專利名稱：抑制癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活化p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)，使p53蛋白質(zhì)定位于核的方法。另外，本發(fā)明還涉及含有促進(jìn)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活化的物質(zhì)的醫(yī)藥組合物。
背景技術(shù)：
Synoviolin是作為在來源于風(fēng)濕患者滑膜細(xì)胞過量表達(dá)的膜蛋白質(zhì)而發(fā)現(xiàn)的新蛋白質(zhì)(WO02/052007)。并且，經(jīng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究表明，Synoviolin是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的必需分子。
由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測系統(tǒng)顯示Synoviolin具有RING finger基元。該基元常見于在蛋白質(zhì)的泛素化中發(fā)揮重要作用的叫做E3泛素連接酶的酶中，事實(shí)上，證明Synoviolin具有E3泛素連接酶特征之一的自身泛素化活性(WO02/052007)。
要指出的是，p53基因定位于第17號染色體p13，是對癌細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖非常重要的癌抑制基因。p53蛋白質(zhì)識別DNA上的特異堿基序列[5′-(A/T)GPyPyPy-3′]，促進(jìn)waf1/cip1、GADD45、BAX等特定基因的轉(zhuǎn)錄活化。而且，已知其具有下述生理活性(i)抑制其他多種基因的轉(zhuǎn)錄、(ii)與SV40大T抗原、腺病毒EIB蛋白質(zhì)、人類乳頭瘤病毒E6等病毒性癌基因或mdm2等細(xì)胞性癌基因結(jié)合、(iii)與含有錯(cuò)配的DNA特異結(jié)合等。
因此，為了發(fā)現(xiàn)抑制癌的物質(zhì)，研究控制p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)功能的分子是重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供促進(jìn)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活化的方法，以及促進(jìn)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活化的醫(yī)藥組合物。
為了解決上述課題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究。于是在詳細(xì)分析Synoviolin同源敲除動(dòng)物時(shí)發(fā)現(xiàn)與野生型相比，觀察到更多發(fā)生調(diào)亡的細(xì)胞，而且，與調(diào)亡的誘導(dǎo)關(guān)系密切的p53蛋白質(zhì)定位于核內(nèi)，強(qiáng)表達(dá)。另外，發(fā)現(xiàn)通過抑制Synoviolin的功能，p53癌抑制基因或p53癌抑制蛋白質(zhì)活化，阻止了癌細(xì)胞的增殖，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所述(1)醫(yī)藥組合物，其含有促進(jìn)p53癌抑制基因活化或p53蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)。
(2)(1)所述的醫(yī)藥組合物，其中，促進(jìn)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活化的物質(zhì)為抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)。
(3)(2)所述的醫(yī)藥組合物，其中，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)為針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
(4)(3)所述的醫(yī)藥組合物，其中，編碼Synoviolin的基因含有序列1所示的堿基序列。
(5)(3)所述的醫(yī)藥組合物，其中，siRNA以序列1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。
(6)(1)～(5)中任意一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其用于治療癌癥。
(7)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)的活化方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
(8)使p53蛋白質(zhì)定位于核的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
(9)癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，使p53蛋白質(zhì)定位于核。
(10)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，對定位于核的p53蛋白質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行放射線照射或紫外線照射。
(11)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，使含有定位于核的p53蛋白質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)一步與抗癌劑接觸，或?qū)υ摷?xì)胞周圍的脈管實(shí)施栓塞。
(12)將p53蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的一部分磷酸化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
(13)(12)所述的方法，其中，氨基酸殘基的一部分為第15位絲氨酸殘基。
(14)活化磷酸化酶的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
(15)(14)所述的方法，其中，磷酸化酶為ATM、ATR、或與它們具有同樣活性的酶等。
(16)誘導(dǎo)p21蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其中p53蛋白質(zhì)通過抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能而活化，由此誘導(dǎo)p21蛋白質(zhì)表達(dá)。
(17)癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，由p53蛋白質(zhì)誘導(dǎo)p21蛋白質(zhì)的表達(dá)。
(18)抑制p53蛋白質(zhì)泛素化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
(19)(7)～(18)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，Synoviolin表達(dá)的抑制利用針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA進(jìn)行。
(20)(7)～(18)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，抑制Synoviolin功能是抑制Synoviolin與p53蛋白質(zhì)結(jié)合的功能。
(21)(19)所述的方法，其中，編碼Synoviolin的基因含有序列1所示的堿基序列。
(22)(19)所述的方法，其中，siRNA以序列1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。


圖1為顯示Synoviolin同源敲除小鼠胎仔成纖維細(xì)胞(MEFs)的免疫組織染色結(jié)果的照片。
圖2為顯示syno-/-的胚胎的抗p53抗體免疫組織染色結(jié)果的照片。
圖3為顯示p53相關(guān)的蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果照片。
圖4為顯示鑒定syno-/-的MEF培養(yǎng)細(xì)胞中p53的磷酸化部位的結(jié)果的照片。
圖5為由針對Synoviolin的siRNA處理而亢進(jìn)的Ser15的磷酸化因咖啡因的添加受到了怎樣的影響的蛋白質(zhì)印跡法照片。
圖6為顯示由針對Synoviolin的siRNA處理，p53和p21的表達(dá)增多的蛋白質(zhì)印跡法照片。
圖7為用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的結(jié)果圖。
圖8為用抗Synoviolin抗體(10Da)對組織陣列進(jìn)行免疫染色的結(jié)果的照片。
圖9為用抗Synoviolin抗體(10Da)對組織陣列進(jìn)行免疫染色的結(jié)果的照片。
圖10為觀察導(dǎo)入GFP野生型p53的細(xì)胞的p53定位的照片。
圖11為使GFP野生型p53和FLAG野生型Synoviolin強(qiáng)表達(dá)，用稀釋400倍的第一抗體α-FLAG抗體、稀釋200倍的第二抗體α-小鼠IgG-TRITC或1μM DAPI對核進(jìn)行染色，觀察p53的定位的照片。
圖12為使GFP野生型p53和FLAG Synoviolin C307S強(qiáng)表達(dá)，用稀釋400倍的第一抗體α-FLAG抗體、稀釋200倍的第二抗體α-小鼠IgG-TRITC或1μM DAPI對核進(jìn)行染色，觀察p53的定位的照片。
圖13為利用MBP-Synoviolin dTM-His的顯示GST-p53體外泛素化反應(yīng)的照片。
圖14為利用Synoviolin RNAi的RA滑膜細(xì)胞中p53 mRNA量的曲線。
圖15為制備的p53結(jié)合區(qū)域缺失變異體的示意圖和進(jìn)行結(jié)合分析的結(jié)果的圖。
圖16為對p53結(jié)合區(qū)域缺失變異體和通過35S-p53進(jìn)行GSTpulldown assay的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明的特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，使p53(p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì))定位于核并活化，由此抑制癌。本發(fā)明是基于下述發(fā)現(xiàn)完成的如果抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，則p53被磷酸化酶磷酸化，p53活化，于是作為依賴于細(xì)胞周期蛋白的磷酸化酶抑制劑的p21的表達(dá)提高，結(jié)果防止癌細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，由此抑制癌的發(fā)生或增殖，以及Synoviolin通過泛素連接酶抑制p53的表達(dá)。
1.p53的活化(1)Synoviolin的表達(dá)和/或功能的抑制和p53的活化如將正常細(xì)胞暴露于紫外線等，則細(xì)胞內(nèi)的p53活化，其結(jié)果是細(xì)胞增殖被抑制，因此可通過升高p53的濃度來阻止癌細(xì)胞增殖。也就是說，當(dāng)p53不發(fā)揮作用時(shí)，癌細(xì)胞的增殖不停止，向癌發(fā)展。事實(shí)上，p53在正常個(gè)體的細(xì)胞中幾乎觀察不到，而在約半數(shù)的來源于癌患者的細(xì)胞中發(fā)生該p53的缺失變異。而且，如沒有發(fā)生這種變異，那么就是p53的控制機(jī)關(guān)發(fā)生某種變異而失去了癌抑制功能。因此，要抑制癌的發(fā)展，必須使p53有效發(fā)揮作用。
在本發(fā)明中，由于將p53的活化作為治療癌的有效方法之一，因此著眼于Synoviolin的功能。制備Synoviolin同源敲除動(dòng)物，進(jìn)行了詳細(xì)研究，結(jié)果觀察到比野生型更多的發(fā)生調(diào)亡的細(xì)胞。即，發(fā)現(xiàn)如果抑制Synoviolin的功能，則可促進(jìn)與調(diào)亡密切相關(guān)的p53的活化，Synoviolin的功能抑制與癌抑制相關(guān)連。
在此，“Synoviolin的表達(dá)”是指編碼Synoviolin的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或由這些的轉(zhuǎn)錄、翻譯生成Synoviolin蛋白質(zhì)。另外，“Synoviolin的功能”是指抑制p53的活化，上述Synoviolin的功能也包括Synoviolin與p53結(jié)合的功能和將p53泛素化的功能。因此，“抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能”是指與野生型Synoviolin基因或蛋白質(zhì)的量、功能或活性相比，其量、功能或活性降低或消失。上述“抑制”包括抑制功能和表達(dá)二者、以及抑制任何一方。
由于Synoviolin促進(jìn)p53的泛素化，因此可通過抑制Synoviolin與p53的結(jié)合抑制p53的泛素化，假如抑制了p53的泛素化，則p53被活化，進(jìn)一步意味著癌將受到抑制。
另外，調(diào)亡是指細(xì)胞自身啟動(dòng)的程序性細(xì)胞死亡，其特征是細(xì)胞核的染色體聚集、細(xì)胞核片段化、細(xì)胞表面微絨毛消失、細(xì)胞質(zhì)聚集、Casp蛋白酶活化、線粒體膜電位消失等。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生上述特征時(shí)，判定為發(fā)生調(diào)亡。
在本發(fā)明中，如對胚胎(胎児胚)的p53進(jìn)行免疫染色，則p53在Synoviolin homo剔除小鼠胚胎全身強(qiáng)表達(dá)。另外，從Synoviolin homo剔除小鼠胚胎分離的胎仔成纖維細(xì)胞(MEFs)與從野生型分離的相比表達(dá)也增強(qiáng)，而且p53在核內(nèi)強(qiáng)勢定位。這種核定位在野生型中完全沒有觀察到。另外，如使Synoviolin和p53強(qiáng)表達(dá)，則p53與Synoviolin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)共定位。這說明通過抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，可使p53向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步，Synoviolin homo剔除小鼠胎仔MEFs表現(xiàn)強(qiáng)放射線敏感性、紫外線敏感性。因此，在本發(fā)明中，抑制癌細(xì)胞中Synoviolin的表達(dá)和/或功能，使p53向核內(nèi)轉(zhuǎn)移后，如對p53進(jìn)行放射線照射或紫外線照射、則可有效抑制癌細(xì)胞的增殖。對放射線照射方法沒有特別限定，可照射例如1～10Gy的γ線。另外，對于紫外線照射，可使用適當(dāng)?shù)淖贤饩€照射裝置(FUNACOSHI公司、Derumara公司、KEYENCE公司等生產(chǎn))照射紫外線(波長100～400nm、優(yōu)選290～400nm)。
進(jìn)一步，在本發(fā)明中，可使含有定位于核中的p53的細(xì)胞(特別是癌細(xì)胞)進(jìn)一步與抗癌劑接觸，從而有效地抑制癌?；蛘撸瑢ι鲜龊卸ㄎ挥诤酥械膒53的細(xì)胞的癌細(xì)胞周圍的脈管(例如血管或淋巴管)實(shí)施栓塞，由此可抑制癌。
“抗癌劑”包括烷基化劑、抗代謝藥、微管抑制劑、鉑配位化合物、分子靶向治療藥等。作為這些抗癌劑的具體例子，可列舉以下化合物，但并不限定于此。
<烷基化劑>
氮芥類環(huán)磷酰胺(Endoxan)、苯丙氨酸氮芥(Melphalan)等乙撐亞胺類塞替哌(Thiotepa)等烷基磺酸酯類白消安(Busulphan)等亞硝基脲類尼莫司汀(Nimustine)、洛莫司汀(Lomustine)等<抗代謝藥>
葉酸衍生物甲氨蝶呤等嘌呤類巰嘌呤(Mercaptopurine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)等嘧啶類衍生物5-氟尿嘧啶、替加氟(Tegafur)、卡莫氟(Carmofur)等<微管抑制藥>
植物堿藥物(Vinca alkaloid)長春新堿、長春堿等紫杉烷(taxane)泰素、多烯紫杉醇(docetaxel)等<類激素藥>
他莫昔芬(Tamoxifen)、雌激素等<鉑配位化合物>
順鉑、卡鉑(Carboplatin)等<分子靶向治療藥>
伊馬替尼(Imatinib)、利妥?，?Rituximab)、吉非替尼(Gefitinib)等。
用于使癌細(xì)胞與抗癌劑接觸的方法可采用向含有定位于核中的p53的細(xì)胞或組織(癌細(xì)胞或癌組織)添加抗癌劑的方法、或向癌患者或患癌動(dòng)物施用抗癌劑的方法等。此時(shí)對抗癌劑的處理量沒有特別限定，如為添加的情況，則為100pM～100μM，優(yōu)選為1nM～10μM。向動(dòng)物體內(nèi)給藥時(shí)，例如使用Endoxan作為抗癌劑時(shí)，為0.1～100mg/kg/day，優(yōu)選為2～25mg/kg/day。對于Endoxan以外的抗癌劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)設(shè)定給藥量和添加量。
對含有定位于核中的p53的細(xì)胞的癌細(xì)胞周圍的脈管實(shí)施栓塞，可使含有定位于核中的p53的癌細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)或組織周圍形成血栓，對于血管或淋巴管也可以利用脂肪形成栓塞、也可以利用空氣、氣體形成栓塞。
(2)抑制Synoviolin表達(dá)和/或功能促使p53磷酸化和活化進(jìn)一步，本發(fā)明的特征在于，通過將p53的氨基酸殘基的一部分磷酸化從而使p53活化。與p53的活化相關(guān)的作為磷酸化對象的氨基酸殘基優(yōu)選為p53氨基酸序列中的絲氨酸殘基，進(jìn)一步優(yōu)選15位絲氨酸殘基(Ser15)。
如p53的Ser15被磷酸化，則p53的表達(dá)升高，轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，其結(jié)果是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加。ATM(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變)、ATR(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張相關(guān)的)等磷酸化酶與該p53 Ser15的磷酸化密切相關(guān)。ATM是人常染色體隱性遺傳疾病毛細(xì)血管擴(kuò)張性運(yùn)動(dòng)失調(diào)癥的原因蛋白質(zhì)，其具有感知DNA的損傷，將癌抑制基因p53磷酸化，從而控制細(xì)胞增殖的功能。ATR是ATM家族中的一員，其是被在很大范圍被化學(xué)療法藥物、紫外線照射、或蛋白質(zhì)磷酸化酶的抑制誘導(dǎo)，且參與不涉及ATM的p53活化的磷酸化酶。
已知咖啡因抑制ATM和ATR的功能，在本發(fā)明中，在Synoviolin表達(dá)和/或功能抑制實(shí)驗(yàn)中通過使用咖啡因，表明Synoviolin調(diào)節(jié)ATM和ATR的活化。
即，在咖啡因不存在時(shí)，如抑制Synoviolin表達(dá)和/或功能，則p53活化。而在咖啡因存在的情況下，如果抑制Synoviolin表達(dá)和/或功能，則p53的活化被抑制。另外，還已知咖啡因抑制ATM和ATR的活性(p53的磷酸化)。
因咖啡因抑制ATM和ATR的活性，即使抑制了Synoviolin的表達(dá)和/或功能，p53也不活化，由此可認(rèn)為機(jī)理如下如果抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，則ATM和ATR被活化，從而誘導(dǎo)p53活化。由此，可認(rèn)為由于抑制了Synoviolin的表達(dá)和/或功能，這些磷酸化酶的活性提高。因此，本發(fā)明的特征在于通過抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，促進(jìn)磷酸化酶活化。與ATM和ATR具有同樣活性的酶等(磷酸化p53的酶等)，DNA-PK或GSK3β等也可以。
作為由p53 Ser15的磷酸化誘導(dǎo)表達(dá)的物質(zhì)，已知有p21蛋白質(zhì)。p21起周期蛋白依賴性磷酸化酶(CDK)活性抑制劑的作用，是通過抑制CDK活性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)。CDK是抑制細(xì)胞周期的主要物質(zhì)，與作為其伙伴的周期蛋白質(zhì)共同發(fā)揮作用，例如，控制由細(xì)胞休眠狀態(tài)的G1期向DNA復(fù)制期的S期的順利轉(zhuǎn)變。在癌細(xì)胞中，如果p53活化，則作為CDK抑制劑的p21的表達(dá)升高，因此妨礙了癌細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)變，從而抑制癌。因此，如上所述，本發(fā)明的特征在于，通過抑制Synoviolin表達(dá)和/或功能，提高p53的活化，誘導(dǎo)p21的表達(dá)，引起CDK的抑制，由此抑制癌。
(3)p53泛素化的抑制和穩(wěn)定化Synoviolin使p53泛素化。泛素化是指作為蛋白質(zhì)降解標(biāo)記分子的泛素對蛋白質(zhì)翻譯后的修飾反應(yīng)。以往認(rèn)為該泛素化的生理意義在于用于送往蛋白體(proteosome)類蛋白質(zhì)分解機(jī)構(gòu)的標(biāo)記物修飾。通過后來的研究，目前將泛素化的意義定位為控制蛋白質(zhì)功能的可逆蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)。
具體而言，泛素化是通過泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)等酶協(xié)同的級聯(lián)反應(yīng)，在作為基體的蛋白質(zhì)上鍵合枝狀泛素分子，形成聚泛素鏈的過程。該聚泛素鏈通過泛素分子內(nèi)的48號賴氨酸殘基的ε-氨基而形成，成為26S蛋白酶體分解的信號，引導(dǎo)分解目標(biāo)蛋白質(zhì)。
本發(fā)明以通過抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能使p53活化為特征，這種p53的活化與上述p53的磷酸化機(jī)理不同，其著眼于抑制p53的泛素化這一機(jī)理。
(4)Synoviolin和p53結(jié)合部位的確定Synoviolin和p53結(jié)合部位通過下述方法確定例如，可制備多種Synoviolin氨基酸序列中某區(qū)域缺失的p53結(jié)合部位缺失突變體，通過對35S-p53進(jìn)行GST Pull-down分析來確定。具體地，將上述Synoviolin的p53結(jié)合部位缺失突變體以GST融合蛋白質(zhì)的形式在大腸菌等中表達(dá)，通過GST Pull-down分析法確定與35S-p53蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間結(jié)合。
由此，判定Synoviolin的p53結(jié)合部位為從Synoviolin蛋白質(zhì)所含的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的第236號至第270號的35個(gè)氨基酸殘基。
如上所述，Synoviolin促進(jìn)p53的泛素化。因此，通過抑制備為Synoviolin功能之一的與p53的結(jié)合功能，抑制了p53的泛素化，從而p53被活化。參與與p53結(jié)合的Synoviolin蛋白質(zhì)區(qū)域優(yōu)選為Synoviolin氨基酸序列的236號至第270號的區(qū)域。因此，優(yōu)選主要選擇上述區(qū)域作為用于抑制結(jié)合的目標(biāo)區(qū)域。為了抑制Synoviolin和p53的結(jié)合，可以例如使Synoviolin的拮抗劑(低分子化合物、肽等)作用，通過結(jié)合分析法(binding assay)、酵母雙雜交法或泛素化活性測定法進(jìn)行評價(jià)?；蛘撸部梢允棺R別Synoviolin的上述236號至第270號區(qū)域的抗體與Synoviolin反應(yīng)，通過這些方法抑制Synoviolin和p53的結(jié)合。
2.Synoviolin表達(dá)和/或功能抑制以及活性抑制為了使p53活化，采用抑制Synoviolin表達(dá)和/或功能的方法。
對Synoviolin表達(dá)和/或功能的抑制沒有特別的限定，可以利用例如RNA干涉(RNAi)。設(shè)計(jì)和合成針對Synoviolin基因的siRNA(小分子干擾RNA)，將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，由此可引起RNAi。
RNAi是指dsRNA(雙鏈RNA)特異性且選擇性地與目標(biāo)基因結(jié)合，并切斷該目標(biāo)基因，由此有效抑制其表述的現(xiàn)象。例如，如將dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則抑制(敲減)與該RNA序列相同的基因的表達(dá)。
siRNA的設(shè)計(jì)可如下所述進(jìn)行。
(a)只要是編碼Synoviolin的基因即可沒有特別限制，可將任意區(qū)域作為候補(bǔ)。例如，在人的情況下，可將GenBank登錄號AB024690(SEQ ID NO.1)的任意區(qū)域作為候補(bǔ)。
(b)從選擇的區(qū)域中選擇以AA開始的序列，該序列的長度為19～25個(gè)堿基，優(yōu)選為19～21個(gè)堿基?？梢赃x擇序列的GC含量例如為40～60％的序列。具體而言，可使用SEQ ID NO.1中所示的堿基序列中，含有選自下述堿基序列的至少一個(gè)序列的DNA作為siRNA的目標(biāo)序列。特別優(yōu)選將(i)(SEQ ID NO.3)、(ii)(SEQ ID NO.4)、(vi)(SEQ ID NO.8)、(vii)(SEQ ID NO.9)、(viii)(SEQ ID NO.10)作為目標(biāo)。
(i)AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA(SEQ.ID.No.3)(ii)AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG(SEQ.ID.No.4)(iii)AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT(SEQ.ID.No.5)(iv)AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT(SEQ.ID.No.6)(v)AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT(SEQ.ID.No.7)(vi)AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA(SEQ.ID.No.8)(vii)AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA(SEQ.ID.No.9)(vii)AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG(SEQ.ID.No.10)(ix)AA CATCCACACACTGCTGGAC GC(SEQ.ID.No.11)(x)AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC(SEQ.ID.NO.12)(xi)AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT(SEQ.ID.NO.13)(xii)AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG(SEQ.ID.NO.14)(xiii)AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT(SEQ.ID.NO.15)(xiv)AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA(SEQ.ID.NO.16)將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞可采用下述方法將在體外合成的siRNA與質(zhì)粒DNA連接，將其導(dǎo)入細(xì)胞的方法、將2條RNA退火的方法等。
另外，本發(fā)明中，為了得到RNAi效果，可以使用shRNA。shRNA稱為短發(fā)夾RNA(short haipin RNA)，是一條鏈的一部分區(qū)域具有與其他區(qū)域形成互補(bǔ)鏈的莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)的RNA分子。
shRNA可設(shè)計(jì)為其一部分形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例如，以某區(qū)域的序列作為序列A，與序列A互補(bǔ)的鏈作為序列B，則設(shè)計(jì)為以序列A、間隔區(qū)、序列B的順序使這些序列存在于一條RNA鏈上，整體為45～60個(gè)堿基的長度。序列A為目標(biāo)Synoviolin基因(SEQ ID NO.1)的一部分區(qū)域的序列，對目標(biāo)區(qū)域沒有特別限定，可將任意的區(qū)域作為候補(bǔ)。序列A的長度為19～25個(gè)堿基，優(yōu)選為19～21個(gè)堿基。
3.藥物組合物本發(fā)明中制備的shRNA、siRNA是抑制Synoviolin表達(dá)和/或功能的物質(zhì)，可作為活化p53的藥物組合物(特別是癌基因治療劑)使用。
將本發(fā)明的藥物組合物用作癌的基因治療劑時(shí)，對使用部位沒有特別限定，使用對象可以為腦癌、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、各種白血病(例如急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、成人T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤)等。上述癌可以為原發(fā)灶、可以為轉(zhuǎn)移的、也可以為與其他疾病并發(fā)的。
將本發(fā)明的藥物組合物用作基因治療劑時(shí)，除了通過注射將本發(fā)明的藥物組合物直接給藥外，還可列舉施用整合了核酸的載體的方法。作為上述載體，可列舉腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒(vaccinia yirus)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)載體、慢病毒(Lentivirus)載體等，可通過使用這些病毒載體更有效地施用。
另外，也可將本發(fā)明的藥物組合物導(dǎo)入核糖體等磷脂小胞體，施用該小胞體。將保有siRNA、shRNA的小胞體通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入規(guī)定的細(xì)胞。然后，將得到的細(xì)胞通過例如靜脈、動(dòng)脈等施用于全身。也可以對腦等局部用藥。
本發(fā)明的藥物組合物的給藥量因年齡、性別、癥狀、給藥途徑、給藥次數(shù)、劑型而不同，例如為腺病毒時(shí)，給藥量為每日每次106～1013個(gè)左右，間隔1～8周給藥。
為了將siRNA或shRNA導(dǎo)入目的組織或器官，可以使用市售的基因?qū)朐噭┖?例如アデノエクスプレスクロ一ンテツク公司)。
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
MEF培養(yǎng)細(xì)胞p53活化的研究用蛋白質(zhì)印跡法檢測Synoviolin剔除小鼠(syno-/-)胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)的p53，進(jìn)一步將細(xì)胞通過免疫組織染色確認(rèn)。
即，免疫染色法是將MEFs按照常規(guī)方法固定在載玻片上，用抗p53抗體(小鼠單克隆抗體BDBecton，Dickinson公司)進(jìn)行免疫染色。用0.3％牛血清白蛋白(BSA)稀釋的抗p53抗體(BD10μg/ml)與用0.3％牛血清白蛋白(BSA)封閉了30分鐘的樣品在室溫下免疫反應(yīng)60分鐘。將反應(yīng)后的樣品用PBS洗滌后，將TRITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Dako公司)作為第二抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。用熒光顯微鏡確認(rèn)與抗p53抗體免疫反應(yīng)的抗原。
結(jié)果，確認(rèn)syno-/-的MEFs培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)生p53活化的細(xì)胞與野生型相比要多(圖1，“MEF-/-”的圖)。
syno-/-小鼠p53活化的研究syno-/-小鼠p53活化的研究用胚胎通過免疫染色進(jìn)行。
即，syno-/-胎仔的免疫染色是按照常規(guī)方法將組織固定在載玻片上，采用VECTASTAIN ABC試劑盒(VECTOR公司)進(jìn)行的。稀釋為5μg/ml的抗p53抗體FL393在室溫下與用封閉劑封閉30分鐘的樣品免疫反應(yīng)60分鐘。用PBS洗滌反應(yīng)后的樣品，將HRP標(biāo)記抗兔IgG抗體作為第二抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。與抗p53抗體免疫反應(yīng)的抗原通過基于HRP活性的3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽的顯色進(jìn)行確認(rèn)。作為對比染色，進(jìn)行甲基綠染色。
結(jié)果，確認(rèn)syno-/-胚胎中的p53活化了(圖2)。
Synoviolin對p53的效果syno-/-的MEF培養(yǎng)細(xì)胞中的p53通過蛋白質(zhì)印跡法檢測。
即，將各種細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(50mM Tris-HCl(Ph8.0)、150mMNaCl、1％NP40、1mM PMSF、0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)、2μg/ml亮抑酶肽、2μg/ml抑蛋白酶肽、2μg/ml抑胃酶肽)制備破碎細(xì)胞組分。然后，用SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分離破碎的細(xì)胞部分。進(jìn)行SDS-PAGE后，來自細(xì)胞的蛋白質(zhì)通過電印跡法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜。對該NC膜用加入5％脫脂奶粉的Tris緩沖生理鹽水(TBS)在室溫下封閉1小時(shí)后，將抗p53抗體c-terminalaa；195-393或FL393用加入5％脫脂奶粉的TBS稀釋，在室溫免疫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后的NC膜用0.1％Tween 20/TBS洗滌，將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗兔IgG抗體作為第二抗體在室溫下免疫反應(yīng)1小時(shí)，用0.1％Tween 20/TBS洗滌，檢測HRP活性，由此檢測目的抗原。HRP活性檢測使用ECL試劑盒(Amersham社)(ClinicalChemistry.25，p1531，1979)。
結(jié)果，通過蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)syno-/-的MEF培養(yǎng)細(xì)胞中的p53表達(dá)量增加(圖3)。
syno-/-的MEF培養(yǎng)細(xì)胞中的p53的磷酸化部位的鑒定在本實(shí)施例中，用抗p53抗體通過蛋白質(zhì)印跡法對p53的磷酸化部位進(jìn)行鑒定。
即，用識別p53(SEQ ID NO.17)的不同絲氨酸殘基的磷酸化的4種抗磷酸化p53單克隆抗體(Phospho-p53(ser15)、Phospho-p53(ser20)、Phospho-p53(ser37)和Phospho-p53(ser46)；Becton，Dickinson公司)，將MEF細(xì)胞的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離，實(shí)施蛋白質(zhì)印跡法。蛋白質(zhì)印跡法的操作，除了使用抗磷酸化p53單克隆抗體作為第一抗體，抗小鼠IgG山羊-HRP作為標(biāo)記抗體以外，其他如實(shí)施例3所述。
結(jié)果，在syno-/-的MEF培養(yǎng)細(xì)胞中，p53的氨基酸序列(SEQ IDNO.17)中，第15位絲氨酸殘基的磷酸化顯著(圖4)。在圖4中，左上圖為第15位絲氨酸殘基磷酸化得到的。53kDa附近的帶明顯較濃。
Ser15磷酸化亢進(jìn)的機(jī)理研究將確認(rèn)表達(dá)野生型p53的RKO(來自人大腸癌的細(xì)胞株)作為細(xì)胞株，在60mm的板上以1.0×105細(xì)胞/板/2mL接種細(xì)胞，用Oligofectamine轉(zhuǎn)染GFP和針對Synoviolin siRNA后，在72小時(shí)后添加對Ser15的磷酸化很重要的ATM和ATR(ATM和Rad3相關(guān)的)的抑制劑咖啡因(10mM)，用針對磷酸化Ser15-p53的抗體Phospho-p53(Ser15)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。
結(jié)果，由Synoviolin的siRNA促進(jìn)的Ser15的磷酸化由于添加了咖啡因(添加后12小時(shí)，24小時(shí))而被完全抑制(圖5)。因此，表明通常通過抑制ATM和ATR的功能，抑制p53。
Synoviolin對由p53誘導(dǎo)的p21表達(dá)的影響對RKO細(xì)胞進(jìn)行針對Synoviolin的siRNA處理，用蛋白質(zhì)印跡法研究作為p53轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的p21表達(dá)的變化。
即，用抗p21多克隆抗體(Santa Cruz公司)，將確認(rèn)表達(dá)野生型p53的RKO(來自人大腸癌的細(xì)胞株)作為細(xì)胞株在60mm板上以1.0×105細(xì)胞/板/2mL接種細(xì)胞，用Oligofectamine轉(zhuǎn)染GFP和針對Synoviolin的siRNA后，用SDS-PAGE分離72小時(shí)后的蛋白質(zhì)，實(shí)施蛋白質(zhì)印跡法。蛋白質(zhì)印跡法的操作除了使用抗p21多克隆抗體作為第一抗體，抗小鼠IgG山羊-HRP作為標(biāo)記抗體以外，其他與實(shí)施例3所述相同。
結(jié)果，通過對Synoviolin siRNA處理，p53的表達(dá)升高的同時(shí)，p21的表達(dá)也增加了。該效果在72小時(shí)時(shí)明顯示出(圖6)。
Synoviolin的表達(dá)抑制對p53相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)、細(xì)胞周期的影響等的研究在本實(shí)施例中，研究利用RNAi抑制滑膜細(xì)胞中的Synoviolin時(shí)對p53相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)、細(xì)胞周期的影響。
將RA滑膜細(xì)胞以9.0×104細(xì)胞播種在10cm dish上，轉(zhuǎn)染Synoviolin siRNA(終濃度25Nm)后，用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期。結(jié)果，在siRNA 25nM(No.589)觀察到細(xì)胞周期在G0/G1期的延遲(圖7)。
使用h589作為siRNA。
另外，h589是指將以下的有義鏈和反義鏈退火得到的雙鏈RNA。
有義鏈h589GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT(SEQ IDNO.18)反義鏈h589CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT(SEQ IDNO.19) 對癌組織的Synoviolin表達(dá)的研究將Tissue array(CHEMICON公司10個(gè)普通人癌組織和正常人組織)用抗Synoviolin抗體(10Da)進(jìn)行免疫染色。
用于免疫染色的抗體濃度為8μg/ml，使用的試劑盒為Simple StainMAX(M)。
結(jié)果，對于正常組織，在大腸、腎、肺、卵巢、精囊、皮膚和乳腺確認(rèn)了Synoviolin表達(dá)，而在神經(jīng)和淋巴結(jié)沒有確認(rèn)。另外，對于各癌組織，確認(rèn)Synoviolin表達(dá)的、特別是判斷為表達(dá)明顯增進(jìn)的組織為神經(jīng)、淋巴結(jié)(圖8和圖9)。
培養(yǎng)細(xì)胞中Synoviolin和p53共表達(dá)時(shí)對各自的定位的影響將3種質(zhì)粒，GFP-p53、FLAG-Synoviolin以及FLAG-SynoviolinC307S(無泛素(Ub)化活性)導(dǎo)入Saos 2細(xì)胞。
各質(zhì)粒如下。
GFP-p53綠熒光蛋白和野生型p53的融合蛋白表達(dá)FLAG-SynoviolinFLAG標(biāo)記野生型Synoviolin表達(dá)FLAG-Synoviolin C307S(無泛素(Ub)化活性)FLAG標(biāo)記失活型Synoviolin表達(dá)用fuGENE6(Roche)進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，24小時(shí)后用10％福爾馬林固定，用稀釋400倍的第一抗體α-FLAG抗體、稀釋200倍的第二抗體α-小鼠IgG-TRITC，1μM DAPI對核進(jìn)行染色，觀察其定位。
結(jié)果，觀察到野生型p53的強(qiáng)表達(dá)和在核中的定位(圖10)。野生型Synoviolin強(qiáng)表達(dá)且在細(xì)胞質(zhì)(特別是核周圍)定位。另外，如果使野生型p53和野生型Synoviolin強(qiáng)表達(dá)，則觀察到本來定位于核的p53在核周圍呈小點(diǎn)狀分布，與Synoviolin共定位(圖11)。如果野生型p53和Synoviolin C307S突變體強(qiáng)表達(dá)，則觀察到p53在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成大點(diǎn)，與Synoviolin共定位(圖12)。
由上可知，Synoviolin和p53在一定條件下共定位。可以認(rèn)為其定位形態(tài)因泛素化活性的有無而改變。
利用MBP-Synoviolin dam-His的GST-p53體外泛素化的研究觀察到p53的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的量因細(xì)胞內(nèi)Synoviolin的增減而變化，說明p53受Synoviolin控制。因此，為了研究Synoviolin是否直接將p53泛素化(Ub)，用GST-p53和MBP-Synoviolin dTM-His進(jìn)行體外Ub化反應(yīng)的研究。
GST-p53將N末端融合了GST的p53在大腸菌內(nèi)表達(dá)，生成得到的部分。
MBP-Synoviolin dTM-His將N末端融合了MBP、C末端融合了His標(biāo)記的Synoviolin在大腸菌內(nèi)表達(dá)，將其純化得到的部分。
將保有pGEX/p53的大腸菌(BL21)用500mL的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)后(1mM、30℃、6h)，用含有0.5％NP-40的緩沖液由培養(yǎng)液配制大腸菌提取液。
在0.1％NP-40存在下，用GSH-瓊脂糖凝膠樹脂由大腸菌提取液純化GST-p53。用該透析后的樣品，將用于MBP-Synoviolin dTM-His和其他體外Ub化反應(yīng)的組合物(ATP、PK-his-HA-Ub、酵母E1、His-UbcH5c)組合進(jìn)行反應(yīng)(圖13)。反應(yīng)后，用7.5％SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，通過抗p53抗體(FL393或DO-1)檢測膜上的p53蛋白質(zhì)。另外，改變GST-p53的添加量進(jìn)行同樣的反應(yīng)和檢測。
結(jié)果，添加含有GST-p53純化部分和MBP-Synoviolin dTM-His的全部組合物時(shí)，觀察到以約90kDa的位置為中心的p53來源的梯狀信號(圖13)。另外，這些信號依賴于GST-p53添加量而增強(qiáng)。由這些結(jié)果可以認(rèn)為，Synoviolin直接參與p53的泛素化。因此，表明通過抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，可以抑制p53的泛素化。
RNAi下的Synoviolin、p53mRNA量的研究在本實(shí)施例中，在Synoviolin RNAi條件下，對于Synoviolin和相關(guān)基因的mRNA量的經(jīng)時(shí)變化進(jìn)行研究，由此研究Synoviolin對細(xì)胞周期、凋亡等的影響。
以30000細(xì)胞/10cm dish接種RA滑膜細(xì)胞，按照規(guī)定方法轉(zhuǎn)染25nM siRNA(No.589)，細(xì)胞培養(yǎng)4天，在此期間經(jīng)時(shí)回收細(xì)胞，得到mRNA。將1μg的mRNA作為模板，用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA。對得到的cDNA，用ABI TaqMan Gene expression assay(GEX)進(jìn)行定量。將18S rRNA作為對照基因，算出mRNA量。
GEX試劑target assay No.(assay ID)，Synoviolin為Hs00381211_ml，TP53為Hs00153340_ml。
結(jié)果，確認(rèn)在Synoviolin siRNA存在下，Synoviolin mRNA量減少，但p53的mRNA量沒有變化(圖14)。
Synoviolin p53結(jié)合區(qū)域的確定GST-Synoviolin和p53在體外通過pulldown assay結(jié)合，對此，Synoviolin蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的第236到第270號的35個(gè)氨基酸殘基是必要的。
進(jìn)一步，在本實(shí)施例中，為了確定Synoviolin與p53結(jié)合的必要的區(qū)域，如圖15所示，制備Synoviolin的p53結(jié)合區(qū)域缺失突變體，對35S-p53如下進(jìn)行GST pulldown assay(圖16)。
用1μL編碼各GST蛋白質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μL的感受態(tài)細(xì)胞(BL-21株)。各GST蛋白質(zhì)和質(zhì)粒的名稱如下GST蛋白質(zhì)質(zhì)粒GSTpGEX-6P-1(Pharmacia Biotech)GST-SynoΔTM 236-617pGEX-5-1/SΔTMGST-SynoΔTM 236-270p6-3GST-SynoΔTM 271-617pST490接種于4mL的LB-Amp+，在37℃培養(yǎng)一晚。次日測定預(yù)培養(yǎng)的OD600。在15mL的LB-Amp+中接種達(dá)到OD600＝3.0(終濃度0.2)。在25℃恒溫槽中培養(yǎng)約2小時(shí)，確認(rèn)OD600＝0.6～0.8后，向恒溫槽中加冰，冷卻至20℃，將培養(yǎng)容器用10分鐘冷卻至20℃。加入0.1M的IPTG 15μL(終濃度＝0.1mM，通常的1/1000)、1mM ZnCl2150μL(終濃度＝10μM)，在20℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，誘導(dǎo)GST蛋白質(zhì)的表達(dá)。誘導(dǎo)后，離心回收細(xì)胞(5000rpm，5min，4℃)。將細(xì)胞再懸浮于1mlPBS(-)，轉(zhuǎn)移至Enpendorf管，回收細(xì)胞(14000rpm，1min，4℃)。吸取全部上清后，再懸浮于500μL的PBS(-)/Z(PBS(-)/10μM ZnCl2)，用液氮冷凍，在-20℃下保存。次日，將-20℃的樣品置于37℃的恒溫槽中10min，使其溶解，接著放到冰水中冷卻至0℃?；旌弦韵碌鞍姿饷敢种苿?，每個(gè)樣品加6.5μL。
100mM PMSF(Final 1mM)20μl抑蛋白酶肽(Final 0.1％) 2μl0.5mg/ml抑胃酶肽(Final 0.5μg/ml)2μl1mg/ml亮抑酶肽(Final 1μg/ml)2μl將各樣品進(jìn)行超聲波破碎(Power Level 7、15秒，3次)。每次在冰水中冷卻30秒。接著加入500μl的2x GST Buffer/Z(2％TritonX-100，720mM NaCl、1x PBS(-)、10μM ZnCl2、10mMβ-巰基乙醇、2mM PMSF、0.1％抑蛋白酶肽)并混合后，進(jìn)一步進(jìn)行超聲波破碎(Power Level 7、15秒、1次)。將破碎的液體在14000rpm30min 4℃的條件下離心。在此期間用1ml的1x PBS(-)將200μl的80％-勻漿谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose)珠洗滌3次，加入160μl的1x PBS(-)，調(diào)整至50％-勻漿。向1ml離心后的上清中加入80μl的50％-勻漿谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，在4℃下旋轉(zhuǎn)2小時(shí)，使GST蛋白質(zhì)結(jié)合于珠。用1mL的1x GST-Buffer/Z(1％TritonX-100，360mM NaCl、0.5x PBS(-)、5μM ZnCl2、5mMβ-巰基乙醇、1mM PMSF、0.05％抑蛋白酶肽)將珠洗滌4次。離心在2000rpm、1min、4℃的條件下進(jìn)行。殘留的上清全部吸取后，加入60μL的1x GST-Buffer/Z，使合計(jì)為100μL。將其中10μL與等量的2xSDS Sample Buffer混合，在100℃下用加熱器(heatblock)加熱5min，每次10μl地加至10％凝膠中。同時(shí)還使用0.25～4μg的BSA。進(jìn)行電泳(150V 50min)、CBB染色(用未使用的30min)、脫色(1小時(shí)2次)、甘油水(30～60min)、干燥凝膠(80℃、1小時(shí))，檢測GST蛋白質(zhì)表達(dá)、回收效率。次日，進(jìn)行35S-p53的體外翻譯。首先，混合以下試劑。
TNT網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(-80℃)25μlTNT網(wǎng)織紅細(xì)胞緩沖液(-80℃)2μl氨基酸混合物(蛋氨酸)(-80℃) 1μlDEPC-處理水 15μl
RNase抑制劑(培養(yǎng)室-20℃)1μlTNT聚合酶(培養(yǎng)室-20℃) 1μl35S-Met 4μl質(zhì)粒(p53·HA) 1μl合計(jì)50μl在30℃恒溫槽中保溫1.5～2.5小時(shí)，進(jìn)行體外翻譯。在此期間，將G-25柱的蓋(ふた)輕緩離心(2500rpm，1min，4℃)，加入100μl的pulldown Buffer V(20mM HEPES pH 7.9、150mM NaCl、0.2％TritonX-100)，進(jìn)一步離心，洗柱。將50μl體外翻譯溶液全部加在該柱上，進(jìn)行離心(2500rpm，1min，4℃)。再加200μl的pulldown BufferV，再次離心(2500rpm，1min，4℃)。將其用作體外翻譯產(chǎn)物(IvTL)。將其中的4μl與16μl的Milli-Q，20μl的2xSDS Buffer混合，作為On put10％。向含有結(jié)合有30μg GST蛋白質(zhì)的珠的1ml pulldown Buffer V中加入120μl的IvTL，在4℃旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。離心(10000rpm，1min，4℃)后，將上清每次以370μL的量加入含有GST、各GST-Synoviolin珠的1ml pulldown BufferV中，在4℃旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。將該珠用1mlpulldown Buffer V洗滌4次。此時(shí)必須剩余上清100μl，使其不吸取珠。離心在2500rpm、1min、4℃的條件下進(jìn)行。吸取上清后，加入40μl的1x SDS Sample Buffer，作為Pulldown樣品。將On put 10％和pulldown樣品在100℃加熱1小時(shí)，在-20℃保存。次日將樣品在37℃的恒溫槽中加熱10分鐘，每次以10μl的量加至10％凝膠。進(jìn)行電泳(150V 50min)、CBB染色(30min)、脫色(1小時(shí)2次)、甘油水(30～60min)、干燥凝膠(80℃、1小時(shí))后，對IP Plate曝光。14小時(shí)后，用BAS讀取曝光的IP Plate，用ImageGauge定量。另外用膜掃描儀(filmscanner)讀取C.B.B.染色的凝膠。
結(jié)果，p53結(jié)合區(qū)域缺失突變體幾乎完全失去了結(jié)合活性。另外，由圖15可知p53結(jié)合區(qū)域僅為從236開始到270氨基酸的35個(gè)氨基酸的一個(gè)部位。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性通過本發(fā)明提供促進(jìn)p53癌抑制基因活性的物質(zhì)。該物質(zhì)由于可活化p53，使p53轉(zhuǎn)移至核，因此可用作癌治療用藥物組合物。在本發(fā)明中，通過抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，可治療癌。
序列表free textSEQ ID NO.17合成的寡聚核苷酸(DNA/RNA混合物)SEQ ID NO.18合成的寡聚核苷酸(DNA/RNA混合物)
序列表<110>Locomogene，Inc<120>抑制癌癥的方法<130>P04-232PCT<150>JP2003-428300<151>2003-12-24<160>19<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3374<212>DNA<213>(智人)Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(403)..(2256)<223>
<400>1gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg60ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa120gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat180tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca240ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag300tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga360gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc acg 414Met Phe Arg Thrgca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg gct 462Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala5 10 15 20cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac ctg 510
His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr Leu25 30 35acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt gtc558Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe Val40 45 50ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg caa606Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly Gln55 60 65ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt tcc tgg tac gcc654Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr Ala70 75 80gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg gat gac ttc agc702Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg Asp Asp Phe Ser85 90 95 100ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt ttc750Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe105 110 115cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc aac798His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro Asn120 125 130atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt atg ttc ctc ctg846Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu Met Phe Leu Leu135 140 145ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat cac agc atc ctg894Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr His Ser Ile Leu150 155 160acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt gag tat gcc atc942Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe Glu Tyr Ala Ile165 170 175 180ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat gtg ctg cac tcc990Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr Val Leu His Ser185 190 195gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag gct gtg tac atg1038Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr Met200 205 210
ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt ctg ctg tac atg1086Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr Met215 220 225gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc cca ctc ttt gcc1134Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe Pro Leu Phe Ala230 235 240atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag aaa gct gtg aca1182Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys Lys Ala Val Thr245 250 255 260gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg aac acc ctg tat1230Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met Asn Thr Leu Tyr265 270 275cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac aat gtc tgc atc1278Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp Asn Val Cys Ile280 285 290atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga ctg ccc tgc aac1326Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg Leu Pro Cys Asn295 300 305cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc cag cgg cag cag1374His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe Gln Arg Gln Gln310 315 320acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca tcg ctg cca gcg1422Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala325 330 335 340cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg cca ccc cct gcc1470Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly Pro Pro Pro Ala345 350 355ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac ttc ccc cag ggc1518Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn Phe Pro Gln Gly360 365 370ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg tgg ccc ccc atg1566Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu Trp Pro Pro Met375 380 385ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca gga gag gct gtg1614
Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu Ala Val390 395 400gct cct cca tcc acc agt gca gca gcc ctt tct cgg ccc agt gga gca1662Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly Ala405 410 415 420gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct tct gcc aca1710Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala Thr425 430 435gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc cct gcc cct1758Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly Pro Ala Pro440 445 450ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg cct cca ccc1806Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu Pro Pro Pro455 460 465ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt gct ggg ctg1854Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe Ala Gly Leu470 475 480acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg cag cac ctg1902Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg Gln His Leu485 490 495 500gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg ctg gac gcc1950Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Asp Ala505 510 515gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc tcc ttg ggg1998Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ser Leu Gly520 525 530ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg act gcc act2046Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly Thr Ala Thr535 540 545aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc tca gag gcc2094Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser Ser Glu Ala550 555 560acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa atg gaa agg2142Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu Met Glu Arg565 570 575 580
cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct gag gat gga 2190Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro Glu Asp Gly585 590 595gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag aag ctg gag 2238Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys Leu Glu600 605 610tct cct gtt gcc cac tga cactgcccca gcccagcccc agcctctgct 2286Ser Pro Val Ala His615cttttgagca gccctcgctg gaacatgtcc tgccaccaag tgccagctcc ctctctgtct2346gcaccaggga gtagtacccc cagctctgag aaagaggcgg catcccctag gccaagtgga2406aagaggctgg ggttcccatt tgactccagt cccaggcagc catggggatc tcgggtcagt2466tccagccttc ctctccaact cttcagccct gtgttctgct ggggccatga aggcagaagg2526tttagcctct gagaagccct cttcttcccc cacccctttc caggagaagg ggctgcccct2586ccaagcccta cttgtatgtg cggagtcaca ctgcagtgcc gaacagtatt agctcccgtt2646cccaagtgtg gactccagag gggctggagg caagctatga acttgctcgc tggcccaccc2706ctaagactgg tacccatttc cttttcttac cctgatctcc ccagaagcct cttgtggtgg2766tggctgtgcc ccctatgccc tgtggcattt ctgcgtctta ctggcaacca cacaactcag2826ggaaaggaat gcctgggagt gggggtgcag gcgggcagca ctgagggacc ctgccccgcc2886cctcccccca ggcccctttc ccctgcagct tctcaagtga gactgacctg tctcacccag2946cagccactgc ccagccgcac tccaggcaag ggccagtgcg cctgctcctg accactgcaa3006tcccagcgcc caaggaaggc cacttctcaa ctggcagaac ttctgaagtt tagaattgga3066attacttcct tactagtgtc ttttggctta aattttgtct tttgaagttg aatgcttaat3126cccgggaaag aggaacagga gtgccagact cctggtcttt ccagtttaga aaaggctctg3186tgccaaggag ggaccacagg agctgggacc tgcctgcccc tgtcctttcc ccttggtttt3246gtgttacaag agttgttgga gacagtttca gatgattatt taatttgtaa atattgtaca3306
aattttaata gcttaaattg tatatacagc caaataaaaa cttgcattaa caaaaaaaaa 3366aaaaaaaa 3374<210>2<211>617<212>PRT<213>智人<400>2Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly1 5 10 15Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr20 25 30Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile35 40 45Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val50 55 60Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg65 70 75 80Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg85 90 95Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe100 105 110Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu115 120 125Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu130 135 140Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr145 150 155 160His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe165 170 175Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr
180 185 190Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys195 200 205Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val210 215 220Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe225 230 235 240Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys245 250 255Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met260 265 270Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp275 280 285Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg290 295 300Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe305 310 315 320Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala325 330 335Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly340 345 350Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn355 360 365Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu370 375 380Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser385 390 395 400Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg405 410 415Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala
420 425 430Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala435 440 445Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro450 455 460Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly465 470 475 480Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu485 490 495Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr500 505 510Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu515 520 525Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu530 535 540Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro545 550 555 560Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro565 570 575Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met580 585 590Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu595 600 605Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His610 615<210>3<211>23<212>DNA<213>智人<400>3aatgtctgca tcatctgccg aga 23
<210>4<211>23<212>DNA<213>智人<400>4aagctgtgac agatgccatc atg23<210>5<211>23<212>DNA<213>智人<400>5aaagctgtga cagatgccat cat23<210>6<211>23<212>DNA<213>智人<400>6aagaaagctg tgacagatgc cat23<210>7<211>23<212>DNA<213>智人<400>7aaggttctgc tgtacatggc ctt23<210>8<211>23<212>DNA<213>智人<400>8aacaaggctg tgtacatgct cta23<210>9<211>23<212>DNA<213>智人<400>9
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<400>15aagagactgc cctgcaacca cat23<210>16<211>23<212>DNA<213>
<400>16aacgttcctg gtacgccgtc aca23<210>17<211>393<212>PRT<213>智人<400>17Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln15 10 15Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu20 25 30Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp35 40 45Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro50 55 60Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro65 70 75 80Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser85 90 95Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly100 105 110Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro115 120 125Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln130 135 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met145 150 155 160Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys165 170 175Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln180 185 190His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp195 200 205Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu210 215 220Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser225 230 235 240Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr245 250 255Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val260 265 270Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn275 280 285Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr290 295 300Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys305 310 315 320Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu325 330 335Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp340 345 350Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His355 360 365Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met370 375 380Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
385 390<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸(DNA/RNA混合物)<400>18gguguucuuu gggcaacugt t21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸(DNA/RNA混合物)<400>19caguugccca aagaacacct t2權(quán)利要求
1.醫(yī)藥組合物，其含有促進(jìn)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物，其中，促進(jìn)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活化的物質(zhì)是抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)。
3.權(quán)利要求2所述的醫(yī)藥組合物，其中，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)是針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
4.權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥組合物，其中，編碼Synoviolin的基因含有SEQ ID NO.1所示的堿基序列。
5.權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥組合物，其中，siRNA以SEQ ID NO.1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。
6.權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其用于治療癌。
7.p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)的活化方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
8.使p53蛋白質(zhì)定位于核的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
9.癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，使p53蛋白質(zhì)定位于核。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，對定位于核的p53蛋白質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行放射線照射或紫外線照射。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，使含有定位于核的p53蛋白質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)一步與抗癌劑接觸，或?qū)υ摷?xì)胞周圍的脈管實(shí)施栓塞。
12.將p53蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的一部分磷酸化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中，氨基酸殘基的一部分為第15位絲氨酸殘基。
14.活化磷酸化酶的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中，磷酸化酶為ATM、ATR、或與它們具有同樣活性的酶等。
16.誘導(dǎo)p21蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，其通過抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能活化p53蛋白質(zhì)，由此誘導(dǎo)21蛋白質(zhì)表達(dá)。
17.癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能，由p53蛋白質(zhì)誘導(dǎo)p21蛋白質(zhì)的表達(dá)。
18.活化p53蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達(dá)和/或功能。
19.權(quán)利要求7～18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，Synoviolin表達(dá)的抑制利用針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA進(jìn)行。
20.權(quán)利要求7～18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，抑制Synoviolin功能為抑制Synoviolin與p53蛋白質(zhì)結(jié)合的功能。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中，編碼Synoviolin的基因含有SEQ ID NO.1所示的堿基序列。
22.權(quán)利要求19所述的方法，其中，siRNA以SEQ ID NO.1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。
全文摘要
本發(fā)明提供以將p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活化，使其定位于核為特征的方法、以及含有促進(jìn)p53癌抑制基因或p53蛋白質(zhì)活化物質(zhì)的醫(yī)藥組合物。
文檔編號A61K31/7088GK1909927SQ20048003883
公開日2007年2月7日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者中島利博, 山崎聰士, 八木下尚子 申請人:株式會(huì)社洛科摩基因