專利名稱：一種中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水凝膠材料，特別是涉及一種在中樞神經(jīng)修復(fù)中用于促經(jīng)神經(jīng)再生，細(xì)胞，蛋白等緩釋等的水凝膠材料及其制備方法，這是一種新穎的中樞組織工程框架材料，屬于中樞組織工程框架材料及制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織工程支架材料在神經(jīng)再生方面所起的作用有以下幾點(diǎn)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成；為血管、神經(jīng)軸突長入提供橋梁；作為生長因子、替代細(xì)胞的載體。傳統(tǒng)的腦缺損修復(fù)材料采用丙烯腈與氯乙烯共聚物，聚碳酸酯，硝化纖維，聚α羥酸果酸或硅樹脂，水溶性凝膠聚乙二醇，N-(2-羥丙基)異丁烯酰胺(HPMA)，這些材料均在不同程度上促進(jìn)了軸突的再生，此外還有報(bào)道由賴氨酸、丙氨酸、天冬氨酸形成的自制生物支架，這些支架可以具有促進(jìn)各類神經(jīng)細(xì)胞的粘附、分化和廣泛生長的特性，且能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞間的突觸形成，但是這些材料的修復(fù)效果還不夠理想。
神經(jīng)組織工程的研究尤其是神經(jīng)組織工程框架材料的研究還處于起步階段。理想的神經(jīng)組織修復(fù)材料除了應(yīng)具備一般醫(yī)用材料都應(yīng)具備的生物相容性、可加工性和可消毒性外，還應(yīng)具備下述的組成、性能和結(jié)構(gòu)要求(1)應(yīng)適時(shí)地在體內(nèi)降解和被機(jī)體吸收，即材料的降解速度和代謝吸收速度應(yīng)與神經(jīng)再生修復(fù)的速度相匹配。
(2)應(yīng)保證神經(jīng)修復(fù)所需的三維空間，使毛細(xì)血管和纖維組織可以長入以提供營養(yǎng)的大孔結(jié)構(gòu)。
(3)應(yīng)保證神經(jīng)修復(fù)所需的營養(yǎng)供應(yīng)即提供受損神經(jīng)再生所需的可起到調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞生長、分化并促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和組織再生的神經(jīng)生長因子。
透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是一種在所有脊椎動(dòng)物器官和血液中均可發(fā)現(xiàn)，并在軟結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)中廣泛分布的最主要的蛋白多糖。有研究提出了以透明質(zhì)酸為基礎(chǔ)的腦細(xì)胞外基質(zhì)模型，該模型認(rèn)為，腦組織的細(xì)胞外基質(zhì)是由透明質(zhì)酸經(jīng)過多種連接蛋白連接而成的三維框架結(jié)構(gòu)組成，可見透明質(zhì)酸適合作為腦組織工程框架材料，用于腦損傷修復(fù)。研究表明，透明質(zhì)酸在腦發(fā)育過程有極其重要的作用，并可促進(jìn)血管再生，有效抑制神經(jīng)組織瘢痕形成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明選用透明質(zhì)酸作為主要成分制備神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料，但是純的透明質(zhì)酸凝膠不適合細(xì)胞粘附和作為神經(jīng)生長的基質(zhì)。膠原和多聚賴氨酸是用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)最常用的基質(zhì)，具有良好的神經(jīng)細(xì)胞粘附性能。然而，采用涂層的辦法是非共價(jià)連接，是一種非長久改性方法，涂在基質(zhì)表層的多聚賴氨酸和膠原很容易在清洗的過程損失掉。
一種中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料，其特征在于，該中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料以透明質(zhì)酸為主要成分，與一種或多種高分子共聚，得到疏松多孔的框架材料。
本發(fā)明提出的神經(jīng)修復(fù)用凝膠材料的制備方法，包括如下步驟1)配制預(yù)料在4℃下將透明質(zhì)酸(HA)溶解到蒸餾水中，得到1～5wt％的HA溶液；在4℃下將D型多聚賴氨酸或膠原分散于蒸餾水中；2)混合并凍干在室溫下混合預(yù)先配制好的HA溶液和另一種復(fù)合物(D型多聚賴氨酸或膠原)溶液混合，使得溶液中該種復(fù)合物和HA質(zhì)量比為0.1～1，用磁力攪拌器攪拌30分鐘；再將攪拌后的漿狀物倒入玻璃皿中，用封口膜蓋住，然后在-20℃下冷凍干燥，得到多孔膜結(jié)構(gòu)的材料；3)共價(jià)交聯(lián)室溫下，將步驟2)得到的凍干后的多孔膜浸入EDC的95％乙醇溶液中反應(yīng)24小時(shí)；95％的乙醇作為EDC的溶劑，可以防止膜在交聯(lián)過程中的分解和損失；4)超聲波清洗并凍干交聯(lián)后的膜在蒸餾水中用超聲波清洗1小時(shí)，除去殘留的EDC，清洗后在-20℃下重新冷凍干燥，即得到水凝膠框架材料。
在上述水凝膠材料制備過程中，使用的交聯(lián)劑是碳二亞胺鹽酸鹽，甲醛，戊二醛，己二酸二酰肼其中的任意一種或者多種。
在制得的水凝膠框架材料中，可加入生長因子，細(xì)胞，蛋白，基因等物質(zhì)中的一種或者多種，以便更好的用于中樞神經(jīng)修復(fù)。
用本方法制備的神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料，具有良好的生物相容性和可以大范圍調(diào)節(jié)的生物降解性，具有和中樞神經(jīng)組織相近的流變學(xué)特性和力學(xué)性能，植入中樞神經(jīng)以后不會(huì)對(duì)組織造成二次傷害，適用于神經(jīng)修復(fù)。其制備方法流程簡單，成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1實(shí)例1中PDL-HA水凝膠SEM照片(w/w＝0.1)。
圖2實(shí)例2中膠原-HA水凝膠SEM照片(w/w＝1)。
圖3實(shí)例3中PDL-HA水凝膠SEM照片(w/w＝0.5)。
圖4實(shí)例1中的凝膠流變學(xué)檢測(cè)(a)在37℃變動(dòng)凝膠的的存儲(chǔ)模量(G′)和損失模量(G″)隨著頻率的變化圖(4:1)(b)HA-PDL凝膠材料的復(fù)合模量(G*)和復(fù)合粘度(η*)隨著頻率的變化圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明本發(fā)明提出的框架材料的制備方法主要是通過化學(xué)交聯(lián)，對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行復(fù)合，以得到適合神經(jīng)修復(fù)的框架材料。主要步驟在實(shí)例中說明。
實(shí)例1透明質(zhì)酸—多聚賴氨酸水凝膠用1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)交聯(lián)透明質(zhì)酸和D型多聚賴氨酸(PDL)的混合溶液，交聯(lián)后的產(chǎn)物冷凍干燥成膜。
用EDC交聯(lián)結(jié)合冷凍干燥技術(shù)的方法所制備的HA-PDL復(fù)合基質(zhì)具有多孔的網(wǎng)絡(luò)支架結(jié)構(gòu)，同時(shí)具備了良好的溶脹性和機(jī)械穩(wěn)定性。
具體制備步驟如下(1)在4℃下將PDL分散于蒸餾水中，加入1wt％的HA溶液，使混合溶液中的PDL與HA之比為0.1，用磁力攪拌器攪拌30分鐘。
(2)將最終的漿狀物倒在玻璃皿中，用封口膜蓋住，然后在-20℃下冷凍干燥。
(3)在室溫下，將制備的多孔膜浸入EDC的95％的乙醇溶液中反應(yīng)24小時(shí)。
(4)交聯(lián)的膜在蒸餾水中超聲波清洗1小時(shí)，以除去殘留的EDC，清洗后在-20℃下重新冷凍干燥。
凍干樣品疏松多空，掃描電鏡(SEM)顯示其典型形貌如附圖1所示。
凍干后樣品吸水后就成為水凝膠，可以調(diào)節(jié)交聯(lián)度得到需要的力學(xué)性能。將實(shí)例1得到的水凝膠進(jìn)行流變學(xué)測(cè)試，表征其力學(xué)性能，并與中樞神經(jīng)組織的力學(xué)性能進(jìn)行比較，以確定出力學(xué)性能與神經(jīng)組織相匹配的凝膠。附圖4是實(shí)例1中的凝膠流變學(xué)檢測(cè)，(a)在37℃變動(dòng)凝膠的的存儲(chǔ)模量(G′)和損失模量(G″)隨著頻率的變化圖(4:1)，(b)HA-PDL凝膠材料的復(fù)合模量(G*)和復(fù)合粘度(η*)隨著頻率的變化圖；該流變學(xué)數(shù)據(jù)特點(diǎn)與前人研究的腦組織的流變學(xué)特點(diǎn)很相似。
用不同組分配比得到的材料流變學(xué)特性都不一樣，附圖4只顯示了實(shí)施例1中得到的材料的流變學(xué)特性。
實(shí)施例2透明質(zhì)酸—膠原(I型)水凝膠本實(shí)例制備過程和實(shí)例1相似，將多聚賴氨酸換成I型膠原即可。
(1)4℃下將I型膠原分散于蒸餾水中，加入3wt％的透明質(zhì)酸溶液，使混合溶液中的膠原與HA之比為1，用磁力攪拌器攪拌30分鐘。
(2)將最終的漿狀物倒在玻璃皿中，用封口膜蓋住，然后在-20℃下冷凍干燥。
(3)在室溫下，將制備的多孔膜浸入EDC的95％的乙醇溶液中反應(yīng)24小時(shí)。
(4)交聯(lián)的膜在蒸餾水中超聲波清洗1小時(shí)，以除去殘留的EDC，清洗后在-20℃下重新冷凍干燥。
由此得到經(jīng)EDC交聯(lián)修飾的透明質(zhì)酸—膠原復(fù)合水凝膠。圖2是實(shí)例2中膠原-HA水凝膠SEM照片(w/w＝1)。
實(shí)施例3透明質(zhì)酸—多聚賴氨酸水凝膠本實(shí)例制備過程和實(shí)例1相似，只是PDL和HA的比例為0.5。
(1)4℃下將PDL分散于蒸餾水中，加入1wt％的透明質(zhì)酸溶液，使混合溶液中的PDL與HA之比為0.5，用磁力攪拌器攪拌30分鐘。
(2)將最終的漿狀物倒在玻璃皿中，用封口膜蓋住，然后在-20℃下冷凍干燥。
(3)在室溫下，將制備的多孔膜浸入EDC的95％的乙醇溶液中反應(yīng)24小時(shí)。
(4)交聯(lián)的膜在蒸餾水中超聲波清洗1小時(shí)，以除去殘留的EDC，清洗后在-20℃下重新冷凍干燥。
由此得到經(jīng)EDC交聯(lián)修飾的透明質(zhì)酸—多聚賴氨酸復(fù)合水凝膠。
圖3是實(shí)例3中PDL-HA水凝膠SEM照片(w/w＝0.5)。
權(quán)利要求
1.一種中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料，其特征在于，該中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料以透明質(zhì)酸為主要成分，與一種或多種高分子共聚，得到疏松多孔的框架材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料，其特征在于，在制得的水凝膠框架材料中加入生長因子，細(xì)胞，蛋白，基因等物質(zhì)中的一種或者多種，以便更好的用于中樞神經(jīng)修復(fù)。
3.一種中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟1)配制預(yù)料在4℃下將透明質(zhì)酸(HA)溶解到蒸餾水中，得到1～5wt％的HA溶液；在4℃下將D型多聚賴氨酸或膠原分散于蒸餾水中；2)混合并凍干在室溫下混合預(yù)先配制好的HA溶液和另一種復(fù)合物溶液混合，使得溶液中該種復(fù)合物和HA質(zhì)量比為0.1～1，用磁力攪拌器攪拌30分鐘；再將攪拌后的漿狀物倒入玻璃皿中，用封口膜蓋住，然后在-20℃下冷凍干燥，得到多孔膜結(jié)構(gòu)的材料；3)共價(jià)交聯(lián)室溫下，將步驟2)得到的凍干后的多孔膜浸入EDC的95％乙醇溶液中反應(yīng)24小時(shí)；95％的乙醇作為EDC的溶劑，防止膜在交聯(lián)過程中的分解和損失；4)超聲波清洗并凍干交聯(lián)后的膜在蒸餾水中用超聲波清洗1小時(shí)，除去殘留的EDC，清洗后在-20℃下重新冷凍干燥，即得到水凝膠框架材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種中樞神經(jīng)修復(fù)用水凝膠材料的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑是碳二亞胺鹽酸鹽，甲醛，戊二醛，己二酸二酰肼其中的任意一種或者多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水凝膠材料，特別是涉及一種在中樞神經(jīng)修復(fù)中用于促經(jīng)神經(jīng)再生，細(xì)胞，蛋白等緩釋等的水凝膠材料及其制備方法，屬于中樞組織工程框架材料及制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明水凝膠材料是以透明質(zhì)酸為主要成分，與一種或多種高分子共聚，得到疏松多孔的框架材料。通過配制預(yù)料；混合并凍干；共價(jià)交聯(lián)；超聲波清洗并凍干；即得到水凝膠框架材料。在制得的水凝膠框架材料中加入生長因子，細(xì)胞，蛋白，基因等物質(zhì)中的一種或者多種可更好的用于中樞神經(jīng)修復(fù)。本發(fā)明具有良好的生物相容性和生物降解性，具有和中樞神經(jīng)組織相近的流變學(xué)特性和力學(xué)性能，植入中樞神經(jīng)以后不會(huì)對(duì)組織造成二次傷害，制備方法流程簡單，成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61L31/04GK1850301SQ20061001141
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者崔福齋, 田維明, 徐群淵, 侯少平, 魏岳騰 申請(qǐng)人:清華大學(xué)