專利名稱：還原型輔酶q水溶液的穩(wěn)定組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以還原型輔酶Q為組成成分的溶液，特別涉及為了穩(wěn)定維持還原型輔酶Q的氧化而添加抗氧化劑和/或螯合劑的水溶液。
背景技術(shù)：
輔酶Q是廣泛分布于細(xì)菌至哺乳動(dòng)物有機(jī)體的必需成分，眾所周知，輔酶Q在生物有機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞中作為線粒體電子信息傳遞系統(tǒng)的組成成分。已知輔酶Q除了在線粒體內(nèi)循環(huán)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，在電子傳遞系統(tǒng)中作為傳遞成分而起的作用外，還原型輔酶Q還具有抗氧化作用。在人體內(nèi)，輔酶Q的側(cè)鏈具有10個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)，其主要成分為輔酶Q10，在生物體內(nèi)，通常以40～90％左右的還原型形式存在。作為輔酶Q的生理作用，包括由線粒體活化作用而產(chǎn)生的能量生產(chǎn)的活化、心臟機(jī)能的活化、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性作用、由抗氧化作用而起到保護(hù)細(xì)胞的作用等等。
已知輔酶Q在很多用途上使用，例如，從對(duì)心臟的效果來看，氧化型輔酶Q10用作充血性心力衰竭的藥物。除了醫(yī)藥用途之外，它還用作經(jīng)口服的維生素類、營(yíng)養(yǎng)制劑、營(yíng)養(yǎng)輔助劑。但是，輔酶Q脂溶性強(qiáng)，難溶于水，所以，在實(shí)際應(yīng)用中，僅知道它作為口服劑和皮膚用劑。
近年來，有很多報(bào)道由于血液中的氧化脅迫增加而導(dǎo)致疾病惡化。其中，具有代表性的例子有，動(dòng)脈硬化、糖尿病并發(fā)癥等。在這些疾病中，由于血液中存在的各種氧化脅迫而導(dǎo)致脂質(zhì)變性等，由此引起疾病的發(fā)生或惡化。為減少這種氧化脅迫的影響，通過給與抗氧化劑藥物而活化抗氧化能力是行之有效的。維生素E被認(rèn)為是抑制脂質(zhì)過氧化最有效的脂溶性抗氧化物質(zhì)的典型化合物，它廣泛用于疾病的預(yù)防等等。
近年來，為使維生素E能充分地發(fā)揮抗氧化活性，有人提出了還原型輔酶Q10與維生素E共存的重要性(Bowry等，1993，J.American ChemicalSociety，115，6029-6044)，輔酶Q作為脂溶性抗氧化物質(zhì)的重要性正逐漸地被明確。
還原型輔酶Q本身也具有很強(qiáng)的抗氧化作用，因此，通過溶化可把足夠量的還原型輔酶Q輸入到血液中，就有可能有效地提高血液中的抗氧化活性。所述提高血液中的抗氧化活性被認(rèn)為是針對(duì)缺血性再回流時(shí)的血管障礙、防止動(dòng)脈硬化的再次狹窄、防止腦梗塞后的血管障礙、預(yù)防動(dòng)脈硬化、預(yù)防糖尿病并發(fā)癥等活性酶種而顯示很多惡化的疾病，它具有廣泛的實(shí)用性。還有，新的補(bǔ)充形式是通過點(diǎn)滴輸入到體內(nèi)，由此可以對(duì)無法通過口服攝取的重癥患者或腦疾病患者提供輔酶Q。因此，可以想像使輔酶Q溶液化會(huì)帶來很多好處。
已知輔酶Q有氧化型和還原型，關(guān)于使氧化型輔酶Q10(泛癸利酮或泛醌)溶液化的方法，已經(jīng)有很多的研究。
所述氧化型輔酶Q10的溶液化方法，已經(jīng)報(bào)道了很多方法，如用脂質(zhì)體包覆、用表面活性劑或油脂的懸濁等(特開平5-186340號(hào)公報(bào)、特開平7-69874號(hào)公報(bào)、特表2000-510841號(hào)公報(bào))，但是，把它們實(shí)際應(yīng)用的例子卻很少。其理由之一就是，為了使氧化型輔酶Q10顯示抗氧化活性，必須由還原酶等轉(zhuǎn)化為還原型，然而，在血液中不存在還原酶，所以通過注射等進(jìn)行給與，無法期待對(duì)血液中的氧化脅迫顯示抗氧化活性。
另一方面，還原型輔酶Q10本身具有抗氧化活性，對(duì)上述之類疾病的有用性可以報(bào)有很大的希望，但是，其缺點(diǎn)為易氧化不穩(wěn)定，無法實(shí)際應(yīng)用。有研究報(bào)告說，為了研究氧化還原酶等而制成還原型輔酶Q10的脂質(zhì)體包覆物(Kishi等，1999，BioFactors，10，131-138)，其所用的脂質(zhì)體的例子是每次實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)制備，它如何能夠穩(wěn)定地維持成為還原型輔酶Q的溶液方法，至今還完全不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種還原型輔酶Q氧化穩(wěn)定性改進(jìn)的水溶液。
本發(fā)明人為了解決上述技術(shù)問題，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)有利于提高還原型輔酶Q穩(wěn)定性的水溶液的組成，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及的水溶液是一種含有還原型輔酶Q的水溶液，其特征在于，在該水溶液中含有抗氧化劑和/或螯合劑。
本發(fā)明的水溶液是一種含有用下式(1)表示的還原型輔酶Q的水溶液，其特征在于，在該水溶液中含有抗氧化劑和/或螯合劑 (其中，n表示1～12的整數(shù))。
輔酶Q包括由下式(1)和(2)表示的 (其中，n表示1～12的整數(shù))，和 (其中，n表示1～12的整數(shù))。式(1)為還原型輔酶Q，式(2)為氧化型輔酶Q。
在本發(fā)明中，輔酶Q如上述式(1)和式(2)表示的那樣，側(cè)鏈的重復(fù)單元(式中n)，可以使用1～12，但是側(cè)鏈的重復(fù)單元為10，也就是說，特別優(yōu)選使用輔酶Q10。
在本發(fā)明中，還原型輔酶Q也可以含有氧化型輔酶Q。此時(shí)，在輔酶Q的總量中，還原型輔酶Q優(yōu)選為20重量％或20重量％以上，更優(yōu)選含有40重量％或40重量％以上，最優(yōu)選含有60重量％或60重量％以上。
作為獲得上述還原型輔酶Q的方法沒有特別的限定，可采用公知方法，如合成、發(fā)酵、從天然物質(zhì)中提取等得到輔酶Q后，通過層析法把洗提液中的還原型輔酶Q的組分加以濃縮的方法。此時(shí)，根據(jù)需要，對(duì)所述輔酶Q添加一般性的還原劑如氫硼化鈉、亞二硫代酸鈉(連二亞硫酸鈉)等，也可以按照常規(guī)方法，把上述輔酶Q中所含的氧化型輔酶Q進(jìn)行還原，作為還原型輔酶Q后，再用層析法進(jìn)行濃縮。還可以通過使上述還原劑作用于已有的高純度輔酶Q而得到。
作為獲得本發(fā)明水溶液的方法沒有特別的限定，例如(1)把還原型輔酶Q和適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┖?或螯合劑用適當(dāng)?shù)幕鶆┘右员桓?，進(jìn)行脂質(zhì)體化而得到?；蛘?2)在含有還原型輔酶Q的脂質(zhì)體中添加適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┖?或螯合劑的水溶液而得到?；蛘?3)把還原型輔酶Q和適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┘?或螯合劑用適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┘右钥扇芑蛉榛玫健?br> 本發(fā)明的水溶液只要含有還原型輔酶Q和抗氧化劑和/或螯合劑即可，而沒有特別限制。如上述(1)，(2)用脂質(zhì)體制備時(shí)，脂質(zhì)體分散在水溶液中成為水溶液，又如上述(3)使用表面活性劑制備時(shí)，還原型輔酶Q成為可溶化或乳化的水溶液。
對(duì)本發(fā)明中使用的抗氧化劑未作特別限制，可以舉出，檸檬酸、檸檬酸衍生物、維生素C、維生素C衍生物、普羅布丁、番茄紅素、維生素A、類胡蘿卜素類、維生素B、維生素B衍生物、黃酮類、多酚類、谷胱甘肽、硒、硫代硫酸鈉、維生素E、維生素E衍生物、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化酶以及它們的混合物等。
其中，優(yōu)選檸檬酸、檸檬酸衍生物、維生素C、維生素C衍生物、谷胱甘肽、硫代硫酸鈉，更優(yōu)選維生素C、檸檬酸等，最優(yōu)選維生素C。
另外，對(duì)所述螯合劑未作特定限制，例如，乙二胺四乙酸及其鹽、乙二胺二乙酸及其鹽、肟基二乙酸及其鹽、羥乙基乙二胺四乙酸及其鹽、二亞乙基三胺五乙酸及其鹽、氮基三乙酸及其鹽、三亞乙基四胺六乙酸及其鹽、二羧甲基谷氨酸四鈉鹽、二羥甲基甘氨酸、1，3-丙二胺四乙酸及其鹽、1，3-二氨基-2-羥基丙烷四乙酸及其鹽、葡糖酸鈉鹽、羥基亞乙基二膦酸(ヒドロキシエチルイデンジホスホン酸)、亞烷基膦酸、亞磷酸基丁烷三羧酸以及它們的混合物等。
其中，優(yōu)選乙二胺四乙酸及其鹽、羥乙基乙二胺四乙酸及其鹽、二亞乙基三胺五乙酸及其鹽、葡糖酸鈉鹽、羥基亞乙基二膦酸，更優(yōu)選乙二胺四乙酸及其鹽。
當(dāng)在本發(fā)明水溶液中使用脂質(zhì)體時(shí)，作為脂質(zhì)體中所用的基本制劑，例如有純化大豆卵磷脂、磷脂酰膽堿等的磷脂質(zhì)，或二半乳糖苷甘油酯等的糖脂質(zhì)等，從對(duì)還原型輔酶Q的氧化的穩(wěn)定性考慮，優(yōu)選純化大豆卵磷脂、磷脂酰膽堿。
當(dāng)在本發(fā)明水溶液中使用表面活性劑時(shí)，作為表面活性劑沒有特別的限制，例如有，羧酸鹽型陰離子類表面活性劑等，從還原型輔酶Q的氧化穩(wěn)定性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選聚山梨酸酯80、聚氧化乙烯硬化蓖麻油等。
在本發(fā)明水溶液中，還原型輔酶Q的濃度沒有特別的限制，從氧化穩(wěn)定性、在水溶液中的溶解性等方面考慮，還原型輔酶Q對(duì)水溶液的體積的重量比例，優(yōu)選0.001w/v％至5w/v％，更優(yōu)選0.05w/v％至1w/v％。另外，對(duì)抗氧化劑的濃度也未作特別的限制，但從其有效性觀點(diǎn)考慮，以水溶液的總量計(jì)，優(yōu)選0.01w/v％至50w/v％，更優(yōu)選0.05w/v％至10w/v％。還有，螯合劑的濃度也未作特別的限制，但從其有效性觀點(diǎn)考慮，以水溶液的總量計(jì)，優(yōu)選0.001w/v％至10w/v％，更優(yōu)選0.005w/v％至5w/v％。所述抗氧化劑以及螯合劑的各自濃度，單獨(dú)使用或并用時(shí)也適用。
對(duì)本發(fā)明的水溶液的pH未作特定的限制，因其用途的不同而不同，但從輔酶Q穩(wěn)定性的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選pH為1.0至8.0，更優(yōu)選pH為2.0至7.6。
如上所述，在制備的水溶液中，可根據(jù)常規(guī)方法適當(dāng)?shù)靥砑踊旌纤巹W(xué)所允許的其他制劑原材料。對(duì)所述允許添加的制劑原材料未作特別的限制，例如乳化劑、緊張化劑、緩沖劑、助溶劑、溶解助劑、防臭劑、防腐劑、穩(wěn)定劑等。還有，可以根據(jù)用途，加入其他有效成分，例如藥劑、營(yíng)養(yǎng)輔助成分等。
所述本發(fā)明水溶液組合物的保存方法，未作特別的限制，可以進(jìn)行低溫保存(例如，-80℃至4℃)、密閉容器厭氧保存、遮光保存等。
如上制備的本發(fā)明水溶液，可以對(duì)氧化更加穩(wěn)定的保持還原型輔酶Q。
含有本發(fā)明還原型輔酶Q的水溶液可以廣泛地用于醫(yī)療、化妝、食品、園藝、奶酪畜牧業(yè)等。其具體形態(tài)是，注射劑、輸液、液劑、點(diǎn)眼劑、內(nèi)服用液劑、洗滌劑、生發(fā)香水、化妝用奶液、噴霧液、噴霧劑、飲料液、液體肥料、保存溶液等，作為醫(yī)療用，還可以用作器官移植時(shí)的保存溶液等。另外，還可作為動(dòng)物飼料等。作為抗氧化溶液，還可用于肉、魚等生鮮食品的保存。
具體實(shí)施例方式
下面，將以實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1用脂質(zhì)體包覆的抗氧化劑賦予還原型輔酶Q10的氧化穩(wěn)定性為了評(píng)價(jià)脂質(zhì)體中的還原型輔酶Q10的氧化穩(wěn)定性，在40℃的保存條件下，選擇以氧化穩(wěn)定性差的卵黃磷脂(磷脂，和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))作為脂質(zhì)體的基本制劑，對(duì)提高還原型輔酶Q10(含有0.005w/v％)氧化穩(wěn)定性的物質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
通過以下方法制備含有還原型輔酶Q10的脂質(zhì)體。即，把還原型輔酶Q10的粉末溶解在甲醇中，制成0.1mg/ml的溶液。然后以同樣的方法，制得溶解在甲醇中的磷脂溶液(3.2mg/ml)，同時(shí)彼此混合1ml。在該混合液中添加2ml氯仿，然后減壓除去溶劑。待溶劑完全除去后，加入2ml的50mMHEPES緩沖液(pH7.4)，用攪拌器使脂質(zhì)膜分散，制得乳白色的懸濁液。該懸濁液在氮?dú)饬鳌?℃的條件下，超聲波處理30分鐘，使之形成脂質(zhì)體后，以3000rpm，進(jìn)行20分鐘離心，沉淀巨大分子并將其除去。離心分離沒有被沉淀的部分，作為還原型輔酶Q10的脂質(zhì)體溶液。
此外，如下所述，制成含有0.05w/v％抗氧化劑或螯合劑的脂質(zhì)體。當(dāng)含有維生素E時(shí)，制備10mg/ml的乙醇溶液，在上述含有還原型輔酶Q10的脂質(zhì)體制作過程中添加氯仿之前，添加至還原型輔酶Q10及磷脂的混合液中，按下列同樣操作，制得脂質(zhì)體。當(dāng)含其他水溶性的抗氧化劑或螯合劑時(shí)，在上述HEPES緩沖液中溶解抗氧化劑或螯合劑使之達(dá)到0.05w/v％，制得脂質(zhì)體。
因此，制成含有多種抗氧化劑(乙酸維生素E、硫代硫酸鈉、檸檬酸、維生素C、維生素E(α-生育酚)的脂質(zhì)體，用還原型輔酶Q10的保持率來評(píng)價(jià)在空氣40℃保存下的氧化穩(wěn)定性.。
為了求得還原型輔酶Q10的保持率，首先將己烷1ml加入0.05ml的脂質(zhì)體溶液中，攪拌30秒后，離心分離(3000rpm，1分鐘)，使己烷層和水層分離。然后，吸取己烷層，在氮?dú)庀赂稍锕袒螅?.2ml的乙醇溶解，用HPLC進(jìn)行定量。在公知的分析條件下，使用電化學(xué)檢測(cè)儀分別對(duì)氧化型輔酶Q10和還原型輔酶Q10進(jìn)行定量。還原型輔酶Q10的保持率以制備脂質(zhì)體時(shí)的還原型輔酶Q10的量作為100％而求出。
其結(jié)果表明，在沒有添加抗氧化劑的脂質(zhì)體中，由于氧化，保存1～2天后保持率在10％或10％以下，而在添加有乙酸維生素E的脂質(zhì)體中，保存2天后其保持率為63％，在添加有硫代硫酸鈉的脂質(zhì)體中，保存3天后其保持率為76％，在添加有檸檬酸的脂質(zhì)體中，保存8天后其保持率為54％，在添加有維生素C的脂質(zhì)體中，保存15天后其保持率為68％。但是，在添加維生素E(α-生育酚)的脂質(zhì)體中，沒有看到明顯的效果。
由此可知，取決于抗氧化劑的種類，對(duì)脂質(zhì)體中的還原型輔酶Q10的穩(wěn)定性，既有明顯效果的也有一般效果的。具體地來說，維生素C的效果最明顯，下面以此類推，檸檬酸、硫代硫酸鈉、乙酸維生素C、維生素E。
實(shí)施例2用脂質(zhì)體包覆的螯合劑賦予還原型輔酶Q10的氧化穩(wěn)定性與實(shí)施例1相同，評(píng)價(jià)了螯合劑對(duì)還原型輔酶Q10的保持率的效果。用與實(shí)施例1同樣的方法，制備含有0.05w/v％乙二胺四乙酸的脂質(zhì)體，在40℃、空氣中保存，評(píng)價(jià)螯合劑的穩(wěn)定性效果。
在沒有添加螯合劑的脂質(zhì)體中的還原型輔酶Q10由于氧化，保存1～2天后、其保持率在10％或10％以下，而在添加有乙二胺四乙酸的脂質(zhì)體中，保存43天后其保持率為76％。
雖然人們知道作為螯合劑的乙二胺四乙酸對(duì)易氧化的物質(zhì)具有保護(hù)作用，但像這次試驗(yàn)的結(jié)果所示，超出強(qiáng)氧化劑的保護(hù)效果是完全沒有想到的結(jié)果。
實(shí)施例3抗氧化劑對(duì)表面活性劑溶液的效果(1)在含有0.005w/v％的還原型輔酶Q10的0.1％聚山梨酸酯80水溶液中，添加作為抗氧化劑的維生素C使之達(dá)到0.05w/v％，在40℃保存下，評(píng)價(jià)抗氧化劑的效果。
在沒有添加抗氧化劑的溶液中，保存6天后保持率為27％。而在添加有維生素C的溶液中，即使保存6天后仍保持原有的88％還原型。
實(shí)施例4抗氧化劑對(duì)表面活性劑溶液的效果(2)在含有0.005w/v％的還原型輔酶Q10的0.1％聚氧化乙烯硬化蓖麻油溶液(HCO-60日光ケミカルズ公司產(chǎn)品)中，添加作為抗氧化劑的維生素C或檸檬酸使之達(dá)到0.05w/v％，在40℃保存下，評(píng)價(jià)抗氧化劑的效果。
在沒有添加抗氧化劑的溶液中，保存7天后保持率為17％。而在添加有維生素C的溶液中，即使保存14天后仍保持原有的73％還原型。在添加有檸檬酸溶液中，即使保存71天后的還原型保持率仍為61％。
實(shí)施例5螯合劑對(duì)表面活性劑溶液的效果(1)除了使用作為螯合劑的乙二胺四乙酸來代替抗氧化劑以外，其他均與實(shí)施例3相同，評(píng)價(jià)了螯合劑的效果。
在沒有添加螯合劑的溶液中，保存6天后維持率為27％。而在添加有乙二胺四乙酸的溶液中，發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)體同樣強(qiáng)的保護(hù)效果，即使保存78天后，還原型仍保持在80％。
實(shí)施例6螯合劑對(duì)表面活性劑溶液的效果(2)除了使用作為螯合劑的乙二胺四乙酸來代替抗氧化劑以外，其他均與實(shí)施例4相同，評(píng)價(jià)了螯合劑的效果。
在沒有添加螯合劑的溶液中，保存7天后保持率為17％。而在添加有乙二胺四乙酸的溶液中，即使保存167天后還原型仍保持在74％。因此，在40℃高溫條件下，經(jīng)過近半年長(zhǎng)時(shí)間的保存，還原型輔酶Q10仍保持很高的比例，這是完全沒有想到的結(jié)果。
產(chǎn)業(yè)上的實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種更加穩(wěn)定的作為抗氧化物質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)輔助成分的有很大實(shí)用性的還原型輔酶Q的溶液。
權(quán)利要求
1.一種水溶液，它是一種含有用下式(1)表示的還原型輔酶Q的水溶液，在該水溶液中包含螯合劑 式中，n表示1～12的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的水溶液，其中還原型輔酶Q為還原型輔酶Q10。
3.如權(quán)利要求1或2所述的水溶液，所述螯合劑為乙二胺四乙酸或其鹽、羥乙基乙二胺四乙酸或其鹽、二亞乙基三胺五乙酸或其鹽、葡糖酸鈉鹽或羥基亞乙基二膦酸。
全文摘要
本發(fā)明通過使用具有疏水性且容易氧化、不穩(wěn)定的還原型輔酶Q，提供一種含有對(duì)氧化更加穩(wěn)定的還原型輔酶Q的水溶液。通過本發(fā)明得到的含有還原型輔酶Q的水溶液，是一種含有還原型輔酶Q以及維生素C等抗氧化劑和/或乙二胺四乙酸等螯合劑的水溶液，可長(zhǎng)期、穩(wěn)定地保持還原型輔酶Q。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1899272SQ20061010840
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2002年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月10日
發(fā)明者藤井健志, 川辺泰三, 細(xì)江和典, 日高隆義 申請(qǐng)人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社