專利名稱：治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，具體地，是以中藥材為原料制備而成的藥物組合物，屬藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見(jiàn)、嚴(yán)重影響視力且治療最為棘手的眼部并發(fā)癥，是致盲的最常見(jiàn)原因之一。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高、人口的快速增長(zhǎng)和生活模式的現(xiàn)代化以及社會(huì)的老齡化，糖尿病的發(fā)病率和患病率逐年上升。據(jù)2002年WHO糖尿病流行病學(xué)資料表明，在西方國(guó)家中糖尿病的患病率已達(dá)6.0％～7.6％，全球糖尿病患者已達(dá)1.77個(gè)億，預(yù)測(cè)至2030年將翻倍猛增至3.66億。糖尿病已躍居全世界發(fā)病率和死亡率最高的五種疾病之一。
近年來(lái)糖尿病的發(fā)病率有逐漸增高的趨勢(shì)，我國(guó)1997年11省市的調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)的糖尿病發(fā)病率已經(jīng)從80年代初的不足1％上升到3.26％，在部分城市居民中甚至超過(guò)了5％，估計(jì)我國(guó)已有4000萬(wàn)糖尿病患者。據(jù)預(yù)測(cè)，到2015年，我國(guó)的糖尿病患者將達(dá)到6000萬(wàn)。DR是DM最早出現(xiàn)的慢性微血管神經(jīng)并發(fā)癥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DM人群中30～50％合并DR，其中1/4有明顯視力障礙，生存質(zhì)量與健康水平嚴(yán)重下降，其致盲率為8～12％。隨著DM發(fā)病率的逐年上升，以DR為代表的DM的神經(jīng)微血管并發(fā)癥給眾多的DM病人危害將越來(lái)越嚴(yán)重。
美國(guó)ETDRS研究表明控制血糖、血壓對(duì)DR治療有益，眼底激光光凝可阻斷DR的發(fā)展進(jìn)程、保存中心視力，是公認(rèn)的治療手段之一，但激光光凝可損害周邊視野，而已喪失的視力也難以恢復(fù)，限制了其應(yīng)用。同時(shí)目前藥物對(duì)DR的治療效果并不理想，使得DR的防治成為目前困擾醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題。
DR的治療是復(fù)雜的系統(tǒng)工程，控制血糖是治療DR的基本原則，但控制血糖并不能完全阻止所有DR患者的發(fā)展，有報(bào)道顯示經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的血糖控制后，仍有部分DR病人視網(wǎng)膜病變不同程度的加重[1，2]。針對(duì)DR的治療措施主要包括藥物，激光及玻璃體切割等，但迄今尚無(wú)一種有效藥物或治療方法能預(yù)防或控制DR眼底病變的發(fā)生發(fā)展。在臨床應(yīng)用的導(dǎo)升明(Doxium)、遞法明療效不甚理想，甲基維生素B12(Methycobal，彌可保)、醛糖還原酶抑制劑(aldose reductase inhibitor，ARI如Sorbinil)[3，4]、PKC抑制劑[5]、VEGF抑制劑[5]、蛋白質(zhì)非酶糖基化抑制劑[6](如氨基胍)等仍處于臨床前或臨床研究階段。美國(guó)的早期糖尿病視網(wǎng)膜病變治療研究(the Early TreatmentDiabetic retinopathy Study，ETDRS)證實(shí)阿斯匹林抗炎治療對(duì)DR無(wú)效果[7]。對(duì)于增殖期DR，目前主要的治療手段是激光光凝和玻璃體切割，雖有一定效果，但也存在一定的局限性，還可并發(fā)視野損害、視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重后果[8]。
中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DR的基本病機(jī)是氣陰兩虛、肝腎虧虛、目絡(luò)瘀阻，其中非增殖期DR以氣陰兩虛、肝腎不足、目絡(luò)阻滯為主，進(jìn)入增殖期后，則以瘀血阻絡(luò)、痰濁內(nèi)生及陰損及陽(yáng)出現(xiàn)陰陽(yáng)兩虛為其突出特點(diǎn)。
虛瘀并治中藥復(fù)方采用補(bǔ)虛祛瘀的治法，針對(duì)DR非增殖期的基本病機(jī)進(jìn)行綜合防治，療效優(yōu)于西藥導(dǎo)升明膠囊，并且可提高病人的視力，顯著改善DR患者全身癥狀。
近年來(lái)，葛根的研究與開(kāi)發(fā)逐漸受到關(guān)注。葛根素是從葛根中分離出來(lái)的有效成分之一，具有擴(kuò)張冠狀血管、降低外周血管阻力、降血壓、降血糖、β-受體阻滯等作用，在眼科的應(yīng)用漸為廣泛[9-14]，為眼科臨床應(yīng)用葛根素提供了依據(jù)，以葛根素為主的異黃酮類成分為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的有效部位。
黃芪注射液等黃芪的提取物制劑，含有三萜皂甙、黃酮類、多糖類、氨基酸和微量元素。黃芪提取物不僅臨床用于糖尿病的治療，而且在眼科疾病治療上顯示良好的應(yīng)用前景，從多種途徑對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變起到一定的治療作用[15-20]。從黃芪注射液原液中分離出14個(gè)化合物，經(jīng)NMR及MS技術(shù)鑒定了它們的結(jié)構(gòu)，其中包括6個(gè)異黃酮化合物、1個(gè)紫檀烷化合物、6個(gè)黃芪皂苷類化合物，黃芪注射液的主要化學(xué)成分均包括在以上化合物中。
近年來(lái)，對(duì)燈盞細(xì)辛進(jìn)行了大量研究，并將該藥試用于眼科多種疾病，取得滿意效果，燈盞細(xì)辛及其制劑在眼科疾病治療上顯示良好的應(yīng)用前景，并且可以從多種途徑對(duì)糖尿病腎病早期和并發(fā)病變起到一定的治療作用[20-23]。
由于天然藥物成分復(fù)雜，藥物配伍使用可能產(chǎn)生的效果不同。目前，尚無(wú)將黃芪、葛根、燈盞細(xì)辛為原料配伍治療糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)報(bào)道，也沒(méi)有將其中的活性成分提取配伍治療糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法及用途。
本發(fā)明提供了一種治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，它是由含有下述重量配比的原料制備而成的藥劑黃芪10～40份、葛根10～30份、燈盞細(xì)辛10～30份。
進(jìn)一步地，它是由下述重量配比的原料而成的藥劑黃芪20～30份、葛根20～40份、燈盞細(xì)辛20～30份。
更進(jìn)一步地，它是由下述重量配比的原料制備而成的藥劑黃芪20份、葛根30份、燈盞細(xì)辛20份。
本發(fā)明藥物組合物是由黃芪、葛根、燈盞細(xì)辛的原料或水或有機(jī)溶劑提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
質(zhì)量控制含量測(cè)定選擇提取物中的葛根素、野黃芩苷，黃芪甲苷、總皂苷、總黃酮、總異黃酮。所述的葛根提取物含總異黃酮以葛根素計(jì)算不得低于60％，含葛根素不得低于20％；黃芪提取物含總皂苷以黃芪甲苷計(jì)算不得低于50％，含黃芪甲苷不得低于5％；燈盞細(xì)辛提取物含總黃酮以蘆丁計(jì)算不得低于35％，含野黃芩苷不得低于3％。
其中，所述的活性成分的重量配比為黃芪提取物1～10份、葛根提取物50～125份、燈盞提取物20～60份。
進(jìn)一步地，所述的活性成分的重量配比為黃芪提取物1份、葛根提取物70份、燈盞提取物25份。
所述的藥劑是顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、合劑。
本發(fā)明還提供了一種制備該藥物組合物的方法，包括如下步驟a、稱取下述重量配比的原料黃芪20～30份、葛根10～30份、燈盞細(xì)辛10～30份；b、葛根粉碎成粗粉，用60～95％乙醇提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，再用10～95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得葛根提取物；c、黃芪粉碎成粗粉，用60～95％乙醇加熱回流提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，加氫氧化鈉至含堿量為2～5％，加正丁醇動(dòng)態(tài)萃取2～5次，合并正丁醇液，2～5％氫氧化鈉溶液洗滌，再用水洗滌，棄去洗液，合并正丁醇液，減壓濃縮至近干，加丙酮研磨洗滌至色淺，取沉淀物減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得黃芪提取物；d、燈盞細(xì)辛加水煎煮，合并煎液，濾過(guò)，濃縮后通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，繼續(xù)用10～95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得燈盞細(xì)辛提取物；e、將b、c、d步驟制備的黃芪提取物、葛根提取物、燈盞細(xì)辛提取物混合，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的制劑。
本發(fā)明還提供了所述的各重量配比的原料在制備治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物中的用途。
進(jìn)一步地，所述的藥物是治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物。
本發(fā)明藥物的原料配比根據(jù)祖國(guó)中醫(yī)中藥理論，結(jié)合糖尿病的藥理配比而成。原料中黃芪補(bǔ)益氣血，葛根益陰生津，再以燈盞花祛瘀通脈，三藥合用共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功效，發(fā)揮協(xié)同增效的作用。同時(shí)確定本發(fā)明藥物原料中的有效成分，并將有效成分配伍使用，對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變非增殖期本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜的病理狀態(tài)具有益氣養(yǎng)陰之活血通通脈的功效。通過(guò)虛瘀并治能明顯改善視物昏花等癥狀、提高病人的視力；本發(fā)明藥物還具有活血通絡(luò)的功效，能促進(jìn)眼底出血和滲出的吸收。在提高視力、改善各種病狀方面明顯優(yōu)于西藥“導(dǎo)升明”。同時(shí)本藥為純中藥的制劑，采用先進(jìn)的工藝制成，有效成分明確，攜帶和服用方便。毒理試驗(yàn)證明安全無(wú)毒副作用，可長(zhǎng)期服用。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1復(fù)方提取工藝路線的藥效學(xué)篩選用樣品的制備流程圖2葛根提取工藝路線的藥效學(xué)篩選用樣品的制備流程圖3黃芪提取工藝路線的藥效學(xué)篩選用樣品的制備流程圖4燈盞細(xì)辛提取工藝路線的藥效學(xué)篩選用樣品的制備流程具體實(shí)施方式
實(shí)施例1本發(fā)明藥物膠囊劑的制備稱取葛根30kg、燈盞細(xì)辛20kg、黃芪20kg，葛根粉碎成粗粉，用60％乙醇加熱回流提取二次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，適當(dāng)濃縮，加于已處理好的大孔吸附樹(shù)脂柱上，水洗脫，棄去水洗脫液，繼續(xù)用70％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得葛根提取物；黃芪粉碎成粗粉，用90％乙醇加熱回流提取三次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，適當(dāng)濃縮，加氫氧化鈉至含堿量為5％，加正丁醇動(dòng)態(tài)萃取2次，合并正丁醇液，5％氫氧化鈉溶液洗滌1次，水洗滌2次，棄去洗液，合并正丁醇液，減壓濃縮至近干，加丙酮研磨洗滌至色淺，取沉淀物減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得黃芪提取物；燈盞細(xì)辛加水煎煮三次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，適當(dāng)濃縮，加于已處理好的大孔吸附樹(shù)脂柱上，水洗脫，棄去水洗脫液，繼續(xù)用70％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得燈盞細(xì)辛提取物；加入上述細(xì)粉和羧甲淀粉鈉、羥丙基纖維素、微粉硅膠、硬脂酸鎂，混勻，裝入膠囊，即得。
其他劑型的制備方法是，按照前述方法將得到的三味藥主要成分的干燥細(xì)粉，按中藥常規(guī)劑型的制備方法加入輔料制成不同的劑型，如片劑、顆粒劑、丸劑、軟膠囊和合劑等劑型。
實(shí)施例2本發(fā)明藥物丸劑的制備a、稱取黃芪10kg、葛根10kg、燈盞細(xì)辛10kg；b、葛根粉碎成粗粉，用95％乙醇提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，再用10～95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得葛根提取物；c、黃芪粉碎成粗粉，用95％乙醇加熱回流提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，加氫氧化鈉至含堿量為5％，加正丁醇動(dòng)態(tài)萃取5次，合并正丁醇液，5％氫氧化鈉溶液洗滌，再用水洗滌，棄去洗液，合并正丁醇液，減壓濃縮至近干，加丙酮研磨洗滌至色淺，取沉淀物減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得黃芪提取物；d、燈盞細(xì)辛加水煎煮，合并煎液，濾過(guò)，濃縮后通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，繼續(xù)用95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得燈盞細(xì)辛提取物；
將上述提取物混合，加入藥學(xué)上常用的輔料，如淀粉，制粒、整粒，得片劑。
實(shí)施例3本發(fā)明藥物片劑的制備a、稱取黃芪40kg、葛根30kg、燈盞細(xì)辛30kg；b、葛根粉碎成粗粉，用60％乙醇提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，再用10～95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得葛根提取物；c、黃芪粉碎成粗粉，用60％乙醇加熱回流提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，加氫氧化鈉至含堿量為2％，加正丁醇動(dòng)態(tài)萃取2次，合并正丁醇液，2％氫氧化鈉溶液洗滌，再用水洗滌，棄去洗液，合并正丁醇液，減壓濃縮至近干，加丙酮研磨洗滌至色淺，取沉淀物減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得黃芪提取物；d、燈盞細(xì)辛加水煎煮，合并煎液，濾過(guò)，濃縮后通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，繼續(xù)用10％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得燈盞細(xì)辛提取物；實(shí)施例4本發(fā)明藥物其他劑型的制備稱取黃芪30kg、葛根40kg、燈盞細(xì)辛30kg，直接打粉，得散劑。
在本發(fā)明藥物原料選擇的合理范圍內(nèi)，按本發(fā)明藥物提取處理方法，可制備成藥學(xué)上常用的制劑。
實(shí)施例5本發(fā)明藥物片劑的制備按實(shí)施例1的方法制備的黃芪提取物1kg、葛根提取物50kg、燈盞提取物30kg，混合，加入淀粉，制粒、整粒，加入硬脂酸鎂，壓片，即得。
實(shí)施例6本發(fā)明藥物膠囊劑的制備按實(shí)施例1的方法制備的黃芪提取物10kg、葛根提取物125kg、燈盞提取物60kg混合，加入淀粉，制粒、整粒，直接裝膠囊。
實(shí)施例7本發(fā)明藥物顆粒劑的制備按實(shí)施例1方法制備的黃芪提取物2kg、葛根提取物80kg、燈盞提取物40kg混合，加入淀粉，制粒、整粒，直接裝膠囊。
實(shí)施例8本發(fā)明藥物片劑的制備按實(shí)施例1的方法制備的黃芪30kg、葛根40kg、燈盞細(xì)辛30kg、地黃20kg、枸杞子20kg、決明子15kg、茺蔚子20kg，其中黃芪、葛根、燈盞細(xì)辛按實(shí)施例1方法提取，其它藥物直接加水煎煮，濃縮，混合，加入淀粉，制粒、整粒，加入硬脂酸鎂，壓片，即得。
實(shí)施例9本發(fā)明藥物提取物原料的質(zhì)量控制將實(shí)施例1制備的膠囊劑進(jìn)行質(zhì)量控制，所述的“本品”為實(shí)施例1制備的膠囊劑，其中的質(zhì)量控制方法不僅僅針對(duì)藥材原料的質(zhì)量控制，也針對(duì)原料提取物的質(zhì)量控制。
1原料藥的質(zhì)量控制含量測(cè)定
(1)黃芪法定標(biāo)準(zhǔn)出自《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部第212頁(yè)。
(2)葛根法定標(biāo)準(zhǔn)出自《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部第233頁(yè)。
(3)燈盞細(xì)辛法定標(biāo)準(zhǔn)出自《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部第100頁(yè)。
2質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(1)成品中黃芪甲苷含量測(cè)定指標(biāo)和方法確定黃芪甲苷是黃芪的重要活性成分，故選擇黃芪甲苷為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。黃芪的含量測(cè)定，《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版(一部)采用薄層掃描法測(cè)定，但該方法操作復(fù)雜。本試驗(yàn)采用《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版(一部)黃芪項(xiàng)下的HPLC-ESLD檢測(cè)。蒸發(fā)光檢測(cè)法可以排除因?yàn)樵碥疹愇镔|(zhì)紫外吸收低(200nm左右)而造成的測(cè)定誤差及干擾，并且此方法快速、簡(jiǎn)便、精確、靈敏并且重現(xiàn)性好，較少受人為因素影響。
含量限度 本品根據(jù)4批樣品測(cè)定結(jié)果，成品中黃芪甲苷平均含量為0.225mg/粒，由于中試黃芪藥材黃芪甲苷含量約為0.048％，根據(jù)計(jì)算，藥材到成品的未考慮成品率的轉(zhuǎn)移率約為50％?？紤]到收膏率及藥品在儲(chǔ)存、運(yùn)輸中的相關(guān)影響因素，因此本品每粒含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計(jì)，不得少于0.18mg。
(2)成品中葛根素含量測(cè)定指標(biāo)和方法確定 本品采用高效液相色譜法測(cè)定葛根素，因?yàn)楦鸶貫楸酒饭π嚓P(guān)的主要有效成分，高效液相色譜法快速、簡(jiǎn)便、精確、靈敏并且重現(xiàn)性好，較少受人為因素影響。
含量限度 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)4批樣品測(cè)定結(jié)果，成品中葛根素(C21H20O9)平均含量為67.1mg/粒，中試葛根藥材葛根素含量約為6.24％，根據(jù)計(jì)算，藥材到成品的未考慮成品率的平均轉(zhuǎn)移率為63.32％?？紤]到收膏率及藥品在儲(chǔ)存、運(yùn)輸中的相關(guān)影響因素，因此暫定本品每粒含葛根以葛根素(C21H20O9)計(jì)，不得少于50.0mg。
(3)成品中野黃芩苷含量測(cè)定指標(biāo)和方法確定 本品處方中燈盞細(xì)辛，與本發(fā)明藥物的功能主治密切相關(guān)；野黃芩苷是燈盞細(xì)辛的重要活性成分，故選擇野黃芩苷為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。本標(biāo)準(zhǔn)采用反相高效液相色譜法測(cè)定樣品中的野黃芩苷，該法快速、簡(jiǎn)便、精確、靈敏并且重現(xiàn)性好，較少受人為因素影響。
含量限度 本品根據(jù)4批樣品測(cè)定結(jié)果，成品中野黃芩苷(C21H18O12)平均含量為3.0mg/粒，中試燈盞細(xì)辛藥材野黃芩苷含量為0.41％，根據(jù)計(jì)算，藥材到成品的未考慮成品率平均轉(zhuǎn)移率為64.83％?？紤]到收膏率及藥品在儲(chǔ)存、運(yùn)輸中的相關(guān)影響因素，因此暫定本品每粒含燈盞細(xì)辛以野黃芩苷(C21H18O12)計(jì)，不得少于2.5mg。
(4)黃芪半成品提取物中總皂苷含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備精密稱取80℃減壓干燥至恒重的黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；批號(hào)0781200210)10.31mg，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，精密量取3ml置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每1ml含黃芪甲苷0.1237mg)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml，分別置具塞磨口試管中，置水浴中加熱，蒸干溶劑，加5％的香草醛-冰醋酸0.2ml，加高氯酸0.8ml，密塞，置70℃水浴恒溫加熱20分鐘，取出，立即用流水冷卻，加冰醋酸5.0ml搖勻；以相應(yīng)的溶液為空白。照比色法(《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版(一部)附錄VB)，在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度(A)為縱坐標(biāo)、濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。
結(jié)果表明，在0.0124~0.0330mg/ml范圍內(nèi)，黃芪甲苷對(duì)照品x(mg/ml)與吸收度(A)y線性關(guān)系良好(r＝0.9999)，回歸方程為y＝21.252x+0.0039。
供試品溶液制備取本品粉未約50mg，精密稱定，加甲醇50ml，加熱回流60分鐘，濾過(guò)，濾液回收甲醇并濃縮至干，殘?jiān)铀柡驼〈?0ml，微熱使溶解，用1％的氫氧化鈉振搖洗滌3次(10ml，10ml，10ml)，棄去氫氧化鈉液，正丁醇液用正丁醇飽和水洗滌3次(10ml，10ml，10ml)，棄去水層，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
樣品測(cè)定取批號(hào)為040401、050701、050702、050703的樣品各25mg(各3份)，精密稱定，按總皂苷含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
含量限度的制定考慮到原料產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏等因素以及多批含量測(cè)定結(jié)果，黃芪提取物總皂苷含量以黃芪甲苷計(jì)不得少于50％。
(5)葛根半成品提取物中總異黃酮含量測(cè)定1)、儀器條件Lambda35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Perkin Elmer公司)；比色皿石英，1cm；CQ-250型超聲處理波清洗器(上海之信超聲處理有限公司)；電子天平BP121S、BP211D(賽多利斯儀器有限公司)；W201恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)。
2)、對(duì)照品溶液的制備精密稱取葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；供含量測(cè)定用，批號(hào)110752-200209)17.8mg，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(每1ml中含葛根素0.356mg)。
3)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液(0.356mg/ml)1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分別置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成濃度為3.56μg/ml、5.34μg/ml、7.12μg/ml、8.9μg/ml、10.68μg/ml的對(duì)照品溶液，照紫外分光光度法(中華人民共和國(guó)藥典2000年版一部附錄VA)，在250nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。
結(jié)果表明，在3.56~10.68μg/ml范圍內(nèi)，葛根素吸收度y與對(duì)照品濃度x(μg/ml)的線性關(guān)系良好(r＝0.9999)，回歸方程為y＝0.0736x+0.003。
測(cè)定法精密量取樣品溶液，依法測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
4)、樣品測(cè)定取不同批號(hào)樣品(批號(hào)040401、050701、050702、050703)約20mg(各3份)，精密稱定，按總異黃酮測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
含量限度的制定考慮到原料產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏等因素以及多批含量測(cè)定結(jié)果，葛根提取物總異黃酮含量以葛根素計(jì)不得少于60％。
(6)燈盞細(xì)辛半成品提取物中總黃酮含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備 精密稱取110℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0mg(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供，批號(hào)0080-9705)，置50ml量瓶中，加60％乙醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，用60％乙醇稀釋至刻度，搖勻，避光冷藏，作為貯備液。(濃度為0.204mg/ml)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取蘆丁溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，分別置10ml量瓶中，各加30％乙醇至5.0ml，精密各加亞硝酸鈉(1-＞20)0.3ml，搖勻，放置6min，加硝酸鋁溶液(1-＞10)0.3ml，搖勻，再放置6min，加氫氧化鈉試液4ml，分別用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min，在510nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為y＝10.951x-0.0178(R＝0.999)測(cè)定法 精密吸取供試品溶液一定量，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加30％乙醇至5.0ml”起依法測(cè)定吸光度，計(jì)算。
樣品測(cè)定取燈盞細(xì)辛中試提取物(批號(hào)為040401、050701、050702、050703)各50mg(各3份)，精密稱定，按總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
含量限度的制定考慮到原料產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏等因素以及多批含量測(cè)定結(jié)果，燈盞細(xì)辛提取物總黃酮含量以蘆丁計(jì)不得少于35％。
(7)對(duì)照品來(lái)源野黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，按96.4％折算，批號(hào)842-200102)；葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)110752-200209)；黃芪甲苷為對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)0781-200311)；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供，批號(hào)0080-9705)。
同時(shí)對(duì)實(shí)施例1的提取物按上述方法進(jìn)行質(zhì)量控制，結(jié)果如下根據(jù)中試規(guī)模樣品4批次測(cè)定結(jié)果，暫定中間體提取物的工藝標(biāo)準(zhǔn)限度(內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，以含量均值的80％～90％作為限度)葛根中間提取物含總異黃酮以葛根素計(jì)算不得低于60％；含葛根素不得低于20％；
黃芪中間提取物含總皂苷以黃芪甲苷計(jì)算不得低于50％；含黃芪甲苷不得低于5％；燈盞細(xì)辛中間提取物含總黃酮以蘆丁計(jì)算不得低于35％；含野黃芩苷不得低于3％；以下通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。
試驗(yàn)例1黃芪、葛根及燈盞花提取物工藝篩選試驗(yàn)以下通過(guò)將黃芪、葛根及燈盞花提取物分別對(duì)體外高糖培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞的影響進(jìn)行試驗(yàn)，從而確定最佳的提取工藝。
一、復(fù)方合并提取工藝路線的篩選試驗(yàn)水和乙醇是目前實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)中最常用的溶劑一般濃度在90％以上的乙醇適宜提取黃酮苷元極性較低的成分，濃度在60％左右的乙醇適宜提取黃酮苷及三萜皂苷等極性中等及較大的成分；水適宜提取多糖等極性大的成分。根據(jù)處方藥物化學(xué)組分的理化性質(zhì)，選擇以上三種溶劑所得的提取物作為藥效學(xué)供試樣品。(制備流程詳見(jiàn)圖1)二、葛根提取路線的藥效篩選試驗(yàn)葛根提取方法用乙醇作溶劑的為多，一方面是由于水提工藝提取的葛根素含量低，一方面有研究資料表明其作用與葛根素含量呈正相關(guān)性，采用乙醇提取工藝對(duì)藥物的活性產(chǎn)生顯著影響，醇提法不僅葛根素含量高，而且提取液中總固形物的量少，提高了單位質(zhì)量藥物中葛根素的百分率。
葛根的主要化學(xué)部位為①異黃酮類，包括以大豆素及以其為苷元的大豆苷、葛根素等化合物；②多糖類，包括淀粉類。其中①類成分溶于乙醇，使用醇提工藝；②類成分溶于水，不溶于乙醇，可以在醇提后使用水提工藝。根據(jù)大孔吸附樹(shù)脂的吸附性能，①類成分可以被吸附，并可以被乙醇解吸附，可以初步分離，因此擬定葛根提取工藝路線。(制備流程詳見(jiàn)圖2)三、黃芪提取路線的藥效篩選試驗(yàn)?zāi)壳皩?duì)黃芪藥材及含黃芪的中成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)均以黃芪皂苷(黃芪甲苷)作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)。黃芪皂苷參照文獻(xiàn)，因此擬定黃芪提取工藝路線。(制備流程詳見(jiàn)圖3)四、燈盞細(xì)辛提取路線的藥效篩選試驗(yàn)從燈盞細(xì)辛植物中分離、鑒定出黃酮類化合物，咖啡酸酯類化合物，酚酸類化合物以及其它類化合物。燈盞細(xì)辛注射液和片劑的主要成分是以野黃芩苷(燈盞乙素)為主的黃酮類，黃酮類化學(xué)成分是燈盞細(xì)辛中主要及有效成分之一，因此參照文獻(xiàn)擬定燈盞細(xì)辛提取工藝路線。(制備流程詳見(jiàn)圖4)五、工藝路線篩選結(jié)論篩選結(jié)果表明，樣品TA、TB、GB、HC、DB對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，這些樣品包括了原生藥材中的主要有效部位。
在初步提取工藝路線確定的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了提取、分離、濃縮、純化等工藝研究，確定了優(yōu)化的工藝參數(shù)，制備了處方各藥味的中間體半成品(批號(hào)040401)，其中葛根中間體半成品收率為12.49％、黃芪中間體半成品收率為0.27％、燈盞細(xì)辛中間體半成品收率為6.17％。
根據(jù)臨床使用經(jīng)驗(yàn)和及其用藥用量比例，按葛根、黃芪、燈盞細(xì)辛的藥材飲片比例，采用各藥材中間體半成品進(jìn)行復(fù)方有效組分的藥效學(xué)研究。
表1復(fù)方分別提取純化的有效組分的配伍配比試驗(yàn)設(shè)計(jì)

藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品TA與TB混合樣品T、樣品P對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，樣品P的作用明顯。
六、具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)藥品黃芪提取物由中藥黃芪經(jīng)一系列工藝制成不同樣品(HA~HD)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院按圖2所述方法制備；葛根提取物由中藥黃芪經(jīng)一系列工藝制成不同樣品(GA~GD)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院按圖3所述方法制備。
燈盞花提取物由燈盞花經(jīng)一系列工藝制成樣品(DA~DD)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院按圖4所述的方法制備。
二甲基亞砜(DMSO)上海生工生物工程有限公司。
2、實(shí)驗(yàn)方法采用MTT法測(cè)定中藥黃芪提取物(樣品HA~HD)、葛根提取物(樣品GA~GD)、燈盞花提取物(樣品DA~DD)對(duì)體外高糖培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的保護(hù)作用。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用葡萄糖濃度為20mmol/的DMEM培養(yǎng)液、培養(yǎng)時(shí)間2天作為藥物篩選的培養(yǎng)液濃度及培養(yǎng)時(shí)間。
黃芪提取物(樣品HA~HD)、葛根提取物(樣品GA~GD)、燈盞花提取物(樣品DA~DD)以各樣品的飽和濃度的1/2作為篩選樣品濃度的最大開(kāi)始濃度，再依次以5倍的間距作為篩選樣品濃度。
取第3代周細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)后換用葡萄糖濃度為20mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)，分組，加入不同濃度的各種黃芪提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出96孔培養(yǎng)板，加入MTT溶液，培養(yǎng)4h，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目，然后吸凈上清液，每孔加入150μl DMSO振蕩數(shù)分鐘，立即測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，并根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝(試驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100％。
3、統(tǒng)計(jì)方法采SPSS11.0版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用q檢驗(yàn)(L-S-D法)。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析表2表明HA、HB、HC對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖無(wú)促進(jìn)作用。0.773mg/ml、0.1546mg/ml、0.0309mg/ml、0.00618mg/ml、0.00124mg/ml、0.00025mg/ml、0.00005mg/ml、0.00001mg/ml、0.000002mg/ml的HD對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。
由于高濃度的HA1、HA2顏色較濃，對(duì)OD值有影響，故根據(jù)倒置相差顯微鏡下的觀察所見(jiàn)HA1、HA2組的周細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞形狀極不規(guī)則，部分細(xì)胞體積變大，核膜輪廓不清或者消失，胞核碎裂、固縮，可見(jiàn)細(xì)胞碎片。不認(rèn)為HA1、HA2對(duì)周細(xì)胞有促增殖作用。
表3表明GA、GC、GD對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖無(wú)促進(jìn)作用。0.00816mg/ml、0.00163mg/ml、0.00033mg/ml、0.000066mg/ml、0.000013mg/ml、0.0000026mg/ml的GB對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
由于高濃度的GA1、GC1、GD1顏色較濃，對(duì)OD值有影響，故根據(jù)倒置相差顯微鏡下的觀察所見(jiàn)GA1、GC1、GD1組的周細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞形狀極不規(guī)則，部分細(xì)胞體積變大，核膜輪廓不清或者消失，胞核碎裂、固縮，可見(jiàn)細(xì)胞碎片。不認(rèn)為HA1、HA2對(duì)周細(xì)胞有促增殖作用。
表4表明DA、DC、DD對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖無(wú)促進(jìn)作用。0.1249mg/ml、0.02498mg/ml、0.004996mg/ml、0.0009992mg/ml的DB對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
由于高濃度的DB1顏色較濃，對(duì)OD值有影響，故根據(jù)倒置相差顯微鏡下的觀察所見(jiàn)HA1、HA2組的周細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞形狀極不規(guī)則，部分細(xì)胞體積變大，核膜輪廓不清或者消失，胞核碎裂、固縮，可見(jiàn)細(xì)胞碎片。不認(rèn)為DB1對(duì)周細(xì)胞有促增殖作用。
5、結(jié)論1中藥黃芪的提取物樣品HD，對(duì)體外高糖培養(yǎng)周細(xì)胞有促增殖作用。
2中藥葛根的提取物樣品GB對(duì)體外高糖培養(yǎng)周細(xì)胞有促增殖作用。
3燈盞花提取物樣品DB對(duì)體外高糖培養(yǎng)周細(xì)胞有促增殖作用。
各藥材的主要有效部位及其主要組成成分類型葛根的有效部位為總異黃酮類和總皂苷類(以總異黃酮為主)；黃芪的有效部位為總異黃酮類和總皂苷類(以總皂苷為主)；燈盞細(xì)辛有效部位為總黃酮苷類。
因此，根據(jù)上述藥效學(xué)篩選結(jié)果確定本發(fā)明藥物原料的基本工藝路線為(1)葛根的初步提取工藝路線乙醇提取，提取液濃縮，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗至無(wú)色，乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥。
(2)黃芪的初步提取工藝路線乙醇提取，提取液濃縮，堿化，正丁醇萃取，水洗，濃縮，丙酮沉淀，收集沉淀，干燥。
(3)燈盞細(xì)辛的初步提取工藝路線水煎提取，提取液濃縮，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗至無(wú)色，乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥。
試驗(yàn)例2葛根、黃芪、燈盞花三種提取物不同配比對(duì)高糖培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞的影響采用MTT法測(cè)定中藥黃芪提取物(按實(shí)施例1制備的方法)、葛根提取物(按實(shí)施例1制備的方法)、燈盞花提取物(按實(shí)施例1制備的方法)對(duì)體外高糖培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的保護(hù)作用。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用葡萄糖濃度為20mmol/的DMEM培養(yǎng)液、培養(yǎng)時(shí)間2天作為藥物篩選的培養(yǎng)液濃度及培養(yǎng)時(shí)間。
黃芪提取物(按實(shí)施例1制備的方法)、葛根提取物(按實(shí)施例1制備的方法)、燈盞花提取物(按實(shí)施例1制備的方法)以各樣品的飽和濃度的1/2作為篩選樣品濃度的最大開(kāi)始濃度，再依次以5倍的間距作為篩選樣品濃度。三種提取物不同配比(1～25號(hào))由燈盞花、黃芪、葛根的提取物按所有可能的配伍組合配制成1～25號(hào)配比。
取第3代周細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)后換用葡萄糖濃度為20mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)，分組，加入不同濃度的各種黃芪提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出96孔培養(yǎng)板，加入MTT溶液，培養(yǎng)4h，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目，然后吸凈上清液，每孔加入150μl DMSO振蕩數(shù)分鐘，立即測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，并根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝(試驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100％。
表5復(fù)方分別提取純化的有效組分的配伍配比試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表6配比1-25對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞增殖(光密度值)的影響

與加PBS液對(duì)照組比較“★”P＜0.05。
上表顯示配比1、配比2、配比3、配比4、配比9、配比10、配比11、配比12、配比13、配比14、配比17、配比18、配比20、配比21、配比22、配比23、配比24、配比25對(duì)體外高糖培養(yǎng)周細(xì)胞均有有促增殖作用，其中，配比4號(hào)的作用最強(qiáng)，配比21的作用次之。通過(guò)藥效學(xué)篩選試驗(yàn)驗(yàn)證了本發(fā)明藥物的處方比例為葛根∶黃芪∶燈盞細(xì)辛＝18∶12∶12＝3∶2∶2。
試驗(yàn)例3本發(fā)明藥物中不同藥物的配伍對(duì)STZ誘發(fā)糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的影響通過(guò)本發(fā)明的藥物中三個(gè)主要成分的不同組合對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障的影響，對(duì)比研究本發(fā)明三味藥復(fù)方配伍的作用是否優(yōu)于其他配伍。
采用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型，在造模后3個(gè)月將動(dòng)物分為9個(gè)組，分別為D，G，H，DG，DH，GH，DGH組和空白對(duì)照、模型組(D燈盞花，G葛根，H黃芪)，各組分別以三味藥的單味或不同組合提取物進(jìn)行灌胃治療(如D表示為單用燈盞花，DG是燈盞花和葛根合用)，根據(jù)試驗(yàn)例1和2的結(jié)果，對(duì)DGH組采用3∶2∶2的比例進(jìn)行配藥，劑量300mg/kg體重，為成人每日用量的10倍。其他各組的藥物參照上述配比進(jìn)行準(zhǔn)備灌胃用藥，劑量同DGH組也為300mg/kg體重每日。在三個(gè)月治療結(jié)束時(shí)采用伊文思藍(lán)灌注示蹤顯示研究了STZ糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障(Blood-retina barrier，BRB)的滲漏情況。結(jié)果STZ糖尿病模型大鼠在血糖升高6個(gè)月后可出現(xiàn)BRB明顯的損害，較正常組大鼠的血管滲漏明顯增加(P＜0.01)。本發(fā)明藥物三味藥DGH的配伍使用可減少明顯BRB的損害引起的血管滲漏，較單味藥D和G的改善血管作用明顯，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，和單味H及DG配伍比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
結(jié)論在相同原料用量條件下，本發(fā)明三味藥配伍可明顯改善STZ糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜血管的滲漏，作用優(yōu)于本發(fā)明的三昧藥的單獨(dú)使用和兩兩配伍使用。
表7本發(fā)明藥物不同組合對(duì)STZ糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)的影響

注 “△”P＜0.05，“△△”P＜0.01，與正常組比較“▲”P＜0.05，“▲▲”P＜0.01，與陰性對(duì)照組比較“*”P＜0.05， “**”P＜0.01，與DGH組比較試驗(yàn)例4本發(fā)明藥物對(duì)STZ誘發(fā)糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的影響在造模后6個(gè)月內(nèi)各時(shí)點(diǎn)連續(xù)8次采用伊文思藍(lán)灌注示蹤顯示，研究了STZ糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜(Blood-retina barrier，BRB)的滲漏情況，并在造模后3個(gè)月開(kāi)始對(duì)治療組用本發(fā)明藥物、對(duì)照組以導(dǎo)升明膠囊灌胃治療3個(gè)月，觀察藥物對(duì)BRB。結(jié)果造模兩周后即可出現(xiàn)較為明顯的滲漏，和造模前比較差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著病程的增加，STZ大鼠高血糖狀態(tài)的持續(xù)，伊文思藍(lán)的滲漏量也逐漸增多，到造模后3個(gè)月時(shí)伊文思藍(lán)的滲漏量明顯增多的趨勢(shì)。對(duì)造模3個(gè)月STZ糖尿病模型大鼠連續(xù)灌胃本發(fā)明藥物治療3個(gè)月，結(jié)果提示本發(fā)明藥物對(duì)STZ糖尿病BRB有明顯的保護(hù)作用，可明顯減少視網(wǎng)膜血管的滲漏；保護(hù)高血糖狀態(tài)下血-視網(wǎng)膜屏障的作用。結(jié)論STZ糖尿病模型大鼠在早期即可出現(xiàn)BRB和視功能的損害，并隨著高血糖的持續(xù)而加重。本發(fā)明藥物可減少BRB的損害引起的血管滲漏，并優(yōu)于對(duì)照西藥導(dǎo)升明膠囊。結(jié)果如下
表8本發(fā)明藥物膠囊對(duì)STZ大鼠視網(wǎng)膜血管伊文思藍(lán)滲漏的影響

注 “△”P＜0.05， “△△”P＜0.01，與正常組比較“▲”P＜0.05， “▲▲”P＜0.01，與陰性對(duì)照組比較“*”P＜0.05， “**”P＜0.01，與導(dǎo)升明組比較“●”P＜0.05， “●●”P＜0.01，與低劑量組比較試驗(yàn)例5本發(fā)明藥物對(duì)STZ誘發(fā)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能(mfERG)的影響采用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型，在造模后6個(gè)月內(nèi)各時(shí)點(diǎn)連續(xù)8次采用多焦視網(wǎng)膜電圖(mfERG)評(píng)價(jià)STZ糖尿病大鼠的視功能變化情況。并在造模后3個(gè)月開(kāi)始對(duì)治療組用本發(fā)明藥物、對(duì)照組以導(dǎo)升明膠囊灌胃治療3個(gè)月，觀察藥物本發(fā)明藥物對(duì)大鼠視功能的影響。
對(duì)STZ造模3月大鼠進(jìn)行連續(xù)3個(gè)月的治療后，在治療3月木mfERG記錄發(fā)現(xiàn)，各組N1波的峰潛時(shí)和反應(yīng)密度差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而陰性對(duì)照組和距常組比較P1波的峰潛時(shí)則明顯延長(zhǎng)，反應(yīng)密度明顯降低，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而本發(fā)明藥物各個(gè)治療組和導(dǎo)升明組的P1波峰潛時(shí)又縮短，和陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而和正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本發(fā)明藥物各個(gè)治療組和導(dǎo)升明組的P1波反應(yīng)密度增高，但和正常組比較仍較低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但本發(fā)明藥物高劑量組、中劑量組和導(dǎo)升明組的P1波反應(yīng)密度增高較明顯，和陰性組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且本發(fā)明藥物的中、高劑量組的反應(yīng)密度增高程度要好于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
表9本發(fā)明藥物膠囊對(duì)STZ大鼠mfERG總波形N1、P1波的峰潛時(shí)和反應(yīng)密度的影響

注 “△”P＜0.05， “△△”P＜0.01，與6月正常組比較
“▲”P＜0.05，“▲▲”P＜0.01，與造模6月陰性對(duì)照組比較“*”P＜0.05， “**”P＜0.01，與導(dǎo)升明組比較試驗(yàn)例6 本發(fā)明藥物對(duì)STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)損害影響選用STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠模型，觀察3個(gè)月后再連續(xù)給藥3個(gè)月。研究STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠在持續(xù)高血糖情況下視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)方面的改變；并在此基礎(chǔ)上，觀察本發(fā)明藥物對(duì)形態(tài)學(xué)損害的影響。研究結(jié)果顯示STZ糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管可出現(xiàn)毛細(xì)血管基底膜節(jié)段性增厚，結(jié)構(gòu)不清，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹增殖，血管滲透性增加，血液有形物質(zhì)滲出，重者可見(jiàn)毛細(xì)血管腔完全或不全閉塞?；啄こ使?jié)段樣明顯增厚膨隆，染色不均，邊界模糊不清，或可見(jiàn)毛細(xì)血管壁斷裂。本發(fā)明藥物各劑量組及遞法明組(DIfrare，法國(guó)樂(lè)康美的瀾制藥廠生產(chǎn))較空白對(duì)照組好轉(zhuǎn)，但仍可見(jiàn)毛細(xì)血管。內(nèi)核層病變較明顯，可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，核碎裂，染色不均，邊緣模糊不清，中藥本發(fā)明藥物抑制毛細(xì)血管基底膜的增厚，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的腫脹。本發(fā)明藥物高、中劑量能減低糖尿病性大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度，與西藥遞法明效果近似。
表10本發(fā)明藥物膠囊劑對(duì)STZ大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度的影響

注 “*”P＜0.05， “**”P＜0.01，與正常組比較“▲”P＜0.05， “▲▲”P＜0.01，與空白對(duì)照組比較“△”P＜0.05， “△△”P＜0.01，與遞法明組比較“☆”P＜0.05“☆☆”P＜0.01與本發(fā)明藥物膠囊各組比較試驗(yàn)例7本發(fā)明藥物對(duì)STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管損害影響選用STZ成功復(fù)制實(shí)驗(yàn)性STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠模型，觀察3個(gè)月后再連續(xù)給藥3個(gè)月。對(duì)STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠在持續(xù)高血糖情況下視網(wǎng)膜組織進(jìn)行消化鋪片，研究視網(wǎng)膜毛細(xì)血管形態(tài)學(xué)方面的改變進(jìn)行了研究；并觀察本發(fā)明藥物對(duì)STZ糖尿病性大鼠毛細(xì)血管損害的影響。研究結(jié)果顯示陰性對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管節(jié)段性膨大成囊樣或扭曲成絆，周細(xì)胞數(shù)目明顯減少，微血管瘤形成，可見(jiàn)影周毛細(xì)血管；管徑不均，管腔變小或閉塞，無(wú)灌注區(qū)形成。對(duì)照藥遞法明組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞明顯凋亡，但仍可見(jiàn)毛細(xì)血管局部擴(kuò)張、膨隆，微血管瘤形成及滲透性改變。中藥部位復(fù)方本發(fā)明藥物顆粒高、中劑量組毛細(xì)血管周細(xì)胞數(shù)目減少，染色質(zhì)濃集，核固縮或濃染成小圓點(diǎn)或不規(guī)則形，但毛細(xì)血管管腔基本正常，血管走向平直。分析并計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞的比值(E/P)，結(jié)果顯示中藥本發(fā)明藥物可明顯減少糖尿病大鼠的E/P比值。
表11本發(fā)明藥物膠囊對(duì)STZ大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的影響

注“*”P＜0.05，“**”P＜0.01，與正常組比較“▲”P＜0.05，“▲▲”P＜0.01，與空白對(duì)照組比較“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01，與遞法明組比較“☆”P＜0.05“☆☆”P＜0.01與本發(fā)明藥物膠囊各組比較表2黃芪提取物對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞增殖的影響

與PBS液組比較“★”P＜0.05(增殖作用)；“☆”P＜0.05(抑制作用)。
(注由于藥液采用PBS液溶解和稀釋，故藥液各濃度組均以PBS液組作為對(duì)照組)。
表3葛根提取物對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞增殖的影響

表4燈盞花提取物對(duì)高糖培養(yǎng)的周細(xì)胞增殖的影響

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1.一種治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于它是由含有下述重量配比的原料制備而成的藥劑黃芪10～40份、葛根10～30份、燈盞細(xì)辛10～30份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料而成的藥劑黃芪20～40份、葛根20～30份、燈盞細(xì)辛20～30份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料制備而成的藥劑黃芪20份、葛根30份、燈盞細(xì)辛20份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于它是由黃芪、葛根、燈盞細(xì)辛的原料或水或有機(jī)溶劑提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于葛根提取物含總異黃酮以葛根素計(jì)算不得低于60％，含葛根素不得低于20％；黃芪提取物含總皂苷以黃芪甲苷計(jì)算不得低于50％，含黃芪甲苷不得低于5％；燈盞細(xì)辛提取物含總黃酮以蘆丁計(jì)算不得低于35％，含野黃芩苷不得低于3％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于所述的活性成分的重量配比為黃芪提取物1～10份、葛根提取物50～125份、燈盞提取物20～60份。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于所述的活性成分的重量配比為黃芪提取物1份、葛根提取物70份、燈盞提取物25份。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、合劑。
9.一種制備權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物的方法，包括如下步驟a、稱取下述重量配比的原料黃芪20～30份、葛根10～30份、燈盞細(xì)辛10～30份；b、葛根粉碎成粗粉，用60～95％乙醇提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，再用10～95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得葛根提取物；c、黃芪粉碎成粗粉，用60～95％乙醇加熱回流提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮，加氫氧化鈉至含堿量為2～5％，加正丁醇動(dòng)態(tài)萃取2～5次，合并正丁醇液，2～5％氫氧化鈉溶液洗滌，再用水洗滌，棄去洗液，合并正丁醇液，減壓濃縮至近干，加丙酮研磨洗滌至色淺，取沉淀物減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得黃芪提取物；d、燈盞細(xì)辛加水煎煮，合并煎液，濾過(guò)，濃縮后通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，水洗脫，棄去水洗脫液，繼續(xù)用10～95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，得燈盞細(xì)辛提取物；e、將b、c、d步驟制備的黃芪提取物、葛根提取物、燈盞細(xì)辛提取物混合，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的制劑。
10.權(quán)利要求1所述的各重量配比的原料在制備治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物組合物，它是由黃芪、葛根、燈盞細(xì)辛為活性成分制備而成的藥劑。本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法和用途。本發(fā)明藥物原料采用藥物的有效部位入藥，藥效明確，可控性強(qiáng)，將各有效成分配伍使用，具有活血通絡(luò)明目的功效，能促進(jìn)眼底出血和滲出的吸收，在提高視力、改善各種病狀方面明顯優(yōu)于西藥羥苯磺酸鈣(導(dǎo)升明、安多明)和遞法明，發(fā)揮了協(xié)同增效作用。同時(shí)本發(fā)明藥物工藝先進(jìn)，有效成分明確，攜帶和服用方便，毒理試驗(yàn)證明安全無(wú)毒副作用，可長(zhǎng)期服用，為臨床提供了一種新的藥用選擇。
文檔編號(hào)A61P27/02GK101032550SQ20061002119
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者段俊國(guó), 廖品正, 張藝 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué), 綠谷(集團(tuán))有限公司