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一種殺滅癌細胞、抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物的制作方法

文檔序號:1011185閱讀:446來源:國知局
專利名稱:一種殺滅癌細胞、抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種抗惡性腫瘤的藥物。
背景技術(shù)
作為腫瘤這種疾病、目前已構(gòu)成主要危害人類死亡的疾病之一。病因不明確。主要治療手段仍是沿用多年的手術(shù)切除,放射療法及化學(xué)療法。傳統(tǒng)的治療方法根治率很低,只能短時間延續(xù)患者生命和緩解病痛。絕大多數(shù)病人因復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡。以往的中、西治療惡性腫瘤的藥物,目前還沒有哪一種被公認是治療惡性腫瘤的救命藥物,而且藥的價格非常昂貴。尤其是某些中藥,較多采用了名貴、和一些毒性很大的中藥藥材,堅持服用這些藥物的病人,為較短的生命延續(xù)時間,付出了巨大的經(jīng)濟代價,多數(shù)病人得到的是人財兩空的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能殺滅癌細胞,抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物,提高惡性腫瘤藥物治療的治療效果,使惡性腫瘤的藥物治療在現(xiàn)有技術(shù)的水平上取得較大的進步。
本發(fā)明的藥物由以下重量份數(shù)比的原料組成磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)250-350、抗壞血酸鹽(維生素C)150-250、硝酸鈰30-50、硒酸鈉5-15。
本發(fā)明的藥物原料最佳重量份數(shù)比為磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)、300、抗壞血酸鹽(維生素C)200、硝酸鈰40、硒酸鈉10。
本發(fā)明的藥物以磺化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)為主要活性成分。是基于1.6-0-磺酸化甲殼質(zhì)(S-Chitin), 和6-0-磺酸化及羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-Chitin),CH2OCH2COOH.SO3H CH2OCH2COOH.SO3H
具有明顯地抑制瘤細胞的滲透,并且其滲透通過基質(zhì)的能力與其磺酸化率有關(guān)系。(磺酸化率增高使瘤細胞滲透被抑制的能力增加)2.SCM-ChitinIII為高磺酸化率的羧甲基SCM-Chitin。
3.SCM-ChitinIII其抗凝活性很低使細胞遷移率低。(抗凝活性高可使細胞遷移率高。)4.SCM-ChitinIII能阻斷瘤細胞向昆布寧包被的底物的攻擊與移行。即意味著阻斷浸潤。
5.SCM-ChitinIII阻斷瘤細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移機理被認為是它與昆布寧分子特異結(jié)合的結(jié)果。
6.一定劑量的SCM-ChitinIII,能抑制肝素酶,即抑制了磺酸類肝素的降解。
7.SCM-ChitinIII能夠抑制瘤細胞的IV型膠原的水解活性。
8.SCM-ChitinIII的作用1)無毒。2)抵抗凝性。3)抑制肝素酶。4)抑制瘤細胞對IV型膠原的水解作用。5)它與昆布寧結(jié)合而使瘤細胞浸潤與轉(zhuǎn)移作用減弱。
本發(fā)明以微量元素硒為輔助成份是基于微量元素硒是抗氧化劑,又是谷胱甘肽過氧化物酶的重要成分,可抑制過氧化反應(yīng),分解過氧化物,清除自由基及修復(fù)生物膜,保護易被氧化的物質(zhì)。含硒化合物可降低化學(xué)致癌物質(zhì)與DNA共價結(jié)合,硒能參與并促進體內(nèi)多種抗氧化硒的合成,低水平硒會使酶的活性下降而導(dǎo)致癌的發(fā)生與發(fā)展,緩解氧化壓力。硒化合物可調(diào)整和激活身體免疫功能,能從多方面預(yù)防癌癥發(fā)生及間接抑制癌腫瘤的生長。
本發(fā)明以稀土元素鈰為輔助成份,是基于在用稀土元素進行抵抗腫瘤細胞生長的免疫實驗中,證明稀土元素(鈰、鑭等)有較強的絡(luò)合作用,可對細胞DNA進行剪切,并對細胞內(nèi)多種酶活性有提高或抑制作用。對惡性腫瘤細胞有很強的殺滅能力,能主動向癌細胞進攻,將癌細胞消滅在萌芽狀態(tài)。小鼠口服鈰后,自然殺傷細胞攻擊癌細胞的能力提高了38%。機體一體免疫功能也大有改善。鈰在調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因方面也證實有十分有益的作用。它能清除體內(nèi)有害的自由基外,還可使癌細胞內(nèi)的鈣調(diào)素水平降低,抑癌基因水平上升。表明鈰的抑癌作用可能是通過使癌細胞惡性程度下降來實現(xiàn)的,說明鈰對腫瘤的防治有確切的作用。
維生素C是公認的抗氧化劑,能保護磺化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)不被氧化。并且與亞硒酸納協(xié)同對肝癌細胞有逆轉(zhuǎn)作用。
本發(fā)明的積極效果在于利用對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用SCM-ChitinIII和對惡性腫瘤細胞有很強的殺滅能力稀土元素鈰及抗氧化劑硒和維生素C組成防治惡性腫瘤的藥物,其中的各原料成分相互協(xié)同,在抑制惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和殺滅腫瘤細胞具有突出的效果,有望使惡性腫瘤得到治愈,或大大地減少腫瘤病人的死亡。甚到可避免手術(shù),放射與化療來實現(xiàn)治愈腫瘤。
本發(fā)明的藥物為口服藥,首選劑型為膠囊,裝入膠囊的磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)、抗壞血酸鹽、硝酸鈰、硒酸鈉均為粒度60目的藥粉。
本發(fā)明的藥物服用量為日服2次,每次用量按純藥計550mg,即磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)300mg、抗壞血酸鹽200mg、硝酸鈰40mg、硒酸鈉10mg。
本發(fā)明的藥物也可以和現(xiàn)有的各種藥用載體和/或賦形劑混合,制成其他口服劑型。
藥效實驗本實驗采用體外、針對體內(nèi)方法,研究已純化并修飾的羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-Chitin)惡性腫瘤細胞株體外粘附性、浸潤性、遷移性及腫瘤細胞外基質(zhì)酶的降解等影響,同時制備體內(nèi)動物模型,通過光鏡觀察和比較SCM-Chitin對腫瘤細胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)移等影響。
一、SCM-ChitinIII抑癌轉(zhuǎn)移作用的體外研究(一)CM-Chitin對惡性腫瘤細胞株體外粘附性的檢測用RPMI-1640(含15%小牛血清和雙抗)將細胞制成密度為2×106/ml細胞懸液,加入12孔板,每孔加入1×106/0.2ml,同時加入不同濃度的SCM-Chitin(200ug/ml,300ug/ml,400ug/ml,500ug/ml)。
對照組不加SCM-Chitin。置CO2細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)30分、60分、90分、120分鐘。取出后棄去未粘附細胞,胰酶消化,收集粘附細胞并計數(shù),計算、比較兩組粘附率。
(一)SCM-ChitinIII對ACC-M細胞浸潤抑制檢測1、濾膜準備選用孔徑為80μm濾膜(Polyvinylpyrrolidone-freepolycarbonate),其表面鋪有Matrigel(100μg/ml),下面鋪有Fibronectin(100μg/ml)或鼠尾膠原。
2、Transwell小室,在下室加培養(yǎng)液,上室加密度為2×106/ml腫瘤細胞懸液和不同濃度的SCM-Chitin,對照不加SCM-Chitin。置于CO2細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)8h、10h、12h后,取出濾膜,甲醇固定,HE染色,除去濾膜上表面的細胞,在放大400倍的光鏡下,計算、比較兩組通過濾膜進入下表面的細胞數(shù)。
(二)SCM-ChitinIII對腫瘤細胞遷移性的影響將密度為2×106/ml腫瘤細胞懸液接種至預(yù)先在濾膜下表面鋪有Fibronectin或鼠尾膠原的上室中。不同濃度的SCM-Chitin加入下室,對照不加SCM-Chitin。置于CO2細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6h、8h、10h、12h后,固定,染色,計算、比較兩組通過濾膜進入下表面的細胞數(shù)。
(三)SCM-ChitinIII對腫瘤細胞下基質(zhì)酶的降解作用1、H標記從EHS腫瘤中提取并純化的IV型膠原。
2、將標記的IV型膠原鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中。
3、加入不同濃度的SCM-Chitin,孵育3h,加入腫瘤細胞懸液,孵育24h、48h、72h后,提取上清夜,檢測IV型膠原水解度。
二SCM-ChitinIII抑制ACC-M轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究將實驗分為三組1、將ACC-M經(jīng)裸小鼠尾靜脈注射,造成肺轉(zhuǎn)移灶。
2、在注射ACC-M之前,服用不同濃度SCM-ChitinIII 6、8、10周。
3、在肺轉(zhuǎn)移灶形成后,服用不同濃度SCM-ChitinIII 6、8、10周通過光鏡觀察和比較不同濃度的SCM-ChitinIII對腫瘤細胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)移等影響。
三、磺酸化甲殼質(zhì)衍生物抑制黑色素瘤的轉(zhuǎn)移是通過細胞外基質(zhì)和酶的降解的研究材料和方法B16-BL6黑色素瘤是一種高轉(zhuǎn)移瘤株,獲得它是通過腫瘤浸潤期分離篩選而成,由Dr.J.J.Fidler腫瘤中心,TX提供。黑色素瘤細胞在MEM中單層培養(yǎng)保持存在,內(nèi)含7.5%FBS中有維生素溶液,丙酮酸鈉,非必須氨基酸和L-谷氨酸。
甲殼質(zhì)來自于螃蟹殼,用常規(guī)方法在使用前將其碎至45~60目。CM-甲殼質(zhì)的制備,羧甲基度在0.40,0.56,和0.80,在使用之前甲殼質(zhì)衍生物用PBS溶解。
肝素鈉鹽(Lot TLP 3856;活性197.1units/mg)從Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd,Osaka,日本購之。
純化的鼠的纖維連結(jié)蛋白從Seikagaku Kogyo Co,Ltd,東京日本購買。
純化的鼠的昆布寧和基底膜膠質(zhì)(含昆布寧、IV型膠原、磺酸化肝素蛋白糖和entactin)從Collaborative Reseerch,Inc獲得。
Bedford,MA,所有的試劑和介質(zhì)均有很低的內(nèi)毒素(<1.0mg/ml),是由比色法來測試的。(Pyrodck;Seikagaku Kogyo Co.Ltd.東京日本)細胞黏附微量試驗。通過資料所述的方法作出細胞浸潤模型,B16-BL6黑色素細胞在MEM培養(yǎng)基中[內(nèi)含5%FBS,加入0.3×μci/ml的[125I]碘脫氧尿嘧啶核苷(特異活性,200mci/mmol;新英格蘭原子能,Boswn,MA)]培養(yǎng)24小時,以對數(shù)生長相的方式進行。然后,細胞用2倍體積的溫的PBS洗,以除去未結(jié)合上的放射性校記物,再通過加入0.02%EDTA,溫度37℃,1分鐘后收集,在冷的沒有血清存在下的MEM下再被懸浮,以形成細胞單個懸浮。在125I-碘脫氧尿嘧啶核苷-瘤細胞,(2×104)以0.05~1/洞加入,微量培養(yǎng)洞預(yù)先用昆布寧包被處理。培養(yǎng)在37℃,30分鐘,然后用其4倍體積的PBS洗,除去未浸潤的細胞。與基質(zhì)結(jié)合上的瘤細胞用0.1N NaOH.0.1ml溶解之溶解物用棉花簽吸之,再用r-計數(shù)器測之放射性,結(jié)合率(細胞結(jié)合數(shù)量/底物)用下列公式表示之 結(jié)合遷移實驗。瘤細胞在細胞移動培養(yǎng)室內(nèi)沿著與纖維連結(jié)蛋白或昆布寧結(jié)合的基質(zhì)的梯度移動(Transwell Cell Culture Chembers即No.3422;Costar,Carmbrige,MA)參照或按McCarthy等人報導(dǎo)的方法,以及按改良的方法進行。不含有碳酸鹽的吡咯吲嗓聚維尼龍濾器,其孔徑是8.0μm的微孔(Nucltopore,Pleasanton,CA)。在培養(yǎng)濾器(膜)的下部預(yù)先用5μg的纖維連結(jié)蛋白或昆布寧,其體積是50μl來包被,然后室溫下過夜干燥。包被上的濾器膜用PBS充分地洗滌,然后迅速干燥之。腫瘤細胞的對數(shù)方式培養(yǎng)后用含1mM的EDTA的PBS(洗滌)收集。再用3倍的不含MEM的血清洗滌,再用含0.1%的BSA的MEM懸浮至濃度為2×106/ml。將懸浮的細胞(100μl)分別加入(實驗組)及不加入(對照組)實驗用藥到膜上室內(nèi),然后在5%CO2氣供給下進行數(shù)小時孵育。然后濾膜用甲烷固定,用蘇木精及伊紅染色。在濾膜上池的細胞用棉簽檫的方式移出。從膜上移至膜下(通過濾膜)進入下室各處的細胞在400倍顯微鏡下計數(shù),試驗的每一樣品均為一式三份進行。
侵潤試驗。腫瘤侵潤活性是由Albini等人報導(dǎo)的方法來進行的。也有些改良方法簡言之,用纖維連結(jié)蛋白或昆布寧來包被濾膜下表面(下池),方法同前述。用冷的PBS來稀釋基質(zhì)膠達100μg/ml,使濾膜(器)的上層表面含5μg/filter使其在室溫下遮蓋干燥。然后該濾膜分別地用基質(zhì)膠/昆布寧或基質(zhì)膠/纖維連結(jié)蛋白包上被膜,以后的程序與肝素轉(zhuǎn)移的方法相同。浸潤的細胞通過基質(zhì)膠與濾膜到濾膜器的下層表面,然后被計數(shù)。
肝素結(jié)合實驗?!?H〕肝素(放射活性0.49mci/mg;Du pont-New England,核研究產(chǎn)物Boston.MA)與昆布寧和BSA結(jié)合的定量試驗是通固相放免法,是在96孔組織培養(yǎng)板來完成的。昆布寧(3μg/60μl.每3L,)被加入,寶溫干燥過夜。含有緩沖液的BSA(2mg/ml在6mM的磷酸,0.1MNaCl,68μM CaCl,pH6.8的溶液中。)加到再孔之中,然后37℃孵育2小時。除去緩沖液,將〔3H〕-肝素標記物(肝素標記物的放射活性為5×104dpm/0.05μ℃g)在50μl的體積,37℃孵育2h,其中有未標記的肝素與甲殼質(zhì)衍生物存在與不存在兩個組。用含有0.1%3-〔(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio〕-1-Propanesulfonate的緩沖液洗3次,以除去未標記上的肝素標記物。被標記上的標記物通過用200μl的0.5N NaOH〔內(nèi)含硫酸十二酯)37℃孵育30′,然后液爍記數(shù)統(tǒng)計。
肝素酶的制備。肝素酶是從B16-BL6細胞中抽提出來的,使用肝素-瓊脂糖(偶聯(lián)體)和伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖(偶聯(lián)體)層析來完成。首先,用B16-BL6黑色素細胞(2×108),它來自于部分融合培養(yǎng)在DME∶F12為1∶1的混合基質(zhì),內(nèi)含5%的胎牛血清。提取是在0.5%Triton X-100,內(nèi)含1mM的苯甲磺酰氟,5mM N-ethylmaleimide,50mM Tris-HCl,pH7.5(緩沖液1)在4℃,30分鐘條件下進行。提取物被離心,30000×g,30分鐘。上清大約含有100mg的蛋白質(zhì)作為層析樣品。肝素-瓊脂糖柱用緩沖液1來平衡,流速為30ml/h。平衡后再用200ml的緩沖液1,200ml的0.2%Triton×-100∶20mM醋酸鈉pH6.0(即緩沖液2),以及用300ml的0.5M的氯化鈉20mM醋酸鈉,pH6.0(即緩沖液3),約用10小時洗之。結(jié)合上的肝素-蛋白質(zhì),用氯化鈉及醋酸鈉(20mM)pH6.0的梯度洗脫(0.15-1.2mol),有活性的肝素酶被收集,然后對緩沖液3進行透析,然后再離心1s30000×g,30分鐘。其上清夜上伴刀豆蛋白A-瓊脂糖柱(柱床體積為50ml),用緩沖液3來平衡。在用200ml緩沖液3洗柱4小時后,與半刀豆球蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)用200ml,內(nèi)含1.0Mα-methyl-D-mannopyranoside的緩沖液3來洗脫。洗脫物被收集后再被濃縮,用Amicon濃縮器,YM-10型號的膜來濃縮。部分純化的肝素酶的特異活性是通過對3H-標記的HS降解產(chǎn)物的分析來測定的這可在肝素酶抑制試驗中來討論。在研究中,使用肝素酶中含有0.89mg/ml的蛋白質(zhì)和降解60μg的HS(底物)/ml的蛋白質(zhì)/h.在37℃。
肝素酶抑制試驗。肝素酶抑制試驗的理論根據(jù)文獻提及的方法HS(M34000)是從小牛肺被純化而來,其部分被N-脫磺酸基然后用〔3H〕-乙醋酐進行乙?;S?H-標記的HS(5μg)來孵育,條件37℃.3h.加26.7μg的部分純化的肝素酶於50μl的0.2M醋酸鈉的緩沖液之中,pH5.6。其中加入各不同濃度的修飾后的甲殼質(zhì),以及空白等各管。孵育終結(jié)后加熱100℃.5′,煮沸后冷卻之,再離心18000g.5′?!?H〕HS的降解產(chǎn)物,取25μl的懸浮液用排組色譜層析進行分析,使用Waters600E高效液相系統(tǒng)(Waters Milford,MA)用一個生物膠TSK-30-XL柱(300×7.5mm;Bio-Rad,Richmond,CA)。洗柱用12.5mMTris-HCI0.15M NaCI,pH7.5,流率0.5ml/分鐘,在23℃下進行。樣品洗脫,塑管/30秒,7ml/塑管,每管加3ml的閃爍液(NaTionalDiagnostics,Manville,Nj),每部分(管)放射活性使用LS2800液爍計數(shù)儀來測定(Beckman Irvine,CA),(A).肝素酶的活性通過色譜〔3H〕HS℃峰整個半面積的減少來確定。
3H-標記的IV型膠原的制備。從EHS瘤株純化IV型前膠原,其前膠原是在C57BL/6小鼠體內(nèi)生長的(在Nakajima等人的文獻中論述的)其乙?;谩?H〕標記的乙酰酐來酰化,然后IV型膠原溶液(3mg/ml)溶于0.2M的乙酸中,再用2M的醋酸鈉調(diào)pH至8.0。再立即用1mci的〔3H〕乙酰酐(溶液50μl苯溶液)混合(100mci/mmol;ICN Radiochemicals,Lrvine CA)然后4℃孵育16h,〔3H〕標記的IV型膠原溶液在3ml 0.5M的醋酸之中再用4升的0.2M醋酸,4℃透析6h,如此反復(fù)4次,3H-標記的IV型膠原的放射活性應(yīng)是2220dpm/μg。
IV型膠原水解試驗?!?H〕標記的IV型膠原(20μg/孔)被放置在48-3L組織培養(yǎng)板的每孔內(nèi)(Costar,Cambriage MA)再吹干,過夜。將DMEF12介質(zhì)(500μl)加入到干燥了的IV型膠原膜上,再于37℃孵育3h。然后,再用新鮮的DMEF12介質(zhì),內(nèi)含各種硫酸化甲殼質(zhì)衍生物(400μg/ml)更換之,同樣37℃孵育3h。B16-BL6(5×104)細胞被懸浮在含有0.5%BSA(小牛血清)的DMEF12介質(zhì),然后在37℃下孵育,在humidifed孵育箱中(5%CO2∶95%空氣)。孵育48小時后,培養(yǎng)的上清被吸出,再用100μl的內(nèi)含50%三氯醋酸的水溶液來沉之,之后離心18000g,IV型膠原的水解活性是通過測定上清液的放射活性來計算。
統(tǒng)計學(xué)分析,對兩組進行T檢查進行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果甲殼質(zhì)衍生物對腫瘤細胞浸潤的抑制。我們首先在體外進行了甲殼質(zhì)衍生物和肝素對B16-BL6黑色素細胞生長的直接作用。瘤細胞用500μg/ml的甲殼質(zhì)衍生物來孵育不能使〔3H〕胸腺嘧啶與瘤細胞摻入。重組體IFN-r(103單位)/ml在體外有明顯的抑制細胞生長的作用。第二步我們進行了甲殼質(zhì)衍生物和肝素對黑色素瘤細胞浸潤作用的影響試驗,這要使用基底膜基質(zhì)再建的方式來完成。(表2)將瘤細胞加入到Transwell Cham bers的上室,在Transwell Cham bers的上室內(nèi)設(shè)其甲殼質(zhì)衍生物及肝素存在與空白等組。SCM-Chitin II和SCM-ChitinIII,指C6位上不同量的硫酸化和羧甲基基團的量,以及肝素均能抑制瘤細胞的浸潤,是通過基底物質(zhì)/纖維連結(jié)蛋白和基底物質(zhì)/包被的混布寧的通透來證實的(或移動)。而CM-Chitin和N-脫乙酰甲殼質(zhì)衍生物,SCM-殼聚糖就無此作用。
硫酸化甲殼質(zhì)衍生物對腫瘤細胞器的影響。腫瘤細胞被粘附在細胞外基質(zhì)和基底膜上,被認為是細胞浸潤的早期階段,這也是細胞轉(zhuǎn)移的過程。我們第二步的試驗,將證實硫酸化甲殼質(zhì)衍生物對B16-BL6細胞在預(yù)先用混布寧包被的基底物質(zhì)上的黏附的影響,其基底物質(zhì)主要是基底膜物質(zhì)125I-標記的B16-BL6細胞被加入到用昆布寧包被的Transwell,其試驗設(shè)有含有硫酸化甲殼質(zhì)衍生物及空白不含有的對照組。6-0-硫酸化甲殼質(zhì),以及肝素均具有明顯地抑制腫瘤細胞黏附于混布寧包被的Transwell。(P<0.01)反之,CM-甲殼質(zhì)確無此作用。SCM-甲殼質(zhì)確無此作用。SCM-甲殼質(zhì)I、II和III均有抑制瘤細胞的粘附作用,但它是隨硫酸化率的增高而作用加強。相反,SCM-殼聚糖確無此作用,即使6-0和N-端完全硫酸化也無該作用。
用SCM-甲殼質(zhì)III處理的瘤細胞或混布寧底物對瘤細胞遷移的影響。我們所做的實驗是使用SCM-甲殼質(zhì)III來預(yù)處理或不處理(空白)瘤細胞,以及混布寧底物,來看瘤細胞的移動率。瘤細胞移動到被固定在Transwell濾膜下面的混布寧處,被阻止是由于加入SCM-甲殼質(zhì)III或肝素〔3H〕-肝素預(yù)Transwell下室的緣故。用SCM-甲殼質(zhì)III或肝素預(yù)處理混布寧包被的濾膜引起腫瘤細胞移動受阻。相反瘤細胞不被預(yù)處理,則無此現(xiàn)象。CM-甲殼質(zhì)無論用什么方式來處理也沒有抑制瘤細胞的移動作用。我們觀察到,孵育2小時后〔3H〕-肝素與混布寧是主要的結(jié)合形式,在這一試驗中,〔3H〕-肝素加入到用混布寧包被的室孔內(nèi),其中有未標記的肝素或硫酸化甲殼質(zhì)的衍生物存在及不存在(空白)等組,作為抑制劑用。Fig4表明依據(jù)其不同濃度,未標記的肝素或SCM-甲殼質(zhì)III完全地抑制〔3H〕-標記肝素與混布寧的結(jié)合(即抑制了轉(zhuǎn)移)。相反,SCM-甲殼質(zhì)I和CM-甲殼質(zhì)對腫瘤細胞的浸潤、黏附和遷移沒有作用。我們發(fā)現(xiàn),加入SCM-甲殼質(zhì)III或沒標記的肝素1個小時內(nèi)有70-80%混布寧-〔3H〕-肝素結(jié)合體被拆開,表明SCM-甲殼質(zhì)III和肝素對混布寧的結(jié)合是可逆的。硫酸化甲殼質(zhì)衍生物對瘤細胞外基質(zhì)酶降解的影響。在浸潤急性期,瘤細胞所產(chǎn)生的蛋白水解酶和糖甙降解酶是使瘤細胞轉(zhuǎn)移的主要因子,其機制是破壞了由纖維連結(jié)蛋白和硫酸化氨基多糖所構(gòu)成的幾道結(jié)締組織屏障所改瘤細胞的轉(zhuǎn)移。值得注意的是,肝素能抑制黑色素瘤的硫酸化肝素的降解。因此,我們研究硫酸化的甲殼質(zhì)衍生物是否有一個抵抗凝的性質(zhì),SCM-甲殼質(zhì)III能抑制瘤細胞外基質(zhì)的酶的降解,SCM-甲殼質(zhì)III以及肝素通過存化的肝素酶能抑制HS的降解(硫酸化肝素),其肝素酶來自于B16-BL6細胞,同時還要取決于其濃度與方法。CM-甲殼質(zhì)不能抑制瘤細胞對再建基底膜基質(zhì)的浸潤以及除了1000μg/ml濃度外的一些濃度也不能抑制HS的降解。另一方面,SCM-甲殼質(zhì)IIIB16-BL6細胞對IV型3H〕-標記膠原的水解作用可直接用3H-標記的IV型前膠原來進一步研究,其前膠原可從EHS瘤株存化獲得。因為血清成份能影響來自于瘤細胞的IV型前膠原水解酶的活性。產(chǎn)生幾釋放(5)該實驗使用小牛血清(BSA)。在放入B16-BL6細胞前,將干燥的IV型膠原與甲殼質(zhì)衍生物和肝素孵育3小時,然后再加入B16-BL6細胞,用400μg/ml的SCM-甲殼質(zhì)來施實,IV型膠超過75%的降解被抑制,而用肝素大約有20%的降解被抑制。CM-甲殼質(zhì)在IV型膠原的水解中沒有抑制作用。在加入B16-BL6細胞3個小時后,再將SCM-甲殼質(zhì)III加入到IV型膠原中,其IV型膠原的水解活性沒被觀察到,以作為未施實對照組和比較。
四、稀土硝酸鈰對喉癌細胞株Hep-2生長的抑制作用1、材料和方法1.1癌細胞株人喉癌細胞株Hep-2細胞。
1.2硝酸鈰培養(yǎng)濃度將硝酸鈰加入培養(yǎng)體系中,調(diào)整其終濃度為0.05,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2mmol/L。
1.3喉癌Hep-2細胞單層培養(yǎng)方法取培養(yǎng)瓶內(nèi)指數(shù)生長期的Hep-2細胞,經(jīng)0.25%的胰酶消化后,用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)配成1×105/ml細胞懸液,接種于96孔板內(nèi),置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2培養(yǎng)。硝酸鈰組(10個復(fù)孔)在培養(yǎng)24h后加入硝酸鈰溶液并調(diào)節(jié)為相應(yīng)的實驗終濃度。連續(xù)培養(yǎng)3d,而對照組則連續(xù)培養(yǎng)4d。
1.4體外檢測硝酸鈰對Hep-2細胞生長影響的實驗方法1.4.1MTT實驗[2]癌細胞生長抑制率計算

1.4.2Hep-2細胞軟瓊脂克隆形成率測定[3]采用雙層瓊脂法,在每個平皿接種的細胞數(shù)為1×104個,其中瓊脂培養(yǎng)基中含有系列濃度梯度的硝酸鈰,以37℃、5%CO2在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10d,以104個細胞中形成的細胞克隆數(shù)計算。計算公式如下

1.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果均采用x±s表示,采用t或t′檢驗。
2、結(jié)果2.1硝酸鈰對喉癌Hep-2細胞增殖的影響硝酸鈰從0.4mmol/L起,細胞其細胞培養(yǎng)孔的光密度便開始下降,尤其是0.8-3.2mmol/L范圍中,光密度下降更為明顯,見表1。
表1 硝酸鈰對喉癌細胞增殖的影響(x±s)

注*與0濃度組比較,P<0.05
2.2硝酸鈰對喉癌Hep-2細胞軟瓊脂克隆形成率的影響在0.4mmol/L濃度以上,硝酸鈰對Hep-2細胞軟瓊脂克隆形成率呈抑制狀態(tài),見表2。
表2硝酸鈰對喉癌細胞克隆形成率的影響(x±s)

注*與0濃度組比較,P<0.05由實驗結(jié)果可見稀土元素鈰對惡性喉癌細胞有明顯的抑制增殖作用。亦有研究證實稀土元素對Lewis肺癌、Sigo肉瘤也有明顯的抑制作用。
五、硒酸鈉對人前列腺癌細胞PC-3細胞株活力和增殖的抑制1、材料和方法1.1材料、儀器 人前列腺癌細胞PC-3購自上海細胞所細胞庫,硒酸鈉和MTT購自Sigma公司,胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司,優(yōu)質(zhì)小牛血清(中國杭州四季青生物技術(shù)公司),3H-TdR購自中國原子能研究所。冷凍離心機(Heraeus公司,400R),CO2培養(yǎng)箱(Heraeus,BB5060UV),BHC-1300生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),酶標儀(Bio-Rad 550),ZT-III型多空細胞樣品收集器,Beckman LS-6500液閃計數(shù)儀。
1.2PC-3細胞的培養(yǎng) 將購買的細胞培養(yǎng)于RP-MI-1640培養(yǎng)基中(其中添加10%小牛血清,100u/ml青霉素100μg/ml鏈霉素),細胞傳代使用0.25%胰蛋白酶消化,每2天換1次培養(yǎng)液。當細胞培養(yǎng)至一定規(guī)模時,用胰酶消化獲得細胞,PBS多次洗滌,調(diào)節(jié)細胞密度至105個/ml,將細胞接種到96孔板中,每孔0.1ml,細胞接種后繼續(xù)培養(yǎng)24小時,然后用于不同的實驗。
1.3MTT法檢測細胞的活力 將96孔板中的細胞分為4組,分別為對照組,分別為對照組,硒酸鈉抵、中、高劑量組。對照組用普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),硒酸鈉作用組用添加了硒酸鈉的培養(yǎng)基培養(yǎng),藥物終濃度分別為5、10和15μmol/L。加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24和48小時,然后每孔加MTT200μl(5mg/ml),4小時后棄去培養(yǎng)基,每孔加二甲基亞砜100μl,酶標儀上測定A570nm。
1.43H-TdR摻入實驗 按上述方法以不同濃度的硒酸鈉處理細胞48小時后,加入3H-TdR(5×104Bq/cell),繼續(xù)培養(yǎng)12小時后,用胰酶消化細胞,用多空樣品收集器收集細胞于999型纖維膜上,烘干加閃爍液,于Beckman LS-6500液閃計數(shù)儀上計數(shù)〔13,14〕。
1.5統(tǒng)計處理 實驗結(jié)果用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計,統(tǒng)計方法為t檢驗,結(jié)果以(x±s)表示。
2.結(jié)果硒酸鈉對PC-3細胞活力的抑制。由表1可見硒酸鈉可抑制PC-3細胞活力。24小時作用時,硒酸鈉中劑量組A值顯著地低于對照組,高劑量組A值與對照組有極顯著差異。48小時作用時硒酸納低劑量組A值顯著低于對照組中劑量和高劑量組A值與對照組有極顯著差異。
表1 硒酸納對PC-3細胞活力的影響

與對照組相比,*P<0.05;#P<0.01。
硒酸納對PC-3細胞細胞增殖的抑制48小時的硒酸納處理后,可抑制PC-3細胞的增殖,低劑量組(2057±217)cpm與對照組(2110±268)cpm與對照組相比差異有顯著性,高劑量組(1704±165)cpm與對照組相比,差異有極顯著性,并且硒酸納對細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。
六、維生素C抗氧化的實驗研究研究證實,維生素C有很強的抗氧化作用,它將氧化物質(zhì)還原,保護了有生物活性的物質(zhì)不被氧化或延長發(fā)揮其生物活性。
維生素C抗氧化實驗1、原理維生素C能還原2,6二氯酚靛酚,同時本身被氧化成脫氫維生素C,既將氧化物質(zhì)還原,達到抗氧化作用。
維生素C 2,6二氯酚靛酚(氧化型)
脫氫維生素C 2,6二氯酚靛酚(還原型)2、材料與方法2.1材料2,6二氯酚靛酚(上海化學(xué)試劑公司)維生素C(既抗壞血酸)(上海醫(yī)藥公司)2.2方法2,6二氯酚靛酚在鹼性或中性環(huán)境中呈藍色,在酸性溶液中為淺紅色,被還原后無色。用2,6二氯酚靛酚滴定維生素C,滴至全部溶液呈淺紅色(約15稱不退色)既達終點。此時表示溶液中的維生素C已被全部氧化。以滴定時所需要2,6二氯酚靛酚的量計算出所消耗的維生素C的量。
公式N標·V標=N測·V測3、結(jié)果0.088mg維生素C氧化0.01N 2,6二氯酚靛酚1ml。
注由上述實驗及化學(xué)反應(yīng)式可見維生素C是很強的抗氧化劑。在組織與細胞內(nèi)將氧化物質(zhì)還原而達到保護SCM-Chitin的作用。
七、抗壞血酸和亞硒酸鈉對肝癌細胞影響的研究采用細胞倍增時間、分裂指數(shù)、生化變化和軟瓊脂克隆形成率等指標測定分化,研究了抗壞血酸和亞硒酸納對人肝癌細胞逆轉(zhuǎn)的作用。結(jié)果表明用抗壞血酸4mmol·L-1聯(lián)合亞硒酸納2μmol·L-1處理細胞后,細胞的生長率和有絲分裂指數(shù)都顯著下降。一些與細胞惡性表型有關(guān)的指標,如細胞表面電荷明顯下降電泳率從1.74μm·s-1·V-1·cm-1下降到0.91μm·s-1·V-1·un-1,甲胎蛋白含量從331μg·g-1(蛋白)下降到90μg·g-1,γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性從0.74U·g-1(蛋白)下降到0.19U·g-1。與細胞分化有關(guān)的指標,如酪氨酸-α-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)的活性從14.7μmoml·g-1(蛋白)升高至42.6μmoml·g-1,軟瓊脂克隆形成能力下降94.7%。由此可見,抗壞血酸和亞硒酸納聯(lián)合能誘導(dǎo)肝癌細胞在分化,逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性表型。
具體實施例方式
1、羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-Chitin)的制備磺酸黃甲殼質(zhì)來自于螃蟹殼,用常規(guī)方法在使用前將其粉碎至45~60目。CM-甲殼質(zhì)制備,羧甲基度可用0.40,0.56,和0.80的?;撬峄募讱べ|(zhì)和CM-甲殼質(zhì)是用Horton和Just的-般方法制備的。簡言之,甲殼質(zhì)和CM-甲殼質(zhì)是重蒸的吡啶來除去水然后在用吡啶懸出來處理?;酋B人?吡啶的混合物加入到甲殼質(zhì)懸液之中,混合物在攪拌下沸騰回流90分鐘。上清夜被輕輕地傾棄,將殘渣懸在冰水之中,然后用2MnaOH調(diào)pH9。加以醇使沉淀形成,再在水中溶之,然后用無離子水透析,除去游離的鹽,然后凍干。
取制得的磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)300重量份和購得的抗壞血酸鹽200重量份,硝酸鈰40重量份,硒酸鈉10重量份粉碎成60目的粉末,裝入現(xiàn)有的藥用膠囊,即完成本發(fā)明的藥物的制備。
權(quán)利要求
1.一種殺滅癌細胞,抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物,其特征是由以下重量份數(shù)比的原料組成磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)250-350、抗壞血酸鹽150-250、硝酸鈰30-50、硒酸鈉5-15。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種殺滅癌細胞,抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物,其特征是所用原料重量份數(shù)比為磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)300、抗壞血酸200、硝酸鈰40、硒酸鈉10。
全文摘要
一種殺滅癌細胞,抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物,本發(fā)明的藥物由以下重量份數(shù)比的原料組成磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)250-350、抗壞血酸鹽(維生素C)150-250、硝酸鈰30-50、硒酸鈉5-15。發(fā)明的積極效果在于利用對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用SCM-ChitinIII和對惡性腫瘤細胞有很強的殺滅能力稀土元素鈰及抗氧化劑硒和維生素C組成防治惡性腫瘤的藥物,其中的各原料成分相互協(xié)同,在抑制惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和殺滅腫瘤細胞具有突出的效果,有望使惡性腫瘤得到治愈,或大大地減少腫瘤病人的死亡。甚到可避免手術(shù),放射與化療來實現(xiàn)治愈腫瘤。
文檔編號A61K33/04GK1927221SQ20061001681
公開日2007年3月14日 申請日期2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者馮延民 申請人:姚春陽, 馮延民
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