專利名稱：迷迭香酸的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及迷迭香酸的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤為一種惡性疾病，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界50多億人口中平均每年死于惡性腫瘤者達(dá)690萬(wàn)人，新發(fā)病例為870萬(wàn)例，且數(shù)字還在逐年增加。國(guó)內(nèi)情況也基本如此，近20年間惡性腫瘤在死因中構(gòu)成比已由12.6％升至17.9％。因此，各國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)一直對(duì)腫瘤研究和抗腫瘤藥物予以高度重視，在抗腫瘤藥物的研究上，目前已取了重大進(jìn)展。
血小板減少性紫癜包括原發(fā)性血小板減少性紫癜和繼發(fā)性血小板減少性紫癜。主要表現(xiàn)為血小板生成減少，目前尚無(wú)理想治療藥物。
迷迭香酸過(guò)去一直作為抗菌和免疫抑制劑用于各種藥物中，如韓國(guó)專利(KR15989/1999)公開(kāi)了迷迭香酸及其衍生物用于制備免疫抑制劑藥物的用途，能特異性的抑制配體多肽與Lck SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，干擾T細(xì)胞內(nèi)的Lck介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，也能抑制細(xì)胞因子基因的表達(dá)和抑制移植組織內(nèi)的免疫反應(yīng)。日本專利(JP2002-055688)公開(kāi)了迷迭香酸在抗菌制劑中的用途。中國(guó)專利(CN 95113971.1)公開(kāi)了迷迭香酸二聚體化合物在制備治療消化性潰瘍的藥物中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了(1)由迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物制備的各種藥物在抗消化道腫瘤和其它腫瘤及增效、減毒的應(yīng)用；(2)本發(fā)明涉及迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、以及迷迭香酸衍生物用于治療血小板減少性紫癜疾病的用途；(3)迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚及迷迭香酸衍生物的制備方法；(4)從植物腫節(jié)風(fēng)中制備迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚及迷迭香酸衍生物的制備方法。
本發(fā)明的目的提供一種迷迭香酸的新應(yīng)用和制備方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種迷迭香酸的制備方法，它包括迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物，所述的迷迭香酸衍生物包括(1)其它化合物與迷迭香酸羰基上的羥基形成的各種酯化物如迷迭香基甲基酯，迷迭香基乙基酯，迷迭香基異丙基酯，迷迭香基苯甲基酯，迷迭香基苯乙基酯，迷迭香基對(duì)羥基苯甲基酯；(2)迷迭香酸銨鹽，鎂鹽以及其它各種鹽；(3)與迷迭香酸苯環(huán)上的羥基形成的各種?；?，其結(jié)構(gòu)為
本發(fā)明還提供了一種從植物腫節(jié)風(fēng)(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)中提取分離含迷迭香酸總多酚及提取分離純化高純度迷迭香酸的方法。此方法用10-60％乙醇為溶劑滲漉提取，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱和反相硅膠柱層析分離和純化，可制備純度從20％至大于90％以上的單體成分迷迭香酸。該方法所用的大孔吸附樹(shù)脂柱和反相硅膠柱可再生反復(fù)多次使用，所用的溶劑為乙醇和水，故可適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所用的提取溶劑還可以是水和10-60％甲醇。提取方法還可以是浸漬法或其它任何適用于工業(yè)化生產(chǎn)的方法。本發(fā)明樣品的濃縮和干燥方法可用薄膜濃縮，減壓濃縮和真空干燥，噴霧干燥，冷凍干燥等各種方法。選擇何種方法可視實(shí)際條件。
本發(fā)明所用的大孔吸附樹(shù)脂可以是極性大孔吸附樹(shù)脂、中等極性大孔吸附樹(shù)脂、弱極性大孔吸附樹(shù)脂及非極性大孔吸附樹(shù)脂。還可以是聚酰胺樹(shù)脂。
本發(fā)明所提供的從腫節(jié)風(fēng)中提取分離迷迭香酸的方法不是唯一的，只是一種非限制性的舉例，本發(fā)明也包括其他任何能使迷迭香酸的純度20％至90％以上，用于質(zhì)量控制的對(duì)照品迷迭香酸及其迷迭香酸衍生物的純度為98％以上的提取分離純化方法。
本發(fā)明還提供了(1)由迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物制備的各種藥物在抗消化道腫瘤和其它腫瘤的用途；(2)由迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物制備的藥物在抗腫瘤增效、減毒的應(yīng)用；(3)迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、以及迷迭香酸衍生物用于治療血小板減少性紫癜疾病的用途；本發(fā)明在制備具有抗腫瘤功效的藥物和腫瘤輔助治療的藥物中的用途時(shí)，即可以是迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物單獨(dú)使用，也可以是與至少一種療效明確的其他抗腫瘤藥物(包括抗腫瘤有效單體和中藥提取有效部位)聯(lián)合使用，加入制藥中可接受的載體。
本發(fā)明的抗腫瘤作用包括抗消化系統(tǒng)腫瘤的作用(包括胃、胰腺、肝、食道、直腸、結(jié)腸等惡性腫瘤)以及抗其他腫瘤的作用。
抗腫瘤增效作用體現(xiàn)在與化療藥、放療合用時(shí)可以提高療效。
抗腫瘤減毒作用體現(xiàn)在降低由放射、化學(xué)治療腫瘤所引起的毒性反應(yīng)如白細(xì)胞下降及血小板減少。
本發(fā)明迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、以及迷迭香酸衍生物具有升高血小板的作用，可以用于治療血小板減少性紫癜。
本發(fā)明的藥物制劑還具有抗菌抗炎作用，并可用于治療咽喉炎、氣管支氣管炎、肺炎、角膜炎、蜂窩組織炎、闌尾炎。
本發(fā)明提供的藥物制劑包括經(jīng)口服給藥制劑和非口服給藥途徑制劑。口服給藥制劑如片劑、丸劑、滴丸、膠囊、軟膠囊、泡騰劑、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑等。非口服給藥途徑制劑包括注射劑、粉針、大輸液、栓劑等。
本發(fā)明在制劑時(shí)，主藥迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物加入藥學(xué)上可接受的載體，或主藥加入少量一種療效明確的具有抗腫瘤藥物的其他成分，再加入制藥中可接受的載體，采用常規(guī)的制劑技術(shù)，將其制成所需的劑型。
本發(fā)明所用的制藥輔料包括粘合劑(可以是聚維酮、淀粉漿、纖維素等)、崩解劑(可以是干燥淀粉、羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素、聚乙烯比咯烷酮等)、潤(rùn)滑劑(可以是滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鈣鎂、硬脂酸鈣等)、矯味劑(可以是蔗糖、阿司巴甜、甜菊素、果糖等)、穩(wěn)定劑(可以是對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯等)、稀釋劑(可以是淀粉、糊精、糖粉、乳糖等)、潤(rùn)濕劑(可以是水或乙醇)、助流劑(可以是微粉硅膠)、賦形劑(可以是糖類衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇；淀粉類衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精或羧甲基淀粉；纖維素衍生物如結(jié)晶纖維、羥丙基纖維、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣；硅酸鹽衍生物如硅酸鎂鋁；磷酸鹽衍生物如磷酸鈣；硫酸鹽衍生物如硫酸鈣；碳酸鹽衍生物如碳酸鈣；阿拉伯膠；右旋糖苷)。
本發(fā)明還以活性單體成分迷迭香酸作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并建立了高效液相色譜分析方法用于腫節(jié)風(fēng)各種制劑的質(zhì)量檢測(cè)。
所述的含迷迭香酸的多酚及迷迭香酸的制劑，可從植物腫節(jié)風(fēng)中提取分離純化得到，也可從其它植物中提取分離純化得到。
由于本發(fā)明采取了上述的技術(shù)措施，它與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種從植物腫節(jié)風(fēng)(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)中提取分離含迷迭香酸總多酚及提取分離純化高純度迷迭香酸的方法。此方法用10-60％乙醇為溶劑滲漉提取，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱和反相硅膠柱層析分離和純化，可制備純度從20％至大于90％以上的單體成分迷迭香酸。該方法所用的大孔吸附樹(shù)脂柱和反相硅膠柱可再生反復(fù)多次使用，所用的溶劑為乙醇和水，故可適用于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是迷迭香酸的高效液相色譜圖和紫外光譜圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
下面給出實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
(一)藥理實(shí)施例1、整體試驗(yàn)通過(guò)多種腫瘤試驗(yàn)證明迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、迷迭香酸衍生物具有明顯的抗腫瘤作用。
(1)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)在抗小鼠S180、H22試驗(yàn)中，通過(guò)口服、尾靜脈注射方式給予迷迭香酸及含迷迭香酸總多酚制劑，均具有明顯的抗腫瘤作用，抑瘤率在39％和62％之間，S180、H22腹水型腫瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率50％-100％。表1，表2。
表1不同途徑及濃度的迷迭香酸及含迷迭香酸總多酚抗小鼠S180實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝10)

說(shuō)明腫節(jié)風(fēng)注射液由福建古田藥業(yè)有限公司出品。
表2不同途徑及濃度的迷迭香酸及含迷迭香酸總多酚抗小鼠肝癌H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝10)

說(shuō)明腫節(jié)風(fēng)注射液由福建古田藥業(yè)有限公司出品。
(2)增效實(shí)驗(yàn)在環(huán)磷酰胺治療小鼠S180、H22實(shí)體瘤增效試驗(yàn)中，通過(guò)口服、尾靜脈注射方式分別給以環(huán)磷酰胺、5Fu及環(huán)磷酰胺或5Fu加迷迭香酸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單用小劑量環(huán)磷酰胺或5Fu的抑瘤率在20％和36％之間，與迷迭香酸或含迷迭香酸總多酚合用后其抑瘤率在45％和67％，說(shuō)明迷迭香酸與環(huán)磷酰胺或5Fu合用時(shí)可明顯增強(qiáng)化療藥的抗腫瘤作用。在5氟尿嘧啶治療小鼠S180、H22腹水型腫瘤增效試驗(yàn)中，通過(guò)口服、尾靜脈注射方式分別給以5氟尿嘧啶小劑量、5氟尿嘧啶小劑量加迷迭香酸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單用小劑量5氟尿嘧啶S180、H22腹水型腫瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率在5％和15％之間，小劑量5氟尿嘧啶加迷迭香酸或含迷迭香酸總多酚后其S180、H22腹水型腫瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率在60％和150％之間。說(shuō)明5氟尿嘧啶與迷迭香酸合用時(shí)可明顯增強(qiáng)其抗腫瘤作用。見(jiàn)表3。
表3 迷迭香酸對(duì)5-FU治療小鼠肉瘤S180實(shí)體瘤的增效作用(n＝12)

(3)減毒實(shí)驗(yàn)在對(duì)環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷治療小鼠S180實(shí)體瘤減毒試驗(yàn)中，通過(guò)口服、肌肉注射、尾靜脈注射這3種方式分別給以環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷和兩者加迷迭香酸或含迷迭香酸總多酚配制成的制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠在給藥環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷后都出現(xiàn)血小板和白細(xì)胞顯著下降，分別加迷迭香酸或含迷迭香酸總多酚配制成的制劑后，白細(xì)胞和血小板明顯上升，說(shuō)明迷迭香酸和化療藥合用時(shí)有明顯的減毒作用。
(4)通過(guò)下面實(shí)驗(yàn)可以證明迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、迷迭香酸衍生物具有明顯的抗原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少性紫癜的作用。
抗原發(fā)性血小板減少性紫癜的作用取BALB/C小鼠，各給藥組灌胃給藥，每天1次。免疫法造模。取外周血觀察血小板數(shù)變化。迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、迷迭香酸衍生物能升高模型組動(dòng)物的血小板數(shù)，具有明顯的抗原發(fā)性血小板減少性紫癜的作用，見(jiàn)表4。
表4 迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、迷迭香酸衍生物對(duì)原發(fā)性血小板減少性小鼠模型血小板的影響(

n＝20)

*P＜0.05，**P＜0.01與正常對(duì)照組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01與模型組比較抗繼發(fā)性血小板減少性紫癜的作用取昆明種小鼠。注射阿糖胞苷造模，連續(xù)給藥10天，取外周血觀察血小板數(shù)變化。迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、迷迭香酸衍生物能升高模型組動(dòng)物的血小板數(shù)具有明顯的抗繼發(fā)性血小板減少性紫癜的作用，見(jiàn)表5。
表5迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚、迷迭香酸衍生物對(duì)繼發(fā)性血小板減少性小鼠模型血小板的影響(

n＝20)

*P＜0.05，**P＜0.01與正常對(duì)照組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01與模型組比較2、體外試驗(yàn)(1)迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)在對(duì)MTT法體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞(hct-8)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(bgc-823)、人卵巢癌細(xì)胞(a-2780)的生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)中，分別給予腫節(jié)風(fēng)中提取的迷迭香酸或含迷迭香酸總多酚及市售腫節(jié)風(fēng)注射液對(duì)照組給予5氟尿嘧啶，對(duì)上述三種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制濃度分別取0.5μg/ml，5.0μg/ml，50.0μg/ml，抑制率和半數(shù)有效濃度(IC50)值見(jiàn)表6，表明迷迭香酸對(duì)結(jié)腸癌的抑制率高于市售腫節(jié)風(fēng)注射液、IC50值低于市售腫節(jié)風(fēng)注射液。
表6 迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚的直接抗腫瘤的作用(MTT法)

說(shuō)明市售腫節(jié)風(fēng)注射液由福建古田藥業(yè)有限公司出品。
(1)迷迭香酸衍生物對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)在對(duì)MTT法體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞(hct-8)的生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)中分別給予迷迭香酸衍生物迷迭香基甲酯、迷迭香酸銨鹽、迷迭香酸乙?；?，對(duì)照組給藥予5氟尿嘧啶。對(duì)人胃癌細(xì)胞(hct-8)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制濃度均取0.5μg/ml，5.0μg/ml，50.0μg/ml，抑制率和半數(shù)有效濃度(IC50)值見(jiàn)7，表明迷迭香酸衍生物對(duì)人胃癌細(xì)胞(hct-8)的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。
表7迷迭香酸衍生物對(duì)人胃癌細(xì)胞(hct-8)生長(zhǎng)抑制的影響(MTT法)

(3)體外抑菌實(shí)驗(yàn)在體外抑菌試驗(yàn)中，采用綠膿桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、白色念球菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、甲鏈球菌、卡他球菌、流感桿菌、肺炎雙球菌、鏈球菌及脆弱類桿菌等15種117株菌，經(jīng)MIC和MSC試驗(yàn)表明迷迭香酸具有抗菌作用。
(二)迷迭香酸提取分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定的實(shí)施例1、迷迭香酸的提取分離純化(1)稱取腫節(jié)風(fēng)藥材，粉碎，用10～30倍10～60％乙醇浸泡24小時(shí)，滲漉提取至滲漉液三氯化鐵反應(yīng)呈陰性或高效液相分析檢測(cè)不出迷迭香酸為止，合并濾液，濾液濃縮至無(wú)醇味，靜置24小時(shí)，濾過(guò)。
(2)上述濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，先用去離子水洗脫至Molish反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)呈陰性，改用10～60％乙醇洗脫2～3個(gè)柱體積，再用10～60％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫段，合并，濃縮成浸膏。
(3)將浸膏溶解于盡可能少的10～60％的乙醇中，上反相硅膠柱層析，先用水洗脫2～3個(gè)柱體積，改用10～50％的乙醇洗脫2～3個(gè)柱體積，再用10～50％的乙醇洗脫2～3個(gè)柱體積，合并10～60％的乙醇洗脫部分，濃縮，干燥，得腫節(jié)風(fēng)總多酚。
(4)將上述腫節(jié)風(fēng)總多酚溶于盡量少的10～60％的乙醇中，再次上反相硅膠柱層析，先用水洗2～3個(gè)柱體積，后用10～50％的乙醇洗脫，分段收集10～50％乙醇洗脫部分，用高效液相色譜檢測(cè)每個(gè)組分，將含有單一成分迷迭香酸的組分合并，濃縮并干燥后得單體化合物迷迭香酸，所得迷迭香酸的含量大于90％。
2、迷迭香酸的結(jié)構(gòu)鑒定迷迭香酸的結(jié)構(gòu)是根據(jù)1維氫譜、碳譜，2維氫-氫相關(guān)譜、碳-氫相關(guān)譜和高分辨的質(zhì)譜分析而鑒定。提純的迷迭香酸的物理和化學(xué)性質(zhì)如下(1)外觀無(wú)定型粉末，無(wú)色；(2)溶解性極易溶于水中、易溶于乙醇和甲醇中；(3)紫外光譜(MeOH，λmax)215、251(肩峰)、293、326nm；(4)紅外光譜(KBr)3429、1693、1606、1524、1448、1384、1263、1162、1116、1056cm-1；(5)質(zhì)譜m/z359.0686[M-1]-1(計(jì)算值359.0767[M-1]-1，C18H15O8)；(6)迷迭香酸的碳譜數(shù)據(jù)(150MHz，氘代甲醇)δ127.7(C-1)，115.4(C-2)，146.7(C-3)，149.7(C-4)，116.7(C-5)，123.4(C-6)，147.9(C-7)，114.6(C-8)，168.7(C-9)，129.4(C-1′)，117.7(C-2′)，146.1(C-3′)，145.2(C-4′)，116.5(C-5′)，122.0(C-6′)，37.9(C-7′)，74.7(C-8′)，173.8(C-9′)；(7)迷迭香酸的氫譜數(shù)據(jù)(600MHz，氘代甲醇)δ7.05(1H，d，J＝1.7Hz，H-2)，6.79(1H，d，J＝8.0Hz，H-5)，6.93(1H，dd，J＝1.7/8.0Hz，H-6)，7.54(1H，d，J＝15.9Hz，H-7)，6.26(1H，d，J＝15.9Hz，H-8))，6.78(1H，d，J＝1.7Hz，H-2′)，6.72(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，6.62(1H，dd，J＝1.7/8.0Hz，H-6′)，3.00(1H，dd，J＝8.3/14.3Hz，H-7a′)，3.09(1H，dd，J＝4.2/14.3Hz，H-7b′)，5.20(1H，dd，J＝4.2/8.3Hz，H-8′)；(8)迷迭香酸的氫-碳遠(yuǎn)程偶合關(guān)系如下 (9)迷迭香酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 (10)以上數(shù)據(jù)及分析結(jié)果表明純化的化合物就是迷迭香酸。
(三)迷迭香酸衍生物制備的實(shí)施例
1、迷迭香基甲酯迷迭香酸(500mg)溶于甲醇(30mL)回流20小時(shí)。回流液冷卻后用乙酸乙酯100mL稀釋，并先后用飽和的碳酸氫鈉50mL和10％鹽酸洗滌3次。乙酸乙酯相用硫酸鎂脫水干燥后減壓真空濃縮得粘稠狀物。粘稠狀物通過(guò)硅膠柱層析分離(洗脫液正己烷/乙酸乙酯)后得到固體物迷迭香基甲酯(490mg)。
該化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)如下溶于乙醇、甲醇和乙酸乙酯中；紫外光譜(MeOH，λmax)213、250(肩峰)、290、326nm紅外光譜(KBr)3426、1670、1659，1602、1520、1447、1386、1266、1160、1118、1060cm-1；碳譜數(shù)據(jù)(150MHz，氘代甲醇)δ127.8(C-1)，115.2(C-2)，146.8(C-3)，149.5(C-4)，116.5(C-5)，123.1(C-6)，147.7(C-7)，114.3(C-8)，168.8(C-9)，129.3(C-1′)，117.5(C-2′)，145.8(C-3′)，145.0(C-4′)，116.1(C-5′)，122.1(C-6′)，37.7(C-7′)，74.2(C-8′)，170.6(C-9′)，55.8(C，-OCH3)；氫譜數(shù)據(jù)(600MHz，氘代甲醇)δ7.03(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，6.78(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)，6.90(1H，dd，J＝1.8/8.1Hz，H-6)，7.55(1H，d，J＝15.8Hz，H-7)，6.25(1H，d，J＝15.8Hz，H-8))，6.76(1H，d，J＝1.8Hz，H-2′)，6.71(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，6.61(1H，dd，J＝1.8/8.0Hz，H-6′)，3.02(1H，dd，J＝8.1/14.5Hz，H-7a′)，3.08(1H，dd，J＝4.3/14.5Hz，H-7b′)，5.53(1H，dd，J＝4.3/8.1Hz，H-8′)，3.88(3H，s，-OCH3)。
以上數(shù)據(jù)表明該化物為迷迭香基甲酯，其結(jié)構(gòu)如下 2、迷迭香酸鹽(1)迷迭香酸銨鹽的制備稱取迷迭香酸500mg，加5mL水溶解后用10％氫氧化銨溶液調(diào)pH至5.0，水溶液冷凍或真空減壓濃縮并干燥后得到迷迭香酸銨鹽。
(2)迷迭香酸鎂鹽的制備稱取迷迭香酸500mg，加5mL水溶解后用氫氧化鎂溶液調(diào)pH至5.0，水溶液冷凍或真空減壓濃縮并干燥后得到迷迭香酸鎂鹽。
3、迷迭香酸乙?；锏闹苽浞Q取迷迭香酸500mg溶于200mL無(wú)水醋酐和無(wú)水吡啶的混合溶液(1∶2)中室溫放置24小時(shí)。反應(yīng)物加50mL水?dāng)嚢韬鬁p壓真空濃縮得稠狀物。該稠狀物用硅膠柱層析分離(洗脫液正己烷/乙酸乙酯)后得到迷迭香酸乙?；?690mg)。
(四)迷迭香酸含量測(cè)定的實(shí)施例1、迷迭香酸的含量測(cè)定(1)儀器高效液相色譜儀。
(2)試藥迷迭香酸對(duì)照品(從腫節(jié)風(fēng)中提取分離純化，純度大于99％)，甲醇(色譜純)，乙酸(分析純)。
(3)色譜條件色譜柱Hypersil C18高效液相色譜柱(250×4.6mm，5μm)；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)326nm；流速1.5mL/min；流動(dòng)相見(jiàn)表8。
表8迷迭香酸反相高效液相分析的梯度流動(dòng)相

迷迭香酸的含量測(cè)定也可用分光度法。
(4)對(duì)照品溶液的制備精密稱取在60℃真空干燥后的迷迭香酸對(duì)照品25.0mg，置25ml容量瓶中，加70％乙醇20ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
(5)供試品溶液的制備精密稱取在60℃真空干燥后的單體化合物迷迭香酸25.0mg，置25ml容量瓶中，加70％乙醇20ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
(6)線性關(guān)系考察取濃度為1.0mg/mL的迷迭香酸對(duì)照品溶液2、4、8、10、20μL依次進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定迷迭香酸的峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，回歸得直線方程Y＝1511.380204X-444.46234，r＝0.99967。結(jié)果表明迷迭香酸進(jìn)樣量在2-20μg范圍內(nèi)峰面積積分值與濃度呈良好的線性關(guān)系。
(7)精密度試驗(yàn)取濃度為1.0mg/mL的迷迭香酸對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，在前述色譜條件下測(cè)定迷迭香酸的峰面積，其峰面積的RSD＝0.97％(n＝6)。
(8)穩(wěn)定性試驗(yàn)取濃度為1.0mg/mL的迷迭香酸對(duì)照品溶液分別在0、1、38、40、45小時(shí)進(jìn)樣，每次10μL，在前述色譜條件下測(cè)定迷迭香酸的峰面積，其峰面積的RSD＝0.64％(n＝5)。
(9)樣品測(cè)定取濃度為1.0mg/mL的迷迭香酸供試品溶液10μL進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定迷迭香酸的峰面積，并計(jì)算迷迭香酸的含量。本發(fā)明從腫節(jié)風(fēng)中提取分離純化的單體化合物迷迭香酸的含量為91.0％(n＝3，SD＝0.5)。見(jiàn)圖1。
2、腫節(jié)風(fēng)總多酚中迷迭香酸的含量測(cè)定精密稱取在600C真空干燥后的腫節(jié)風(fēng)總多酚樣品50.0mg，置50ml容量瓶中，加70％乙醇35ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得1.0mg/mL的供試品溶液。取濃度為1.0mg/mL的供試品溶液20μL進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定各單一化合物的峰面積，各單一化合物的含量均以迷迭香酸計(jì)算。各單一化合物含量的總和即為腫節(jié)風(fēng)總多酚的含量。本發(fā)明制備的腫節(jié)風(fēng)總多酚的含量為52.6％(n＝3，SD＝0.53)。
3、腫節(jié)風(fēng)中迷迭香酸的含量測(cè)定分別精密稱取在60℃真空干燥后的腫節(jié)風(fēng)粗粉6份(每份2.0000g)，分別置一小層析柱中分別用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇浸泡24小時(shí)后，滲漉提取至滲漉液三氯化鐵反應(yīng)呈陰性或高效液相分析檢測(cè)不出迷迭香酸為止。合并各溶劑滲漉液，各滲漉液經(jīng)減壓濃縮至大約30mL后分別定量轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，最后分別用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得40.0mg/mL的腫節(jié)風(fēng)樣品液。取濃度為40.0mg/mL的腫節(jié)風(fēng)樣品液10μL或20μL進(jìn)樣，在前述色譜條件下測(cè)定迷迭香酸的峰面積，并計(jì)算腫節(jié)風(fēng)中迷迭香酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明用不同溶劑提取腫節(jié)風(fēng)中迷迭香酸的效果差異很大。用水、10％乙醇、和30％乙醇提取的迷迭香酸含量最高且三者無(wú)顯著差異，50％乙醇和70％乙醇次之，95％乙醇提取的迷迭香酸含量最低。故本發(fā)明提取迷迭香酸所用的溶劑為10～30％乙醇或水。
4、各種制劑中迷迭香酸的含量測(cè)定各種制劑中迷迭香酸的含量測(cè)定均可用上述建立的高效液相色譜分析方法。
提取迷迭香酸所用的溶劑可用10～60％乙醇或水。但是，由于各種制劑的制備工藝不同，加入的輔料不同，故供分析測(cè)試用的樣品液的制備方法可能有不同。對(duì)液體制劑而言，樣品可直接進(jìn)樣分析；對(duì)用10～60％乙醇或水能全部溶解的制劑而言，樣品溶解后也可直接進(jìn)樣分析；而對(duì)哪些用10～60％乙醇或水不能全部溶解的制劑而言，樣品液的制備可能采用不同的提取方法，在此情況下，必須考察樣品的加樣回收率以保證制劑中迷迭香酸的完全提出。
權(quán)利要求
1.一種迷迭香酸的制備方法，它包括迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物，所述的迷迭香酸衍生物包括(1)其它化合物與迷迭香酸羰基上的羥基形成的各種酯化物如迷迭香基甲基酯，迷迭香基乙基酯，迷迭香基異丙基酯，迷迭香基苯甲基酯，迷迭香基苯乙基酯，迷迭香基對(duì)羥基苯甲基酯；(2)迷迭香酸銨鹽，鎂鹽以及其它各種鹽；(3)與迷迭香酸苯環(huán)上的羥基形成的各種?；?，其結(jié)構(gòu)為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的迷迭香酸的制備方法，其特征是包括如下步驟迷迭香酸的提取分離純化(1)稱取腫節(jié)風(fēng)藥材，粉碎，用10～30倍10～60％乙醇浸泡24小時(shí)，滲漉提取至滲漉液三氯化鐵反應(yīng)呈陰性或高效液相分析檢測(cè)不出迷迭香酸為止，合并濾液，濾液濃縮至無(wú)醇味，靜置24小時(shí)，濾過(guò)；(2)上述濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，先用去離子水洗脫至Molish反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)呈陰性，改用10～60％乙醇洗脫2～3個(gè)柱體積，再用10～60％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫段，合并，濃縮成浸膏；(3)將浸膏溶解于盡可能少的10～60％的乙醇中，上反相硅膠柱層析，先用水洗脫2～3個(gè)柱體積，改用10～50％的乙醇洗脫2～3個(gè)柱體積，再用10～50％的乙醇洗脫2～3個(gè)柱體積，合并10～60％的乙醇洗脫部分，濃縮，干燥，得腫節(jié)風(fēng)總多酚；(4)將上述腫節(jié)風(fēng)總多酚溶于盡量少的10～60％的乙醇中，再次上反相硅膠柱層析，先用水洗2～3個(gè)柱體積，后用10～60％的乙醇洗脫，分段收集10～60％乙醇洗脫部分，用高效液相色譜檢測(cè)每個(gè)組分，將含有單一成分迷迭香酸的組分合并，濃縮并干燥后得單體化合物迷迭香酸，所得迷迭香酸的含量大于90％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的迷迭香酸的制備方法，其特征是包括如下步驟迷迭香基甲酯的制備迷迭香酸500mg溶于甲醇30mL回流20小時(shí)，回流液冷卻后用乙酸乙酯100mL稀釋，并先后用飽和的碳酸氫鈉50mL和10％鹽酸洗滌3次，乙酸乙酯相用硫酸鎂脫水干燥后減壓真空濃縮得粘稠狀物，粘稠狀物通過(guò)硅膠柱層析分離，洗脫液正己烷/乙酸乙酯，后得到固體物迷迭香基甲酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的迷迭香酸的制備方法，其特征是包括如下步驟迷迭香酸鹽的制備稱取迷迭香酸500mg，加5mL水溶解后用堿溶液調(diào)pH至5.0，水溶液冷凍或真空減壓濃縮并干燥后得到迷迭香酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的迷迭香酸的制備方法，其特征是包括如下步驟迷迭香酸乙酰化物的制備稱取迷迭香酸500mg溶于200mL無(wú)水醋酐和無(wú)水吡啶的混合溶液中，無(wú)水醋酐和無(wú)水吡啶的比例為1∶2，室溫放置24小時(shí)，反應(yīng)物加50mL水?dāng)嚢韬鬁p壓真空濃縮得稠狀物，該稠狀物用硅膠柱層析分離，洗脫液正己烷/乙酸乙酯，后得到迷迭香酸乙?；?。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的迷迭香酸的制備方法，其特征是所用的提取溶劑還可以是水和10-60％甲醇，提取方法還可以是浸漬法或其它任何適用于工業(yè)化生產(chǎn)的方法，濃縮和干燥方法可用薄膜濃縮，減壓濃縮和真空干燥，噴霧干燥，冷凍干燥的方法，所述的大孔吸附樹(shù)脂可以是極性大孔吸附樹(shù)脂、中等極性大孔吸附樹(shù)脂、弱極性大孔吸附樹(shù)脂及非極性大孔吸附樹(shù)脂，還可以是聚酰胺樹(shù)脂。
7.一種迷迭香酸的應(yīng)用，其特征是(1)由迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物制備的藥物在抗消化道腫瘤和其它腫瘤治療方面的應(yīng)用；(2)由迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物制備的藥物在抗腫瘤增效、減毒的應(yīng)用；(3)迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物用于治療血小板減少性紫癜疾病的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的迷迭香酸的應(yīng)用，其特征是在制備具有抗腫瘤功效的藥物、腫瘤增效、減毒治療的藥物中的應(yīng)用和治療血小板減少性紫癜疾病的應(yīng)用時(shí)，可以是迷迭香酸單獨(dú)使用，也可以是與至少一種療效明確的其他抗腫瘤藥物，包括抗腫瘤有效單體和中藥提取有效部位聯(lián)合使用，加入制藥中可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的迷迭香酸的應(yīng)用，其特征是所述的藥物制劑包括經(jīng)口服給藥制劑和非口服給藥途徑制劑，口服給藥制劑如片劑、丸劑、滴丸、膠囊、軟膠囊、泡騰劑、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑，非口服給藥途徑制劑包括注射劑、粉針、大輸液、栓劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的迷迭香酸的應(yīng)用，其特征是所述的含迷迭香酸的多酚及迷迭香酸的制劑，可從植物腫節(jié)風(fēng)中提取分離純化得到，也可從其它植物中提取分離純化得到。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了迷迭香酸的制備方法和應(yīng)用。其特征是，迷迭香酸、含迷迭香酸的多酚、以及迷迭香酸衍生物的單獨(dú)或與其他植物提取物混合制成的制劑的抗消化道腫瘤和其它腫瘤，以及與化療藥或放療抗腫瘤的增效、減毒作用的應(yīng)用。另外，單體化合物迷迭香酸、含迷迭香酸的多酚、以及迷迭香酸衍生物的藥物制劑，也可直接用于升高白細(xì)胞及血小板的藥物制劑，例如原發(fā)性或、繼發(fā)性血小板減少性紫癜，以及因化療或放療引起的白細(xì)胞及血小板減少。本發(fā)明還提供了一種從植物腫節(jié)風(fēng)(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)中提取高純度的迷迭香酸的方法，含迷迭香酸的多酚的提取方法，以及迷迭香酸衍生物的制備方法。
文檔編號(hào)A61K31/21GK101020637SQ20071006738
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者連曉媛, 張治針 申請(qǐng)人:連曉媛, 張治針