專利名稱：：西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚甲、乙素及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一類從中國南海豆莢軟珊瑚(丄o6op/^wwsp.)中分離得到的新西松烷內(nèi)酯型二碎化合物豆莢軟珊瑚甲、乙素(lobophilidesA，B)及其制備方法和用途。該類化合物對多種腫瘤細(xì)胞株具有強烈的抑制作用，可作為一類研制新的抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，也可作為治療各種臨床常見多發(fā)癌癥的藥物。
背景技術(shù)：
：珊瑚系低等腔腸門動物，該類海洋生物全球有6100多種，其中中國有496種。軟珊瑚是指腔腸門珊瑚綱八放珊瑚亞綱軟珊瑚亞目動物。軟珊瑚亞目又分6個科，即尸ara/cyo""cbe，v4/qyow7fibe,軟珊瑚中富含結(jié)構(gòu)新穎次生代謝產(chǎn)物，其化合物的結(jié)構(gòu)類型主要包括二萜、倍半萜、多羥基甾醇和前列腺素等。豆莢軟珊瑚屬于」/c""/Wfle科，是最早受到關(guān)注也是研究最多的軟珊瑚之一，研究范圍涉及20多個品種。其化學(xué)成分報道最多的是西松烷型和洛貝型二萜。在開發(fā)利用我國的海洋生物資源，從中尋找具有生物活性及藥用前景的海洋天然產(chǎn)物的過程中，我們發(fā)現(xiàn)，中國南海豆莢軟珊瑚的乙酸乙酯粗提物在體外抗腫瘤篩選實驗中對A549人肺腺癌細(xì)胞主株顯示良好的抑制活性。進(jìn)一步的生物活性跟蹤研究，導(dǎo)致了新西松烷內(nèi)酯型二碎化合物豆莢軟珊瑚甲、乙素的發(fā)現(xiàn)。文獻(xiàn)檢索表明，豆莢軟珊瑚曱、乙素是高度氧化、結(jié)構(gòu)新穎的西松烷內(nèi)酯型二辟化合物。體外抗腫瘤生物活性篩選實驗表明，豆莢軟珊瑚曱素對八549人肺腺癌細(xì)胞抹顯示明顯的細(xì)胞毒性；豆莢軟珊瑚乙素則對A549人肺腺癌細(xì)胞抹及P388小鼠白血病細(xì)胞抹均有顯著的抑制作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從中國南海豆莢軟珊瑚中提取分離得到的兩個新的西松烷內(nèi)酯型二碎化合物豆莢軟珊瑚曱、乙素。本發(fā)明的另一目的是提供上述西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚曱、乙素的制備方法。本發(fā)明的還一目的是提供上述西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚曱、乙素在制備治療癌癥和/或肺瘤的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚曱、乙素分別具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式這2個化合物均系首次從中國三亞陵水產(chǎn)豆莢軟珊瑚中提取得到,故分別命名為豆莢軟珊瑚曱、乙素。豆莢軟珊瑚甲素(lobophilideA)豆莢軟珊瑚乙素(lobophilideB)本發(fā)明提供了從中國南海豆莢軟珊瑚中提取分離化合物豆莢軟珊瑚曱、乙素的方法，步驟如下1)提取將中國南海豆莢軟珊瑚用酮溶劑提取，所得提取液濃縮后得粗浸膏；將該粗浸膏加入NaCl溶液中，混懸均勻后用乙醚萃取，所得萃取液濃縮后得到乙醚浸膏；2)分離步驟1)中得到的乙醚浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚/乙醚梯度洗脫；其中，石油醚/乙醚體積比50:50洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗碼純化，得到豆莢軟珊瑚乙素；石油醚/乙醚體積比20:80洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫純化，得到豆莢軟珊瑚曱素。在步驟1)提取中，所述的酮溶劑優(yōu)選為丙酮，所述的NaCl溶液優(yōu)選為0.71.5NNaCl溶液；并且所述酮溶劑提取是采用超聲波提取；所述步驟2)中，所述的石油醚/乙醚梯度洗脫是以石油醚/乙醚體積比100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90—0:100進(jìn)行梯度洗脫；所述步驟2)中石油醚/乙醚體積比50:50洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑為體積比1:8的石油醚/乙醚，將Rf值在0.250.35處的洗脫液合并、減壓濃縮，得到豆莢軟珊瑚乙素；所述步驟2)中石油醚/乙醚20:80洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑為體積比7:3的石油醚/丙酮，將Rf值在0.45-0.55處的洗脫液合并、減壓濃縮，得到豆莢軟珊瑚曱素。本發(fā)明對西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚曱、乙素進(jìn)行了抗腫瘤活性測試，表明這些化合物具有明顯的抗腫瘤作用。可用于制備治療癌癥和/或肺瘤的藥物。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限此。'H-NMR用VarianInova600型儀測定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Q-TOFMicroLC-MS-MS型質(zhì)譜儀測定；所使用的硅膠，為青島海洋化工廠生產(chǎn)；各種溶劑均由國藥集團(tuán)試劑有限公司生產(chǎn)，均為分析純。如無特殊說明，以下實施例中涉及到的液/液之間比值均為體積比。實施例l:西松烷內(nèi)酯型二辟化合物豆莢軟珊瑚甲、乙素的制備(1)提取中國南海豆莢軟珊瑚干重502g,用丙酮1000ml反復(fù)超聲提取3次，提取液合并后減壓濃縮，所得粗浸膏混懸于500mllNNaCl溶液中，以乙醚500ml反復(fù)萃取該混懸液3次，所得萃取液合并后減壓濃縮得到乙醚浸膏2.5g。(2)分離乙醚浸膏2.5g經(jīng)200-300目硅膠柱層析，以石油醚/乙醚100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90—0:100梯度洗脫，每個梯度用量1000ml;其中，石油醚/乙醚50:50洗脫液濃縮物得146.3mg，該部分經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑為石油醚/乙醚1:8,將Rf值在0.25-0.35處的洗脫液合并、減壓濃縮即得到豆莢軟珊瑚乙素41.3mg;石油醚/乙醚20:80洗脫液濃縮物得520.0mg，該部分經(jīng)SephadexLH-20凝月交柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮7:3,將Rf值在0.45~0.55處的洗脫液合并、減壓濃縮即得到豆莢軟珊瑚曱素136.8mg。豆莢軟珊瑚曱素的理化性狀如下白色固體，光學(xué)活性問022+33.8°(c,0.535，CHC13);IR譜中出現(xiàn)3411(-OH),1735(a,P-不飽和酮)，1270,1020(a,p-不飽和羧酸酯)cm"等吸收峰；正離子模式電噴霧質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z355.2[M+Na]+和687.4[2M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質(zhì)譜顯示其分子式為C2()H2804{w/z355.1883[M+Na]+,A=-0.2mmu}。}H與"CNMR數(shù)據(jù)見表1。同時，通過測定二維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)、H-C相關(guān)譜(HMQC)、H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)以及H-H核空間偶極相關(guān)譜(ROESY),確定了所有碳原子和氫原子的信號歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。豆莢軟珊瑚乙素的理化性狀如下無色油狀物，光學(xué)活性[a]D22+66.1(c,0.324,CHC13);IR譜中出現(xiàn)3479(-OH)，1732(a,(3-不飽和酮),1270,1027(a，|3-不飽和羧酸酯)等吸收峰；正離子模式電噴霧質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z339.2[M+Na]+和655.1[2M+Na]+,高分辨正離子模式電噴霧質(zhì)譜顯示其分子式為C2()H2803{w/z339.1955[M+Na]+,△=+1.9mmu}。與13CNMR數(shù)據(jù)見表2。同時，通過測定二維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)、H-C相關(guān)譜(HMQC)、H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)以及H-H核空間偶極相關(guān)譜(ROESY),確定了所有碳原子和氫原子的信號歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。表1.豆莢軟珊瑚甲素的核磁共振波譜數(shù)據(jù)表a'b<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注aVarianInova600MHz;溶劑CDC13，S化學(xué)位移單位ppm，'H-NMR和"C-NMR分別以溶劑中殘存的氯仿(SH7.26ppm)和氘代氯仿內(nèi)標(biāo)(5c77.0);b核磁共振信號的歸屬是在HMQC、HMBC等二維譜基礎(chǔ)上完成的；e由DEPT譜完成信號歸屬。表2.豆莢軟珊瑚乙素的核磁共振波譜數(shù)據(jù)表a'b<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>94.93，m124.0,d1910a2,31,m24.5,tiop2.28,mlla2.35，m34.6,t9，10,12,13,20UP2.23,m9,10,12,13,2012140.1,s135.22，dd，8.2，7.7124.8，d1,11,14,2014a2.33,m33.5,t14(32.29,m15139.3,s16a5.68,d,2.6122.8,t1，14,1716b6,27,d,2.61,14，15,1717170.2，s181.66,s17.5,q3,4，5,6191.61,s16,8,q7,8,920a4.11,s60.0,t11，12,1320b4.11,s11，12，13注aVarianInova600MHz;溶劑CDC13,5化學(xué)位移單位ppm,'H-NMR和^C-NMR分別以溶劑中殘存的氯仿(5H7.26ppm)和氖代氯仿內(nèi)標(biāo)(5c77.0);b核磁共振信號的歸屬是在HMQC、HMBC等二維譜基礎(chǔ)上完成的；e由DEPT譜完成信號歸屬。試驗實施例1西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚曱、乙素的抗胂瘤活性測試對照組OD值一治療組OD值腫瘤抑制率=-X100%對照組OD值測試原理MTT法活細(xì)胞的線粒體中存在與NADP相關(guān)的脫氬酶，可將黃色的MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)還原為不溶性的藍(lán)紫色曱臢(Formazan)，死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。用三聯(lián)液溶解曱臢后可用酶標(biāo)儀在570nm處檢測光密度值。光密度值與活細(xì)胞數(shù)成正比。實驗方法MTT法按不同腫瘤生成速率，將一定數(shù)量處于對數(shù)生長期的人肺腺癌細(xì)胞抹A-549,小鼠白血病細(xì)胞抹P-38890iul/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24小時后加入受試藥液(即豆莢軟珊瑚曱素、豆莢軟珊瑚乙素的DMSO溶液)lOiul/孔，對每個細(xì)胞抹，每個濃度均為三個復(fù)孔，對照的新鮮培養(yǎng)基10(il/孔。腫瘤細(xì)胞在37。C、5%C02條件下培養(yǎng)48小時后，加無血清培養(yǎng)基新鮮配制的5mg/mlMTT液20pl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，加入三聯(lián)液(10。/。SDS-5。/。異丁醇-0,01mol/LHCl)50jul/孔，于(302培養(yǎng)箱中過夜。然后在570nm用酶標(biāo)儀測定OD值。實驗結(jié)果如下10—5mol/L時對腫瘤細(xì)胞的抑制率西松烷內(nèi)酯型二萜化-A-549P-388合物豆莢軟珊瑚甲素^豆莢軟珊瑚乙素95.7100總結(jié)經(jīng)體外抗腫瘤藥理活性研究表明，西松烷內(nèi)酯型二薛化合物豆莢軟珊瑚曱素對處于對數(shù)生長期的人肺腺癌細(xì)胞林A-549有顯著的抑制作用，西松烷內(nèi)酯型二辟化合物豆莢軟珊瑚乙素對處于對數(shù)生長期的人肺腺癌細(xì)胞抹A-549和小鼠白血病細(xì)胞抹P-388有顯著的抑制作用。因此，西松烷內(nèi)酯型二碎化合物豆莢軟珊瑚曱素、乙素可用于制備治療癌癥和/或胂瘤的藥物。權(quán)利要求1.一類結(jié)構(gòu)式如下的西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚甲素或乙素id="icf0001"file="A2007100380470002C1.gif"wi="101"he="28"top="50"left="46"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>豆莢軟珊瑚甲素豆莢軟珊瑚乙素。2、一種權(quán)利要求1所述的西松烷內(nèi)酯型二碎化合物豆莢軟珊瑚曱素或乙素的制備方法，其特征是，該方法包括以下步驟1)提取將中國南海豆莢軟珊瑚用酮溶劑提取，所得提取液濃縮后得粗浸膏；將該粗浸膏加入NaCl溶液中，混懸均勻后用乙醚萃取，所得萃取液濃縮后得到乙醚浸膏；2)分離步驟1)中得到的乙醚浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚/乙醚梯度洗脫；其中，石油醚/乙醚體積比50:50洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫純化，得到豆莢軟珊瑚乙素；石油醚/乙醚體積比20:80洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫純化，得到豆莢軟珊瑚曱素。3、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟l)中，所述的酮溶劑為丙酮。4、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟1)中，所述的NaCl溶液為0.7-1.5NNaCl溶液。豆莢軟珊瑚甲素豆莢軟珊瑚乙素5、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟l)中，所述的酮溶劑提取是采用超聲波提取。6、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟2)中，所述的石油醚/乙醚梯度洗脫是以石油醚/乙醚體積比100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90—0:100進(jìn)行梯度洗脫。7、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟2)中石油醚/乙醚體積比50:50洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝月交柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑為體積比1:8的石油醚/乙醚，將Rf值在0.25~0.35處的洗脫液合并、減壓濃縮，得到豆莢軟珊瑚乙素；所述步驟2)中石油醚/乙醚20:80洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層析4企測，展開劑為體積比7:3的石油醚/丙酮，將Rf值在0.45-0.55處的洗脫液合并、減壓濃縮，得到豆莢軟珊瑚曱素。8、權(quán)利要求1所述的西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚曱素或乙素在制備治療癌癥和/或腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一類從海洋軟珊瑚中提取、分離獲得的結(jié)構(gòu)式的西松烷內(nèi)酯型二萜化合物豆莢軟珊瑚甲、乙素及其制備方法和用途。經(jīng)多次體外抗腫瘤活性實驗表明，該類化合物具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞活性，可望在制備治療癌癥/腫瘤的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明還可為研制新的治療各種常見多發(fā)癌癥藥物提供先導(dǎo)化合物，對開發(fā)利用中國的海洋生物資源具有重要意義。文檔編號A61K31/365GK101265248SQ20071003804公開日2008年9月17日申請日期2007年3月14日優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日發(fā)明者健丁,周秀紅,文張,林莉萍,郭躍偉申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所