研究成果。預(yù)期在治療大腸癌和預(yù)防其復(fù)發(fā)上有較好的應(yīng)用價(jià) 值，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是4是供一種含多種、大量的伴侶分子-抗原肽的腸癌瘤苗 及其制備方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種腸癌富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗，由如下方法獲得腸癌 CT26細(xì)胞細(xì)胞懸液加入欖香烯至欖香烯濃度為3嗎/ml， 5%C02、 37。C培 養(yǎng)3周，經(jīng)39。C 42。C水浴處理40分鐘后，5%C02、 37。C培養(yǎng)8小時(shí)， 再以高能X射線(30Mv)垂直照射處理30秒，5%C02、 37。C培養(yǎng)24小 時(shí)，冰浴中超聲裂解細(xì)胞，4。C低溫透析袋透析去除分子量低于60kD和 高于180kD的蛋白分子，凝膠過濾結(jié)合SDS-PAGE分析收取70、 90、 110 和170kD峰段處蛋白液并合并，濃縮(濃縮是為了除去蛋白液中大量的 水分， 一般濃縮至體積為蛋白液體積的1/15 1/10即可)得富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物，作為抗肺瘤疫苗(瘤苗)，即為所述腸癌富伴侶分子-抗原 肽復(fù)合物瘤苗。
化療藥欖香烯是從中藥莪術(shù)中提取的有效成分，能提高腫瘤細(xì)胞抗原 性，從而使肺瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體更強(qiáng)的抗癌免疫；熱應(yīng)激和放射可誘導(dǎo)腫瘤 細(xì)胞大量合成熱休克蛋白等伴侶分子、也能提高腫瘤抗原性(表現(xiàn)為腫瘤 抗原肽合成增加)。因此，本發(fā)明以不同條件的欖香晞、熱應(yīng)激和放射， 體外序貫處理腸癌細(xì)胞，來提高癌細(xì)胞的抗原性并促進(jìn)各種伴侶分子—— 胂瘤抗原肽復(fù)合物的形成，以利于抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。這一設(shè)想具有創(chuàng)新性，是本發(fā)明解決的第一個(gè)技術(shù)問題。進(jìn)一步，本發(fā)明以不同 條件欖香烯、熱應(yīng)激和放射，體外序貫處理下腫瘤細(xì)胞的抗原物質(zhì)(伴侶 分子-抗原肽)的合成，摸索最佳合成的條件。這是本發(fā)明解決的另一個(gè) 技術(shù)問題，這在一定程度上解決了腫瘤抗原的抗原性及量的問題。
本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵是從經(jīng)上述處理后的腸癌細(xì)胞裂解液中提取、制備 含多種、大量的伴侶分子-抗原肽。這可進(jìn)一步解決激活機(jī)體抗癌免疫的 腫瘤抗原量及密度的問題，以及抗原呈遞中要求多伴侶分子協(xié)調(diào)的問題。
本發(fā)明還涉及所述的腸癌富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗的制備方
法，所述方法如下腸癌CT26細(xì)胞細(xì)胞懸液，加入欖香烯至欖香烯濃度 為3|ig/ml， 5%C02、 37。C培養(yǎng)3周，經(jīng)39。C 42。C水浴處理30 40min后， 5%C02、 37。C培養(yǎng)8小時(shí)，再以高能X射線垂直照射處理30秒，5%C02、 37。C培養(yǎng)24小時(shí)，裂解細(xì)胞，去除分子量低于60kD和高于180kD的蛋 白分子，凝膠過濾結(jié)合SDS-PAGE分析收取70、 90、 110和170kD峰段 處蛋白液合并，濃縮得富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物(即瘤苗)。
優(yōu)選的，所述方法如下取細(xì)胞濃度lxl()S個(gè)/mL的腸癌CT26細(xì)胞 細(xì)胞懸液，加欖香烯至欖香烯濃度為0.003mg/mL, 5%C02、 37。C培養(yǎng)3 周，經(jīng)42。C水浴處理40分鐘后，5%C02、 37。C培養(yǎng)8小時(shí)，再以30Mv 高能X射線垂直照射處理30秒，5%C02、 37。C培養(yǎng)24小時(shí)，冰浴中超 聲裂解細(xì)胞，4。C低溫透析袋透析去除分子量低于60kD和高于180kD的 蛋白分子，凝膠過濾結(jié)合SDS-PAGE分析收取70、 90、 110和170kD峰 段處蛋白液合并，濃縮得富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物，即為所述瘤苗。
本發(fā)明以射線照射、欖香烯和熱應(yīng)激處理腸癌細(xì)胞，提高其抗原性并 誘導(dǎo)大量合成伴侶分子，采用低溫透析、凝膠過濾結(jié)合SDS-PAGE粗提這些伴侶分子，以減少伴侶分子-抗原肽的量的損失；去除部分可能抑制
抗癌免疫的蛋白分子(主要為小分子量的蛋白)，混合濃縮后制備富伴侶 分子-抗原肽復(fù)合物的瘤苗，以期在一定程度上克服抗原量及密度問題以 及多伴侶分子協(xié)調(diào)問題。結(jié)果表明，與目前常用的親和層析和離子交換方 法相比，本發(fā)明的方法更簡(jiǎn)便、成本低，且產(chǎn)量高。較好提取制備各種伴 侶分子-抗原肽。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)觀察了不同的熱應(yīng)激對(duì)伴侶分子表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)42°C 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞合成伴侶分子效應(yīng)最強(qiáng)烈。進(jìn)一步地，觀察了射線照射、 欖香烯與不同溫度處理組合誘導(dǎo)伴侶分子-抗原肽的免疫效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明， 射線照射、不同溫度熱應(yīng)激和欖香烯處理均能有效提高瘤苗誘導(dǎo)的免疫學(xué) 效應(yīng)，其中以射線照射、42。C+欖香烯組的瘤苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)最強(qiáng)，顯 示出最強(qiáng)的淋巴增殖效應(yīng)，最高的NK和CTL活性。
腸癌是常見的惡性腫瘤，位居前三，近年來其發(fā)病又呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)。 瘤苗對(duì)化療后轉(zhuǎn)移或耐藥的癌細(xì)胞更為有效可靠。本發(fā)明成功摸索出從腫 瘤細(xì)胞裂解液提取高免疫原性的富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物的制備方法。 形成了新型腸癌瘤苗，目前動(dòng)物模型試驗(yàn)結(jié)果預(yù)示瘤苗在治療腸癌和預(yù)防 其復(fù)發(fā)上有較好的應(yīng)用價(jià)值，預(yù)期產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在方法簡(jiǎn)便、成本低，且產(chǎn)量高，可較 好提取制備各種伴侶分子-抗原肽；所得瘤苗具有較強(qiáng)的免疫效應(yīng)和淋巴 增殖效應(yīng)，較高的NK和CTL活性，在治療腸癌和預(yù)防其復(fù)發(fā)上有較好 的應(yīng)用價(jià)值，預(yù)期產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

圖1為不同熱處理的細(xì)胞裂解液蛋白電泳圖；1泳道39.5°C; 2泳道 37°C; 3泳道42°C， 4泳道43°C;圖2為不同序貫處理制備的富伴侶分子-抗原肽Western Blotting圖；1泳 道蛋白Marker; 2泳道42°C; 3泳道37°C; 圖3為各組瘤苗免疫鼠的瘤體生長(zhǎng)； 圖4為各組瘤苗對(duì)荷瘤鼠的生存延長(zhǎng)作用； 圖5為各瘤苗免疫保護(hù)作用中的NK活性； 圖6為各瘤苗免疫保護(hù)作用中的CTL活性。 具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此
試劑及材料
無菌室，超凈臺(tái)，高速低溫離心機(jī)，截留分子量分別為50KD和300KD 的透析袋、葡聚糖凝膠G-200、低溫透析裝置及耗材(華東醫(yī)藥)； DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移電泳槽，0)2培養(yǎng)箱，10%的胎 牛血清RPMI-1640、及胰酶購(gòu)于GIBO公司；伴侶分子HSP70, gp96, HSP110和HSP170的熒光單克隆抗體購(gòu)于Sigma 7>司；考馬氏亮藍(lán)蛋白 測(cè)定試劑，蛋白marker (上海生工公司)；乳酸脫氫酶試劑盒及BCA蛋 白定量試劑盒(Sigma公司)；MTT(AMRESCO公司)；酶標(biāo)儀EXL-800 (BIO-TEK，美國(guó))；欖香烯注射液購(gòu)自上海金山制藥廠；CT-26結(jié)腸癌 細(xì)胞抹購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；BALB/c小鼠購(gòu)于國(guó)家嚙齒類實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心上海分中心；離心機(jī)(HITACHI)、高速離心機(jī)(BECKMAN)、 電泳儀(BIO-RAD)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(SHELL)、倒置顯微鏡(NIK0N)和超聲細(xì) 胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；
pH7.5的細(xì)胞裂解液組成20 mmol/L Tris-Cl; 20 mmol/L NaCl; 0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(ED-TA); 0.1 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT); 0.5 mmol Hexadecyltrimethylammonium bromide 。
實(shí)施例l:不同序貫處理癌細(xì)胞 方法與過程
CT26細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代(RPMI-1640培養(yǎng)基，5%C02, 37°C )， EDTA畫 胰蛋白酶復(fù)合消化液(購(gòu)自GIBICO)消化貼壁細(xì)胞。收獲細(xì)胞，以PBS 離心洗滌(2000g, 5分鐘)；以RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì) 胞濃度為lxl0Vml，于培養(yǎng)基中加欖香烯注射液至其終濃度為3mg/L，分 裝于50ml培養(yǎng)瓶，20ml/瓶，分4組分別置于37°C、 39.5°C、 42。C和43。C 水浴處理30分鐘，常規(guī)培養(yǎng)(5%C02， 37°C )過夜，次日以高能X射線 (30MV)從培養(yǎng)瓶上方垂直照射0.5分鐘(達(dá)200cGy劑量)。常纟見培養(yǎng) (5%C02, 37°C)24小時(shí)后，EDTA-胰蛋白酶復(fù)合消化液收獲細(xì)胞；未 加欖香烯的CT26細(xì)胞亦分4組同樣熱應(yīng)激和射線處理。共形成8組細(xì)胞， 每組培養(yǎng)瓶數(shù)相同。
實(shí)施例2:富伴侶分子腫瘤抗原肽復(fù)合物制備 方法與過程
將各組細(xì)胞常規(guī)收獲并低溫(冰浴)超聲粉碎裂解300W, 10秒/ 次，間隔10秒，200次/管，裂解液低溫高速離心，取上清SDS-PAGE分 析，結(jié)果(見圖1)提示42。C組的伴侶分子蛋白表達(dá)最高。按組合并上清， 飽和硫S吏銨鹽析法分離蛋白，所獲沉淀物(即為蛋白質(zhì))用0.0002mol/L pH7.4 PBS溶解，移入截留分子量為50KD透析袋4。C低溫透析48小時(shí)(透 析液為0.00002mol/L pH7.4的PBS )，去除低于50KD大分子，透析袋內(nèi)容物轉(zhuǎn)移入截留分子量為300KD透析袋同樣低溫透析，收集已經(jīng)去除高 于300KD分子的透析液。再移入50KD透析袋4°C,外加6萬分子量的 聚乙二醇粉，以濃縮透析袋的液體體積至約250ml。以葡聚糖凝膠G-200 常規(guī)裝柱(柱直徑2cm,長(zhǎng)1米)，將此250ml透析液凝膠過濾，對(duì)各收 集管液取樣作SDS-PAGE分析，根據(jù)電泳條帶，收取并合并近70、 90、 IIO和170KD峰段處管的過濾液，作以70、 90、 110和170KD的標(biāo)記。 各組每一峰段收集液均為30ml。
實(shí)施例3:富伴侶分子腫瘤抗原肽復(fù)合物鑒定 方法與過程
上述8組細(xì)胞經(jīng)過裂解透析，每組過濾分成近70、 90、 110和170KD 峰段處的4大管過濾液(每一大管均為30ml),每組合并4大管過濾液， 得120ml混合液，聚乙二醇法濃縮液體體積至10ml。 Western blotting對(duì) 所獲混合液蛋白定性，結(jié)果如圖2所示，制備物富含伴侶分子蛋白HSP70、 HSP90、 HSP110和HSP170，以42。C熱應(yīng)激+照射組發(fā)光最著，含量最高。 常規(guī)BCA法測(cè)量蛋白濃度，42。C熱應(yīng)激+照射組為3g/L, 37。C熱應(yīng)激十 照射組為0.1g/L。
實(shí)施例4: DC的分離、誘導(dǎo)與活化
處死7周齡BALBL/c小鼠6只，無菌操作取股骨并抽取骨髓細(xì)胞液， 骨髓細(xì)胞液收集在一起，以0.83% tris-NH4Cl破紅；PBS洗滌。每組常規(guī) Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化單個(gè)核細(xì)胞
方法
1. 在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液3ml;2. 取骨髓細(xì)胞液與等量RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊 加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpmx20分鐘。離 心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加和減少均勻、平穩(wěn)，4吏保持清晰的界面；
3. 離心后管內(nèi)分為三層，上層為不含細(xì)胞骨髓液和RPMI1640培養(yǎng) 液液，下層主要為紅系和粒系各期細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、 中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個(gè)核細(xì)胞包括 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板；
4. 用毛細(xì)血管插到云霧層，吸^i單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中， 加入5倍以上體積的RPMI1640, 1500rpmx 10分鐘，洗滌細(xì)月包2次；
5. 末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重 懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與 一 滴0.2 %臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上， 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)；
單個(gè)核細(xì)胞濃度(細(xì)胞數(shù)/l毫升細(xì)胞懸液)=(4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞 總數(shù)/4) xl04x2 (稀釋倍數(shù))；
6. 細(xì)胞活力檢測(cè)死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200 個(gè)淋巴細(xì)胞。計(jì)算出活細(xì)胞百分率；
活細(xì)胞百分率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)><100% 結(jié)果活細(xì)胞百分率在96%。 試劑和材泮+:
10 %小牛血清RPMI1640購(gòu)自杭州吉諾公司，0.2 %臺(tái)酚蘭染色液，淋 巴細(xì)胞分離液(比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺)購(gòu)自上海生工^^司。 磷酸緩沖液(PB)配制 原液
A液0.2MNaH2P04溶液NaH2PO
27.6克
或NaH2P(V2H20
31.2克
蒸餾水溶解至
1000毫升
B液0.2MHa2HP04溶液
Ha2HP04.12H20
71.6克
蒸鎦水溶解至1000毫升
實(shí)際配制(0.1M , PH7.2 PBS)
A液
28毫升
B液
72毫升
加蒸餾水 100ml 經(jīng)10磅、IO分鐘高壓滅菌。4。C保存?zhèn)溆谩?br> 用10% FCS的RPMI-1640調(diào)整到3xl06/ml,加入6孔培養(yǎng)才反(2ml/ 孔)中，共10孑L.50/。CO2， 37。C培養(yǎng)兩小時(shí)后，吸出未貼壁細(xì)胞，用培養(yǎng) 基輕洗，吸出懸浮細(xì)胞-80。C凍存。貼壁細(xì)胞采用含GM-CSF ( 100 pg/L )， IL-4(50|ig/L), 10。/。FCS的RPMI-1640, 5%C02， 37。C培養(yǎng)，3天換液 一次。 一周后加入各組純化的富伴侶分子肽復(fù)合物溶液0.2ml，繼續(xù)培養(yǎng) 5至7天收獲細(xì)胞，即為活化的DC。
實(shí)施例5:瘤苗的動(dòng)物體內(nèi)抗癌實(shí)-驗(yàn)
于8周齡BALB/c小鼠的右后肢背部皮下第3、 6、 9、 12、 15天分別 注射100ul實(shí)施例4制備的DC細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度lx104),并相應(yīng)分組 (共5組，8只/組)。末次注射3天后處死3只鼠，取脾并分離脾細(xì)胞(詳 見實(shí)施例6)。其余5只小鼠以活CT26腸癌細(xì)胞的攻擊(lxl()S個(gè)活細(xì)胞/次，皮下接種)。觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況、小鼠生存時(shí)間等。結(jié)果(見圖
3、圖4)提示欖香烯預(yù)處理后不同溫度的熱應(yīng)激+照射組的瘤苗均具有 明顯的抗瘤攻擊作用。而以42。C熱應(yīng)激+照射組的瘤苗的抗瘤攻擊作用最 強(qiáng)，表現(xiàn)為最小的腫瘤生長(zhǎng)和最長(zhǎng)的小鼠生存時(shí)間。
實(shí)施例6 :免疫鼠脾細(xì)胞的分離
每組脫頸推處死BALB/C小鼠3只，共15只，75%乙醇浸泡消毒， 無菌條件下剖腹取出脾臟，用無菌PBS洗三次，切成直徑5 10mm小塊， 置于120目不銹鋼網(wǎng)中，不銹鋼篩網(wǎng)放在平皿中并加入RPMI-1640培養(yǎng) 基，用無菌試管末端輕輕擠壓組織，收獲細(xì)胞，0.83。/。Tris-NH4C1破紅， 塑板黏附除去巨噬細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，配成 2xl0Vml濃度的淋巴細(xì)胞懸液待用。
實(shí)施例7:瘤苗(富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物)的免疫效應(yīng) 1)瘤苗的細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)
刺激原為經(jīng)過不同條件處理的伴侶分子-抗原肽復(fù)合物lOOul,增殖細(xì) 胞為正常的BALB/c鼠脾淋巴細(xì)胞，分離方法同實(shí)施例6,配成2xl06ml 的淋巴細(xì)胞懸液。兩者各取50nl混合加入96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，每組3個(gè) 復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于37、 5%C02、 100%濕度條件下培養(yǎng)3天后，用MTT 比色法測(cè)定吸光值(A490腿)。以增殖指數(shù)(PI)表示，PI=(實(shí)驗(yàn)孔A 值-肺瘤細(xì)胞孔)、淋巴細(xì)胞孔A值。加入96孔板常規(guī)培養(yǎng)3天，用MTT 比色法測(cè)定吸光值(A),以增殖指數(shù)PI表示細(xì)胞增殖效應(yīng)；Ph實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A值。結(jié)果如下表
表l:瘤苗的體外細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)組別OD值
1. 39.5 °C0.231 ±0.042
2. 42 °C0.41±0.035
3.39.5。C+射線組0.338±0細(xì)
*4. .42。C+射線組0.512±0.116
5. 39.5。C+射線+欖香烯組0.252±0.073
6. 42'C+射線+欖香烯組0.601±0.042
表1結(jié)果顯示體外淋巴細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示所研制的瘤苗欖香烯預(yù)處理后 不同溫度的熱應(yīng)激+照射組的瘤苗均具有明顯的淋巴細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)。 而以42 °C +射線+欖香烯組的這種細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)最強(qiáng)大。
2) NK細(xì)胞活性的4企測(cè)
YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞；以實(shí)施例6中分離的免疫鼠脾細(xì)胞為效應(yīng) 細(xì)胞，乳酸脫氫酶釋放法(LDH法)檢測(cè)NK細(xì)胞活性按試劑盒(購(gòu) 自promega公司)說明要求將靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞、1640和NP-40分另'J力口 入lOOpl于相應(yīng)孔(使靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞均為2xl()S個(gè))，常規(guī)培養(yǎng)。1000 轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，耳又上清50pl至新孔，加入酶底物。置于37 。C 10min 后每孔加終止液50]il，酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值(A)。殺傷活性=(八殺傷孔 -A耙細(xì)胞釋放孔)/ (A耙細(xì)胞最大釋放孔-A把細(xì)胞釋放孔)x 100%。 結(jié)果見圖5: 結(jié)果顯示
所研制的瘤苗欖香烯預(yù)處理后不同溫度的熱應(yīng)激+照射組的瘤苗均 具有明顯的刺激免疫鼠的NK活性的效應(yīng)。而以42。C+射線+欖香烯組的 這種活化效應(yīng)最強(qiáng)大。3) CTL殺傷活性的測(cè)定
將lml免疫鼠的脾細(xì)胞(2xl06/ml)分別與6種不同條件制備的伴侶 分子-腫瘤抗原肽復(fù)合物lml混合，加入6孔板于37。C、 5%C02、 100% 濕度條件下培養(yǎng)7天，設(shè)立對(duì)照，收集培養(yǎng)孔中懸浮細(xì)胞作為CTL效應(yīng) 細(xì)胞。以活CT26細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行4-h 51Cr釋放殺傷實(shí)驗(yàn)CT26細(xì) 胞用200 uCi Na51Cr04標(biāo)記2 h,然后細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗3遍，靶細(xì) 胞按不同的效靶比(e: t)與效應(yīng)細(xì)胞共育。取上清于y計(jì)數(shù)儀上測(cè) cpm值。BALB/c小鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞作為對(duì)照靶細(xì)胞。最大釋》文組為 耙細(xì)胞加1%SDS;自發(fā)釋放組為靶細(xì)胞加培養(yǎng)基。殺傷活性=(實(shí)-險(xiǎn)組 cpm -自發(fā)釋放組cpm) / (最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm) xioo%。 結(jié)果見圖6。
結(jié)果顯示
所研制的各瘤苗欖香烯預(yù)處理后不同溫度的熱應(yīng)激+照射組的瘤苗 均具有明顯的提高免疫鼠的CTL活性效應(yīng)。而以42。C+射線+欖香烯組的 這種效應(yīng)最強(qiáng)大。
權(quán)利要求
1.一種腸癌富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗，由如下方法獲得取腸癌CT26細(xì)胞細(xì)胞懸液，加入欖香烯至濃度為3μg/ml，5％CO2、37℃培養(yǎng)3日，經(jīng)39℃～42℃水浴處理30～40min后，5％CO2、37℃培養(yǎng)8小時(shí)，再以高能X射線垂直照射處理30秒，5％CO2、37℃培養(yǎng)24小時(shí)，超聲裂解細(xì)胞，低溫透析去除分子量低于60kD和高于180kD的蛋白分子，凝膠過濾結(jié)合SDS-PAGE分析收取70、90、110和170kD峰段處蛋白液，合并蛋白液濃縮得所述腸癌富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗。
2. 如權(quán)利要求1所述的腸癌富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗的制備方法， 所述方法如下取腸癌CT26細(xì)胞細(xì)胞懸液，加入欖香烯至濃度為 3(ig/ml, 5%C02、 37。C培養(yǎng)3日，經(jīng)39。C 42。C水浴處理30 40分鐘后， 5%C02、37。C培養(yǎng)8小時(shí)，再以高能X射線垂直照射處理30秒，5%C02、 37。C培養(yǎng)24小時(shí)，冰浴中超聲裂解細(xì)胞，4。C低溫透析袋低溫透析去 除分子量低于60kD和高于180kD的蛋白分子，凝膠過濾結(jié)合 SDS-PAGE分析收取70、 90、 110和170kD峰段處蛋白液合并，濃縮 得富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤苗。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于取細(xì)胞濃度1 x l03/mL的腸 癌CT26細(xì)胞細(xì)胞懸液，加欖香烯至欖香烯濃度為0.003mg/mL, 5%C02、 37。C培養(yǎng)3日，經(jīng)42。C水浴處理30分鐘后，5%C02、 37。C培養(yǎng)8小時(shí)， 再以高能X射線垂直照射處理30秒，5%C02、 37。C培養(yǎng)24小時(shí)，冰 浴中超聲裂解細(xì)胞，4。C低溫透析袋透析去除分子量低于60kD和高于 180kD的蛋白分子，凝膠過濾結(jié)合SDS-PAGE分析收取70、 90、 110和170kD峰段處蛋白液合并，濃縮得所述富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物瘤拔田。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物的腸癌瘤苗及其制備方法，所述瘤苗為富含多種結(jié)合了抗原肽的蛋白分子(伴侶分子)的混合物，此混合物即為腸癌瘤苗。其制備方法如下腸癌細(xì)胞加欖香烯后常規(guī)培養(yǎng)后經(jīng)39℃～42℃熱處理30分鐘，常規(guī)培養(yǎng)；再以高能X線照射，常規(guī)培養(yǎng)1日。裂解細(xì)胞，透析去除分子量低于60kD和高于180kD的分子，凝膠過濾結(jié)合SDS-PAGE收取70、90、110和170kD峰段處蛋白液，合并濃縮得富伴侶分子-抗原肽復(fù)合物。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、成本低，且產(chǎn)量高，可較好提取制備各種伴侶分子-抗原肽；所得瘤苗具有較強(qiáng)的免疫效應(yīng)和淋巴增殖效應(yīng)，較高的NK和CTL活性，在治療腸癌和預(yù)防其復(fù)發(fā)上有較好的應(yīng)用價(jià)值，預(yù)期產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101297966SQ200810063509
公開日2008年11月5日 申請(qǐng)日期2008年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日
發(fā)明者黃常新 申請(qǐng)人:黃常新