專利名稱：：通過抑制Notch途徑激活治療腸腺瘤和/或腺癌的制作方法通過抑制Notch途徑激活治療腸腺瘤和/或腺癌本發(fā)明涉及生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于治療腸腺瘤(也稱為息肉)和/或腺癌的方法和藥物。小腸是消化道的最大部分和消化及吸收的主要部位。除接收來自胃的食糜之外，小腸的起始段十二指腸還接收來自膽囊的膽汁以及來自胰腺的消化酶。胰酶以非活性形式產(chǎn)生，只在十二指腸腔中才成為有活性的。小腸分為三部分十二指腸、空腸和回腸。腸腔表面完全被許多稱作絨毛的長0.5-1.5mm的手指狀或葉狀突起覆蓋。絨毛的中心是粘膜固有層的延伸，而它的表面被單層柱狀上皮覆蓋。絨毛基底向腸腔表面的開口是叫做腸腺或利貝昆氏腺窩的單層管狀結(jié)構(gòu)。這些隱窩向下延伸向粘膜肌層。襯著它們的單層柱狀細(xì)胞是覆蓋絨毛的單層柱狀細(xì)胞的延續(xù)部分。上皮的主要細(xì)胞類型是腸上皮細(xì)胞或吸收細(xì)胞。每個(gè)腸上皮細(xì)胞在其腸腔表面具有約3000個(gè)微絨毛，其在光學(xué)顯微鏡下看起來為絨毛表面上的模糊紋狀緣。絨毛和微絨毛與粘膜下層的褶皺一起被稱為環(huán)狀襞，使小腸的吸收表面積增加約600倍。小腸上皮由以下細(xì)胞類型組成腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、微鈹褶細(xì)胞和未分化細(xì)胞。將更詳細(xì)地討論這些細(xì)胞中的一些。腸上皮細(xì)胞(也稱為吸收細(xì)胞)是具有微絨毛和基底核的高柱狀細(xì)胞，專門用于物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。它們通過連接復(fù)合物彼此相連以及與其它細(xì)胞類型相連。氨基酸和單糖經(jīng)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，單酸甘油酯和脂肪酸被動(dòng)地通過微絨毛膜。被吸收的物質(zhì)進(jìn)入正好在上皮下面的粘膜固有層中的有孔毛細(xì)血管或者進(jìn)入淋巴乳糜管(多數(shù)脂類和脂蛋白顆粒)。腸上皮細(xì)胞的壽命為5-6天。杯狀細(xì)胞是粘液分泌細(xì)胞，是第二最豐富的上皮細(xì)胞。它們分散于其它細(xì)胞類型之間。杯狀細(xì)胞的粘液是非常大的糖蛋白，積蓄在細(xì)胞頂端。細(xì)胞的細(xì)長形基部容納有細(xì)胞核和細(xì)胞器。從十二指腸到回腸末端杯狀細(xì)胞的豐度增加。它們的壽命也為5-6天。未分化細(xì)胞是干細(xì)胞，只存在于隱窩基部，產(chǎn)生所有其它類型的細(xì)胞。注定要成為杯狀細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞在離開干細(xì)胞庫后經(jīng)歷約兩次額外的分裂，從隱窩遷移至絨毛，并將在絨毛頂端脫落。大腸由結(jié)腸、盲腸、闌尾、直腸和肛管組成。結(jié)腸的主要功能是重吸收電解質(zhì)和水并排出未消化的食物和廢物。粘膜從大體水平上看起來是平滑的，因?yàn)槠錄]有絨毛。存在無數(shù)的直的管狀腺。它們一直延伸至粘膜肌層。腺體和表面襯有單層柱狀上皮，其細(xì)胞類型與對小腸描述的相同。但是潘氏細(xì)胞通常不存在于成人中，腸內(nèi)分泌細(xì)胞少見。柱狀吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞是豐富的。杯狀細(xì)胞在隱窩中比沿表面更廣泛，其數(shù)目越朝向直腸遠(yuǎn)端越多。粘液有助于增加固體結(jié)腸內(nèi)容物的通過，并包覆細(xì)菌和顆粒物質(zhì)。吸收細(xì)胞具有不規(guī)則的短微絨毛，雖然它們分泌糖萼，但還沒有證明含有消化酶。吸收細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)電解質(zhì)。水被動(dòng)地隨著電解質(zhì)也被吸收。與在小腸相同，隱窩基部存在未分化細(xì)胞。盡管有關(guān)于多種癌癥形式(從外觀上為實(shí)體瘤和在身體不同部位的相關(guān)轉(zhuǎn)移到在全身循環(huán)的血細(xì)胞白血病，從完全良性到侵襲性惡性)的廣泛知識(shí)，但是有效的治療癌癥仍是困難的，通常治療限于三種類型放射治療、化學(xué)治療和手術(shù)治療。目前實(shí)際上還不存在針對特定的癌癥或一組癌癥的根本原因進(jìn)行更特異的治療的可能性。針對通過藥物發(fā)現(xiàn)嘗試提供這些特定藥物進(jìn)行了廣泛的努力，所述藥物發(fā)現(xiàn)嘗試試圖鑒定用于特定癌癥治療的藥物。癌癥的發(fā)生通常從一個(gè)細(xì)胞變化開始，該變化導(dǎo)致該第一個(gè)細(xì)胞無限制地發(fā)育和分裂成為不停分裂的細(xì)胞群。這些變化通常是關(guān)鍵基因慢性發(fā)生的突變或其它改變的累積，在該變化中突變的細(xì)胞群失去其原有的、常常是特殊的特征，而獲得越來越多的癌性性質(zhì)。在改變的細(xì)胞中，細(xì)胞正常的生長調(diào)節(jié)處理失去其功能。在所述細(xì)胞類型中通常只表達(dá)少量的基因的轉(zhuǎn)錄在癌細(xì)胞中不再受控制。在特定細(xì)胞類型中將是休眠的轉(zhuǎn)錄因子對基因轉(zhuǎn)錄的激活能夠例如導(dǎo)致癌癥的典型的非限制性生長和腫瘤性質(zhì)。實(shí)例是抑制基因的突變，抑制基因通常通過產(chǎn)生抑制轉(zhuǎn)錄途徑的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，而在特殊化的細(xì)胞中不再使用這一途徑。突變的抑制基因不再幫助保持細(xì)胞生長被阻止。針對或干預(yù)控制細(xì)胞生長或發(fā)育的轉(zhuǎn)錄途徑中的特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA相互作用的藥物可被認(rèn)為是用于特定癌癥治療中的典型候選藥物，特別是當(dāng)這些途徑發(fā)生錯(cuò)誤并導(dǎo)致無限制的細(xì)胞增長時(shí)。轉(zhuǎn)錄途徑發(fā)生錯(cuò)誤并導(dǎo)致癌癥發(fā)生的典型實(shí)例可見于結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)。該基因的突變是人中最常見的引起疾病事件之一，約50%的人群在正常壽命期間都將發(fā)生由APC突變引起的結(jié)腸直腸息肉。遺傳APC突變的個(gè)體發(fā)生成千上萬的結(jié)腸直腸腫瘤。APC蛋白與至少六種其它可能涉及交流APC相關(guān)生長控制的蛋白質(zhì)相互作用P-連環(huán)蛋白、i連環(huán)蛋白、微管蛋白、EB1、hDLG和ZW3/GSK卩激酶。具有突變APC的結(jié)腸癌細(xì)胞含有大量的單體的胞質(zhì)P-連環(huán)蛋白。再引入野生型APC減少P-連環(huán)蛋白的總量。特別是在過去十年間，結(jié)腸直腸癌的分子遺傳分析發(fā)現(xiàn)，最初被鑒定為引起家族性腺瘤性息肉病(FAP)的基因的結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)腫瘤抑制基因在結(jié)腸直腸腫瘤形成中發(fā)揮著限速作用其在多數(shù)散發(fā)的結(jié)腸直腸腫瘤中突變，在小鼠和人中在腫瘤發(fā)生的初期兩個(gè)APC等位基因都失活。此外，盡管結(jié)腸直腸腫瘤代表FAP的標(biāo)志，但是種系A(chǔ)PC突變通常導(dǎo)致外胚層、中胚層、內(nèi)胚層源的廣譜損害。實(shí)際上，F(xiàn)AP患者具有高的發(fā)展成為硬纖維瘤(纖維瘤)、十二指腸和胃腫瘤、視網(wǎng)膜上皮先天性肥大(CHRPE)、表皮囊腫、骨瘤、CNS腫瘤等的風(fēng)險(xiǎn)。后一觀測結(jié)果清楚地表明APC基因在維持整個(gè)有機(jī)體中的許多不同部位的組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在整個(gè)動(dòng)物界中控制空間分布和細(xì)胞的命運(yùn)決策(Artavanis-Tsakonas等，1999)。Notch基因編碼大的單跨膜受體。Notch受體與配體之間的相互作用導(dǎo)致受體的蛋白水解性裂解。所得的游離Notch胞內(nèi)域(NICD)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，在此其與轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jk(CSL或CBFI)結(jié)合，因此激活耙基因轉(zhuǎn)錄(Baron2003,Mumm&Kopan2000)。被最好表征的Notch耙基因是發(fā)狀分裂增強(qiáng)子(hairy/enhancerofsplit,HES)轉(zhuǎn)錄阻抑物。HES蛋白又阻抑下游基因的表達(dá)(Heitzler等，1996，Oellers等，1994)。盡管Notch途徑組分均在小鼠腸中表達(dá)(Schroder&Gossler2002)，但目前還沒有獲得這些組分參與控制上皮細(xì)胞命運(yùn)的遺傳學(xué)證據(jù)。已知在其它組織中代表Notch靶基因的HES-1缺陷動(dòng)物顯示粘液分泌細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞相對增加，其以吸收細(xì)胞相對減少為代價(jià)(Jensen等，2000)。如基因敲除所揭示的，在腸中推定的HES-1阻抑的下游靶Math-l(Jensen等，2000)(Zheng等，2000)是保證朝向分泌譜系所必需的(Yang等，2001)。對這些結(jié)果的解釋表明Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變了離開過渡擴(kuò)增區(qū)室轉(zhuǎn)向腸上皮細(xì)胞表型的分化隱窩細(xì)胞的命運(yùn)。在這一路線中，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子基因例如HESl，HES1又阻抑諸如Mathl等基因，驅(qū)動(dòng)分化細(xì)胞離開分泌譜系。Notch對腸細(xì)胞命運(yùn)的控制的間接支持來自如最初開發(fā)用于阿爾茨海默氏病的，分泌酶抑制劑的使用。Notch是幾種y-分泌酶的已知底物之一。Y-分泌酶對Notch的蛋白水解加工是該途徑激活后的必需步驟。結(jié)果，Y-分泌酶抑制劑的作用之一是去除Notch途徑激活(DeStrooper等，1999,K叩an&Goate2000)。用這些抑制劑進(jìn)行的嚙齒動(dòng)物毒理學(xué)研究揭示分泌粘液的杯狀細(xì)胞的大小和數(shù)目都增加(Searfoss等，2003;Wong等，2004;Milano等，2004)。由于這些種類的研究，多個(gè)有希望的Y-分泌酶抑制劑在它們用于治療阿爾茨海默氏病的進(jìn)一步臨床開發(fā)中已經(jīng)停止，因?yàn)閲?yán)重懷疑它們誘發(fā)腸道異常。本發(fā)明公開了令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，Notch途徑激活的抑制劑(例如Y-分泌酶抑制劑)對于治療腸腺瘤和/或腺癌極為有用。用Notch途徑激活的抑制劑治療腸腺瘤和/或腺癌導(dǎo)致轉(zhuǎn)化/惡性細(xì)胞增殖的抑制，使它們分化為有絲分裂期后細(xì)胞(即不再進(jìn)行(可見)分裂)例如杯狀細(xì)胞。這些分化的細(xì)胞具有相對短(5-6天)的壽命，在其死亡后由機(jī)體清除，腸腺瘤和/或腺癌在大小/體積上至少部分減小。在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于改變腺瘤和/或腺癌細(xì)胞命運(yùn)的方法，該方法包括影響Notch途徑激活。更具體而言，本發(fā)明提供一種(體外和/或體內(nèi))用于誘導(dǎo)腺瘤和/或腺癌細(xì)胞形成有絲分裂期后細(xì)胞的方法，該方法包括至少部分地抑制所述腺瘤和/或腺癌細(xì)胞中的Notch途徑激活。有絲分裂期后細(xì)胞的實(shí)例是杯狀細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于至少部分地減少動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法，該方法包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活。Notch途徑激活通常與以下事件一起發(fā)生。Notch是跨膜表面受體，其可通過多種蛋白水解性裂解而被激活，其中的一種裂解是被一種稱為Y-分泌酶的具有蛋白酶活性的蛋白復(fù)合物裂解。(力-分泌酶是一種蛋白酶，其在膜內(nèi)行使其裂解活動(dòng)。(力-分泌酶是一種多組分酶，由至少四種不同的蛋白，即早老素(早老素1或2)、nicastrin、PEN-2和APH-1組成。早老素是Y-分泌酶的催化中心。與配體結(jié)合時(shí)，Notch受體發(fā)生構(gòu)象變化，使胞外域通過金屬蛋白酶ADAM蛋白酶的作用而脫落。然后緊跟著Y-分泌酶復(fù)合物發(fā)揮作用，導(dǎo)致釋放Notch胞內(nèi)域(NICD)。NICD轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，在此其與CSL(C-啟動(dòng)子結(jié)合因子/重組信號序列結(jié)合蛋白JK/無毛抑制因子/Lagl灘互作用。NICD的結(jié)合將CSL從轉(zhuǎn)錄阻抑物轉(zhuǎn)化為激活物，導(dǎo)致Notch靶基因的表達(dá)。本發(fā)明的發(fā)明人研究了Notch途徑多種組分和靶基因在APC突變的min小鼠中自發(fā)發(fā)生的腺瘤中的表達(dá)，APC突變的min小鼠是家族性腺瘤性息肉病和腸癌的可靠動(dòng)物模型。本發(fā)明的發(fā)明人建立了Notch途徑中多個(gè)組分包括Notch2和Delta-like-l在腺瘤中的表達(dá)。此外，本發(fā)明的發(fā)明人還確定了Notch靶基因Hesl在腺瘤中表達(dá)，這表明活性Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在這些腺瘤中發(fā)生。接著的一步中，本發(fā)明的發(fā)明人確定了Notch途徑激活的抑制劑對腺瘤的作用。通過向參與腸腺瘤和/或腺癌的惡性/轉(zhuǎn)化細(xì)胞提供Notch途徑激活的抑制劑，所述細(xì)胞的命運(yùn)被改變?yōu)檗D(zhuǎn)向有絲分裂期后的命運(yùn)，例如轉(zhuǎn)向杯狀細(xì)胞類型。該細(xì)胞具有相對短(5-6天)的壽命，提供抑制劑不久將死亡，導(dǎo)致腸腺瘤和/或腺癌細(xì)胞的量減少，即腸腺瘤和/或腺癌中至少一種體積減小。通過提供Notch途徑激活的抑制劑，腸腺瘤和/或腺癌的增殖能力至少部分地被減小。優(yōu)選地，該減小通過掃描或探查手術(shù)可見。更優(yōu)選地，腸腺瘤和/或腺癌的減小是完全的，即無(可見的)殘余惡性/轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本文的動(dòng)物定義為非人動(dòng)物或人。Notch途徑激活的(至少部分抑制，但優(yōu)選完全)抑制可通過不同途徑實(shí)現(xiàn)，本文以下(非限制性)概述這些途徑。優(yōu)選局部進(jìn)行抑制，即在腺瘤和/或腺癌細(xì)胞中進(jìn)行而不千擾非腺瘤和/或非腺癌細(xì)胞中的Notch途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，Notch途徑激活定義為包括Notch樣分子和/或Notch(樣)分子的不同等位基因變體的途徑激活。腸腺瘤通常定義為良性腫瘤如息肉。腺癌通常定義為惡性腫瘤，也稱為結(jié)腸直腸癌。術(shù)語"腸腺瘤和/或腺癌"在本文中定義為還包括來自所述腺癌的轉(zhuǎn)移灶。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)移灶來自腸腺癌。該轉(zhuǎn)移灶可以位于(要)治療的個(gè)體的身體的任何部位，例如腸腺癌轉(zhuǎn)移灶位于所述個(gè)體的肺或腦或腎臟或肝臟。此外，本發(fā)明的方法適合治療腸腺瘤和/或腺癌和/或來自它們的任何大小的轉(zhuǎn)移灶。目前使用的腫瘤治療的一個(gè)缺點(diǎn)是所述治療通常需要依賴于新形成的血管(血管發(fā)生)的存在以將所述治療中使用的化合物遞送至所述腫瘤或其轉(zhuǎn)移灶。本發(fā)明依賴于對轉(zhuǎn)化/惡性細(xì)胞增殖的抑制以及它們向有絲分裂期后細(xì)胞的分化。因此，與一些傳統(tǒng)治療相比，小腫瘤或小轉(zhuǎn)移灶(尚未有任何新血管形成)可以在早得多的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行治療。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于至少部分地減小動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法，該方法包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活，其中所述Notch途徑激活通過提供給所述動(dòng)物，分泌酶抑制劑而被至少部分地抑制。該Y-分泌酶抑制劑是例如在性質(zhì)上是肽分子或非肽分子或半肽分子，優(yōu)選是小分子。y-分泌酶最初定義用于阿爾茨海默氏病。阿爾茨海默氏病的發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵的步驟是APP蛋白酶解，導(dǎo)致p淀粉樣肽(A卩)形成，p淀粉樣肽是該病的特征性腦斑塊的主要蛋白組分。APP(正如Notch—樣)首先在胞外域(在該情況下通過P-分泌酶)裂解，而APP的其余部分在膜內(nèi)被？分泌酶裂解生成A卩肽。通過阻斷Y-分泌酶活性對A卩肽生成的抑制是目前減慢阿爾茨海默氏病病理進(jìn)展的最有希望的治療策略之一。幾家公司同時(shí)開發(fā)了？分泌酶抑制劑，例如DAPT(N-[N-(3，5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁基酯)。此外，已測試了來自化學(xué)類別AS(芳基磺酰胺)、DBZ(二苯氮蕈(DBZ)、BZ(苯二氮萆)、LY-41K575等的化合物的Y-分泌酶抑制活性。關(guān)于Y-分泌酶抑制劑的綜述例如在Harrison等，2004中進(jìn)行了概述，其中"分泌酶抑制劑被分為磺酰胺/砜和苯二氮草/苯并內(nèi)酰胺。這些，分泌酶抑制劑中的幾個(gè)已經(jīng)進(jìn)入I期和II期臨床試驗(yàn)階段。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，用于至少部分地減小動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法(所述方法包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活，其中所述Notch途徑激活通過提供給所述動(dòng)物，分泌酶抑制劑而被至少部分地抑制)可以通過提供至少一種或至少兩種或多種Y-分泌酶抑制劑，即通過提供不同？分泌酶抑制劑的組合來進(jìn)行。清楚Y-分泌酶通常能夠以(至少)兩種途徑起作用APP途徑和Notch途徑。化學(xué)公司同時(shí)開發(fā)了對一種或另一種特異的Y-分泌酶，例如對APP途徑特但不干擾Notch途徑的Y-分泌酶。清楚不干擾Notch途徑的i分泌酶在本發(fā)明的方法中是無用的。因此，優(yōu)選既能夠干擾Notch途徑又干擾APP途徑的y-分泌酶或優(yōu)選能夠特異地干擾Notch途徑的？分泌酶。這種抑制劑能夠例如在Harrison等，2004中找到，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于至少部分地減小動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法，該方法包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活，其中所述Notch途徑激活通過提供給所述動(dòng)物？分泌酶抑制劑而被至少部分地抑制，其中所述"分泌酶抑制劑是DAPT或二苯氮萆(DBZ)或苯二氮蕈(BZ)。DAPT、DBZ或BZ都有效地誘導(dǎo)腺瘤和/或腺癌細(xì)胞形成有絲分裂期后細(xì)胞，因此這些化合物在本發(fā)明的方法中具有相似的作用。但是DBZ的IC50為1.7nM，BZ的IC50為2.2nM，而DAPT的IC50為10nM,因此如果與DAPT相比，使用較低量的DBZ或BZ可以獲得相似的結(jié)果。如上所述，Y-分泌酶是蛋白復(fù)合物。至少部分地抑制Notch途徑激活的另一種方式通過至少部分地抑制所述蛋白復(fù)合物的形成來完成，因?yàn)檎J(rèn)為只有復(fù)合物才是有活性的。這例如通過提供所述組分之一作為顯性陰性分子或通過提供所述復(fù)合物的一部分/分子來實(shí)現(xiàn)，其中所述部分/分子包含防止進(jìn)一步形成復(fù)合物的突變或?qū)е虏环€(wěn)定(非活性)蛋白復(fù)合物的突變。至少部分地抑制Notch途徑激活的另一種方式是特異性抑制所述復(fù)合物的催化部分，即特異性抑制早老素。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于至少部分地減小動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法，該方法包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活，其中所述Notch途徑激活通過至少部分地減少配體介導(dǎo)的Notch激活而至少部分地被抑制。如上所述，Notch途徑激活從配體結(jié)合開始，這一事件之后Notch受體經(jīng)歷構(gòu)象變化，使胞外域通過ADAM蛋白酶的作用而脫落。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，與Notch結(jié)合的配體可以至少部分地，但優(yōu)選完全被多種策略抑制。優(yōu)選通過提供給所述動(dòng)物Notch的顯性陰性配體來至少部分地減少所述配體介導(dǎo)的Notch激活。天然Notch配體的實(shí)例是Delta、Jagged和Serrate蛋白。顯性陰性配體，即能夠與Notch結(jié)合但基本上不進(jìn)一步激活Notch途徑(阻斷Notch途徑激活)的配體，可來自所述天然配體，例如基于所述天然配體的結(jié)合部分來制備結(jié)合小分子。當(dāng)顯性陰性配體與Notch接觸時(shí)，所述顯性陰性配體與Notch結(jié)合而不進(jìn)一步激活Notch途徑。優(yōu)選地，所述顯性陰性配體與Notch的連接溜合較長時(shí)間且天然配體的結(jié)合被部分地，優(yōu)選完全地阻斷/抑制，結(jié)果Notch途徑激活被(至少部分地)抑制。顯性陰性配體的實(shí)例是例如包含細(xì)胞內(nèi)缺失的Delta禾BSerrate的突變體(SunandArtavanis-Tsakonas,1996)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體介導(dǎo)的Notch激活通過提供給所述動(dòng)物顯性陰性配體而被至少部分地減少。原則上，每種類型的Notch分子，即Notchl、2、3、4或其功能片段和/或功能衍生物都可用于這個(gè)目的。功能片段是來自這些分子(或其等同物)之一的能夠與Notch配體結(jié)合的任何片段(N末端片段、C末端片段或內(nèi)部片段或它們的任何組合)。該功能片段可以例如作為膜結(jié)合化合物或作為非膜結(jié)合化合物而存在。通過顯性陰性Notch與可利用配體的結(jié)合，所述配體不能與天然/原本/功能上可利用的Notch結(jié)合，因此Notch途徑激活被至少部分地抑制。功能衍生物是例如突變(點(diǎn)突變、插入)后使得與配體的結(jié)合仍然可能但該突變阻止配體結(jié)合的信號被傳遞的Notch分子。功能衍生物也可以來自其它物種。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述配體介導(dǎo)的Notch激活通過提供給所述動(dòng)物能夠至少部分地阻斷Notch配體與Notch間相互作用的抗體而被至少部分地減少。該抗體例如是針對Notch的配體結(jié)合部分或針對配體中與Notch相互作用的部分?？贵w的制備在本領(lǐng)域的常規(guī)工作，因此有關(guān)這方面的進(jìn)一步細(xì)節(jié)沒有提供。不依賴于所使用的配體介導(dǎo)的Notch激活抑制類型，結(jié)果都是一樣(至少部分)NICD的形成被抑制，這最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化/惡性細(xì)胞形成有絲分裂期后細(xì)胞(例如杯狀細(xì)胞)。如上所述，Notch途徑激活的(至少部分，但優(yōu)選完全)抑制可以以不同方式實(shí)現(xiàn)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于至少部分地減小動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法，該方法包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活，其中所述Notch途徑激活通過提供給所述動(dòng)物ADAM蛋白酶抑制劑而被至少部分地抑制。Notch配體與Notch結(jié)合后，Notch受體經(jīng)歷構(gòu)象變化，使胞外域通過ADAM蛋白酶的作用而脫落。ADAM代表解聚素(disintegrin)和金屬蛋白酶。通過提供能夠抑制完成胞外域脫落的蛋白酶的物質(zhì)，Notch途徑激活被至少部分地，但優(yōu)選完全地抑制，即無NICD形成發(fā)生。在腸腺瘤和/或腺癌的情況下，這導(dǎo)致增腺瘤和/或腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛薪z分裂期后細(xì)胞即杯狀細(xì)胞。另外，Notch途徑激活的局部抑制優(yōu)選盡可能地避免任何可能的不期望的副作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，至少部分地抑制Notch激活的不同方式也可以組合以例如增強(qiáng)效果。由Wnt途徑的突變激活導(dǎo)致腸腺瘤，所述Wnt途徑的突變激活最常見的原因是腸腫瘤抑制基因APC的缺失(Kinzler和Vogelstein,1996)。我們最近確定了結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的Wnt耙基因程序，因此發(fā)現(xiàn)了腺瘤細(xì)胞與增隱窩祖細(xì)胞之間顯著的對稱性(vandeWetering等，2002)。為研究該對稱性是否延至Notch途徑，我們研究了多種Notch途徑組分和耙基因在APC突變的min小鼠中自發(fā)發(fā)生的腺瘤中的表達(dá)。一般而言，如以前(SchroderandGossler，2002)所報(bào)道，腺瘤中受體和配體的表達(dá)緊跟著隱窩的表達(dá)。例如，圖1給出了APC突變的min小鼠的腺瘤中Notch2和Delta-like-1的表達(dá)。更重要地，作為活性Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)指示的HES1的表達(dá)不僅在隱窩中發(fā)生，也于APCmin小鼠腸中各種大小的腺瘤中一致地觀察到(圖1)。這一觀察結(jié)果表明，象在隱窩中一樣，Notch和Wnt途徑在增腺瘤細(xì)胞中也具有活性。本文公開的實(shí)施例意想不到地證明腸上皮干/祖細(xì)胞既需要Wnt途徑也需要Notch途徑才能保持不分化。本文公開，對于其中Wnt級聯(lián)具有組成型活性的轉(zhuǎn)化/惡性細(xì)胞同樣是事實(shí)需要Notch活性以保持細(xì)胞的轉(zhuǎn)化/惡性狀態(tài)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于至少部分地減小動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法，該方法包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活，還包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Wnt途徑激活。通過提供給患有腸腺瘤和/或腺癌的細(xì)胞Wnt途徑激活的抑制劑，惡性/非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化并在形成后不久死亡，因此減小腸腺瘤和/或腺癌的大小/體積。通過Notch途徑激活抑制劑與Wnt途徑激活抑制劑的組合作用，腸腺瘤和/或腺癌細(xì)胞分化，導(dǎo)致至少部分地減小腸惡性腫瘤。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，通過Wnt途徑抑制劑的單獨(dú)作用也可以治療腸腺瘤和/或腺癌。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供Notch途徑抑制劑在制備用于治療腸腺瘤和/或腺癌的藥物中的用途。如以上對本發(fā)明的方法所述，可以使用多種抑制劑以至少部分地減少NICD的形成，因此至少部分地阻止Notch途徑激活。優(yōu)選Notch抑制劑的實(shí)例是Y-分泌酶抑制劑如DAPT或二苯氮罩(DBZ)或苯二氮萆(BZ)、能夠減少配體介導(dǎo)的Notch激活的抑制齊U(例如通過Notch的顯性陰性配體或通過顯性陰性Notch或通過能夠至少部分地阻斷Notch配體與Notch間相互作用的抗體)或ADAM蛋白酶抑制劑。此外，該抑制劑中可以補(bǔ)充有Wnt途徑抑制劑或與現(xiàn)有的治療如化療、手術(shù)或放療組合使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供Notch途徑激活抑制劑在制備用于治療腸腺瘤和/或腺癌的藥物中的用途，其中所述腸腺瘤和/或腺癌發(fā)生于患有遺傳綜合征家族性腺瘤性息肉病(FAP)的患者中。FAP由結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因的遺傳突變引起。息肉病主要是指"很多息肉"。息肉是腸壁上的小的組織生長物。最常見的息肉且也是唯一能夠變成腸癌的息肉是腺瘤性息肉。在FAP中，在整個(gè)結(jié)腸中發(fā)生成百至上千個(gè)息肉。這些息肉通常開始在16歲左右形成。如果不摘除，這些息肉幾乎總會(huì)發(fā)展成為癌癥。被診斷具有APC突變的個(gè)體不僅具有患結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，而且與一般人群相比可能具有高的患其它類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。弱FAP(attenuatedFAP)(AFAP)是一種嚴(yán)重程度較低的FAP變體，其中人發(fā)生較少的息肉。AFAP通常不像FAP發(fā)生那么早，但它也具有類似的患癌高風(fēng)險(xiǎn)。一旦診斷為FAP，患者通常最終經(jīng)受預(yù)防性(亞)全結(jié)腸切除術(shù)。如果罹患FAP的患者進(jìn)行本發(fā)明的方法或用途，則現(xiàn)在可以部分地避免使用該結(jié)腸切除術(shù)。本文使用的APCmin小鼠大體上是人FAP的對應(yīng)物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含至少兩種Notch途徑激活抑制劑或包含至少一種Notch途徑激活抑制劑和至少一種Wnt途徑抑制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以散劑、在(非)含水液體中的溶液劑或混懸劑的形式或作為乳劑提供。所述藥物組合物可以進(jìn)一步含有藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑。所述藥物組合物可以經(jīng)口服、腸胃外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、非經(jīng)腸(parentally)、腹膜內(nèi)或結(jié)腸直腸(例如用栓劑)給藥。優(yōu)選口服和結(jié)腸直腸遞送，因?yàn)橥ㄟ^這些遞送途徑可以容易地到達(dá)要治療區(qū)域。此外，優(yōu)選局部遞送以避免任何不期望的副作用。關(guān)于劑量，注意本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)例如已知的藥代動(dòng)力學(xué)能夠確定例如DAPT禾口/或DBZ禾口/或BZ的有效劑量。此外，通過使用一個(gè)或多個(gè)熟知的劑量確定實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以確定有效劑里。除了藥物在上述任何方法中的用途之外，本發(fā)明的藥物作為對其它治療的添加(殘余(residual))也是非常有用的。例如，如果決定手術(shù)摘除腺瘤或腺癌，本發(fā)明的藥物在手術(shù)之前和/或期間和/或之后提供以誘導(dǎo)腺瘤和/或腺癌細(xì)胞形成有絲分裂期后細(xì)胞或者至少部分地進(jìn)一步減小腺瘤和/或腺癌或者治療剩余的(可能不可見的)殘留腺瘤和/或腺癌細(xì)胞。這例如通過用本發(fā)明的液化藥物洗滌腹腔或通過直接將本發(fā)明的藥物注射至疑似區(qū)域來進(jìn)行。以下描述將更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但其不限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)I材料和方法免疫組化抗體使用以下抗體。小鼠抗-Ki67(1:100;Novocastra)、小鼠抗-P-連環(huán)蛋白(1:50;TransductionLabs)。組織樣品制備、免疫組化和原位雜交將腸道整個(gè)切除，用冷PBS輕輕沖洗以除去任何糞便內(nèi)容物，然后用福爾馬林沖洗。將小腸巻成緊密的環(huán)圈，在室溫下于福爾馬林中固定16小時(shí)。將組織切片(2-6pm)。脫蠟并水化后，用過氧化物酶封閉緩沖液(120mMNa2HP04，43mM檸檬酸，30mMNaN3，0.2%H202;pH5.8)在室溫下將切片預(yù)處理15分鐘。將樣品在檸檬酸鈉緩沖液(10mM，pH6.0)中煮沸以修復(fù)抗原。20分鐘后，將煮盤緩慢冷卻至室溫?？贵w的溫育在4"C下在于PBS中的BSA中過夜，對于溶菌酶、Ki67在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。在所有情況下都使用Envision+試劑盒(DAKO)作為二級試劑。溫育時(shí)間為30分鐘。使用DAB顯色。然后玻片用蘇木精進(jìn)行復(fù)染并封固。原位雜交使用的探針如所述(Schroder等，2002)。對很好表征的人病理石蠟包埋樣品進(jìn)行相似的原位雜交，但顯然使用人RNA序列作為探針。愛茜藍(lán)染色脫蠟并水化后，將組織在愛茜藍(lán)(1%，在0.5%乙酸中)中溫育5分鐘。然后用水洗滌，在中性紅中溫育l分鐘。迅速脫水，在二甲苯中洗滌，并用Pertex封固。APC^小鼠中Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥理學(xué)抑制用兩種不同的經(jīng)口服遞送的Y-分泌酶抑制劑(DAPT:100mg/kg，在玉米油中)處理8周齡的APC"in小鼠2.5、6.5或15天，然后分離腸，并進(jìn)行組織學(xué)檢査。結(jié)果由Wnt途徑的突變激活導(dǎo)致腸腺瘤，所述Wnt途徑的突變激活最常見的原因是腸腫瘤抑制基因APC的缺失(綜述見Kinzler和Vogelstein，1996;Bienz和Clevers,2000)。我們最近報(bào)告了在Wnt耙基因表達(dá)程序表達(dá)方面結(jié)腸直腸癌細(xì)胞與增隱窩祖細(xì)胞之間具有顯著的對稱性(vandeWetering等，2002)。為研究隱窩與腸腫瘤之間的對稱性是否延至Notch途徑，我們研究了多種Notch途徑組分和耙基因在APCmin小鼠中自發(fā)發(fā)生的腺瘤中的表達(dá)。一般而言，如以前(SchroderandGossler，2002)(表I)所報(bào)告，腺瘤中受體和配體的表達(dá)緊跟著隱窩表達(dá)。例如，圖1顯示腺瘤中Notch2和Delta-like-l的表達(dá)。更重要地，作為活性Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)指示的Hesl的表達(dá)不僅在隱窩中發(fā)生(SchroderandGossler，2002)，也在APCmin小鼠腸中各種大小的腺瘤中一致地觀察到(圖1，右側(cè))。這一觀察結(jié)果表明，象在隱窩中一樣，Notch和Wnt途徑在增腺瘤細(xì)胞中也同時(shí)具有活性。然后我們提出Notch途徑活性對于保持腺瘤細(xì)胞的未分化增殖表型是否是必需的問題。我們選擇通過使用Y-分泌酶抑制劑DAPT對Notch途徑進(jìn)行藥理學(xué)抑制。然后我們開始對15周齡的APCmiVJ、鼠進(jìn)行治療，該齡的這些小鼠在小腸中帶有30-60個(gè)可經(jīng)肉眼檢測到的腺瘤或息肉，在結(jié)腸中帶有1-3個(gè)腺瘤。對小鼠治療達(dá)到15天，然后對腸進(jìn)行組織學(xué)檢査。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和發(fā)表的治療方案，將于玉米油中的DAPT以100mg/kg的劑量每日一次口服給予APCmilM、I。在治療的第2.5天或6.5天未觀察到一致的作用。但是，在用該化合物治療的第15天在腺瘤中發(fā)生了廣泛的變化。如圖2和3所示，增Ki67陽性細(xì)胞的數(shù)目顯著減少。在圖2中，通過P-連環(huán)蛋白染色視覺可見結(jié)腸腺瘤(左側(cè))。值得注意的是，在相鄰的正常隱窩中的增殖未受影響。整個(gè)腺瘤中都出現(xiàn)了愛茜藍(lán)陽性杯狀細(xì)胞的大集中灶。停滯和分化細(xì)胞的胞核p-連環(huán)蛋白陽性表明這些細(xì)胞來自Apc-陰性腺瘤。在圖3中給出了小腸腺瘤的實(shí)例。同樣，左側(cè)顯示腺瘤組織染色為深棕色。Ki67染色(右側(cè))證明的細(xì)胞增殖在用化合物DAPT治療后停止。大量證據(jù)表明Wnt級聯(lián)是小鼠和人腸中過渡擴(kuò)增的隱窩祖細(xì)胞以及腺瘤和腺癌增殖潛能后面的主要驅(qū)動(dòng)力。目前的數(shù)據(jù)表明活性Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在保持隱窩祖細(xì)胞和Apc突變腫瘤細(xì)胞的未分化狀態(tài)中發(fā)揮著同樣重要的作用。雖然在轉(zhuǎn)化過程開始時(shí)Wnt級聯(lián)被經(jīng)突變激活，但Notch途徑在腫瘤進(jìn)展中非?？赡鼙３植煌蛔儭５强梢灶A(yù)見在晚期腫瘤中對存在激活Notch途徑突變存在強(qiáng)的選擇性壓力。該激活突變在結(jié)腸直腸癌中未見報(bào)道。作為在結(jié)腸直腸癌中被激活的Wnt級聯(lián)通常被認(rèn)為對藥物開發(fā)提供相當(dāng)不利的靶，因?yàn)锳pc腫瘤抑制基因蛋白的級聯(lián)下游節(jié)段完全受蛋白-蛋白間相互作用驅(qū)動(dòng)。如本文直接證明的，Notch途徑代表用于治療腸腫瘤如家族性腺瘤性息肉病或散發(fā)性結(jié)腸直腸癌的另一耙向藥物策略。已開發(fā)了多種化學(xué)來源的多種？分泌酶抑制劑用于治療阿爾茨海默氏病。在動(dòng)物毒性研究中腸杯狀細(xì)胞數(shù)目的增加被認(rèn)為是這些化合物最主要的不期望的副作用。但是，我們認(rèn)為這一Notch相關(guān)作用使這些？分泌酶抑制劑成為用于結(jié)腸直腸癌的有吸引力的治療模式。實(shí)驗(yàn)II材料和方法免疫組化抗體使用以下抗體。小鼠抗-Ki67(l:100;Novocastra)、小鼠抗-p-連環(huán)蛋白(1:50;TransductionLabs),兔抗Mathl(1:50;DrJaneJohnson贈(zèng)送)。組織樣品制備、免疫組化和原位雜交將腸道整個(gè)切除，用冷PBS輕輕沖洗以除去任何糞便內(nèi)容物，然后用福爾馬林沖洗。將小腸巻成緊密的環(huán)圈，在室溫下于福爾馬林中固定16小時(shí)。將組織切片(2-6Mm)。脫蠟并水化后，用過氧化物酶封閉緩沖液(120mMNa2HP04,43mM檸檬酸，30mMNaN3，0.2°/。H202;pH5.8)在室溫下將切片預(yù)處理15分鐘。將樣品在檸檬酸鈉緩沖液(10mM,pH6.0)中煮沸以修復(fù)抗原。20分鐘后，將煮盤緩慢冷卻至室溫。針對Mathl的抗體在4°。下將抗體的溫育在于PBS中的BSA中進(jìn)行過夜，針對Ki67和P-連環(huán)蛋白的抗體在室溫下溫育1小時(shí)。在所有情況下都使用Erwision+試劑盒(DAKO)作為二級試劑。使用DAB顯色。然后將玻片用蘇木精進(jìn)行復(fù)染并封固。Y-分泌酶抑制劑DBZ由Syncom,Groningen，theNetherlands定審!j合成3g的DBZ(Milano等，2004)，純度>99.9%。將DBZ微細(xì)地懸浮于在水中的0.5%(重量/體積)羥丙基甲基纖維素(MethocelE4M)和0.1%(重量/體積)吐溫80中。用Y-分泌酶抑制劑DBZ治療動(dòng)物每日用0、3、10和30pmol/KgY-分泌酶抑制劑DBZ腹膜內(nèi)注射C57B16小鼠共5天。我們開始治療8周齡的APC"^小鼠，各兩只小鼠均用0、3、10或30jmiol/KgDBZ注射治療。每隔48小時(shí)腹腔內(nèi)注射DBZ，共進(jìn)行10天，然后通過系列切片對腸進(jìn)行組織學(xué)檢査。結(jié)果作為在體內(nèi)阻斷Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一工具，我們合成了y-分泌酶抑制劑DBZ18，純度>99.9%。DBZ在基于細(xì)胞的測試中阻斷了Notch裂解，其IC5(X2nM(未顯示)。在確定劑量的實(shí)驗(yàn)中，將該化合物以0、3、10和30nmol/Kg每日腹膜內(nèi)注射于C57B16小鼠中，共5天。在較高劑量(10和30拜ol/Kg)時(shí)，PAS染色顯示腹膜內(nèi)注射5天后杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化完全(分別為圖4C和D)。另外，細(xì)胞增殖完全停止，組織學(xué)標(biāo)記物(Ki67和Mathl)揭示組織變化與CSL缺失時(shí)觀察到的變化沒有區(qū)別(結(jié)果未顯示)。在3jxmol/Kg時(shí)，PAS染色顯示杯狀細(xì)胞數(shù)目稍稍增加(圖4B)。遺傳學(xué)和藥理學(xué)的結(jié)果聯(lián)合表明在隱窩區(qū)室中Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是正確保持隱窩祖細(xì)胞未分化狀態(tài)所必需的。關(guān)于Notch途徑活性對于保持腺瘤細(xì)胞的未分化增殖表型是否必需的問題，我們選擇從藥理學(xué)上抑制Notch途徑。在實(shí)驗(yàn)I中，這通過使用，分泌酶抑制劑DAPT來進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)II中，我們選擇通過使用y-分泌酶抑制劑DBZ對Notch途徑進(jìn)行藥理抑制(Wong等，2004)。我們開始對8周齡的APCmin小鼠進(jìn)行治療，該齡的這些小鼠在小腸中帶有30-60個(gè)可經(jīng)肉眼檢測到的腺瘤(息肉)，結(jié)腸中帶有0-3個(gè)腺瘤。各兩只小鼠用0、3、10或30iamol/KgDBZ治療10天，然后通過系列切片對腸進(jìn)行組織學(xué)檢查。對p-連環(huán)蛋白染色來顯示腺瘤，腺瘤通常被包埋在堆積(accumulation)的已增生但未轉(zhuǎn)化的正常隱窩中(圖5A、C)。10或30pmol/Kg的DBZ在腺瘤中容易地誘導(dǎo)了]^3也1+/八8+/1067-杯狀細(xì)胞(圖5D、M-0)，而3nmol/Kg的作用最小，同對正常隱窩細(xì)胞的作用一樣(未顯示)。即使在同一動(dòng)物中在各腺瘤中也觀察到不同的轉(zhuǎn)化率。為定量轉(zhuǎn)化率，通過測定Mathl+細(xì)胞核的百分比對來自用10pmol/KgDBZ治療的小鼠的100個(gè)腺瘤進(jìn)行分析。在8%的腺瘤中，大于全部上皮細(xì)胞的50%被轉(zhuǎn)化為Mathl+細(xì)胞。在20%的腺瘤中，發(fā)生10-50%轉(zhuǎn)化。28%顯示1-10%的轉(zhuǎn)化，而46%則未顯示杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在未治療的APC^小鼠中從未觀察到杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在分析的100個(gè)腺瘤中的每個(gè)中，觀察到<1%的Mathl+杯狀細(xì)胞。這些觀察結(jié)果表明當(dāng)Notch途徑抑制時(shí)腺瘤細(xì)胞可能被迫分化。實(shí)驗(yàn)III材料和方法免疫組化抗體使用以下抗體。小鼠抗-Ki67(1:100;Novocastra)、小鼠抗-|3-連環(huán)蛋白(1:50;TransductionLabs)。組織樣品制備和免疫組化將腸道整個(gè)切除，用冷PBS輕輕沖洗以除去任何糞便內(nèi)容物，然后用福爾馬林沖洗。將小腸巻成緊密的環(huán)圈，在室溫下于福爾馬林中固定16小時(shí)。將組織切片(2-6pm)。脫蠟并水化后，用過氧化物酶封閉緩沖液(120mMNa2HP04,43mM檸檬酸，30mMNaN3，0.2%H202;pH5.8)在室溫下將切片預(yù)處理15分鐘。將樣品在檸檬酸鈉緩沖液(10mM，pH6.0)中煮沸以修復(fù)抗原。20分鐘后，將煮盤緩慢冷卻至室溫?？贵w的溫育在于PBS中的BSA中進(jìn)行過夜，針對Ki67和|3-連環(huán)蛋白的抗體在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。在所有情況下都使用EnViSi0n+試劑盒(DAKO)作為二級試劑。使用DAB顯色。然后將玻片用蘇木精進(jìn)行復(fù)染色并封固。Y分泌酶抑制劑DBZ和BZ由Syncom，Groningen，theNetherlands定制合成3g的DBZ和BZ(Milano等，2004),純度>99.9%。將DBZ微細(xì)地懸浮于在水中的0.5%(重量/體積)羥丙基甲基纖維素(MethocelE4M)和0.1%(重量/體積)吐溫80中，將BZ微細(xì)地懸浮于6%(體積/體積)乙醇/94%(體積/體積)LahrafilM1944CS中。用Y分泌酶抑制劑DBZ和BZ治療動(dòng)物每日用0、3、10和30nmol/KgY分泌酶抑制劑BZ腹膜內(nèi)注射C57B16小鼠共5天。對于口服研究,將藥物(DBZ和BZ)給予8周齡的APCmin小鼠(IO、20或30pmol/Kg)，然后通過系列切片對腸進(jìn)行組織學(xué)檢查。驢作為在體內(nèi)阻斷Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一工具，我們還合成了Y-分泌酶抑制劑BZ，純度>99.9%。BZ和DBZ在基于細(xì)胞的測試中都阻斷了Notch裂解，其IC50分別為2.2和1.7nM(未顯示)。在確定劑量的實(shí)驗(yàn)中，將BZ化合物以0、3、10和30pmol/Kg每日腹膜內(nèi)注射于C57B16小鼠中，共5天。在較高劑量(10和30pmol/Kg)時(shí)，PAS染色顯示腹膜內(nèi)注射5天后杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化完全。組織變化與當(dāng)CSL缺失(結(jié)果未顯示)時(shí)和用DBZ治療(見實(shí)驗(yàn)II)后觀察到的變化沒有區(qū)別。這些結(jié)果再次證實(shí)在隱窩層中Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是正確保持隱窩祖細(xì)胞未分化狀態(tài)所必需的。關(guān)于Notch途徑活性對于保持腺瘤細(xì)胞的未分化增殖表型是否必需的問題，我們選擇從藥理學(xué)上抑制Notch途徑。在實(shí)驗(yàn)I中，這通過使用，分泌酶抑制劑DAPT來進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)II中，我們選擇通過使用Y-分泌酶抑制劑DBZ經(jīng)IP給藥后對Notch途徑從藥理學(xué)上抑制(Wong等，2004)。在實(shí)驗(yàn)m中，我們選擇通過使用不同濃度的，分泌酶抑制劑DBZ和BZ經(jīng)口服給藥后對Notch途徑從藥理學(xué)上抑制。使用不同濃度背后的原理在于高濃度的這些化合物可能不僅影響腸腫瘤，而且也影響正常組織。我們開始對8周齡的APd、鼠進(jìn)行治療，該齡的這些小鼠在小腸中帶有30-60個(gè)可經(jīng)肉眼檢測到的腺瘤(息肉)，結(jié)腸中帶有0-3個(gè)腺瘤。各三只小鼠用10、15或30拜ol/KgBZ或DBZ治療最多12天，然后通過系列切片對腸進(jìn)行組織學(xué)檢查。對P-連環(huán)蛋白染色來顯示腺瘤，腺瘤通常包埋在堆積的已增生但尚未轉(zhuǎn)化的正常隱窩中。用化合物BZ和DBZ經(jīng)口服治療的第12天腺瘤中發(fā)生了變化。濃度為15拜ol/Kg時(shí)，腺瘤中增殖Ki67陽性細(xì)胞的數(shù)目顯著減少，而大部分正常腸組織似乎未受影響。總之，如Ki67/p-連環(huán)蛋白染色所證明，用化合物BZ和DBZ對APCmin小鼠經(jīng)口服治療后腺瘤中的細(xì)胞增殖停止而正常組織似乎未受影響。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>Jagged1+/國Jagged2-—Hesl++附圖簡述圖1原位雜交證明的Notch途徑組分(Delta-like1(左側(cè))、Noteh2(中間)和激活Notch途徑的耙基因(Hesl(右側(cè)))的實(shí)例在APC^n小鼠腺瘤中的表達(dá)。圖2如文中所述用DAPT治療的(上部圖)或未治療的(下部圖)APCmin小鼠結(jié)腸腺瘤的分析。左側(cè)上部/下部圖中的深染表明具有高水平(3-連環(huán)蛋白的上皮中代表腺瘤組織的區(qū)域。中間上部/下部圖給出了對細(xì)胞周期/增殖標(biāo)記物Ki67的染色。注意到用DAPT治療導(dǎo)致腺瘤中增殖活性的顯著下降。右側(cè)上部/下部圖顯示用DAPT治療時(shí)杯狀細(xì)胞的增加，由愛茜藍(lán)染色時(shí)深染細(xì)胞所指示。圖3如文中所述用DAPT治療的(上部圖)或未治療的(下部圖)APCmin小鼠小腸腺瘤的分析。左側(cè)上部/下部圖中的深染表明具有高水平p-連環(huán)蛋白的上皮中代表腺瘤組織的區(qū)域。右側(cè)上部/下部圖給出了對細(xì)胞周期/增殖標(biāo)記物Ki67的染色。注意到用DAPT治療導(dǎo)致腺瘤中增殖活性的顯著下降。圖4Y分泌酶抑制劑DBZ使增殖隱窩細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有絲分裂期后杯狀細(xì)胞。向C57B16小鼠以每日0、3、10和30pmol/Kg腹膜內(nèi)注射Y分泌酶抑制劑DBZ，共5天。濃度為3pmol/Kg時(shí)，PAS染色表明杯狀細(xì)胞數(shù)目輕度減少(B)，而10和30nmol/Kg時(shí)，增殖隱窩細(xì)胞向有絲分裂期后杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化完全(分別為C和D)。圖5通過y分泌酶抑制劑DBZAPC^腫瘤中增殖細(xì)胞向有絲分裂期后杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。APCmin小鼠用0nmol/KgDBZ(A、B、E、F、G、K)或10pmol/KgDBZ(C、D、L、M、N、O)治療IO天，然后通過系列切片對腸進(jìn)行組織學(xué)檢查。對(3-連環(huán)蛋白染色來顯示腺瘤(圖A、C、E、L)。DBZ治療誘導(dǎo)了Mathl(D比B,較高放大倍數(shù)下M比F)和Pas的表達(dá)(O比K)，并降低了Ki67的表達(dá)(N比G)。圖6如文中所述用BZ治療的或未治療的APC^小鼠的腸和腸腺瘤的分析。向C57B16小鼠以每日0、3、10和30Mmol/Kg腹膜內(nèi)注射y分泌酶抑制劑BZ，共5天。為3pmol/Kg時(shí)，PAS染色表明杯狀細(xì)胞數(shù)目輕度減少(未顯示)，而為10和30pmol/Kg時(shí)，增殖隱窩細(xì)胞向有絲分裂期后杯狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化完全(A)。如文中所述經(jīng)口服給予BZ或DBZ治療的(上部圖)或未治療的(下部圖)APC^小鼠的腺瘤的分析。圖(B、C)中深染表明具有高水平P-連環(huán)蛋白的上皮中代表腺瘤組織的區(qū)域。圖(D、E)給出了對細(xì)胞周期/增殖標(biāo)記物Ki67的染色。注意到用DBZ治療(未顯示)或用BZ治療(E比D)導(dǎo)致腺瘤中增殖活性的顯著下降，而周圍組織似乎未受影響。參考文獻(xiàn)Artavanis-TsakonasS，RandMD，LakeRJ.Notchsignalling:cellfatecontrolandsignalintegrationindevelopment.Science.1999Apr30;284(5415):770-6.BaronM.AnoverviewoftheNotchsignallingpathway.SeminCellDevBiol.2003Apr;14(2):113-9.BienzM.andClevers,H.(2000)LinkingcolorectalcancertoWntsignaling.Cell.Oct13;103(2):311-320.DeStrooperB,AnnaertW,CupersP,SaftigP,CraessaertsK，MummJS，SchroeterEH，SchrijversV,WolfeMS，RayWJ，GoateA,KopanR.Presenilin-l-dependentgamma-secretase國likeproteasemediatesreleaseofNotchintracellulardomain.Nature.1999Apr8;398(6727):518-22.HarrisonT.etal.(2004)y-SecretaseasatargetfordruginterventioninAlzheimer'sdisease,CurrentOpinioninDrugDiscovery&Development,7(5);709畫719.HeitzlerP，BourouisM,RuelL,CarteretC，SimpsonP.GenesoftheEnhancerofsplitandachaete-scutecomplexesarerequiredforaregulatoryloopbetweenNotchandDeltaduringlateralsignallinginDrosophila.Development.1996Jan;122(1):161-71.JensenJ，PedersenEE，GalanteP，HaldJ，HellerRS，IshibashiM,KageyamaR，GuillemotF,SerupP,MadsenOD.ControlofendodermalendocrinedevelopmentbyHes-1.NatGenet.2000Jan;24(l):36-44.Kinzler，K.W.andVogelsteinB.，(1996)Lessonsfromhereditarycolorectalcancer.Cell,Oct18;87(2):159-170,KopanR，GoateA.AcommonenzymeconnectsnotchsignalingandAlzheimer'sdisease.GenesDev.2000Nov15;14(22):2799畫806.MilanoJ，McKayJ,DagenaisC,Foster-BrownL,PognanF,GadientR,JacobsRT,ZaccoA,GreenbergB,CiaccioPJ.ModulationofNotchProcessingby{gamma}國SecretaseInhibitorsCausesIntestinalGobletCellMetaplasiaandInductionofGenesKnowntoSpecifyGutSecretoryLineageDifferentiation.Toxicol.ScL2004Nov;82(l):341畫358.MummJS，KopanR.Notchsignalling:fromtheoutsidein.DevBiol.2000Dec15;228(2):151-65.OellersN，DehioM，KnustE.bHLHproteinsencodedbytheEnhancerofsplitcomplexofDrosophilanegativelyinterferewithtranscriptionalactivationmediatedbyproneuralgenes.MolGenGenet.1994Sepl;244(5):465-73.SchroderNandGosslerA.ExpressionofNotchpathwaycomponentsinfetalandadultmousesmallintestine.GeneExprPatterns.2002Dec;2(3-4):247隱50.Searfoss,G.H.etal(2003)Adipsin，abiomarkerofgatrointestinaltoxicitymediatedbyafunctionalgamma-secretaseinhibitor,J.Biol.Chem.,Nov14(278(46):46107國46116.Sun,X.andArtavanis-Tsakonas,S.(1996)TheintracellulardeletionsofDeltaandSerratedefinedominantnegativeformsoftheDrosophilaNotchligands，Development,122,pages2465-2474.VandeWeteringM，SanchoE，VerweijC,deLauW，OvingI，HurlstoneA,vanderHornK,BatlleE,CoudreuseD，HaramisAP,Tjon-Pon-FongM，MoererP，vandenBornM,SoeteG，PalsS，EilersM，MedemaR,CleversH.Thebeta-catenin/TCF-4compleximposesaciyptprogenitorphenotypeoncolorectalcancercells.Cell.2002Oct18;111(2):241-50.WongGT,ManfraD,PouletFM，ZhangQ,JosienH,BaraT，EngstromL，Pinzon畫OrtizM,FineJS,LeeHJ,ZhangL，HigginsGA,ParkerEM.Chronictreatmentwiththegamma-secretaseinhibitorLY-411,575inhibitsbeta-amyloidpeptideproductionandalterslymphopoiesisandintestinalcelldifferentiation.J.BiolChem2004Mar26;279(13):12876-12882.YangBerminghamNA，F(xiàn)inegoldMJ，ZoghbiHY.RequirementofMathlforsecretorycelllineagecommitmentinthemouseintestine.Science.2001Dec7;294(5549):2155-8.ZhengJ.L.etal,(2000)Heslisanegativeregulatorofinnerearhaircelldifferentiation.Development.Nov;127(21):4551-1560.權(quán)利要求1.一種用于改變腺瘤和/或腺癌細(xì)胞命運(yùn)的方法，其包括影響Notch途徑激活。2.—種用于誘導(dǎo)腺瘤和/或腺癌細(xì)胞形成有絲分裂期后細(xì)胞的方法，其包括至少部分地抑制所述腺瘤和/或腺癌細(xì)胞中的Notch途徑激活。3.—種用于至少部分地減少動(dòng)物中存在的腸腺瘤和/或腺癌的方法，其包括至少部分地抑制所述動(dòng)物中的Notch途徑激活。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的方法，其中通過至少部分地減弱配體介導(dǎo)的Notch激活來至少部分地抑制所述Notch途徑激活。5.根據(jù)權(quán)利要求l-3之任一項(xiàng)的方法，其中通過提供？分泌酶抑制劑來至少部分地抑制所述Notch途徑激活。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述？分泌酶抑制劑是DAPT或二苯氮萆(DBZ)或苯二氮萆(DB)。7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中通過提供Notch的顯性陰性配體來至少部分地減弱所述配體介導(dǎo)的Notch激活。8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中通過提供顯性陰性Notch來至少部分地減弱所述配體介導(dǎo)的Notch激活。9.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中通過提供能夠至少部分地阻斷Notch配體與Notch間相互作用的抗體來至少部分地減弱所述配體介導(dǎo)的Notch激活。10.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的方法，其中通過提供ADAM蛋白酶抑制劑來至少部分地抑制所述Notch途徑激活。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10之任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括至少部分地抑制Wnt途徑激活。12.Notch途徑抑制劑在制備用于治療腸腺瘤和/或腺癌的藥物中的用途。13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述Notch途徑抑制劑是，分泌酶抑制劑。14.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中所述？分泌酶抑制劑是DAPT或二苯氮萆(DBZ)或苯二氮蕈(DB)。15.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述Notch途徑抑制劑是能夠減弱配體介導(dǎo)的Notch激活的抑制劑。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述抑制劑是Notch的顯性陰性配體。17.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述抑制劑是顯性陰性Notch。18.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述抑制劑是能夠至少部分地阻斷Notch配體與Notch間相互作用的抗體。19.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述抑制劑是ADAM蛋白酶抑制劑。20.根據(jù)權(quán)利要求13-19之任一項(xiàng)的用途，其進(jìn)一步包括Wnt途徑抑制劑。21.根據(jù)權(quán)利要求13-20之任一項(xiàng)的用途，其中腸腺瘤和/或腺癌發(fā)生于患有遺傳綜合征家族性腺瘤性息肉病(FAP)的患者中。22.—種藥物組合物，其包含至少兩種Notch途徑激活抑制劑或包含至少一種Notch途徑激活抑制劑和至少一種Wnt途徑抑制劑。全文摘要本發(fā)明涉及生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于治療腸腫瘤的方法和藥物。本發(fā)明公開了這一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，Notch途徑激活的抑制劑(例如γ-分泌酶抑制劑)在治療腸腺瘤和/或腺癌中極為有用。文檔編號A61P35/00GK101098708SQ200580046283公開日2008年1月2日申請日期2005年11月10日優(yōu)先權(quán)日2004年11月10日發(fā)明者J·C·克利夫爾斯,J·H·范埃斯,M·E·范吉恩申請人:胡布雷希特實(shí)驗(yàn)室