本發(fā)明屬于植物提取領(lǐng)域，具體而言，涉及一種預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的猴果樹葉與樹皮乙醇提取物的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素功能不足導(dǎo)致的碳水化合物、脂肪與蛋白質(zhì)代謝紊亂引起的血糖值高的疾病。糖尿病是常見的代謝紊亂疾病，全世界有2.8%的人患有此類疾病，到2025年這一比值將會(huì)達(dá)到5.4%。糖尿病患者當(dāng)中有90-95%的病人為II型糖尿病。II型糖尿病的流行是與肥胖緊密相關(guān)，根據(jù)世界健康組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，在2009年患病人數(shù)多于2.2億，經(jīng)預(yù)測，到2030年患病人數(shù)會(huì)升至3.5億。I型糖尿病是由于胰臟的β-細(xì)胞不能產(chǎn)生胰島素導(dǎo)致的，而Ⅱ型糖尿病則是由于胰島素抵抗或β-細(xì)胞功能障礙引起的。I型糖尿病患者治療方法只能用胰島素，而Ⅱ型糖尿病患者治療方法除利用胰島素外還有主要的四種藥物：用于刺激胰臟分泌胰島素的藥物如磺酰脲類藥、快速促胰島素分泌的藥物格列本脲、格列甲嗪、瑞格列奈，用于降低肝葡萄糖合成的藥物雙胍類如甲福明二甲雙胍，用于延緩碳水化合物在腸內(nèi)消化吸收的藥物α-葡萄糖苷酶抑制劑如阿卡波糖，用于提高胰島素活性的藥物噻唑烷二酮類如匹格列酮、羅西格列酮。上述藥物都有不同程度的副反應(yīng)。由于這些藥物的副反應(yīng)限制了降糖藥物的應(yīng)用，因此急需找到糖尿病治療的其他合適的方法，最近幾十年，草藥領(lǐng)域越來越被重視，利用天然產(chǎn)物治療糖尿病的需求越來越大，研究表明世界上已有超過400種植物具有抗糖尿病活性。猴果（AnisophyllealaurinaR.Br.exSabine），Anisophylleaceae科，在西非廣泛種植，樹高5-16米，通常被稱為猴果。在西非當(dāng)?shù)乇挥脕碜鳛閭鹘y(tǒng)藥物，但是，猴果作為抗糖尿病的藥物的研究還沒有報(bào)道，因此需要做體內(nèi)與體外抗糖尿病試驗(yàn)為猴果降血糖功能提供理論依據(jù)，對研發(fā)廉價(jià)質(zhì)優(yōu)的天然產(chǎn)物藥物代替價(jià)格高、副作用多的合成抗糖尿病藥物具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有研究不足，本發(fā)明的目的在于通過對猴果樹葉與樹皮提取物的體外試驗(yàn)與動(dòng)物試驗(yàn)研究，提供一種預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病及并發(fā)癥的猴果樹葉與樹皮提取物及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種抗Ⅱ型糖尿病及并發(fā)癥的猴果樹葉與樹皮乙醇提取物，在制備抗高血糖藥物中的應(yīng)用。一種抗Ⅱ型糖尿病及并發(fā)癥的猴果樹葉與樹皮乙醇提取物，在制備抗高血糖并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。所述的猴果樹葉乙醇提取物由如下方法制備得到的：收集猴果新鮮的樹葉與樹皮，曬干、研磨后，取20g干粉放入100ml80%的乙醇中，于攪拌速度280rpm，提取溫度為28℃，避光條件下提取3天，提取液過濾，60℃蒸發(fā)濃縮后凍干，4℃保存?zhèn)溆谩Ｋ龅暮锕麡淦ひ掖继崛∥镉扇缦路椒ㄖ苽涞玫降模菏占锕迈r的樹葉與樹皮，曬干、研磨后，取20g干粉放入100ml80%的乙醇中，于攪拌速度280rpm，提取溫度為28℃，避光條件下提取3天，提取液過濾，60℃蒸發(fā)濃縮后凍干，4℃保存?zhèn)溆谩Ｋ龅目耿蛐吞悄虿〉乃幬锇ㄉ鲜鎏崛∥锖退帉W(xué)上可以接受的載體或常規(guī)副食。所述的抗Ⅱ型糖尿病并發(fā)癥的藥物包括上述提取物和藥學(xué)上可以接受的載體或常規(guī)副食。有益效果]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下有益的技術(shù)效果：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制效果，能夠控制Ⅱ型糖尿病病人的餐后血糖升高速度，對糖尿病代謝相關(guān)信號(hào)通路靶點(diǎn)PTP-1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2有顯著的抑制作用，減少糖尿病人高糖產(chǎn)生的腦血管損傷，并且可以控制糖尿病病人體重減輕程度、減少血漿中血脂膽固醇水平和甘油三酯水平，防止動(dòng)脈硬化、冠心病等疾病的發(fā)生，并且可以減少糖尿病對肝功能、腎功能的損傷，因此猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對開發(fā)治療Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的藥物具有潛在價(jià)值。【具體實(shí)施方式】以下結(jié)合實(shí)例，對本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式詳述如下：實(shí)施例1:猴果樹葉與樹皮乙醇提取物抗糖尿病體外試驗(yàn)猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果試驗(yàn)猴果樹葉與樹皮乙醇提取物處理：稱取猴果樹葉與樹皮乙醇提取物溶解于二甲基亞砜（DMSO(v/v1:1)）中制成0-4mg/ml濃度的溶液備用。取上述各濃度溶液50μl于96孔酶標(biāo)板中，向試管中加入含有1.0U/mlα-葡萄糖苷酶（溶解于0.1M，pH為6.9磷酸緩沖液）溶液100μl，于25℃孵育10min，再次加入5mM的硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（溶解于0.1M，pH為6.9磷酸緩沖液）溶液50μl于25℃孵育10min，在504nm測定吸光度。三次平行，空白對照組為緩沖溶液代替α-淀粉酶溶液，其他條件不變。質(zhì)控組為緩沖溶液代替猴果樹葉與樹皮乙醇提取物溶液，其他條件不變。抑制率計(jì)算公式：抑制率（%）={(Ac–Ae)/Ac}100其中Ac為質(zhì)控組吸光度，Ae為猴果樹葉與樹皮乙醇提取物吸光度猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制結(jié)果：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶具有抑制，具有抗糖尿病活性，其結(jié)果如表1、表2所示：表1猴果樹葉乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果猴果樹樹葉提取物濃度（mg/ml）葡萄糖苷酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.812.3331.91.632.3648.42.457.6360.13.268.1774.25478.284.3表2猴果樹皮乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果猴果樹樹皮提取物濃度（mg/ml）葡萄糖苷酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.822.1331.91.623.3648.42.447.6360.13.260.1774.25468.2184.3猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制效果試驗(yàn)猴果樹葉與樹皮乙醇提取物處理：稱取猴果樹葉與樹皮乙醇提取物溶解于二甲基亞砜（DMSO(v/v1:1)）中制成0-4mg/ml濃度的溶液備用。取上述各濃度溶液500μl于試管中，向試管中加入含有0.5mg/mlα-淀粉酶（溶解于0.02M，pH為6.9磷酸緩沖液）溶液500μl，于25℃孵育10min，再次加入1%（溶解于0.02M，pH為6.9磷酸緩沖液）淀粉溶液500μl，于25℃孵育10min，加入顯色劑終止反應(yīng)。將試管置于沸水中加熱5min后冷卻至室溫，向試管中加入15ml蒸餾水稀釋后于540nm測定吸光度。三次平行，空白對照組為緩沖溶液代替α-淀粉酶溶液，其他條件不變。質(zhì)控組為緩沖溶液代替猴果樹葉與樹皮乙醇提取物溶液，其他條件不變。抑制率計(jì)算公式：抑制率（%）={(Ac–Ae)/Ac}100其中Ac為質(zhì)控組吸光度，Ae為猴果樹葉與樹皮乙醇提取物吸光度猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制結(jié)果：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對α-淀粉酶具有抑制效果，具有抗Ⅱ型糖尿病活性，其結(jié)果如表3、表4所示：猴果樹樹葉提取物濃度（mg/ml）淀粉酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.823.324.51.629.6738.72.440.4954.13.248.8763.5452.6278.3表3猴果樹葉乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制效果表4猴果樹皮乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制效果猴果樹樹皮提取物濃度（mg/ml）淀粉酶抑制率（%）阿卡波糖抑制率（%）0.83.524.51.619.8338.72.423.4854.13.238.3963.5458.378.3猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病代謝相關(guān)信號(hào)通路中酶的抑制活性試驗(yàn)肝臟胰島素抵抗主要是指胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出的能力下降，肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，維持空腹?fàn)顟B(tài)下的內(nèi)生性糖的產(chǎn)生和輸出及進(jìn)食后糖的吸收、利用和存儲(chǔ)。PTP-1B是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，PTP-1B抑制劑通過阻斷胰島素刺激的胰島素受體（IR）的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而影響胰島素受體（IRS-1）的磷酸化，使類胰島素和胰島素增敏，降低血糖。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)能廣泛影響細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡及免疫應(yīng)答等過程。許多疾病諸如糖尿病、癌癥、肥胖、類風(fēng)濕和免疫功能紊亂等都與PTPs的異常表達(dá)有關(guān)。有效抑制PTPs的活性能夠提高細(xì)胞磷酸化水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶（TCPTP）是一種胞內(nèi)非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，TCPTP與PTP1B高度同源，尤其是活性位點(diǎn)同源性更高達(dá)94%。SHP-1(SH2ContainingTyrosinePhosphatase1)，是含有SH2結(jié)構(gòu)域的具有高度保守序列的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的亞家族中的重要成員。SHP-1與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生有關(guān)，SHP-1活力的下降或丟失會(huì)提高胰島素靈敏性及葡萄糖耐受性，即SHP-1在調(diào)節(jié)血糖代謝方面有重要作用，通過抑制體內(nèi)SHP-1的活性，能增強(qiáng)免疫力并且降低糖尿病患者的血糖。糖尿病的慢性并發(fā)癥常見的有糖尿病心腦血管病變，腦血管病變是老年患者極易出現(xiàn)的一種并發(fā)癥。神經(jīng)細(xì)胞對葡萄糖的攝取主要依賴外界葡萄糖的濃度，不受胰島素調(diào)控，血腦屏障是腦內(nèi)組織獲取葡萄糖的唯一調(diào)控因素。持續(xù)高糖能降低血液攜氧能力、損傷血腦屏障、增加線粒體的氧化應(yīng)激產(chǎn)生氧自由基。缺氧與氧化應(yīng)激導(dǎo)致蛋白激酶C(PKC)信號(hào)通路激活，從而激活SHP-2磷酸化，激活的SHP-2參與調(diào)控血腦屏障蛋白的表達(dá)、改變血腦屏障通透性，導(dǎo)致糖尿病人腦血管病并發(fā)癥的發(fā)生。由此SHP-2抑制劑可以有效降低糖尿病患者的腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。猴果樹葉和樹皮乙醇提取物對糖尿病代謝相關(guān)信號(hào)通路靶點(diǎn)PTP-1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2有顯著的抑制作用，并與用于糾正蛋白代謝障礙的藥物齊墩果酸、Na3VO4相比，具有更好的作用效果，其結(jié)果如表5所示：表5：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對PTP-1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2的抑制作用實(shí)施例2:猴果樹葉與樹皮乙醇提取物抗糖尿病體內(nèi)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4-6周成年的老鼠，雌雄各半，體重為150g-200g，飼養(yǎng)條件為12h燈光照射、12h避光，飼養(yǎng)溫度為25±3°C、濕度為35%-60%控制飲食，飼養(yǎng)一周內(nèi)記錄血糖和體重。糖尿病小鼠處理：注射60mg/kg的鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：1組為正常小鼠：只注射生理鹽水的正常小鼠為對照組，注射量為5ml/kg；2組為質(zhì)控組：只注射生理鹽水的經(jīng)誘導(dǎo)獲得糖尿病的小鼠，注射量為5ml/kg；3組為格列本脲組：用格列本脲治療的糖尿病小鼠組，使用量為5mg/kg；4組為猴果樹葉體內(nèi)試驗(yàn)組：喂食猴果樹葉乙醇提取物，使用量為300mg/kg；5組為猴果樹皮體內(nèi)試驗(yàn)組：喂食猴果樹皮乙醇提取物，使用量為500mg/kg；每組均有6只小鼠，飼養(yǎng)21天后，取血和組織進(jìn)行檢測。血糖測定：采用ACCUCHECK血糖儀進(jìn)行測定組織與血液采集：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在乙醚麻醉?xiàng)l件下處死，迅速取下肝臟和胰臟與-20℃條件下保存，采集心臟血放于有EDTA(2mg/mL)的試管中，分析血漿中脂質(zhì)與其他生化參數(shù)，所有的分析需在48h內(nèi)完成。猴果樹葉與樹皮抗糖尿病體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果：如表6所示為猴果樹葉與樹皮提取物對糖尿病小鼠體重的影響，猴果樹葉與樹皮提取物減少糖尿病小鼠體重減少的情況與健康對照組和格列本脲治療組的小鼠體重相比均有減少，但是與糖尿病組相比體重減少的程度比較輕，說明猴果樹葉與樹皮乙醇提取物可以改善糖尿病小鼠的體重減少情況。表6：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病小鼠體重影響結(jié)果如表7所示為猴果樹葉與樹皮提取物對糖尿病小鼠血糖的影響，猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病小鼠血糖降低有明顯效果。其效果與格列本脲效果幾乎相同，并且實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖水平比糖尿病對照組低，由此可知猴果樹葉與樹皮乙醇提取物可以降低糖尿病的血糖升高水平。表7：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病小鼠血糖影響結(jié)果糖尿病病人血漿膽固醇、甘油三酯值偏高和高密度脂蛋白膽固醇的減少是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥如血管病變動(dòng)脈硬化和冠心病等的因素之一。糖尿病小鼠血漿脂類偏高是由于自由脂肪酸從外圍脂肪組織流動(dòng)性偏高，因?yàn)橐葝u素能夠抑制荷爾蒙以來的脂肪分解酶的活性，糖尿病病人胰島素減少或胰島素抵抗可能是引起血脂異常的原因。如表8所示猴果的樹葉與樹皮乙醇提取物可以有效地的控制糖尿病小鼠血脂水平。在糖尿病組小鼠中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、超低密度值蛋白水平增加，高密度脂蛋白膽固醇降低。標(biāo)準(zhǔn)對照組和猴果樹葉與樹皮乙醇提取物組血漿膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和超低密度脂蛋白明顯降低而高密度脂蛋白膽固醇明顯增加。這表明猴果樹葉和樹皮乙醇提取物不僅可以控制血糖，并且抑制膽固醇合成路徑，肝臟低密度脂蛋白受體將低密度脂蛋白帶入肝臟，減少其在血漿中的水平，增加高密度脂質(zhì)蛋白與低密度脂質(zhì)蛋白的比值，從而減少糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生。表8：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病小鼠血脂影響結(jié)果糖尿病中膽固醇和脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致動(dòng)脈硬化和冠心病等疾病，這些疾病導(dǎo)致血漿中轉(zhuǎn)氨酶類增加，轉(zhuǎn)氨酶是心臟和損傷的特異性指標(biāo)。臨床發(fā)現(xiàn)糖尿病病人出現(xiàn)肝壞死的并發(fā)癥，因此，本發(fā)明中采用鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病小鼠導(dǎo)致肝損傷而引起丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），和堿性磷酸酶（ALP）活性的升高。同時(shí)，肌氨酸酐、尿素、總蛋白含量為腎功能特異性指標(biāo)。本發(fā)明通過測定上述指標(biāo)，評價(jià)猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病人肝腎功能的影響。如表9所示，猴果樹葉與樹皮乙醇提取物喂養(yǎng)的糖尿病小鼠氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯降低，肌氨酸酐和尿素含量與糖尿病組相比降低，總蛋白含量與正常組無差別。由此可知猴果的樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病人的肝腎并發(fā)癥具有一定的療效。表9：猴果樹葉與樹皮乙醇提取物對糖尿病小鼠肝腎功能的影響當(dāng)前第1頁1 2 3