專(zhuān)利名稱(chēng)：MAGE－10編碼cDNA,腫瘤排斥抗原前體MAGE－10,對(duì)該分子具有特異性的抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤排斥抗原前體，編碼它們的核酸分子，對(duì)所述物質(zhì)具有特異性的抗體及其用途。
背景及現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)宿主生物體對(duì)癌細(xì)胞的識(shí)別或者缺乏識(shí)別的研究已經(jīng)在許多不同的方面著手進(jìn)行著。對(duì)該領(lǐng)域的了解假定對(duì)基礎(chǔ)免疫學(xué)和腫瘤學(xué)都有一些了解。
對(duì)小鼠腫瘤的早期研究表明當(dāng)移植到同系基因的動(dòng)物中時(shí)，這些物質(zhì)表現(xiàn)為導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞排斥的分子。這些分子被受體動(dòng)物中的T-細(xì)胞“識(shí)別”，并且隨著被移植的細(xì)胞的溶解激發(fā)了細(xì)胞溶解的T-細(xì)胞的應(yīng)答。這一證據(jù)首先是通過(guò)化學(xué)致癌劑、比如甲基膽蒽在體外誘導(dǎo)的腫瘤得到的。人們發(fā)現(xiàn)由腫瘤表達(dá)的并且引起T-細(xì)胞應(yīng)答的抗原對(duì)每個(gè)腫瘤而言都是不相同的。對(duì)于用化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)腫瘤的一般性的教導(dǎo)以及在細(xì)胞表面抗原方面的差別而言，參見(jiàn)Prehn等人，《J.Natl.Canc.Inst.》18769-778(1957)；Klein等人，《癌癥研究》201561-1572(1960)；Gross，《癌癥研究》3326-333(1943)；Basombrio，《癌癥研究》302458-2462(1970)。這類(lèi)抗原已經(jīng)逐漸被稱(chēng)作“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTAs”。當(dāng)由化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)時(shí)隨著對(duì)上述抗原的呈遞的觀察，當(dāng)在體外通過(guò)紫外輻射誘導(dǎo)腫瘤時(shí)得到了類(lèi)似的結(jié)果。參見(jiàn)Kripke，《J.Natl.Canc.Inst.》53333-1336(1974)。
當(dāng)對(duì)上述腫瘤的類(lèi)型來(lái)說(shuō)觀察了T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的同時(shí)，人們認(rèn)為自發(fā)性腫瘤通常是非免疫原性的。因此，人們相信這些腫瘤并不提供激發(fā)對(duì)腫瘤攜帶受試者中的腫瘤應(yīng)答的抗原。參見(jiàn)Hewitt等人，《英國(guó)癌癥雜志》33241-259(1976)。
tum-抗原呈遞細(xì)胞系的家族是由小鼠腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系的誘變得到的免疫原性變體，正如Boon等人，《J.Exp.Med.》1521184-1193(1980)所述，該公開(kāi)的內(nèi)容插入本文僅供參考。為了進(jìn)行仔細(xì)的研究，通過(guò)突變?cè)谕祷蛐∈笾胁划a(chǎn)生免疫應(yīng)答并且將形成腫瘤的腫瘤細(xì)胞(即“tum+”細(xì)胞)來(lái)得到tum-抗原。當(dāng)誘變處理這些tum+細(xì)胞時(shí)，它們被同系基因小鼠排斥，并且不能形成腫瘤(因此為“tum-”)。參見(jiàn)Boon等人，《美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)》74272(1977)，該公開(kāi)的內(nèi)容插入本文僅供參考。已經(jīng)表明許多的腫瘤類(lèi)型呈現(xiàn)出這一現(xiàn)象。例如參見(jiàn)Frost等人，《癌癥研究》43125(1983)。
tum-變體似乎不能形成進(jìn)行性(progressive)腫瘤，這是因?yàn)樗鼈円l(fā)了免疫排斥過(guò)程。支持這一假說(shuō)的證據(jù)包括腫瘤的“tun-”變體、即那些沒(méi)有正常地形成腫瘤的變體在免疫系統(tǒng)受到亞致死照射抑制的小鼠中不形成腫瘤的能力，Van Pel等人，《美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)》765282-5285(1979)；并且觀察到肥大細(xì)胞瘤P815的腹膜內(nèi)注射的tum-細(xì)胞按指數(shù)規(guī)律增殖12—15天，然后在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞流入當(dāng)中僅在幾天內(nèi)tum-細(xì)胞就被清除了(Uyttenhove等人，《J.Exp.Med.》1521175-1183(1980))。進(jìn)一步的證據(jù)包括即使當(dāng)與隨后的細(xì)胞的攻擊一起供給免疫抑制劑量的輻射時(shí)，仍觀察到小鼠獲得了可以使它們抵抗隨后對(duì)同一tum-變體的攻擊的免疫記憶(Boon等人，《美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)》74272-275(1977)；Van Pel等人，如上所述；Uyttenhove等人，如上所述)。
隨后的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使自發(fā)性腫瘤發(fā)生突變時(shí)，生產(chǎn)出了產(chǎn)生應(yīng)答的免疫原性變體。的確，這些變體能夠引起對(duì)原始腫瘤的免疫保護(hù)性應(yīng)答。參見(jiàn)Van Pel等人，《J.Exp.Med.》1571992-2001(1983)。因此，已經(jīng)表明可能會(huì)引起腫瘤中所謂的“腫瘤排斥抗原”的呈遞，而該抗原為同系基因排斥應(yīng)答的目標(biāo)。當(dāng)已把外源基因轉(zhuǎn)染到自發(fā)性腫瘤中時(shí)，也已得到了類(lèi)似的結(jié)果。關(guān)于這一點(diǎn)，參見(jiàn)Fearon等人，《癌癥研究》482975-1980(1988)。
已經(jīng)識(shí)別了一類(lèi)抗原，它們呈遞在腫瘤細(xì)胞的表面上并且被溶解細(xì)胞的T細(xì)胞所識(shí)別、從而導(dǎo)致溶解。在下文中，這類(lèi)抗原將被稱(chēng)為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可以或者可以不引起抗體的應(yīng)答。已對(duì)這些抗原研究的程度已經(jīng)通過(guò)溶解細(xì)胞的T細(xì)胞的特征鑒定研究來(lái)實(shí)現(xiàn)，即在體外通過(guò)具體的溶解細(xì)胞的T細(xì)胞(下文為“CTL”)亞型來(lái)鑒定抗原的研究。當(dāng)識(shí)別了呈遞的腫瘤排斥抗原的時(shí)候，亞型便增殖，并且溶解呈遞腫瘤排斥抗原的細(xì)胞。特征鑒定研究已經(jīng)鑒定了特異性地溶解表達(dá)腫瘤排斥抗原的細(xì)胞的CTL克隆。在下列文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)這一工作的實(shí)例Levy等人，《癌癥研究進(jìn)展》241-59(1977)；Boon等人，《J.Exp.Med.》1521184-1193(1980)；Brunner等人，《免疫學(xué)雜志》1241627-1634(1980)；Maryanski等人，《歐洲免疫學(xué)雜志》1241627-1634(1980)；Maryanski等人，《歐洲免疫學(xué)雜志》12406-412(1982)；Palladino等人，《癌癥研究》475074-5079(1987)。對(duì)于由CTLs識(shí)別的其它類(lèi)型的抗原來(lái)說(shuō)需要這種分析，其中包括次要組織相容性抗原，雄性特異性H—Y抗原，稱(chēng)作“tum-”抗原的一類(lèi)抗原以及在本文中討論的抗原。
上述主題的典型的腫瘤稱(chēng)作P815。參見(jiàn)DePlaen等人，《美國(guó)科學(xué)院細(xì)胞》852274-2278(1988)；Szikora等人，《EMBO J》91041-1050(1990)，以及Sibille等人，《J.Exp.Med.》17235-45(1990)，這些公開(kāi)的內(nèi)容插入本文僅供參考。P815腫瘤為一種用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘導(dǎo)的并且同時(shí)以體外的腫瘤和細(xì)胞系來(lái)培養(yǎng)的肥大細(xì)胞瘤。P815系在誘變后已經(jīng)產(chǎn)生了許多的tum-變體，其中包括稱(chēng)作P91A(DePlaen，如上所述)、35B(Szikora，如上所述)和P198(Sibille，如上所述)的變體。與腫瘤排斥抗原相反—并且這是一個(gè)主要的區(qū)別—tum-抗原僅僅呈遞于誘變處理腫瘤細(xì)胞之后。腫瘤排斥抗原呈遞于沒(méi)有誘變的某腫瘤的細(xì)胞上。因此，參考上述文獻(xiàn)，細(xì)胞系可以是tum+、比如稱(chēng)作“P1”的系，并且可以被激發(fā)以生成tum-變體。由于tum-的表型不同于親代細(xì)胞系的表型，因此人們預(yù)料到與其tum+親代系相比在tum-細(xì)胞系的DNA中的差別，并且可以利用這一差別來(lái)確定在tum-細(xì)胞中感興趣的基因的位置。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)tum-變體(比如P91A、35B和P198)的基因與其正常的等位基因的不同之處在于在所述基因的編碼區(qū)中的點(diǎn)突變。參見(jiàn)上述的Szikora和Sibille，以及Lurquin等人，《細(xì)胞》58293-303(1989)。這已經(jīng)證明了不是本發(fā)明的TRAs具有的情況。這些論文也表明了由tum-抗原得到的肽是由用于通過(guò)CTLs識(shí)別的Ld分子呈遞的。P91A由Ld呈遞、P35由Dd呈遞、而P198由Kd呈遞。
于1992年5月22日提交的指定了同一代理人的作為主題申請(qǐng)的PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354講述了一個(gè)人腫瘤排斥抗原前體編碼基因的家族、其稱(chēng)作MAGE家族。這些基因中的幾種在van der Bruggen等人，《科學(xué)》2541643(1991)中也進(jìn)行了討論。目前清楚的是在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)MAGE家族的多種基因，并且對(duì)這些腫瘤的診斷以及對(duì)在那些文獻(xiàn)中討論的其它目的而言所述的基因可以起到標(biāo)記物的作用。另外參見(jiàn)Traversari等人，《免疫遺傳學(xué)》35145(1992)；van der Bruggen等人，《科學(xué)》2541643(1991)和De Plaen等人，《免疫遺傳學(xué)》40360(1994)。
上面所引用的并且插入本文僅供參考的美國(guó)專(zhuān)利5,342,774講述了呈基因組DNA和cDNA形式的TRAPs的MAGE家族的多個(gè)成員。在上面引用的PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354中，在SEQ ID NO22中講述了為920個(gè)堿基對(duì)片段的MAGE-10的基因組DNA。DePlaen等人，《免疫遺傳學(xué)》40360-369(1994)討論了鑒定MAGE-10的485個(gè)核苷酸部分的PCR工作。另外參見(jiàn)Genbank登記號(hào)U10685，這些內(nèi)容插入本文僅供參考。但是卻沒(méi)有討論cDNA分子。
前面引用的PCT申請(qǐng)一般性地討論了針對(duì)MAGE蛋白的抗體。Chen等人(Chen等人的美國(guó)專(zhuān)利5,541,104，這些內(nèi)容插入本文僅供參考)講述了特異性地結(jié)合到腫瘤排斥抗原前體MAGE-1上的單克隆抗體。這份專(zhuān)利插入本文僅供參考。為了制備出單克隆抗體，Chen等人在大腸桿菌中生產(chǎn)出了不是全長(zhǎng)的MAGE-1 TRAP，這是因?yàn)槿L(zhǎng)分子的表達(dá)有一定的困難。
但是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以生產(chǎn)出既與MAGE-1又與MAGE-10 TRAP結(jié)合的單克隆抗體?？紤]到上述文獻(xiàn)中的報(bào)道，這是令人吃驚的，因?yàn)橛每梢缘玫降挠嘘P(guān)MAGE-10的信息來(lái)生產(chǎn)上述抗體看起來(lái)是不可能的。根據(jù)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)由針對(duì)MAGE-10的cDNA編碼的TRAP為分子量約為72千道爾頓的分子。也已發(fā)現(xiàn)可以生產(chǎn)出對(duì)MAGE-10具有特異性的多克隆抗體。在下面的公開(kāi)內(nèi)容中顯示出這些以及本發(fā)明的其它方面。附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示出Western印跡測(cè)定的結(jié)果，其中使用了電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)以便測(cè)試出單克隆抗體與多種細(xì)胞裂解物的反應(yīng)性。
圖2顯示出測(cè)試的結(jié)果，其中把該測(cè)試設(shè)計(jì)為確定在MAGE-1 cDNA存在的條件下是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞系NA8-MEL生產(chǎn)出72千道爾頓的蛋白。優(yōu)詵實(shí)施方案的詳細(xì)描述實(shí)施例1在大腸桿菌中以融合蛋白的形式制備出全長(zhǎng)的重組MAGE-1蛋白。參見(jiàn)Schultz-Thater等人，《Int.J.Cancer》59435-439(1994)，該內(nèi)容插入本文僅供參考。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，即把全長(zhǎng)的MAGE-1 cDNA克隆到眾所周知的表達(dá)載體pET16b中。該載體可以使在N-末端含有10個(gè)組氨酸分子的融合蛋白表達(dá)。在Schultz-Thater操作后，培養(yǎng)大腸桿菌，在溶解所述細(xì)胞之后，在Ni2+柱上純化重組融合蛋白。當(dāng)通過(guò)SDS-PAGE測(cè)試時(shí)，純化的物質(zhì)顯示出48千道爾頓的主要的條帶。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中使用了這種48kD的物質(zhì)。實(shí)施例2在生產(chǎn)出重組MAGE-1融合蛋白后，每次都用溶解在含有完全弗氏佐劑的組合物中的20ug的重組蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫接種，并接種兩次。接下來(lái)是兩次附加的注射，每次都用含有不完全弗氏佐劑的20ug的重組MAGE-1。然后按照Carrel等人，《癌癥研究》402523-2528(1980)所述的方法，使小鼠的脾細(xì)胞與NS-1骨髓瘤細(xì)胞融合。培養(yǎng)得到的雜交瘤細(xì)胞，并且使用ELISA篩選來(lái)自培養(yǎng)物的上清液，以便測(cè)定出是否正在生成重組的MAGE-1特異性的單克隆抗體。ELISA涉及包被重組MAGE-1蛋白(250ng/50ul/孔)，接下來(lái)在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜。加入上清液的樣品，接下來(lái)加入生物素綴合的綿羊抗小鼠Ig和鏈霉抗生物素蛋白—堿性磷酸酶綴合物。
ELISA導(dǎo)致鑒定出289個(gè)生成了抗重組MAGE-1的抗體的雜交瘤。實(shí)施例3在接下來(lái)的一組實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試抗體以便確定是否可以使用這些抗體來(lái)免疫染色對(duì)MAGE-1的mRNA而言呈陽(yáng)性的細(xì)胞。
一開(kāi)始篩選雜交瘤，以便設(shè)法除去任何具有交叉反應(yīng)性的單克隆。為了做到這一點(diǎn)，測(cè)試具有已知的并且具有MAGE-TRAP不同表達(dá)模式的細(xì)胞系。已知MZ2-MEL 3.1表達(dá)所有的MAGE-1，2，3和4；MZ2-MEL2.2表達(dá)MAGE-2和3；并且測(cè)試了U251、即對(duì)所有四種MAGE而言均呈陰性的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞系。在16孔的塑料室中培養(yǎng)細(xì)胞，所述的室安裝在冷丙酮中(0℃處理5分鐘)，然后儲(chǔ)存直至隨時(shí)可以在-20℃下使用。然后用0.3％H2O2封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶(10分鐘)，隨后在0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水溶液中預(yù)溫育所述細(xì)胞30分鐘。這就生成了由Carrel等人如上所述的三層生物素/親和素/過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的第一層。在固定了所述細(xì)胞之后，加入山羊抗小鼠IgG生物素綴合物(按照1∶50進(jìn)行稀釋)，以生成第二層。最后，在以1∶1000進(jìn)行稀釋后，加入親和素—過(guò)氧化物酶綴合物。在第二層和第三層的情況下，培養(yǎng)30分鐘、然后再培養(yǎng)15分鐘。用氨基—乙基咔唑觀察過(guò)氧化物酶，并使用Gill’s蘇木精記錄細(xì)胞染色的數(shù)目30秒。這組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩種mAbs、即6C1和6F2僅對(duì)MZ2-MEL 3.1細(xì)胞染色。然后將這兩個(gè)克隆用于一系列與已對(duì)MAGE-1，2，3和4的mRNA進(jìn)行了測(cè)試的細(xì)胞有關(guān)的實(shí)驗(yàn)中。針對(duì)MAGE-1 mRNA的表達(dá)，把細(xì)胞劃分為呈陽(yáng)性或呈陰性。這是按照下列方法來(lái)測(cè)定的Rimoldi等人，《Int.J.Cancer》54527-528(1993)；Brasseur等人，《Int.J.Cancer》63375-380(1995)。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，使用眾所周知的可以通過(guò)商業(yè)途徑得到的方法和試劑從細(xì)胞樣品中提取總RNA，然后使總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并且使用MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3和MAGE-4特異性引物使其進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。參見(jiàn)上述的Brasseur等人。下面的表1給出了這一工作的結(jié)果。它表明不管MAGE-2、3或4的表達(dá)狀態(tài)如何，兩種mAbs對(duì)所有的MAGE-1陽(yáng)性細(xì)胞都染色。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第二步驟中通過(guò)使用至少為1/秒的伸長(zhǎng)速率至少5秒，使結(jié)晶作用得到增強(qiáng)。
可以根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行結(jié)晶的化合物是天然來(lái)源的維生素E的琥珀酸酯，或稱(chēng)為d-α-琥珀酸生育酚酯(TS)。該化合物對(duì)應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)式，其中鍵合到連接側(cè)鏈的相同碳原子上的甲基從雜環(huán)存在于其中的平面被定位朝向觀察者，而側(cè)鏈則被定位遠(yuǎn)離觀察者和雜環(huán)存在于其中的平面，側(cè)鏈上兩個(gè)甲基被定位遠(yuǎn)離觀察者和側(cè)鏈存在于其中的平面，而鍵合到側(cè)鏈中相同碳原子上的對(duì)應(yīng)氫原子從側(cè)鏈存在于其中的平面定位朝向觀察者。我們也將該化合物稱(chēng)為(2R，4’R，8’R)-α-琥珀酸生育酚酯。所述結(jié)構(gòu)式為
在本發(fā)明中我們以其原意使用術(shù)語(yǔ)結(jié)晶以及類(lèi)似含義的用語(yǔ)，并指結(jié)晶形成這個(gè)現(xiàn)象。
根據(jù)本發(fā)明，d-α-琥珀酸生育酚酯可在少量不妨礙本發(fā)明實(shí)施的其它物質(zhì)的存在下進(jìn)行結(jié)晶。因此，術(shù)語(yǔ)“d-α-琥珀酸生育酚酯”及縮寫(xiě)TS指的是上述化合物以及適用于本發(fā)明方法中的、含有基于d-α-琥珀酸生育酚酯重量計(jì)不超過(guò)10％(重量)的其它物質(zhì)的d-α-琥珀酸生育酚酯混合物。這些物質(zhì)通常是存在的，因它們包括在此前的加工步驟中或存在于維生素E油(生育酚)原料中，并且將這些物質(zhì)完全從TS中除去在經(jīng)濟(jì)上是沒(méi)有吸引力的。具體的物質(zhì)將取決于用來(lái)制備TS的特定方法，但我們通?？梢詫⑵湔J(rèn)為是痕量的殘余結(jié)晶溶劑、清洗試劑或琥珀酸或琥珀酸酐、生育酚等。
在本發(fā)明中TS是從流態(tài)中結(jié)晶出來(lái)的。術(shù)語(yǔ)“流體”以其一般含義使用，指TS由于一種外力而均勻地改變其形狀或方向。
表2—通過(guò)Western印跡用MAbs 6C1和6F12檢測(cè)細(xì)胞系中的MAGE-1蛋白和72kDa的蛋白western印跡 MAGE-mRNA細(xì)胞系MAGE-1 蛋白
黑素瘤；(b)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；(c)骨髓白血??；(d)乳腺癌；(e)成神經(jīng)細(xì)胞瘤；(f)成纖維細(xì)胞實(shí)施例7已知在體外在一些MAGE-1mRNA陰性細(xì)胞系中，通過(guò)5—氮雜—2’—脫氧胞嘧啶、一種甲基化不足試劑(“DAC”)可以誘導(dǎo)MAGE-1的表達(dá)。與三種MAGE-1mRNA陰性細(xì)胞系(IGR39，NA8-MEL和U251)一起培養(yǎng)上述試劑72小時(shí)，在取出裂解物之后，與單克隆抗體6C1一起進(jìn)行培養(yǎng)。這一處理誘導(dǎo)了46kDa和72kDa兩種蛋白的生成。實(shí)施例8上面報(bào)道的令人感興趣的結(jié)果表明進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)定72kDa蛋白的同一性。首先，使用可以通過(guò)商業(yè)途徑得到的系統(tǒng)，由黑素瘤細(xì)胞系MZ2-MEL43制備出黑素瘤的表達(dá)文庫(kù)。在制備之后，把噬菌體鋪成平板(約為4×105pfus)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。然后用5％奶粉的磷酸鹽緩沖鹽水的溶液封閉這些物質(zhì)，隨后與單克隆抗體6C1一起進(jìn)行培養(yǎng)(在RPMI/10％胎牛血清中以1∶4稀釋的雜交瘤上清液)。然后用PBS/0.5％Tween-20洗滌上述物質(zhì)并與辣根過(guò)氧化物酶綴合的綿羊抗—小鼠IgG一起培養(yǎng)，其中是在PBS/5％奶粉的PBS溶液中以1∶3000進(jìn)行稀釋的。接下來(lái)用5％的Tween-20再洗滌一次。如上所述采用ECL檢測(cè)信號(hào)。使所有的陽(yáng)性噬菌斑進(jìn)行第二次和第三次的篩選。然后挑選出陽(yáng)性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到含有噬菌體裂解緩沖溶液(20mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，0.1％Tween20)的試管中，并使用上述物質(zhì)的等分試樣(5ul)來(lái)擴(kuò)增噬菌體的插入片段。使用GTGGCGACGA CTCCTGGAG(SEQ ID NO1)和CAGACCAACT GGTAATGGTA GCG(SEQ ID NO2)它們均為λ引物、通過(guò)PCR擴(kuò)增上述片段。循環(huán)參數(shù)為在94℃下處理1分鐘、在61℃下處理1分鐘、并在72℃下處理1分鐘、共循環(huán)30次，接下來(lái)在72℃下最后延伸10分鐘。
然后使用可以通過(guò)商業(yè)途徑得到的測(cè)序試劑盒以及SEQ ID NO1得到了所述克隆的一部分5’序列。參見(jiàn)Casanova，《分子生物學(xué)方法》23191-197(1993)。對(duì)12個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序，并且發(fā)現(xiàn)有三個(gè)與MAGE-10的基因組序列的是相同的，其中所述的序列如DePlaen等人，《免疫遺傳學(xué)》40360-369(1994)和Genbank登記號(hào)U10685所報(bào)道的。
然后使用SEQ ID NOS1和2以及可以通過(guò)商業(yè)途徑得到的系統(tǒng)來(lái)擴(kuò)增一個(gè)插入片段。對(duì)這次擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，循環(huán)參數(shù)為在94℃下處理15秒鐘、在61℃下處理30秒鐘、在72℃下處理1分鐘(循環(huán)10次)，在94℃下處理15秒鐘、在61℃下處理30秒鐘、在72℃下處理80秒鐘外加20秒鐘的循環(huán)延伸、共循環(huán)20次，接下來(lái)在72℃下處理10分鐘以進(jìn)行最后的延伸。用限制性內(nèi)切核酸酶NotI和SalI切割擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將其亞克隆到Bluescript質(zhì)粒中。隨后使用T3和T7引物進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序。經(jīng)證實(shí)的為一部分的MAGE-10 cDNA序列(1400個(gè)堿基對(duì))，該序列對(duì)應(yīng)于位于5’一端第2770個(gè)位置上的起點(diǎn)，并且在上述DePlaen等人所報(bào)道的基因組序列的3’一端之外延伸了660個(gè)堿基對(duì)。實(shí)施例9使用從上述實(shí)驗(yàn)中得到的信息，進(jìn)行其它的工作以得到MAGE-10的全長(zhǎng)的cDNA克隆。
正如所表明的那樣，上述部分的cDNA克隆長(zhǎng)1.4kb。用限制性內(nèi)切核酸酶使該片段進(jìn)行消化，分離出對(duì)應(yīng)于已知的gDNA序列的第2770-3510個(gè)核苷酸的HpaI片段，并且使用隨機(jī)引發(fā)DNA標(biāo)記試劑盒對(duì)其進(jìn)行32P標(biāo)記。然后使用標(biāo)記的探針篩選來(lái)自黑素瘤細(xì)胞系(Lyse-4)的兩個(gè)文庫(kù)，它們位于載體pcDNAI/Amp和pCEP4中。在65℃下，使用5×SSC、5×Denhardt’s、0.5％SDS和100ug/ml變性鮭精DNA，在濾膜上進(jìn)行雜交。然后在室溫下用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次共10分鐘，在65℃下用1×SSC、0.1％SDS洗滌一次共洗20分鐘，并且在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS洗滌兩次共洗20分鐘。發(fā)現(xiàn)了10個(gè)陽(yáng)性克隆，并使用用于pcDNAI/Amp載體的T7和SP6引物以及用于pCEP-4的pCEP-4正向引物自動(dòng)進(jìn)行測(cè)序。分離出幾種MAGE-10克隆，并且根據(jù)3’一端的不同而歸入兩個(gè)類(lèi)別(分別為2.5kb和1.5kb)。這一差別可能是由于在針對(duì)所述文庫(kù)的cDNA合成期間由交替的(alternate)寡脫氧胸苷酸引發(fā)造成的。除了位于5’一端的開(kāi)頭的50-70個(gè)核苷酸之外，所有的克隆看起來(lái)都是相同的。與至少四個(gè)外顯子的描述了其存在的已知的基因組序列相比，最后的兩個(gè)與上述DePlaen等人預(yù)測(cè)的是相同的(第1740—1814位，以及1890—末端)。第二個(gè)外顯子對(duì)應(yīng)于第603—701位，而第一個(gè)外顯子似乎與任何事先識(shí)別的MAGE-10序列都不對(duì)應(yīng)。在最后的外顯子中發(fā)現(xiàn)了開(kāi)放讀框。序列示于SEQ ID NO3中。在通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)獲得的收集的序列信息的基礎(chǔ)上，開(kāi)頭的大約100個(gè)堿基表示共有序列。實(shí)施例10如上所述，從pcDNAI/Amp文庫(kù)中分離出三個(gè)克隆，并使用它們?cè)隗w外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些插入片段大約長(zhǎng)1.5千堿基，在大約第3156的位置上終止，其中使用了基因組序列計(jì)數(shù)。使用可以通過(guò)商業(yè)途徑得到的系統(tǒng)翻譯1ug的每種DNA，并把螢光素酶對(duì)照質(zhì)粒用作對(duì)照。對(duì)翻譯產(chǎn)物進(jìn)行PAGE分析，并把非放射性標(biāo)記的產(chǎn)物的復(fù)制凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，在該膜上使用mAb 6Cl或如下所述制備的多克隆抗體進(jìn)行Western印跡。放射性標(biāo)記的物質(zhì)顯示出來(lái)自經(jīng)測(cè)試的所有三個(gè)克隆的72千道爾頓的蛋白，這表明mAb與MAGE-1和MAGE-10之間具有交叉反應(yīng)性。實(shí)施例11抗MAGE-10的多克隆抗血清制備如下。制得了免疫原性的MAGE-10衍生的肽(H)QDRIATTDDTTAMASASSSATGSFSYPE(OH) (SEQ IDNO4)，即MAGE-10的一部分推導(dǎo)的氨基酸序列，這正好是這種肽與輔助肽P-30的雜交體。
如per Valmori等人，《免疫學(xué)雜志》149717-721(1992)所述，輔助肽P30是眾所周知的。它是一種破傷風(fēng)毒素T細(xì)胞表位，具有如下的氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO5)。把這些肽以400ug/ml溶解在100mM Tris-HCl，pH 7.5，0.9％NaCl中。在56天的時(shí)間內(nèi)免疫接種兔子，其中在第0天用雜交的肽(0.5ml)接種、在第14天用MAGE-10肽(0.5ml)接種、在第28天第二次注射0.5ml的雜交肽、并且在第56天最后注射0.5ml的MAGE-10肽。
針對(duì)與MAGE-10的反應(yīng)性，以不同的測(cè)定方法來(lái)測(cè)試根據(jù)這一方案生成的抗血清。具體地講，沿著上述提出的路線，在Western印跡實(shí)驗(yàn)中測(cè)試對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3的cDNA表達(dá)的體外翻譯產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)所述的抗血清結(jié)合到通過(guò)體外表達(dá)生成的蛋白上。從黑素瘤的裂解物中還識(shí)別出了72kDa的條帶。在ELISA中，發(fā)現(xiàn)多克隆抗體識(shí)別所述的MAGE-10肽。
前面的實(shí)驗(yàn)描述了特異性地結(jié)合到腫瘤排斥抗原前體TRAP上的單克隆抗體的生產(chǎn)。
因此，本發(fā)明涉及MAGE-10結(jié)合的單克隆抗體以及生產(chǎn)所述抗體的雜交瘤。發(fā)現(xiàn)mAbs在測(cè)定MAGE-10的表達(dá)中是有用的?？梢约尤雖Abs(例如以標(biāo)記的形式)，結(jié)合到固相上，或者用其它方法處理以提高M(jìn)AGE-10檢測(cè)的靈敏度?？紤]到可以使用mAbs的方式，本發(fā)明包括任何一種標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)型的免疫測(cè)定，其中包括ELISAs、RIAs、競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定、凝集測(cè)定以及所有其它的測(cè)定。例如在診斷或監(jiān)測(cè)癌癥的存在或發(fā)展中，MAGE-10表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)是很有用的。
分離的MAGE-10蛋白也是本發(fā)明的一個(gè)特征。正如SDS-PAGE測(cè)得的，該分子的分子量約為72kDa，并且當(dāng)為SEQ ID NO4的肽時(shí)它作為免疫原是很有用的，通過(guò)上述實(shí)施例所示它具有免疫原性。優(yōu)選地，這些物質(zhì)與合適的佐劑結(jié)合使用。
編碼MAGE-10的分離的cDNA也是本發(fā)明的一個(gè)特征、比如SEQ IDNO3的cDNA。本發(fā)明的另一部分為cDNA分子，該分子具有在嚴(yán)格條件下(例如在65℃下0.2×SSC、0.1％SDS，或者更優(yōu)選為0.1×SSC)與SEQ ID NO3雜交的互補(bǔ)序列。這些序列至少應(yīng)當(dāng)包括SEQ ID NO3的按照5’到3’順序的第164—574個(gè)核苷酸。由SEQ ID NO3的第164—185以及553—574個(gè)核苷酸組成的核酸分子作為探針和/或引物是特別有用的，并且它們也是本發(fā)明的一部分。當(dāng)可操作地連接到啟動(dòng)子上時(shí)，可以以表達(dá)載體的形式使用所述序列，然后用于轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以便生成多種重組的真核細(xì)胞系和原核細(xì)胞株。類(lèi)似地，上述序列以及諸如SEQ ID NOS1和2這樣的序列可以用于各種雜交測(cè)定中、比如基于PCR的測(cè)定。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，這些都是眾所周知的并且在此不必重復(fù)。
把已經(jīng)采用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)用作描述的術(shù)語(yǔ)、而并非是限制性的，并且不打算在上述術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的使用中排除任何與所顯示的和描述的特征或其部分等同的內(nèi)容，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到各種的改進(jìn)都可能在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Rimoldi，Donata；Jongeneel，Victor；Coulie，Pierre；Cerrottini，Jean-Charles；Carrel，Stefan；Reed，Daryl(ii)發(fā)明名稱(chēng)MAGE-10編碼cDNA，腫瘤排斥抗原前體MAGE-10，對(duì)該分子具有特異性的抗體及其用途(iii)序列數(shù)3(iv)通訊地址(A)地址Felfe&Lynch(B)街道805第三大道(C)城市紐約市(D)州紐約(E)美國(guó)(F)郵政編碼10022(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)存儲(chǔ)媒體類(lèi)型軟盤(pán)，3.5英寸，144kb存儲(chǔ)量(B)計(jì)算機(jī)IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordpeffect(vi)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/724,774(B)申請(qǐng)日1996年10月3日(C)分類(lèi)號(hào)435(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登記號(hào)30,946(C)證書(shū)號(hào)LUD5457-PCT(ix)電信信息(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGGCGACGA CTCCTGGAG19(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO2CAGACCAACT GGTAATGATA GCG 23(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2559個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3TCCGGGGTCG CTCGAGCCGG CCGGGACTCG GGGATCASAA GTAACGGCGG 50YYMKYGTKCT GAGGGACAGG CTTGAGATCG GCTGAAGAGA GCGGGCCCAG 100GCTCTGTGAG GAGGCAAGGG AGGTGAGAAC CTTGCTCTCA GAGGGTGACT 150CAAGTCAACA CAGGGAACCC CTCTTTTCTA CAGACACAGT GGGTCGCAGG 200ATCTGACAAG AGTCCAGGTT CTCAGGGGAC AGGGAGAGCA AGAGGTCAAG 250AGCTGTGGGA CACCACAGAG CAGCACTGAA GGAGAAGACC TGCCTGTGGG 300TCCCCATCGC CCAAGTCCTG CCCACACTCC CACCTGCTAC CCTGATCAGA 350GTCATCATGC CTCGAGCTCC AAAGCGTCAG CGCTGCATGC CTGAAGAAGA 400TCTTCAATCC CAAAGTGAGA CACAGGGCCT CGAGGGTGCA CAGGCTCCCC 450TGGCTGTGGA GGAGGATGCT TCATCATCCA CTTCCACCAG CTCCTCTTTT 500CCATCCTCTT TTCCCTCCTC CTCCTCTTCC TCCTCCTCCT CCTGCTATCC 550TCTAATACCA AGCACCCCAG AGGAGGTTTC TGCTGATGAT GAGACACCAA 600ATCCTCCCCA GAGTGCTCAG ATAGCCTGCT CCTCCCCCTC GGTCGTTGCT 650TCCCTTCCAT TAGATCAATC TGATGAGGGC TCCAGCAGCC AAAAGGAGGA 700GAGTCCAAGC ACCCTACAGG TCCTGCCAGA CAGTGAGTCT TTACCCAGAA 750GTGAGATAGA TGAAAAGGTG ACTGATTTGG TGCAGTTTCT GCTCTTCAAG 800TATCAAATGA AGGAGCCGAT CACAAAGGCA GAAATACTGG AGAGTGTCAT 850AAAAAATTAT GAAGACCACT TCCCTTTGTT GTTTAGTGAA GCCTCCGAGT 900GCATGCTGCT GGTCTTTGGC ATTGATGTAA AGGAAGTGGA TCCCACTGGC 950CACTCCTTTG TCCTTGTCAC CTCCCTGGGC CTCACCTATG ATGGGATGCT 1000GAGTGATGTC CAGAGCATGC CCAAGACTGG CATTCTCATA CTTATCCTAA 1050GCATAATCTT CATAGAGGGC TACTGCACCC CTGAGGAGGT CATCTGGGAA 1100GCACTGAATA TGATGGGGCT GTATGATGGG ATGGAGCACC TCATTTATGG 1150GGAGCCCAGG AAGCTGCTCA CCCAAGATTG GGTGCAGGAA AACTACCTGG 1200AGTACCGGCA GGTGCCTGGC AGTGATCCTG CACGGTATGA GTTTCTGTGG 1250GGTCCAAGGG CTCATGCTGA AATTAGGAAG ATGAGTCTCC TGAAATTTTT 1300GGCCAAGGTA AATGGGAGTG ATCCAAGATC CTTCCCACTG TGGTATGAGG 1350AGGCTTTGAA AGATGAGGAA GAGAGAGCCC AGGACAGAAT TGCCACCACA 1400GATGATACTA CTGCCATGGC CAGTGCAAGT TCTAGCGCTA CAGGTAGCTT 1450CTCCTACCCT GAATAAAGTA AGACAGATTC TTCACTGTGT TTTAAAAGGC 1500AAGTCAAATA CCACATGATT TTACTCATAT GTGGAATCTA AAAAAAAAAA 1550AAAAAAAAGT TGGTATCATG GAAGTAGAGA GTAGAGCAGT AGTTACATTA 1600CAATTAAATA GGAGGAATAA GTTCTAGTGT TCTATTGCAC AGTAGGATGA 1650CTATAGTTAA CATTAAGATA TTGTATATTA CAAAACAGCT AGAAGGAAGG 1700CTTTTCAATA TTGTCACCAA AAAGAAATGA TAAATGCATG AGGTGATGGA 1750TACACTACCT GATGTGATCA TTATACTACA TATACATGAA TCAGAACATC 1800AAATTGTACC TCATAAATAT CTACAATTAC ATGTCAGTTT TTGTTTATGT 1850TTTTGTTTTT TTTTAATTTA TGAAAACAAA TGAGAATGGA AATCAATGAT 1900GTATGTGGTG GAGGGCCAGG CTGAGGCTGA GGAAAATACA GTGCATAACA 1950TCTTTGTCTT ACTGTTTTCT TTGGATAACC TGGGGACTTC TTTTCTTTTC 2000TTCTTGGTAT TTTATTTTCT TTTTCTTCTT CTTCTTTTTT TTTTTTAACA 2050AAGTCTCACT CTATTGCTCT GGCAGGAGTG CAGTGGTGCA GTCTCGGCTC 2100ACTGCAACTT CCGCCTCCTG GGTTCAAGCG ATTCTCCTGC CTCAGTCTCC 2150TGAGTAGCTG GGATTACAAG TGTGCACCAC CATACCCGGC TAATTTTGTA 2200TTTTTTAGTA GAGATGGGGT TTCACCATGT TGGCCAGGCT GGTCTCAAAC 2250TCCTGACCTC AGGTAATCTG CCCGCCTCAG CCTCCCAAAG TGCTGGGATA 2300ACAGGTGTGA GCCCACTGCA CCCCAGCCTC TTCTTGGTAT TTTAAAATGT 2350TGTTACTTTT ACTAGAATGT TTATGAGCTT CAGAATCTAA GGTCACACGT 2400TCGTTTCTGT TTATCCAGTT TAAGAAACAG TTTTGCTATT TTGTAAAACA 2450AATTGGGAAC CCTTCCATCA TATTTGTAAT CTTTAATAAA ATAACATGGA 2500ATTGGAATAG TAATTTTCTT GGAAATATGA AAAAATAGTA AAATAGAGAA 2550AATAATTTT 2559
權(quán)利要求
1. 編碼MAGE-10腫瘤排斥抗原前體的分離的cDNA分子，其互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO3的第164-574個(gè)核苷酸雜交。
2. 權(quán)利要求1的分離的cDNA分子，它包括SEQ ID NO3的第67-2559個(gè)核苷酸。
3. 權(quán)利要求1的分離的cDNA分子，它包括SEQ ID NO3。
4. 包括權(quán)利要求1的分離的cDNA分子的表達(dá)載體，所述cDNA分子可操作地連接到啟動(dòng)子上。
5. 用權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞系或者原核細(xì)胞株。
6. 分離的MAGE-10腫瘤排斥抗原前體，它具有如SDS-PAGE測(cè)得的約為72千道爾頓的分子量。
7. 由權(quán)利要求1的分離的cDNA分子編碼的分離的MAGE-10腫瘤排斥抗原前體。
8. 結(jié)合到權(quán)利要求6的分離的腫瘤排斥抗原前體上的單克隆抗體。
9. 由SEQ ID NO4的氨基酸序列組成的分離的腫瘤排斥抗原前體衍生的肽。
10. 包括權(quán)利要求6的分離的MAGE-10腫瘤排斥抗原前體和佐劑的免疫原性組合物。
11. 包括權(quán)利要求9的肽和佐劑的免疫原性組合物。
12. 多克隆抗血清，它是通過(guò)在有利于對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的條件下用權(quán)利要求8的肽免疫接種非人的動(dòng)物并由此分離出生成的抗血清來(lái)獲得的。
13. 用于測(cè)定樣品中MAGE-10腫瘤排斥抗原前體的存在的方法，該方法包括將所說(shuō)的樣品與權(quán)利要求8的單克隆抗體接觸并且測(cè)定它們之間的結(jié)合。
14. 用于測(cè)定樣品中MAGE-10腫瘤排斥抗原前體的存在的方法，該方法包括將所說(shuō)的樣品與權(quán)利要求12的多克隆抗血清接觸并且測(cè)定它們之間的結(jié)合。
15. 雜交瘤細(xì)胞，在該細(xì)胞中生成了權(quán)利要求8的單克隆抗體。
16. 權(quán)利要求8的單克隆抗體，其中所說(shuō)的抗體是人源化的。
全文摘要
編碼腫瘤排斥抗原前體MAGE－10的分離的cDNA分子、其蛋白質(zhì)、針對(duì)其的抗體以及這些物質(zhì)的用途為本發(fā)明的一部分。
文檔編號(hào)C07K14/00GK1239479SQ97180275
公開(kāi)日1999年12月22日 申請(qǐng)日期1997年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月3日
發(fā)明者多娜塔·里莫爾迪, 維克托·揚(yáng)尼爾, 皮埃爾·庫(kù)利耶, 讓?zhuān)闋査埂で辛_蒂尼, 斯特凡·卡雷爾, 達(dá)里爾·雷德 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所