專利名稱：人源抗a型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程抗體，具體涉及一種人源抗肉毒神經(jīng)毒素的基因工程抗體，還涉及該抗體的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
肉毒神經(jīng)毒素(Clostridium Botulinum Neurotoxins，BN，簡稱肉毒毒素)是一組已知毒力最強(qiáng)的蛋白質(zhì)(包括A-G型)。當(dāng)肉毒毒素從污染食品或經(jīng)感染進(jìn)入人體循環(huán)后，通過阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(興奮性突觸遞質(zhì))在神經(jīng)肌肉接頭的釋放，引起嚴(yán)重的神經(jīng)失調(diào)和進(jìn)行性神經(jīng)肌肉麻痹的肉毒中毒癥狀，造成骨骼肌無力和延髓麻痹，嚴(yán)重的最終出現(xiàn)呼吸衰竭、心跳停止而導(dǎo)致死亡。引起人類中毒的主要是A、B、E型，A型肉毒毒素比其它血清型可引起更嚴(yán)重的病癥和導(dǎo)致更高的死亡率。
應(yīng)用抗毒素提供被動免疫在毒素中毒的預(yù)防和治療中能起到有效的保護(hù)作用。目前，臨床特異性治療肉毒中毒主要是使用肉毒多價(jià)抗毒素—馬血清。馬血清來源的多克隆抗毒素(HIG)已用于80％以上肉毒中毒病人的治療。多克隆抗毒素可識別大量的不同表位，可以保證一小部分保護(hù)性抗體的存在。1984年Tacket CO報(bào)道馬抗的應(yīng)用，在暴露于肉毒毒素前和暴露后24小時(shí)內(nèi)使用馬抗體也是有效的。但是，使用馬抗有明顯的副作用，Black RE報(bào)道臨床治療中約有9％病例出現(xiàn)血清病和過敏性反應(yīng)(Black RE，Gunn RA.Hypersensitivity reactions associated with botulinal antitoxin.Am J Med 1980；69567-570)。這種異源性產(chǎn)生的強(qiáng)免疫排斥反應(yīng)和血清病等嚴(yán)重限制了馬血清抗毒素的臨床應(yīng)用。為了避免和克服這些副作用，人們從志愿免疫獻(xiàn)血者的血清中制備人免疫球蛋白(human BIG)(Gelzleichter TR，Myers MA，MentonRG，et al.Protection against botulinum toxins provided by passive immunizationwith botulinum human immune globulin J Appl Toxicol.1999 Dec；19 Suppl1S35-8)，主要用于嬰兒肉毒中毒的治療。然而人免疫球蛋白的應(yīng)用仍存在很多問題，主要包括潛在血源感染疾病的傳播、制品有效性和特異性差異，以及制品的獻(xiàn)血者來源不足等，這些問題制約了它的應(yīng)用。而人們常常忽視的潛在問題是，為滿足生產(chǎn)人免疫球蛋白的需要而進(jìn)行肉毒類毒素免疫的志愿者，將會失去用肉毒毒素治療多種神經(jīng)調(diào)節(jié)障礙疾病的機(jī)會和權(quán)利。因此，目前的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了新型抗毒素的制備。Hc是肉毒毒素的受體結(jié)合區(qū)，含中和表位，該位點(diǎn)在不同血清型毒素中是高度特異的。因此成為抗體研究針對靶標(biāo)。
鼠源單克隆抗體是由鼠B細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞分泌的，其制備包括動物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)。2001年P(guān)less DD等制備了針對A型肉毒毒素Hc片段的鼠單克隆抗體，SPR分析抗體解離常數(shù)范圍為0.06-0.9nM，表位繪圖分析顯示，這些鼠源單抗結(jié)合到Hc片段的至少兩個(gè)不同區(qū)域。2004年Yang GH等用不含毒性成分的B型肉毒毒素類毒素免疫制備獲得了一株針對Hc片段的具有毒素中和活性的鼠單抗BTBH-N1，報(bào)道稱10μg可以有效中和20LD50的B型毒素；Bavari；Sina等制備了針對A型肉毒毒素的鼠單克隆抗體，可用于毒素的檢測及治療，并對其申請了專利(United StatesPatent Application No.20060177881)；Marks，James D等通過噬菌體文庫篩選獲得了針對A型肉毒毒素的鼠源中和抗體，并對其申請了專利(United StatesPatent Application No.20040175385)。但是，鼠源性單抗用于人類疾病的預(yù)防和治療時(shí)會產(chǎn)生異種蛋白變態(tài)反應(yīng)，大大限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。而且，機(jī)體對異源抗體蛋白的清除作用使得鼠源性抗體在人體內(nèi)半衰期縮短，生物活性降低。因此，人們一直致力于人源性抗體的研究，如用人脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交；鼠單抗的人源化改造，將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區(qū)框架中，產(chǎn)生CDR移植的人源化抗體，或者采用基因敲除技術(shù)將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，然后用抗原免疫小鼠，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體等等，但都遇到一些技術(shù)困難和條件限制。
近年來分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是文庫技術(shù)的成熟大大推動了抗體基因工程的發(fā)展，并對抗體的人源化過程發(fā)揮著重要作用。從特異性免疫的抗體庫中可以比較容易的得到高親和力抗體。免疫庫的抗體基因來自免疫后個(gè)體的免疫球蛋白mRNA，因此，在免疫庫中，針對某種抗原的抗體基因可能是富集的或經(jīng)親和力成熟的，容易得到高親和力特異抗體克隆。2002年P(guān)eter等從噬菌體天然抗體文庫和BoNT/A噬菌體免疫文庫中篩選抗BoNT/A-Hc的人源ScFv，結(jié)果顯示免疫文庫獲得的抗體可識別并結(jié)合兩個(gè)不同的表位I和II，結(jié)合I的ScFv具有毒素中和活性(Amersdorfer P，Wong C，Smith T，et al，Genetic and immunological comparison of anti-botulinum type A antibodies fromimmune and non-immune human phage libraries.Vaccine.2002 Feb 22；20(11-12)1640-8.)。然而基因工程抗體的表達(dá)量低是阻礙抗體開發(fā)和應(yīng)用的瓶頸。國內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室都開展這方面的研究工作，應(yīng)用了不同的表達(dá)載體、宿主菌和不同的表達(dá)系統(tǒng)。Park JT等利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對抗肉毒毒素抗體Fab片段進(jìn)行了表達(dá)，并對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化(Park JT，Bradbury L，Kragl FJ，et al.Biotechnol Prog.2006 Jan-Feb；22(1)233-40)。Mah DC等在酵母表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了抗A型肉毒毒素ScFv的表達(dá)(Mah DC，Hu WG，Pon JK，etal.Hybrid Hybridomics.2003 Oct；22(5)277-83)；Almquist KC等在轉(zhuǎn)基因土豆中實(shí)現(xiàn)了抗A型肉毒毒素ScFv的表達(dá)；2004年Mowry MC等在CHO DG44細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了針對A型肉毒毒素的一株嵌合抗體的表達(dá)，但還未達(dá)到高水平表達(dá)。
S.Bavari研究確定了產(chǎn)生保護(hù)性免疫的序列片段，并且制備了相應(yīng)的多肽(BoNTaHc1157-1181，Pa；BoNTaHc1230-1253，Pb)，它不但可以識別和結(jié)合肉毒毒素中和抗毒素血清，而且可以免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異的抗BoNTa中和抗體(S.Bavari，Dorothy D.Pless，Edna R.Torres，et al.Identifying thePrinciple protective antigenic determinants of type A botulinumneurotoxin.vaccine，1998，16(19)1850-1856)，因此可以應(yīng)用于抗體免疫文庫的構(gòu)建和抗毒素基因的篩選。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有肉毒毒素中毒治療用抗毒素制品的缺陷，本發(fā)明提供了人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體，該抗體具有如序列表中序列35所示的氨基酸序列，其編碼基因具有如序列表中序列34所示的核苷酸序列。
針對單鏈抗體通常都存在的穩(wěn)定性差的問題，本發(fā)明還提供了一種人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體的小分子穩(wěn)定性改構(gòu)體(dsFv)，即二硫鍵穩(wěn)定性Fvs。該改構(gòu)體是在上述人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體基礎(chǔ)上改構(gòu)而成，在抗體可變區(qū)VH和VL之間，通過定點(diǎn)突變引入二硫鍵形成位點(diǎn)VH46Cys和VL99Cys，以添加二硫鍵的方式連接VH和VL構(gòu)建二硫鍵穩(wěn)定性抗體。其中重鏈的氨基酸序列如序列表中序列36所示，輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列37所示。改構(gòu)的dsFv抗體結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合特異性沒有發(fā)生改變，不同條件下的穩(wěn)定性獲得了明顯改善，實(shí)時(shí)SPR技術(shù)測定抗體親和力也獲得了提高，更加適合于應(yīng)用。
本發(fā)明的人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體具有特異中和活性強(qiáng)、親和力高、無毒副作用的特點(diǎn)，適用于A型肉毒神經(jīng)毒素中毒的急救治療。本發(fā)明獲得的HuAb-BNa產(chǎn)品，不僅可以完全消除抗肉毒神經(jīng)毒素馬血清(ETIG)易引起的過敏反應(yīng)，而且可以克服人抗肉毒神經(jīng)毒素免疫球蛋白(HTIG)生產(chǎn)的血源不足和潛在病毒污染的問題，具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明同時(shí)提供了人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體(HuAb-BNa)的制備方法。首先是制備人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素編碼基因，可以采用化學(xué)合成或基因工程例如PCR方法，然后將該基因克隆入原核或真核表達(dá)載體，制備重組表達(dá)載體，其中原核表達(dá)載體可以為pCANTAB-5E、pET等、真核表達(dá)載體可以為pPCI9K等。然后將制備的重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞如大腸桿菌等、真核細(xì)胞如酵母菌等或哺乳動物細(xì)胞如CHO等中進(jìn)行表達(dá)，其中大腸桿菌可以為HB2151、BL21(DE3)等、酵母為GS115等。
本發(fā)明的HuAb-BNa基因是通過以下方法進(jìn)行篩選的。首先合成制備免疫肽Pa(如序列表中序列1所示)和Pb(如序列表中序列2所示)，制備鋁佐劑肽疫苗，經(jīng)志愿者免疫誘導(dǎo)，從外周血淋巴細(xì)胞中分離、克隆抗體重、輕鏈可變區(qū)基因(VH和VK)，構(gòu)建人源噬菌體抗體免疫文庫，比較容易地用毒素靶抗原，采用酶聯(lián)板固相抗原捕獲法，篩選HuAb-BNa噬菌體陽性克隆，進(jìn)而獲得具有特異中和活性、高親和力的HuAb-BNa基因，在實(shí)施該發(fā)明中，該基因可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成或通過PCR等生物學(xué)方法進(jìn)行制備?？梢栽谠思?xì)胞如大腸桿菌等、真核細(xì)胞如酵母菌等、哺乳動物細(xì)胞如CHO中獲得表達(dá)，經(jīng)過純化獲得均質(zhì)的HuAb-BNa蛋白，從而制備重組人源基因工程抗毒素，這種直接獲得人源抗毒素中和性克隆其基因的方法具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，獲得的基因工程抗毒素是完全人源性的，不需復(fù)雜的人源化制備過程，產(chǎn)品幾乎沒有免疫原性和毒副作用，不需過敏實(shí)驗(yàn)就可以直接使用。
本發(fā)明同時(shí)提供了人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體在肉毒毒素中毒急救治療中的應(yīng)用?？梢蕴峁└鼮榘踩⒂行Ш妥饔脵C(jī)理明確的人源抗毒素?；蚬こ碳夹g(shù)制備的人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體，可以有效中和A型肉毒毒素，延遲A型肉毒毒素中毒癥狀的發(fā)生，保護(hù)小鼠逃避致死量A型肉毒毒素的攻擊，起到急救治療的作用。本發(fā)明同時(shí)還公開了人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體在A型肉毒毒素檢測中的用途。
本發(fā)明針對目前抗毒素產(chǎn)品存在的缺陷，為滿足研制新一代人源(化)抗毒素的需求，提供了人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素編碼基因以及特異針對A型肉毒毒素的高親和力的人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗毒素，而且提供了其制備方法，該抗毒素作為免疫球蛋白的替換品，有很多優(yōu)點(diǎn)其有效成分明確，為抗A型肉毒毒素中和性單克隆抗體；特異性高，針對肉毒毒素的受體(中和)表位；無或低免疫原性，完全人源性蛋白結(jié)構(gòu)；能夠不限量的生產(chǎn)，可基因工程化制備放大。


圖1為提取人脾淋巴細(xì)胞總RNA產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜。
圖2為人抗體VH和VL基因擴(kuò)增圖譜A圖為VH1-6基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳；B圖為VL1-6基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳。其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-6泳道為VH1a-6a或VK1a-6a基因的PCR產(chǎn)物。
圖3為組裝的人單鏈抗體(ScFv)基因庫，重鏈與輕鏈基因拼接產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-6泳道為組裝ScFv的PCR產(chǎn)物。
圖4為人源抗A型肉毒毒素抗體(HuAb-BNa)的重組構(gòu)建與表達(dá)鑒定圖譜，其中A.ScFv的擴(kuò)增M.DL2000；1.ScFv基因；B.ScFv表達(dá)的SDS-PAGE與WB鑒定M.蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1.表達(dá)株蛋白；2.空載體菌蛋白；3.表達(dá)株蛋白免疫印記C.dsFv表達(dá)的SDS-PAGEM.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1.純化前復(fù)性的dsFv蛋白；2.pET22b/BL21裂解液D.dsFv表達(dá)的NATIVE-PAGEM.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1.純化前復(fù)性的dsFv蛋白；2.初純化的dsFv蛋白圖5為HuAb-BNa的純化制備，其中A.純化ScFv的NATIVE-PAGEM.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1-2.純化的ScFv蛋白B.純化dsFv的NATIVE-PAGEM.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1.純化的dsFv蛋白。
圖6為HuAb-BNa的抗原結(jié)合曲線，其中A.HuAb-BNa梯度劑量ScFv的抗原結(jié)合曲線；B.HuAb-BNa梯度劑量dsFv的抗原結(jié)合曲線。
圖7為HuAb-BNa的抗原動力學(xué)結(jié)合Fit曲線(Biacore SPR技術(shù))，其中A.ScFv與A型肉毒毒素抗原動力學(xué)結(jié)合Fit曲線；B.dsFv與A型肉毒毒素抗原動力學(xué)結(jié)合Fit曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 人源抗A型肉毒毒素噬菌體免疫文庫的構(gòu)建與篩選一、材料1.菌株輔助噬菌體M13K07購自Biolab公司；宿主菌E.coli TG1為Pharmacia公司產(chǎn)品。
2.試劑NotI、SfiI等限制性內(nèi)切酶均為Promega公司產(chǎn)品；FicollPlus Pague和anti M13-HRP為Pharmacia產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒、RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑為TAKARA公司產(chǎn)品；BSA(牛血清白蛋白組分V)為GIBCO公司產(chǎn)品；DEPC、羧芐青霉素、四環(huán)素和硫酸卡那霉素購自SIGMA公司。
3.載體噬菌體載體pCANTAB-5E為Pharmacia公司產(chǎn)品。
二、方法結(jié)果1.A型肉毒毒素表位肽疫苗與志愿者免疫1.1 A型肉毒毒素表位肽合成Peptide A(BoNTaHc1157-1181，Pa)如序列表中序列1所示。(25-mer)Peptide B(BoNTaHc1230-1253，Pb)如序列表中序列2所示。(25-mer)免疫多肽Pa和Pb由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程所合成。
1.2表位肽疫苗的志愿者免疫先用多肽Pa和Pb對三名志愿者進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，然后每隔2周用合成多肽加強(qiáng)免疫兩次，免疫時(shí)輔以氫氧化鋁佐劑。
2.人源抗A型肉毒毒素噬菌體免疫文庫的構(gòu)建2.1人源噬菌體免疫文庫構(gòu)建的引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)的系列引物由上海博亞公司合成，如下IgG，IgM cDNA的合成引物GCHIFOR如序列表中序列3所示；MCHIFOR如序列表中序列4所示；LFOR如序列表中序列5所示人源重鏈可變區(qū)(VH)的擴(kuò)增引物HuVh1a-up如序列表中序列6所示；HuVh2a-up如序列表中序列7所示；HuVh3a-up如序列表中序列8所示；HuVh4a-up如序列表中序列9所示；HuVh5a-up如序列表中序列10所示；HuVh6a-up如序列表中序列11所示；HuVh-down如序列表中序列12或13所示人源輕鏈可變區(qū)(VK)的擴(kuò)增引物HuVκ1a-up如序列表中序列14所示；HuVκ2a-up如序列表中序列15所示；HuVκ3a-up如序列表中序列16所示；HuVκ4a-up如序列表中序列17所示；HuVκ5a-up如序列表中序列18所示；HuVκ6a-up如序列表中序列19所示；HuVκ-down如序列表中序列20所示人源ScFv組裝用LinkersVκ1-6/Vh1如序列表中序列21所示；Vκ1-6/Vh2如序列表中序列22所示；Vκ1-6/Vh3如序列表中序列23所示；Vκ1-6/Vh4如序列表中序列24所示；Vκ1-6/Vh5如序列表中序列25所示；Vκ1-6/Vh6如序列表中序列26所示；
含限制性酶切位點(diǎn)Sfi I/Not I的ScFv克隆擴(kuò)增引物HuVκ-up(Sfi I)如序列表中序列27所示；Up-p2如序列表中序列28所示；Up-P3如序列表中序列29所示；Up-p4如序列表中序列30所示；Up-p5如序列表中序列31所示；Up-p6如序列表中序列32所示；HuVh-down(Not I)如序列表中序列33所示。
2.2淋巴細(xì)胞的分離和細(xì)胞總RNA的提取收取抗凝血40ml，以20ml Ficoll離心分離乳白色淋巴細(xì)胞層，用PBS洗3次，2000rpm，5min，7.8×107細(xì)胞懸浮至終體積為1ml。參見試劑盒操作說明(Modified RNAgents Total RNA Isolation protocols)提取細(xì)胞總RNA 20μg，結(jié)果見附圖1。
2.3 cDNA的合成參見TAKARA試劑盒(BcaBESTTMRNA PCR KIT Ver1.1)操作說明。以純化的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，RT反應(yīng)條件為30℃ 10分鐘、42℃ 30分鐘、99℃ 5分鐘、5℃ 5分鐘。
2.4 PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)VH和Vκ基因以2μl cDNA為模板，PCR反應(yīng)系統(tǒng)中添加1.6mmol/L MgCl2，1mmol/L dNTP，加入2.5U的Tag酶，熱啟動，減少非特異性反應(yīng)。PCR條件為94℃ 30秒、57℃ 50秒、72℃ 60秒行25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增目的產(chǎn)物Vh1-6和Vκ1-6進(jìn)行純化，大小為300-400bp，結(jié)果見附圖2。
2.5 ScFv單鏈抗體基因的組裝(splicing overlap extension，SOE)分別測定VH鏈、Vκ鏈及Linker DNA相對的量，進(jìn)行等摩爾混合，通過PCR進(jìn)行組裝。首先無引物拼接，94℃ 5分鐘后，加入0.5μl(2.5U)Tag聚合酶，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)反應(yīng)，94℃ 1分鐘，54℃ 2分鐘，72℃ 3分鐘，最后72℃延伸10分鐘。然后進(jìn)行有引物擴(kuò)增，在ScFv的5’和3’端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Sfi I/Not I，進(jìn)行30輪PCR循環(huán)94℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，72℃ 2分鐘。最后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物大小約為750bp，結(jié)果見附圖3。
2.6重組噬菌體單鏈ScFv抗體文庫的構(gòu)建2.6.1 ScFv克隆入噬菌體載體pCANTAB-5E是Pharmacia公司商業(yè)化載體，按常規(guī)方法從帶有質(zhì)粒DNA的TG1菌中提取和純化載體DNA。用Sfi I和Not I雙酶切消化ScFv的PCR產(chǎn)物和載體pCANTAB-5E并分別純化。然后將ScFv單鏈基因通過連接反應(yīng)克隆入pCANTAB-5E載體。
2.6.2重組噬菌體單鏈ScFv抗體文庫的構(gòu)建將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化200μl事先制備的TG1電轉(zhuǎn)致敏菌，電轉(zhuǎn)設(shè)置為2500V，電擊30秒。電轉(zhuǎn)后加入5-10ml 2×YT-G(含2％葡萄糖)，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將重組轉(zhuǎn)化菌10μl涂含2％葡萄糖的2×YT-氨芐平皿，30℃培養(yǎng)過夜。通過計(jì)算菌落檢測庫容量為1.8×108。
3.人源抗A型肉毒毒素噬菌體陽性克隆的篩選3.1單鏈?zhǔn)删w抗體庫的富集篩選噬菌體文庫經(jīng)過M13K07超感染后，產(chǎn)生的重組噬菌?？舍尫庞诩?xì)菌培養(yǎng)上清中，用于噬菌體陽性克隆的篩選。噬菌體單鏈抗體庫的富集篩選選擇微量孔板篩選方法，將抗原BoNTa包被96孔板，然后進(jìn)行吸附-洗脫-富集的三輪篩選過程，第三輪的陽性克隆率為64.9％，結(jié)合活性(OD450)從第一輪的0.242-0.358，增加到第三輪的0.402-1.462。
3.2噬菌體陽性克隆的序列分析對挑選的噬菌體陽性克隆HuAb-BNa的ScFv進(jìn)行測序，獲得其編碼基因的核苷酸序列。與Kabat數(shù)據(jù)庫中已知基因序列比較，確定家族定位；推導(dǎo)獲得抗體基因編碼的氨基酸序列，如序列表中序列35所示。結(jié)果顯示，抗A型肉毒毒素抗體克隆HuAb-BNa的ScFv全長744bp，編碼248氨基酸，HuAb-BNa的核苷酸序列(ScFv，744bp；VH，369bp；VL，330bp)如序列表中序列34所示，其中TCTGGTGGCGGCGGTTCTGGCGGTGGCGGTTTTGGTGGCGGTGGT為linker序列；HuAb-BNa的氨基酸序列(ScFv，248Aa)如序列表中序列35所示。HuAb-BNa的VH基因長369bp，編碼123個(gè)氨基酸，屬于VH4免疫球蛋白家族；Vκ基因長330bp，編碼110個(gè)氨基酸，屬于K chain IV家族。Vκ基因與VH基因之間由編碼(SerGly4)3的DNA Linker正確連接構(gòu)成ScFv結(jié)構(gòu)?？贵w的VH與Vκ通過不同方式進(jìn)行結(jié)構(gòu)組合和重構(gòu)，可構(gòu)建獲得一系列功能抗體變構(gòu)體，如單鏈抗體(ScFv)、二硫鍵穩(wěn)定型抗體(dsFv)、單鏈二硫鍵穩(wěn)定型抗體(ScdsFv)、Fab抗體片段、多結(jié)構(gòu)域抗體或是全分子抗體等等。
實(shí)施例2 人源抗A型肉毒毒素基因工程抗體的重組制備一、材料1.菌株宿主菌E.coli HB2151為Pharmacia公司產(chǎn)品；E.coli BL21(DE3)為Novagen公司產(chǎn)品。
2.試劑E-tag親和層析純化介質(zhì)和Ni-NTA親和純化用Histrap HP預(yù)裝柱購自Amersham Pharmacia公司；PCR擴(kuò)增試劑為TAKARA公司產(chǎn)品；羧芐青霉素購自SIGMA公司；咪唑購自Amresco公司。
3.載體噬菌體重組表達(dá)載體pCANTAB-5E為Pharmacia公司產(chǎn)品；表達(dá)載體pET22b為Novagen公司產(chǎn)品。
二、方法結(jié)果1.ScFv的重組制備1.1 ScFv在大腸桿菌中的可溶表達(dá)將篩選獲得的陽性克隆的重組表達(dá)質(zhì)粒pCan-ScFv及空載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151，PCR鑒定挑選重組工程菌株，結(jié)果見附圖4-A。進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)工程菌在LB-Amp培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.5，加0.3mmol/L IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)可達(dá)到表達(dá)水平的平臺期，SDS-PAGE分析ScFv的表達(dá)產(chǎn)物分子量約為26KDa，附圖4-B顯示與預(yù)期結(jié)果一致。薄層掃描分析顯示，重組表達(dá)水平為15％。表達(dá)蛋白定位分析表明，表達(dá)蛋白以可溶形式存在于胞內(nèi)。
SDS-PAGE分析取1ml誘導(dǎo)后的菌液，12000rpm離心2min，棄上清，菌體加入100μl上樣緩沖液(10％蔗糖，2％SDS，50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10％巰基乙醇，0.002％溴酚藍(lán))懸起沉淀，沸水中煮5分鐘，12000rpm離心，取上清10μl電泳。對比空載體和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌的蛋白條帶，觀察有無外源基因表達(dá)。
1.2 ScFv的純化利用表達(dá)產(chǎn)物C末端的E-tag，進(jìn)行E-tag親和層析純化(純化介質(zhì)購自Amersham Pharmacia公司)，將收集的洗脫蛋白進(jìn)行NATIVE-PAGE分析，見附圖5-A，并進(jìn)行蛋白定量。
2.穩(wěn)定型改構(gòu)體dsFv的重組構(gòu)建與制備2.1 dsFv的重組構(gòu)建以ScFv基因?yàn)槟０澹捎瞄L引物設(shè)計(jì)，通過連續(xù)三步PCR擴(kuò)增，在ScFv中引入兩個(gè)突變氨基酸，即VH46Gly/Cys，VK99Gly/Cys。突變體基因分析表明，成功的在ScFv中定點(diǎn)引入了突變46GGG→TGC，99GGG→TGC，其它基因序列保持不變，突變基因可以正確編碼成兩個(gè)氨基酸Cys，dsFv的氨基酸序列如下VHm46G/C( 為突變位點(diǎn))如序列表中序列36所示，VKm99G/C( 為突變位點(diǎn))如序列表中序列37所示。
2.2 dsFv的重組制備2.2.1 dsFv的重組表達(dá)構(gòu)建的pET-VHm46G/C和pET-VKm99G/C重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)，表達(dá)蛋白占菌體蛋白的30％以上，以包含體形式存在。
2.2.2包含體的制備與溶解4000rpm、離心10分鐘，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體。加入相當(dāng)于原菌液1/10的蒸餾水，懸起沉淀，超聲破碎細(xì)胞，10,000rpm、離心10分鐘收集包含體沉淀。依次用2.5mol/L NaCl，0.05％Triton-X-100，4mol/L尿素洗滌沉淀得到包含體。將包含體溶解于變性液(pH8.0 0.50mmol/L Tris，6mol/LUrea，0.1mol/L DTT)中，4℃攪拌過夜。
2.3 dsFv的稀釋法復(fù)性與親和純化將處理好的變性蛋白VHm和VKm等比例混合裝入透析袋，在含不同濃度(6M，4M，2M，0M)尿素的PBS中梯度稀釋復(fù)性。逐漸除去變性蛋白中的尿素，使蛋白在此緩慢過程中，重新進(jìn)行蛋白折疊，復(fù)性為與天然抗體蛋白結(jié)構(gòu)相同或相似的可溶蛋白。復(fù)性蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE和NATIVE-PAGE分析在還原蛋白電泳中，復(fù)性產(chǎn)物因?yàn)樵僮冃?，二硫鍵打開，蛋白帶在13KDa，顯示的是抗體可變區(qū)產(chǎn)物；而在非還原蛋白電泳中，抗體可變區(qū)間可以保持了已形成的二硫鍵，復(fù)性產(chǎn)物蛋白帶在26KDa，見附圖4-C、D所示。
上樣buffer A(20mmol/L Na3PO4，0.5mol/L NaCl，40mmol/L imidazole，PH 7.4)平衡Ni-NTA純化柱，復(fù)性蛋白直接上樣，buffer B(20mmol/L Na3PO4，0.5mol/L NaCl，400mmol/L imidazole，PH 7.4)為洗脫液，收集洗脫峰，純化的蛋白用NATIVE-PAGE檢測，見附圖5-B所示。
實(shí)施例3 人源抗A型肉毒毒素基因工程抗體的生物學(xué)活性分析一、材料1.試劑anti His-HRP為Pierce公司產(chǎn)品；BSA(牛血清白蛋白組分V)為GIBCO公司產(chǎn)品；硫氰酸氨購自北京生化試劑公司；抗肉毒馬血清購自中國藥品生物制品鑒定所；親和力測定用試劑如HBS溶液、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)、N羥基琥珀亞胺(NHS)、乙醇胺均為Pharmacia公司產(chǎn)品。
2.材料CM5芯片為Pharmacia公司產(chǎn)品；Balb/C小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。
3.儀器Biacore3000為GE公司產(chǎn)品。
二、方法結(jié)果1.人源抗A型肉毒毒素基因工程抗體的抗原結(jié)合活性(ELISA)1.1 抗原結(jié)合活性用ELISA檢測驗(yàn)證了HuAb-BNa重組抗體只與A型毒素抗原特異結(jié)合，而與B型毒素抗原不結(jié)合。附圖6-A、B顯示梯度劑量的ScFv或dsFv蛋白質(zhì)與A型肉毒毒素抗原的結(jié)合曲線。隨抗體蛋白濃度升高，結(jié)合曲線接近平臺，抗原抗體的結(jié)合漸趨飽和。利用高親和力HuAb-BNa的敏感性結(jié)合特點(diǎn)可以應(yīng)用于A型肉毒毒素的型特異性檢測。
1.2 dsFv與ScFv的相對親和力比較抗體蛋白與抗原結(jié)合過程中加入不同濃度的硫氰酸氨，當(dāng)結(jié)合量縱軸數(shù)值下降為1/2時(shí)，即ELISA檢測的OD450下降為不加硫氰酸氨時(shí)的50％時(shí)，相應(yīng)的硫氰酸氨濃度表示為相對親和力。結(jié)果顯示，dsFv的相對親和力指數(shù)是1.5，而ScFv是1.1，說明重組制備的dsFv對抗原的親和力高于原ScFv母本抗體，其結(jié)合力更強(qiáng)，具有更好的應(yīng)用性質(zhì)。
1.3 Biacore檢測抗毒素的結(jié)合親和力Biacore(Biomolecular Interaction Analysis)的工作原理是基于表面等離子共振傳感(Surface Plasmon Resonance，SPR)技術(shù)來實(shí)時(shí)追蹤生物分子間的相互作用。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將抗原固定在傳感器芯片表面，再將待分析的抗體蛋白注射到傳感器芯片表面，可檢測抗體與抗原結(jié)合和解離的全過程，圖7-A、B就分別顯示了ScFv和dsFv的動態(tài)結(jié)合曲線或Fit曲線，測定的親和力反應(yīng)抗體的結(jié)合強(qiáng)度，是評價(jià)抗體應(yīng)用性的重要指標(biāo)。分析結(jié)果顯示，ScFv的親和力為9.69×10-8，而dsFv的親和力為1.13×10-8，提高了7.5倍，屬于高親和力抗體。
1.4 ELISA檢測ScFv的競爭抑制結(jié)合活性ELISA抗原包被96孔，用3％BSA-PBS(含0.02％NaN3)封閉，加入ScFv抗體蛋白，37℃溫育2小時(shí)，0.05％Tween20-PBS(PBST)和PBS分別洗板三次，加入抗A型肉毒毒素馬血清，37℃溫育1小時(shí)，0.05％Tween20-PBS(PBST)和PBS分別洗板三次，加HRP標(biāo)記的抗馬抗體，37℃溫育1h后，對TMB底物顯色(5mg TMB，0.05mol/L NaHCO3，0.5mmol/L MgCl2)，酶標(biāo)儀上讀取A450。
結(jié)果表明，重組抗毒素在體外具有良好的活性，可競爭抗肉毒馬血清與肉毒毒素的結(jié)合，見表1。
表1 ELISA檢測重組ScFv的競爭抑制活性(D450)

2.人源抗A型肉毒毒素基因工程抗體的中和活性(動物保護(hù)實(shí)驗(yàn))攻毒組10只，以最小致死劑量(MLD)A型肉毒毒素注射的小鼠，48小時(shí)內(nèi)全部死亡；治療組10只，以MLD A型肉毒毒素與100ug dsFv抗體4℃溫育過夜，腹腔注射動物，48小時(shí)內(nèi)小鼠存活5只，96小時(shí)內(nèi)存活2只，小鼠平均死亡時(shí)間長于攻毒組動物3倍多，可以有效中和肉毒毒素，明顯延遲毒素毒性的發(fā)生，對小鼠起到保護(hù)作用；對照組抗肉毒馬血清可以完全中和毒素活性，小鼠全部存活；藥物對照組5只，每只注射100ug dsFv抗體，動物一切正常，沒有死亡，說明注射劑量重組抗體蛋白無毒性，結(jié)果見附表2。
表2.dsFv對BoNTa的體內(nèi)中和活性

序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體及其制備方法與用途<130>
<160>37<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>PRT<213>
<400>1Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn1 5 10 15Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr20 25<210>2<211>25<212>PRT<213>
<400>2Gly Ile Thr Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn1 5 10 15Asp Ile Gly Phe Ile Gly Phe His Gln20 25<210>3<211>24<212>DNA<213>
<400>3gtccaccttg gtgttgctgg gctt 24<210>4<211>24<212>DNA<213>
<400>4tggaagaggc acgttctttt cttt 24<210>5<211>24<212>DNA<213>
<400>5agactctccc ctgttgaagc tctt 24
<210>6<211>23<212>DNA<213>
<400>6caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23<210>7<211>23<212>DNA<213>
<400>7caggtcaact taagggagtc tgg 23<210>8<211>23<212>DNA<213>
<400>8gaggtgcagc tggtggagtc tgg 23<210>9<211>23<212>DNA<213>
<400>9caggtgcagc tgcaggagtc ggg 23<210>10<211>23<212>DNA<213>
<400>10gaggtgcagc tgttgcagtc tgg 23<210>11<211>23<212>DNA<213>
<400>11caggtacagc tgcagcagtc agg 23<210>12<211>30<212>DNA<213>
<400>12cttggtggag gctgaggaga cggtgaccag 30<210>13<211>30
<212>DNA<213>
<400>13cttggtggaa gctgaagaga cggtgaccag 30<210>14<211>23<212>DNA<213>
<400>14gacatccaga tgacccagtc tcc 23<210>15<211>23<212>DNA<213>
<400>15gatgttgtga tgactcagtc tcc 23<210>16<211>23<212>DNA<213>
<400>16gaaattgtgt tgacgcagtc tcc 23<210>17<211>23<212>DNA<213>
<400>17gacatcgtga tgacccagtc tcc 23<210>18<211>23<212>DNA<213>
<400>18gaaacgacac tcacgcagtc tcc 23<210>19<211>23<212>DNA<213>
<400>19gaaattgtgc tgactcagtc tcc 23<210>20<211>28<212>DNA<213>
<400>20
ggtgcagcca cagtacgtta gatctcca 28<210>21<211>94<212>DNA<213>
<400>21tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60gtggcggtgg tcaggtgcag ctggtgcagt ctgg 94<210>22<211>94<212>DNA<213>
<400>22tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60gtggcggtgg tcaggtcaac ttaagggagt ctgg 94<210>23<211>94<212>DNA<213>
<400>23tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60gtggcggtgg tgaggtgcag ctggtggagt ctgg 94<210>24<211>94<212>DNA<213>
<400>24tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60gtggcggtgg tcaggtgcag ctgcaggagt cggg 94<210>25<211>94<212>DNA<213>
<400>25tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60gtggcggtgg tgaggtgcag ctgttgcagt ctgg 94<210>26<211>94<212>DNA<213>
<400>26tggagatcaa acgtactgtg gctgcatctg gtggcggcgg ttctggcggt ggcggttctg 60gtggcggtgg tcaggtacag ctgcagcagt cagg 94
<210>27<211>56<212>DNA<213>
<400>27gtcctcgcaa ctgcggceca gccggccatg gccgacatcc agatgaccca gtctcc 56<210>28<211>56<212>DNA<213>
<400>28gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgatgttg tgatgactca gtctcc 56<210>29<211>56<212>DNA<213>
<400>29gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaaattg tgttgacgca gtctcc 56<210>30<211>56<212>DNA<213>
<400>30gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgacatcg tgatgaccca gtctcc 56<210>31<211>56<212>DNA<213>
<400>31gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaaacga cactcacgca gtctcc 56<210>32<211>56<212>DNA<213>
<400>32gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaaattg tgctgactca gtctcc 56<210>33<211>56<212>DNA<213>
<400>33gagtcattct cgacttgcgg ccgccttggt ggagagctga gagagacggt gaccag 56<210>34<211>744
<212>DNA<213>
<400>34caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtagtt actactgggg ctggatccgc 120cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240tccctgatgc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgagacaa 300ggtagtagtg gttattacca gaactggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360gtctcctcat ctggtggcgg cggttctggc ggtggcggtt ttggtggcgg tggtgatgtt 420gtgatgactc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 480tgcagggcca gtcagagtgt tagcagcagc tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 540caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg 600ttcagtggca gcgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagacc ggagcctgaa 660gattttgcag tgtactactg tcagcaaccg gggttcactt tcggccctgg gaccaaagtg 720gagatcaaac gtactgtggc tgca 744<210>35<211>248<212>PRT<213>
<400>35Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Gln Gly Ser Ser Gly Tyr Tyr Gln Asn Trp Phe Asp Pro100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Val Val Met Thr Gln130 135 140Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser145 150 155 160Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln165 170 175Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser180 185 190Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr195 200 205Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Pro Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val210 215 220Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Gly Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val225 230 235 240Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala245<210>36<211>123<212>PRT<213>
<400>36Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu35 40 45Trp Ile Cys Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Met Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Gln Gly Ser Ser Gly Tyr Tyr Gln Asn Trp Phe Asp Pro
100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>37<211>110<212>PRT<213>
<400>37Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Pro Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Gly Phe Thr Phe85 90 95Gly Pro Cys Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110
權(quán)利要求
1.人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體，其特征在于具有如序列表中序列35所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體，其特征在于其編碼基因具有如序列表中序列34所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體的改構(gòu)體，其特征在于其中重鏈的氨基酸序列如序列表中序列36所示，輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列37所示。
4.權(quán)利要求1、2或3所述人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體或其改構(gòu)體的制備方法，包括如下步驟(1)制備人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素編碼基因；(2)將該基因克隆入原核或真核表達(dá)載體，制備重組表達(dá)載體；(3)將制備的重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中制備人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素編碼基因采用化學(xué)合成或基因工程方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中原核表達(dá)載體為pCANTAB-5E、pET、真核表達(dá)載體為pPCI9K。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中原核細(xì)胞為大腸桿菌HB2151、BL21(DE3)、真核細(xì)胞為酵母GS115、哺乳動物細(xì)胞為CHO。
8.權(quán)利要求1、2或3所述人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體或改構(gòu)體在制備肉毒毒素中毒急救治療藥劑中的用途。
9.權(quán)利要求1、2或3所述人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素基因工程抗體或改構(gòu)體在制備A型肉毒神經(jīng)毒素檢測試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了人源抗A型肉毒神經(jīng)毒素單克隆抗體，該抗體具有序列表中序列35所示的氨基酸序列，本發(fā)明還公開了上述抗體的改構(gòu)體，其重鏈的氨基酸序列如序列表中序列36所示，輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列37所示。上述抗體通過以下方法制備首先通過分子生物學(xué)或其它方法制備具有特異中和活性、高親和力的HuAb－BNa基因，在原核細(xì)胞如大腸桿菌等、真核細(xì)胞如酵母菌等、哺乳動物細(xì)胞如CHO中表達(dá)，經(jīng)過純化獲得均質(zhì)的HuAb－BNa蛋白。本發(fā)明制備的HuAb－BNa，具有特異中和活性強(qiáng)、親和力高、無毒副作用的特點(diǎn)，適用于A型肉毒神經(jīng)毒素中毒的急救治療，同時(shí)適用于A型肉毒神經(jīng)毒素的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P39/02GK101045751SQ200710064229
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者王慧, 蔭俊, 史晶, 侯曉軍, 包士中, 王忠澤, 蔡昆 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所