專利名稱：聚乙二醇化的納米顆粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基于生物可降解的聚合物和聚乙二醇的聚乙二醇化的納米顆粒、制備該聚乙二醇化的納米顆粒的方法、含有該聚乙二醇化的納米顆粒的制劑以及該聚乙二醇化的納米顆粒作為給藥系統(tǒng)的用途。
背景技術：
近年來，生物可降解聚合物納米顆粒已被推薦作為新的給藥系統(tǒng)。它們提供的最重要的特征之一為控制所納入的藥物的釋放。這導致更佳的治療效果，為患者提供更舒適的給藥并且能夠防止服藥過量。而且，可包括進具有不同物理化學特性的藥物，使得能夠增強它們在生物液體中穩(wěn)定性。通常，該事實通常對于抗原、蛋白質和大分子來說非常重要。而且，由于它們尺寸小，納米顆粒適于通過不同途徑給藥，如口服、腸胃外和眼部給藥(Kreuter，Adv.Drug Del.Rev.，7(1991)71-86；Gref et al.，Science，263(1994)1600-1603；Zimmer and Kreuter，Adv.Drug Del.Rev.，16(1995)61-73)。
口服給藥為最方便和最通用的給藥途徑。然而，某些活性分子的生物利用度依賴于(i)藥物分子的特征和藥物形式，以及(ii)胃腸道中的生理條件，如蛋白水解酶、蠕動和系統(tǒng)前代謝(presystemic metabolism)的存在。諸如納米顆粒的膠體系統(tǒng)已被推薦來克服某些這類障礙。這些載體實質上具有大的比表面，由此促進了它們與生物支持物(胃腸粘膜)的相互作用。藥物的釋放控制也使得能在時間上延長低生物半衰期分子的作用。另一方面，納米顆粒也可被派兒結(Peyer’patch)細胞和被淋巴組織濾泡攝取(Hodgeset al.，J.Drug Target.，3(1995)57-60；Florence，Pharm.Res.，14(1997)259-266)。該現(xiàn)象使得藥物導向淋巴通路，并且在疫苗接種的情況下，有助于抗原呈遞。然而，對于通過口服給藥的應用來說，常規(guī)的納米顆粒具有一些顯著的缺陷(i)在胃腸液中的某些不穩(wěn)定性，(ii)低水平的腸內吸收，以及(iii)在胃腸粘膜中的非特異性定向或附著。
納米顆粒的腸胃外給藥提供可控的全身釋放，其適合于具有(i)低口服生物利用度、(ii)短生物血漿半衰期以及(iii)有限的穩(wěn)定性的藥物。腸胃外納米顆粒的另外的顯著優(yōu)勢為藥物在某個器官聚集的可能性。然而，靜脈給藥后，納米顆粒迅速被單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS)的巨噬細胞識別、攝取并且從血液循環(huán)中清除。這種現(xiàn)象限制了它們在控制釋放中的作用以及藥物在除MPS外的其它組織中聚集的可能性。
盡管也可獲得全身性作用，控制釋放系統(tǒng)的眼部給藥對眼睛疾病的治療仍具有顯著優(yōu)勢。然而，由于向鼻淚管排出和淚水稀釋，眼部給藥伴隨制劑從角膜前區(qū)域的快速清除。這些過程導致極低百分比的所給予的藥物可滲透進入角膜并且到達眼內組織(低于5％)。該排出造成藥劑通過該途徑給藥時產生全身性作用。大量的研究已證實，與常規(guī)的諸如溶液和藥膏的眼藥形式相比，納米顆粒的應用使得在結膜中的藥物量增加并且提高了它們的生物利用度(Gurny et al.，J.Controlled Rel.，6(1987)367-373；Deshpande et al.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，15(1998)381-420)。膠體系統(tǒng)可作為簡單滴劑給藥，由于其低粘度避免了視力問題。由于藥物從納米顆?；|中持續(xù)釋放，所以可以降低使用頻率。然而，納米顆粒也顯示從吸收位點快速清除。
因此，即使納米顆粒對上述不同給藥方法可能是有用的，但仍然存在使其應用困難的問題。改變聚合物基質及其表面的特性可提供對上述某些問題的解決方法。
從該觀點看，以適合的聚合物結合或包被納米顆粒，可改變其物理化學特性，并且可間接地改變其分布和與生物介質的相互作用?？赡艿牟呗詾榫垡叶?PEG)結合納米顆粒，稱為聚乙二醇化的納米顆?；颢@得隱形(stealthy)的納米顆粒。
對于它們經(jīng)口服給藥的應用，聚乙二醇與常規(guī)納米顆粒的結合可在消化液中保護它們不受酶攻擊。這是由于聚乙二醇的電位排斥蛋白質(Gref etal.，Science，263(1994)1600-1603)。該方法也使得它們與粘蛋白和存在于腔內的其它蛋白質的相互作用降至最低。相似的策略已用于眼用納米顆粒的開發(fā)中。Fresta等人觀察到在以聚乙二醇包被的聚(氰基丙烯酸烷基酯)納米球中給藥后，無環(huán)鳥苷(acyclovir)的眼吸收顯著增強(Fresta etal.，J.Pharm.Sci.，90(2001)288-297)。該現(xiàn)象被解釋為被包被的納米顆粒與角膜上皮細胞之間的更大相互作用。
用乙二醇包被的不同的納米顆粒靜脈注射給藥已證明循環(huán)延長(Grefet al.，Science，263(1994)1600-1603；Stolnik et al.，Pharm.Res.，11(1994)1800-1808；Bazile et al.，J.Pham.Sci.，84(1995)493-498)。聚乙二醇包被的聚乳酸(PLA)納米顆粒(t1/2＝6h)比用白蛋白或泊洛沙姆(poloxamer)包被的納米顆粒(t1/2＝2-3分鐘)具有更長的血漿半衰期(Verrecchia et al.，J.Controlled Rel.，36(1995)49-61)。存在于納米顆粒表面的親水聚乙二醇鏈顯著地降低了納米顆粒與血蛋白(稱為調理素)的相互作用。這些蛋白質在顆粒與吞噬細胞之間形成“橋梁”，促進吞噬作用(Frank & Fries，Immunol.Today，12(1991)322-326)。然而，聚乙二醇的親水性不是提供有效的抗調理作用的唯一重要因素。其它的親水聚合物如聚乙烯醇已證明僅具有低的保護納米顆粒不受調理作用的能力(Leroux et al.，Life Sci.，57(1995)695-703)。因此，聚乙二醇化提供的空間穩(wěn)定性也可能歸結于其它物理化學特性，如PEG鏈的高度柔性和特定結構形式(Mosquiera et al.，Biomaterials，22(2001)2967-2979)。
這種新策略的主要缺陷為聚乙二醇與納米顆粒表面結合的穩(wěn)定性(Peracchia et al.，Life Sci.，61(1997)749-761)。已知聚乙二醇排斥蛋白質的能力依賴于鏈的構象、電荷、長度和柔性(Torchillin，J.Microencaps.，15(1998)1-19)。納米顆粒表面修飾的方法主要通過物理吸附(Stolnik et al.，Adv.Drug Del.Rev.，16(1995)195-214)或通過共價結合(De Jaeghere et al.，J.Drug Target.，8(2000)143-153)進行。然而，由于相互作用的不穩(wěn)定性，簡單吸附的缺陷為包被的快速丟失。假定共價結合為優(yōu)選，多數(shù)的聚乙二醇化的納米顆粒使用聚乙二醇與乳酸或乙醇酸共聚物制備。然而，共聚化方法需要使用一些催化劑和特殊的化學條件(Beletsi et al.，Int.J.Pharm.，182(1999)187-197)。此外，在有機合成中使用的毒性有機溶劑殘留(二氯甲烷、甲苯等)也是難以解決的。
因此，仍需要獲得口服給藥穩(wěn)定的納米顆粒，在胃腸道中，其保持親水包被并且其具有良好的生物附著性和特異性。為了有效性，它們必須無毒、生物可降解并且容易生產。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供解決上述缺陷的納米顆粒，即口服給藥時，它們具有穩(wěn)定性和特異性，它們具有與粘膜相互作用的良好附著特性，它們能夠攜帶各種各樣的活性分子，它們以可控方式釋放活性分子，并且尤其是當通過胃腸外給藥時，阻止其從血液系統(tǒng)中清除。
已經(jīng)觀察到，由生物可降解的聚合物和聚乙二醇形成的納米顆粒解決了這些問題。尤其發(fā)現(xiàn)，由聚乙烯基甲基醚和馬來酸酐以及聚乙二醇共聚物形成的納米顆粒易于生產并且提供優(yōu)異的生物附著性、尺寸以及ζ電位特征，使它們適合于活性分子的給藥。還發(fā)現(xiàn)對制備它們所用的聚乙二醇的類型進行選擇使得能適當調整這些納米顆粒的特性，這可根據(jù)待攜帶的藥物的類型和/或藥物制型的給藥方法有利地加以利用。
因此，在本發(fā)明的第一方面涉及用于攜帶生物活性分子的聚乙二醇化的納米顆粒，該納米顆粒包含生物可降解的聚合物和聚乙二醇或其衍生物。在一個變體中，該生物可降解的聚合物為乙烯基甲基醚和馬來酸酐(PVM/MA)共聚物。
所述聚乙二醇優(yōu)選具有400至35,000Da的分子量。當聚亞烷基二醇(polyalkylene glycol)選自聚乙二醇、聚丙二醇、包括這兩類單體的嵌段或隨機共聚物、其混合物或其衍生物時，其提供良好的結果。聚乙二醇的至少一個末端羥基基團任選地被取代，優(yōu)選被烷氧基、丙烯酸基、甲基丙烯酸基、烷基、氨基、磷酸基、異硫氰酸基、硫氫基、巰基或硫酸基取代。
在本發(fā)明的一個變體中，聚乙二醇與生物可降解的聚合物之間的重量比為1∶2-6，優(yōu)選1∶2-4，更優(yōu)選約1∶4。
本發(fā)明的聚乙二醇化的納米顆?？杉{入活性分子，如蛋白質、肽、DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。關于它們的活性，可為抗腫瘤制劑或腫瘤抗原、或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護劑或糖皮質激素、或用于疫苗接種的抗原或用于免疫治療的變應原，以及其它。
另一方面，本發(fā)明涉及包括如上所述聚乙二醇化的納米顆粒的藥物組合物。在一個變體中，該制劑用于口服給藥。在另一變體中，該制劑為胃腸外給藥或通過粘膜(例如眼粘膜)給藥。
因此，本發(fā)明的聚乙二醇化的納米顆?？捎糜谒幬锏闹苽渲?。其可任選地為凍干形式。
本發(fā)明的另一方面涉及制備所述聚乙二醇化的納米顆粒方法，其包括在以水醇溶液使所述聚合物除溶劑之前，將所述聚合物和所述聚乙二醇在有機溶劑中同時孵育的步驟。在一個變體中，所述生物可降解的聚合物的濃度在0.001至10％w/v之間，聚乙二醇的濃度在0.001至5％w/v之間。有機相/水醇溶液相的比例任選地為1/1至1/10。
該方法還可包括另外的除去有機溶劑和/或純化的步驟，以及通過使用交聯(lián)劑穩(wěn)定聚乙二醇化的納米顆粒的步驟。所述生物活性分子可在聚合物和聚乙二醇在有機溶劑中同時孵育的步驟中被納入，或可隨后被納入在已形成的納米顆粒的水懸浮液中，以便產生它們的結合。


圖1顯示不同類型納米顆粒的透射電子顯微鏡(TEM)照片-(a)NP；(b)PEG NP；(c)mPEG NP；(d)DAE-PEG NP；(e)DAP-PEG NP。比例尺代表150nm。
圖2顯示根據(jù)所用的方法，PEG 2000(mg/mg)的結合PEG和PVM/MA同時在有機相(OP)中孵育或納米顆粒與PEG的水溶液(AP)孵育。
圖3顯示聚乙二醇的類型對PVM/MA轉變?yōu)榧{米顆粒(PVM/MA-e)的百分數(shù)以及對方法產率的影響。
圖4顯示以PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒(上)和游離PEG 2000(下)的核磁共振圖譜?？驁D中顯示在4.58ppm處(羥基基團的質子)的峰的放大圖。
圖5顯示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒(a)和游離PEG 2000(b)的核磁共振圖譜的細節(jié)。
圖6顯示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以DAP-PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒(a)和游離DAP-PEG 2000(b)的核磁共振圖譜的細節(jié)。
圖7顯示溶解在DMSO中(5mg于0.5ml中)的以DAE-PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒(a)和游離DAE-PEG 2000(b)的核磁共振圖譜的細節(jié)。
圖8顯示依據(jù)核磁共振數(shù)據(jù)和ζ電位值所主張的不同的聚乙二醇化的納米顆粒的結構-a)PEG-NP；b)mPEG-NP；c)DAE-PEG-NP；d)DAP-PEG-NP。
圖9顯示對大鼠口服給藥后，聚乙二醇化的納米顆粒在胃腸道的分布(a)PEG-NP，(b)mPEG-NP，(c)DAE-PEG-NP和(d)DAP-PEG-NP。x軸表示附著的納米顆粒(NP)的量(mg)；y軸表示胃腸道的不同部分(St胃；I1，I2，I3，I4腸部分；Ce盲腸)；z軸表示給藥后的時間(小時)。
圖10顯示10mg的單一劑量口服給藥后，整個胃腸道內不同聚乙二醇化的納米顆粒的生物附著曲線(NP，mg)。t以小時為單位的時間。
圖11顯示以PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒(PEG-NP)10mg口服給藥2小時后回腸部分的熒光顯微鏡圖像。a)回腸絨毛箭頭指示上皮細胞的頂部區(qū)域；b)上皮細胞箭頭指示腸上皮細胞間的熒光。比例尺代表為20μm。
圖12顯示以PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒(PEG-NP)10mg口服給藥2小時后回腸段的光學顯微鏡圖像。a)總圖(放大135倍)以及b)放大的細節(jié)(放大530倍)。L內腔；E腸上皮細胞；GC產生細胞的粘液；黑箭頭腸上皮細胞核；白箭頭粘膜下的毛細血管。
圖13顯示納米顆粒10mg口服給藥2小時后，PEG-NP在回腸派爾結的定位。a)派爾結的總圖(放大135倍)；b)放大的細節(jié)(放大530倍)；PP-派爾結；FAE-濾泡相關的上皮細胞；黑箭頭派爾結的圓頂細胞，其中包括有納米顆粒。
發(fā)明詳細說明令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)用不同聚乙二醇修飾和包被生物可降解聚合物的納米顆粒，例如乙烯基甲基醚和馬來酸酐(PVM/MA)共聚物的納米顆粒，可獲得在口服給藥中具有物理化學特性、生物附著性和特異性的納米顆粒，在非常令人感興趣的系統(tǒng)中將它們轉化為特殊藥物載體。根據(jù)所用的聚乙二醇的類型和制備方法，這些納米顆粒的特征可以有利地被調節(jié)。本發(fā)明的聚乙二醇化的納米顆粒在口服或眼部給藥后，可延長在粘膜中的保留時間。這些納米顆?？捎糜诰哂姓沾暗乃幬锏慕o藥，因而提高了其生物利用度。這些納米顆粒也是高毒性藥物(如抑制細胞生長藥物)的適合載體，由于其使得系統(tǒng)的血漿循環(huán)時間延長，在該段時間內藥物以可控方式逐漸釋放。另一方面，靜脈給藥后，聚乙二醇化的納米顆?？煞乐箚魏送淌杉毎到y(tǒng)(MPS)細胞的識別和清除，提供延長的藥物循環(huán)。
術語“納米顆粒”用于指尺寸小于1.0微米的球體或類似形狀，優(yōu)選為10至900納米的范圍。
如上所述，本發(fā)明的一方面涉及由生物可降解的聚合物形成的聚乙二醇化的納米顆粒?？墒褂矛F(xiàn)有技術中已知的可形成納米顆粒的生物可降解聚合物。這些聚合物包括聚羥基酸，如聚乳酸和聚乙醇酸及其共聚物(如PLGA)、聚酸酐、聚酯和諸如殼聚糖的聚糖，以及其它。在本說明書中，術語“生物可降解的”指聚合物一旦暴露于pH6-9以及溫度在25至45℃之間的生理溶液中，其在一段時間內溶解或降解，這段時間對于所需的應用(例如體內治療)來說是可接受的。
在本發(fā)明的一個變體中，酸酐形式的乙烯基甲醚和馬來酸酐共聚物(PVM/MA或Gantrez AN)用作生物可降解聚合物。其優(yōu)選具有100至2400KDa之間的分子量，更優(yōu)選200至2000KDa之間。在本發(fā)明的一個變體中，優(yōu)選PVM/MA共聚物分子量為180至250KDa之間。
由于其低毒性(LD50＝8-9g/kg，口服)以及優(yōu)良的生物相容性而被廣泛應用于制藥工藝中，所以該共聚物為有利的。在數(shù)量和價格方面，其也屬于容易獲得的。由于其酸酐基團，該聚合物可與不同的親水物質反應，而不用借助通常具有非常大毒性的有機溶劑(戊二醛和碳化二亞胺衍生物)(Arbos et al.，J.Controlled Rel.，83(2002)321-330)。該聚合物在含水介質中不溶，但是Gantrez AN的酸酐基團水解，產生羧基基團。溶解較慢并且取決于其發(fā)生條件?？紤]到在PVM/MA中官能團的生物利用度，分子與親核基團(如羥基(-OH)或胺基(-NH2))的共價結合可通過在含水介質中簡單孵育產生。
該共聚物的非-聚乙二醇化的納米顆粒及其制備在屬于同一申請人的WO 02/069938中描述，在此引入該申請的全部內容作為參考。乙烯基甲基醚和馬來酸酐共聚物納米顆?？扇菀椎刂苽洌渫ㄟ^向該聚合物的有機容液中加入第一極性溶劑(與聚合物溶液混溶的)以及隨后加入第二非溶劑液體，例如水醇溶液，來使聚合物除溶劑而進行。可任選地添加交聯(lián)劑。以下將描述獲得該聚合物的聚乙二醇化的納米顆粒，并且發(fā)現(xiàn)它們非常容易獲得。
在本說明書中，術語“聚乙二醇”理解為任何溶于水的含有由2或3個碳原子連接的醚基團的親水性聚合物，任選地含有分枝的亞烷基基團。因此該定義包括分枝或無分枝的聚乙二醇、聚丙二醇以及包含這兩種類型單體的嵌段或隨機共聚物。該術語也包括末端羥基基團的衍生物，該末端羥基基團可被修飾(一個末端或兩個末端)以引入烷氧基、丙烯酸基、甲基丙烯酸基、烷基、氨基、磷酸基、異硫氰酸基、氫硫基、巰基和硫酸基。聚乙二醇或聚丙二醇可在亞烷基基團上被取代。如取代基存在，這些取代基優(yōu)選烷基基團。
聚乙二醇為已批準用于口服、腸胃外和局部給藥(FDA)的水溶性聚合物。聚乙二醇為環(huán)氧乙烷(EO)或環(huán)氧丙烷(PO)在水存在下、以單乙烯醇或二乙二醇作為反應引發(fā)劑在堿性介質中聚合產生(1，2-Epoxide PolymerEthylene Oxide Polymers and Copolymers(1，2-環(huán)氧聚合物環(huán)氧乙烷聚合物和共聚物)，in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering；Mark，H.F.(Ed.)，John Widely and Sons Inc.，1986，pp.225-273)。當達到需要的分子量時(通常利用反應過程的粘度測量來控制)，通過用酸(乳酸、醋酸等)中和催化劑終止聚合發(fā)應。得到具有非常簡單結構的線性聚合物HO-(CH2-CH2-O)n-H其中(n)為EO單體或單位的數(shù)量。單體也可包含亞丙基基團。
盡管工藝上所有這些產品都應該稱為聚(氧化烯)(poly(oxyalkylene))，平均分子量(或分子質量)在200至35,000之間的產品稱為聚乙二醇(PEG)。該術語聚乙二醇通常用于表明羥基末端基團對這些分子物理化學特性的顯著影響。術語PEG通常和數(shù)值聯(lián)合使用。在制藥工業(yè)中，數(shù)字表示平均分子量，而在化妝品工業(yè)中伴隨字母PEG的數(shù)字指構成分子的聚合的EO的單位(Hand book of Pharmaceutical Excipients，Rowev R.c.，Sheskey P.J.，Weller P.J.(Eds)，4thEdition，Pharmaceutical Press and AmericanPharmaceutical Association，London，UK，2003)。PEG收錄在不同的藥典中，盡管命名不同(International HarmonisationPolyethylene glycol(PEG)Pharmeuropa 1999，11，612-614)。根據(jù)2003由R.C.Rowe，P.J.Sheskey和P.J.Weller編輯，由藥物出版社(Pharmaceutical Press)(倫敦，英國)和美國藥物協(xié)會(華盛頓，美國)出版的藥物賦形劑手冊(第4版)，聚氧乙烯二醇(polyoxyethylene glycol)也稱為聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚乙二醇(macrogols)、聚乙二醇(macrogol)或PEG。英國藥典采用聚乙二醇(polyethylene glycol)和聚乙二醇(macrogols)，歐洲藥典采用聚乙二醇(polyethylene glycol)和聚乙二醇(macrogol)，而美國藥典(USP)采用聚乙二醇(polyethylene glycol(s))。
分子量低于400的PEG為室溫下不揮發(fā)的液體。PEG 600的熔點在17至22℃之間，而平均分子量在800至2000之間的PEG為低熔點、漿糊狀物質，分子量超過3000的PEG為固體，一直到PEG 35000都可購得。另一方面，盡管當分子量的增加時，其熔點也增加，但沸點只增加至最大值60℃。同樣地，當分子量增加，其水溶性降低。在任何情況下，接近50％m/m量的PEG 35000不溶于水中。
從毒理學觀點看，認為PEG無毒無免疫原性(Hermansky S.J et al.，F(xiàn)oodChem.Toxic.，1995，33，139-140；Final Report on the Safety Assessment ofPEGsJ.A.C.T.，1993，12，429-457；polyethylene glycol，21 CFR 172.820，F(xiàn)DA)。WHO規(guī)定每日允許攝入量為10mg/kg重量(Polyethylene glycols；Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on FoodAdditives；World Health Organisation，Geneva；Technical Report Series 1980，648，17-18(聚乙二醇；FAO/WHO聯(lián)合專家委員會關于食品添加劑的第23份報告；日內瓦世界衛(wèi)生組織；技術報告系列1980，648，17-18))。
聚乙二醇衍生物具有與常規(guī)PEG類似的優(yōu)點，例如其水溶性、生理惰性、低毒性以及在極為不同條件下的穩(wěn)定性。這些衍生物包括極其不同的產品并且以取代羥基的官能團為特征，例如-NH2(最活潑基團之一)、苯酚、乙醛、異硫氰酸酯、-SH基團等。在能用于本發(fā)明的聚乙二醇衍生物中，可指出以下物質-聚氧乙烯酯PEG單甲醚單琥珀酰亞胺琥珀酸酯、PEG單甲醚單羧基甲基醚、PEG己二酸酯、PEG二硬脂酸酯、PEG單硬脂酸酯、PEG羥基硬脂酸酯、PEG二月桂酸酯、PEG二油酸酯、PEG單油酸酯、PEG蓖麻醇酸酯、PEG椰子油酯。
-聚氧乙烯烷基醚PEG單甲醚或甲氧基PEG(mPEG)、PEG二甲醚。
-其它聚(乙二醇對苯二酸酯)、聚氧乙烯衍生物和山梨聚糖酯以及脂肪酸、環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物、環(huán)氧乙烷與丙烯酰胺共聚物。
-PEG衍生物O，O’-雙-(2-氨基乙基)聚乙二醇(DAE-PEG 2000)、O，O’-雙-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇。
在本發(fā)明的一個變體中，聚乙二醇無分枝并且羥基基團未被取代。在該變體中，所用聚乙二醇優(yōu)選分子量在400至35,000Da之間。當分子量低于400Da時，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇化無法有效發(fā)生。因此在本發(fā)明的一個優(yōu)選變體中，用于制備聚乙二醇化的納米克顆粒的聚乙二醇的分子量等于或大于400，更優(yōu)選等于或大于1000，尤其優(yōu)選值為1500至10,000之間，優(yōu)選為2000至5000KDa之間。
因此，在本發(fā)明的一個變體中，使用聚乙二醇2000(PEG 2000)。PEG2000與聚合物量的比值優(yōu)選1∶2-6，接近1∶4的比值可提供好的結果。例如約0.25mg PEG 2000/mg聚合物可提供有效的聚乙二醇化。在該情況下，與納米顆粒結合的量為約55.0微克每mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征為球形并且尺寸接近300nm。
在本發(fā)明的另一變體中，用于制備聚乙二醇化的納米顆粒的聚乙二醇具有封閉的末端羥基基團，例如通過用甲基醚衍生物。這降低了其親水性，甚至改變納米顆粒的結構。在這種情況下，更大百分比的聚乙二醇鏈包含在其內部，只有小部分結合于納米顆粒表面。該特性使得我們能利用封閉羥基基團或通過引入如下所述的其它官能團調節(jié)納米顆粒的特性。對于處于納米顆粒內部的m-PEG來說，其功能為通過修飾多孔的聚合物基質來改進藥物釋放。
聚乙二醇基甲基醚2000(m-PEG 2000)用于一個優(yōu)選的變體中。mPEG2000與聚合物的量的比例優(yōu)選1∶2-6，接近1∶4的比值可提供好的結果，例如約0.25mg mPEG 2000/mg聚合物。在該情況下，與納米顆粒結合的量為約35.5微克每mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征為球形并且尺寸接近300nm。
在本發(fā)明的另一個變體中，所用的聚乙二醇具有不同于羥基基團的末端官能團，如氨基基團。這些氨基基團又可被取代并具有官能團。在優(yōu)選變體中，氨基基團為-NH2。觀察具有這些基團的納米顆?？诜o藥后，納米顆粒在腸道的某些段內積聚，允許特異性給藥。
因此，在一個變體中，制備聚乙二醇化的納米顆粒所用的聚乙二醇為O，O’-雙-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG 2000)。在該情況下，由于鏈兩末端連接，聚乙二醇化納米顆粒的結構不是“毛刷”類型結構，而產生“環(huán)”形結構。DAE-PEG與聚合物的量的比例優(yōu)選低于1∶4。在一個優(yōu)選變體中，等于或低于0.25mg DAE-PEG 2000/mg聚合物。在該情況下，DAE-PEG 2000與納米顆粒連接的量為約90.6微克每mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征為球形并且尺寸接近500nm。
在另一個變體中，制備聚乙二醇化的納米顆粒所用的聚乙二醇具有氨基基團并且烷基基團中有分枝。已發(fā)現(xiàn)，帶有這些取代基時傾向于形成毛刷類型結構，末端之一在納米顆粒內部，另一末端在外側。
因此，如果所用的聚乙二醇為O，O’-雙-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇2000(DAP-PEG 2000)，納米顆粒的特征為球形并且尺寸接近360nm。在該情況下，DAP-PEG相對于聚合物的量優(yōu)選等于或低于0.25mgDAP-PEG 2000/mg聚合物，與納米顆粒結合的量為約67.6微克每mg納米顆粒。
對應于上述帶有不同類型官能團的基團，一些聚亞烷基二醇的化學結構舉例說明如下a)H(OCH2CH2)nOHb)H3C(OCH2CH2)nOHc)H2N(CH2CH2O)nCH2CH2NH2d)H2NCHCH3CH2(OCHCH3CH2)(OCH2CH2)n(OCH2CHCH3)NH2具體實例為a)聚乙二醇400、1000或2000(PEG 400，PEG 1000或PEG 2000)；b)聚乙二醇甲基醚2000(mPEG 2000)；c)O，O’-雙-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG 2000)；
d)O，O’-雙-(2-氨基丙基)-聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇(DAP-PEG2000)。
由前述可看出(經(jīng)實施例證實)，聚乙二醇類型的選擇使得能隨意調節(jié)所產生的系統(tǒng)的特性。不同類型聚乙二醇混合物的使用增添了另外的可變因素。從實踐的觀點來看，這對于調整和選擇每一活性分子以及每一給藥方法的最適系統(tǒng)是很重要的。
制備生物可降解聚合物聚乙二醇(優(yōu)選乙烯基甲基醚和馬來酸酐(PVM/MA)共聚物和聚乙二醇)納米顆粒的方法以例如WO 02/069938中描述的溶劑置換方法為基礎。
在本發(fā)明的一個變體中，聚乙二醇化的納米顆粒通過兩種不同的方法制備(i)兩種聚合物同時在有機相中孵育(例如PVM/MA和PEG)以及(ii)生物可降解聚合物納米顆粒與聚乙二醇的水溶液孵育。這些方法對制備PEG結合在其表面的PVM/MA納米顆粒是有效的。由于第一變體(聚合物同時孵育)提供良好的PEG結合程度，所以其為優(yōu)選。
第一種方法包括生物可降解聚合物和聚乙二醇在諸如丙酮的有機溶劑中同時溶解?；旌衔锏姆跤谑覝叵聰嚢枰欢〞r間進行。生物可降解聚合物的濃度優(yōu)選在0.001至10％w/v之間，聚乙二醇或其衍生物的濃度在0.001至5％w/v之間。
一定體積的與聚合物溶液混溶的極性溶劑，例如乙醇，可任選地添加至該溶液中。
也可任選使用交聯(lián)劑，以增強納米顆粒的穩(wěn)定性，如WO 02/069 938中所描述。在交聯(lián)劑中，可以使用二氨化的分子(如1，3-二氨丙醇)、聚糖或單糖、蛋白質以及通常的任何具有能與Gantrez酸酐基團反應的官能團的分子。在本發(fā)明的方法中，當加入PEG時，交聯(lián)不是必需的，因為這同時發(fā)生。如果需要其交聯(lián)，必須加入非常少量的上述產品。
最后，加入類似體積的第二非溶劑液體，優(yōu)選水醇溶液。在一個變體中，使用制藥級用水(WFI純化水，根據(jù)應用)。有機相/水醇溶液比例優(yōu)選為1/1-1/10。具有乳白色懸浮液外觀時納米顆粒立即在介質中形成。
利用任何適合的方法如減壓蒸餾除去有機溶劑，納米顆粒仍保留在穩(wěn)定的水懸浮液中。
用常規(guī)方法純化納米顆粒，如離心、超離心、切向過濾或蒸發(fā)，包括真空的使用。
最后，如需要長期存儲和保存，可將它們凍干。通常的防冷凍劑如蔗糖或甘露醇可用于促進凍干，其優(yōu)選濃度在0.1至10％重量比之間。
第二種方法包括在諸如丙酮的有機溶劑中溶解生物可降解聚合物。隨后一定體積的水醇溶液如乙醇和最終類似體積的水加至該溶液中。當具有乳白色懸浮液外觀時納米顆粒立即在介質中形成。有機溶劑通過如前面所述的方法(例如減壓蒸發(fā))除去，納米顆粒保留在穩(wěn)定的水懸浮液中。然后，納米顆粒在聚乙二醇的水溶液中孵育。孵育在攪拌下進行一段時間。納米顆粒隨后經(jīng)離心純化并最終使用上述相同方法凍干。
本發(fā)明也針對包含所述聚乙二醇化的納米顆粒和任選的活性分子的藥物組合物。適合的藥物制劑為那些本領域技術人員熟知的腸內制劑，優(yōu)選口服，腸胃外制劑，如注射劑，以及局部制劑，如眼用制劑。這些制劑應包含每一種劑型的適合的賦形劑。例如，對片劑或膠囊劑形式的口服劑型的情況，如需要可包括結合劑、分裂劑、潤滑劑、填充劑、腸衣等?？诜苿┦峭ㄟ^常規(guī)的混合、干法或濕法造粒以及加入本發(fā)明的聚乙二醇化的納米顆粒而制備的。
在本發(fā)明的一方面，聚乙二醇化的納米顆粒通過提供到達組織粘膜的途徑給藥(包括口服給藥、直腸給藥、鼻給藥、陰道給藥和眼部給藥)。
當聚乙二醇化的納米顆粒經(jīng)腸胃外給藥時，它們用于改善所結合的生物活性分子和/或常規(guī)納米顆粒的分布情況。對于腸胃外制劑的情況，使用納米顆粒的無菌懸浮液或凍干產物和重建載體(如生理鹽水)。如需要，可加入賦形劑，如低溫儲藏試劑、pH調節(jié)液和表面活性劑。
所述聚乙二醇化的納米顆粒及其制劑可用作生物活性分子給藥的基本成分。活性分子可理解為以預防和治療為目的，對個體給藥的任何化合物，該個體優(yōu)選人類。當然，該術語也包括大分子化合物，如蛋白質、肽、核酸等。聚乙二醇化的納米顆粒用于改善結合的生物活性分子的分布。
在一個變體中，活性分子選自DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。在另一個變體中，活性分子選自蛋白質或肽。
可加入選自抗腫瘤劑或腫瘤的抗原劑、選自中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護劑或糖皮質激素等的活性分子?；蛘?，活性分子為疫苗接種的抗原或免疫治療的變應原。
在本發(fā)明的一個變體中，聚乙二醇化的納米顆粒還用作疫苗接種佐劑。
將藥物加入本發(fā)明的納米顆粒中，可如WO 02/069938中所述進行，即在納米顆粒形成之前加入至聚合物溶液中，或隨后將其加入至已形成的納米顆粒的水懸浮液中。例如，根據(jù)藥物的天然屬性，可使用以下方法a)疏水性藥物加入至有機相(丙酮)并在攪拌(機械、磁力或超聲攪拌)下與PVMMA和PEG聯(lián)合孵育/溶解不定的時間段(多至1小時)。
b)親水性藥物加入至有機相(丙酮)并在攪拌(機械、磁力或超聲攪拌)下與PVMMA和PEG聯(lián)合孵育一段可變的時間(多至1小時)，直至獲得稀丙酮懸浮液。該方法成功地用于包裹蛋白質模型(卵清蛋白、約44kDa的蛋白質)。該加入方法為有效的，可以增強蛋白質模型的包裹。
c)親水性藥物加入至水相中，與預先形成的納米顆粒孵育(該情況用于包裹用在實施例中的兩種熒光標記物FITC和RBITC)下面通過本發(fā)明的非限制性和說明性實施例來描述本發(fā)明。
實施例已采用了一些技術用于新納米顆粒的物理化學表征。納米顆粒的尺寸和ζ電位在Zetamaster儀器中測定(Malvern，英國)。納米顆粒的形狀可在其用磷鎢酸處理后，通過電子透射顯微鏡(Zeiss，德國)觀察。
實施例1以聚乙二醇2000(PEG-NP)制備聚乙二醇化的納米顆粒對兩種方法進行測試-兩種聚合物在有機相中混合-用PEG包被預先形成的納米顆粒制備聚乙二醇化的納米顆粒的方法的產率通過在方法結束后和在其凍干后通過測定其重量得到。制備產率以百分數(shù)表示，相對于最初的PVM/MA-共聚物和聚乙二醇的質量計算得到。與納米顆粒結合的聚乙二醇的量通過比色法(Labsystems iEMS Reader MF)測定，并且以起始使用量和在納米顆粒制備過程中上清液中存在的量之間的差值計算得到。
1.1.有機相中聚乙二醇與乙烯基甲級醚和馬來酸酐共聚物的結合該方法通過PVM/MA和PEG 2000同時在有機相中孵育進行。
為此，將100mg PVM/MA溶解在5ml有機溶劑(丙酮)中。然后，PEG2000加入至該溶液中(10-50mg)?；旌衔镌诖帕嚢柘路磻?小時。然后，10ml乙醇和10ml蒸餾水加至該相中。使得到的混合物均勻化5分鐘。通過減壓蒸發(fā)(Buchi R-144，瑞士)除去有機溶劑，濃縮形成的納米顆粒。懸浮液經(jīng)過離心(20分鐘，17000rpm，兩次)(Sigma 3K30，德國)純化。收集上清液用于分析評價，而剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重懸浮。最后，納米顆粒懸浮液在Genesis 12EL設備(Virtis，USA)中冷凍并凍干。
所獲得的納米顆粒具有類似于常規(guī)納米顆粒的球形形狀(圖1b)。表1為這些聚乙二醇化的納米顆粒的特性。PEG 2000與納米顆粒的結合引起群體的多分散性增加。觀察到隨著聚乙二醇(1∶2比例)量的增加，納米顆粒尺寸尤其是多分散性變得非常高。對納米顆粒表面電位的觀察顯示了聚乙二醇化的納米顆粒較低的負值。這些結果表明，納米顆粒表面上存在聚乙二醇鏈。最后必須指出，PEG 2000PVM/MA的比例低于1∶4w/w時，與納米顆粒結合的PEG的量保持恒定并接近50μg/mg。
表1.PEG 2000的量對納米顆粒物理化學特性的影響。數(shù)據(jù)表示平均值±S.D.(n＝3)。

*結合到納米顆粒的PEG 2000的量(以μg PEG/mg納米顆粒表示)，根據(jù)比色法測定。
1.2.聚乙二醇與預先制備的納米顆粒的結合將100mg PVM/MA溶解在5ml有機溶劑(丙酮)中。然后，在攪拌下向該溶液中加入10ml乙醇和10ml蒸餾水。使得到的混合物均勻化5分鐘。然后，納米顆粒懸浮液在減壓下蒸發(fā)，直至兩種溶劑被除去。含水的納米懸浮液體積用水調至5ml，并且加入含有10-25mg PEG 2000的5ml水溶液。納米顆粒在聚乙二醇相中的孵育在磁力攪拌下進行1小時。懸浮液通過離心(20分鐘，17000rpm，兩次)(Sigma 3K30，德國)純化。除去上清液并且將剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重懸浮。最終將納米顆粒懸浮液在Genesis 12EL設備(Virtis，USA)中冷凍并凍干。
與納米顆粒結合的聚乙二醇的量通過先前指出的比色法測定。通過該方法測定的結果顯示，與納米顆粒結合的PEG的量比實施例1.1所述的方法(在有機溶劑中孵育)低很多(圖2)。該結果的原因是聚乙二醇對水的高親合性，因此聚乙二醇未能與在預先形成的顆粒中來自共聚物水解得到的羧基基團有效地結合?？傻贸鼋Y論，通過共聚物和聚乙二醇在有機相中同時孵育來獲得聚乙二醇化的納米顆粒的方法比以PEG簡單包被預先形成的納米顆粒更有效。
1.3.PEG分子量對聚乙二醇化的納米顆粒的物理化學特性的影響如實施例1.1.所述，該方法為PVM/MA與所需的聚乙二醇(PEG 400、PEG 1000或PEG 2000)同時孵育進行。
為此，將100mg的PMA/MA溶解在5ml有機溶劑(丙酮)中。然后，加入25mg PEG(400、1000或2000)。使混合物在磁力攪拌下反應1小時。然后將10ml乙醇和10ml蒸餾水加入至該相中。將所得到的混合物均勻化5分鐘。通過減壓蒸發(fā)(Buchi R-144，瑞士)除去有機溶劑，濃縮納米顆粒懸浮液。懸浮液經(jīng)離心(20分鐘，17000rpm，兩次)(Sigma 3K30，德國)純化。除去上清液并且剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重懸浮。最后，將納米顆粒懸浮液在Genesis 12EL設備(Virtis，USA)中冷凍并凍干。
PEG(400、1000或2000)和mPEG(實施例2)的量通過比色法測定。為此，將15μl碘溶液(10mg/ml的碘；20mg/ml的碘化鉀)加入至納米顆粒純化步驟中獲得的1ml上清液中。PEG(或mPEG)和碘之間形成的復合物的吸收值通過比色法在λ540nm處觀察(Sims & Snape，Anal.Biochem.，107(1980)60-63)。
表2顯示PEG分子量對獲得的納米顆粒的物理化學特性的影響。依據(jù)該結果，可得出結論低分子量聚乙二醇不適合這些納米顆粒的聚乙二醇化。對于為液體的PEG 400來說，不能獲得結合，而對于PEG 1000來說，結合非常低。這些結果也為顆粒表面電荷的研究所證實。以PEG 400或PEG1000修飾的納米顆粒的ζ電位一直比以PEG 2000聚乙二醇化的顆粒的電位值更負，與未包被的顆粒的電位值相似?？傻贸鼋Y論用PEG 2000進行聚乙二醇化更有效。
表2.PEG分子量對聚乙二醇化的納米顆粒的物理化學特性的影響(PEG/PVM-MA比例＝0.25)。數(shù)據(jù)表示平均值±S.D.(n＝3)。

*NP-未用PEG處理的納米顆粒**ND-未檢測到1通過核磁共振測定與納米顆粒結合的PEG的量(方法在實施例5中描述)。
實施例2以聚乙二醇基甲基醚2000(mPEG-NP)制備聚乙二醇化的納米顆粒該方法通過PVM/MA和mPEG同時在有機相中孵育進行。
為此，將100mg共聚物PVM/MA溶解在5ml有機溶劑(丙酮)中。然后，一定量mPEG 2000加入至該溶液中(10-50mg)?；旌衔镌诖帕嚢柘路磻?小時。然后，將10ml乙醇和10ml蒸餾水加至該相中。使所得到的混合物均勻化5分鐘。有機溶劑通過減壓蒸發(fā)(Buchi R-144，瑞士)除去，濃縮納米顆粒懸浮液。懸浮液經(jīng)過離心(20分鐘，17000rpm，兩次)(Sigma3K30，德國)純化。除去上清液并且剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重懸浮。最后，將納米顆粒懸浮液在Genesis 12EL設備(Virtis，USA)中冷凍并凍干。
圖1(c)顯示被mPEG 2000包被的納米顆粒具有球形形狀并且表面看似光滑。表3顯示mPEG 2000與納米顆粒的結合水平以及其對納米顆粒的尺寸、多分散性和表面電荷的影響。結果顯示隨mPEG 2000起始量的增加，與納米顆粒結合的mPEG的百分數(shù)略有增加。
mPEG的存在增加了納米顆粒群體的多分散性，尤其是在高濃度時(mPEG/PVM-MA比例高于0.25)。另一方面，當所用mPEG增加時，納米顆粒的負電荷降低。然而，當使用大量mPEG時觀察到相當大的偏差，這表明mPEG 2000鏈的表面分布不均一。
表3.mPEG 2000的量對納米顆粒的物理化學特性的影響。數(shù)據(jù)表示平均值±SD (n＝3)

*與納米顆粒結合的mPEG 2000的量(以μg mPEG/mg納米顆粒表示)，根據(jù)比色法測定。
實施例3以O，O’-雙-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000(DAE-PEG-NP)制備聚乙二醇化的納米顆粒該方法通過PVM/MA和DAE-PEG 2000同時在有機相中孵育進行。
為此，一定量的DAE-PEG(5、10、25或35mg)溶解在5ml有機溶劑(丙酮)中。然后，在磁力攪拌下將100mg PVM/MA加入該溶液中。所得到的混合物在磁力攪拌下反應1小時。然后，在攪拌下將10ml乙醇和10ml蒸餾水加至該有機相中。使得到的混合物均勻化5分鐘。通過減壓蒸發(fā)(Buchi R-144，瑞士)除去有機溶劑，濃縮納米顆粒懸浮液。懸浮液經(jīng)離心(20分鐘，17000rpm，兩次)(Sigma 3K30，德國)純化。除去上清液并且剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重懸浮。最后，將納米顆粒懸浮液在Genesis12EL設備(Virtis，USA)中冷凍并凍干。
向納米顆粒純化步驟中獲得的上清液中加入Micro BCATM蛋白質檢測試劑盒(Pierce，U.S.A.)的試劑，以測定DAE-PEG的量和DAP-PEG的量(實施例4)。該試劑能與這些聚乙二醇的氨基基團相互作用得到有色復合物。為此，將150μl試劑加至相同體積的上清液中。37℃孵育2小時后，通過比色法測定λ570nm處的吸收值。
圖1(d)顯示被DAE-PEG 2000包被的納米顆粒具有球形形狀。表4顯示DAE-PEG 2000的結合水平及其對納米顆粒尺寸、多分散性和表面電荷的影響。結果顯示，隨著DAE-PEG 2000的量(從5至35mg)增加，與納米顆粒連接的賦形劑的量也增加。然而，當所用DAE-PEG 2000的量大于25mg時，不形成納米顆粒。
分析尺寸時，觀察到增加結合程度如何產生具有更大尺寸和更大多分散性的納米顆粒。因此，當以25mg DAE-PEG 2000生產DAE-PEG納米顆粒時，得到的顆粒尺寸大于500nm并且具有極高的多分散性。另一方面，觀察到，與未被包被的納米顆粒相比，被包被的納米顆粒表面負電荷減少。這些數(shù)據(jù)表明DAE-PEG 2000鏈存在于納米顆粒表面。
表4.DAE-PEG的量對納米顆粒物理化學特性的影響。數(shù)據(jù)表示平均值±S.D.(n＝3)。

*與納米顆粒結合的DAE-PEG 2000的量(以μg DAE-PEG/mg納米顆粒表示)，根據(jù)比色法測定。
實施例4以O，O’-雙-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇2000制備聚乙二醇化的納米顆粒(DAP-PEG-NP)該方法通過PVM/MA和DAP-PEG 2000同時在有機相中孵育進行。
為此，一定量的DAP-PEG 2000(10-50mg)溶解在5ml有機溶劑(丙酮)中。然后，在磁力攪拌下將100mg乙烯基甲基醚和馬來酸酐共聚物加入至該溶液中。使得到的混合物在磁力攪拌下反應1小時。然后，在攪拌下將10ml乙醇和10ml蒸餾水加至該相中。使得到的混合物均勻化5分鐘。有機溶劑通過減壓蒸發(fā)(Buchi R-144，瑞士)除去，濃縮納米顆粒懸浮液。懸浮液經(jīng)過離心(20分鐘，17000rpm，兩次)(Sigma 3K30，德國)純化。除去上清液，剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重懸浮。最后，將納米顆粒懸浮液在Genesis 12EL設備(Virtis，USA)中冷凍并凍干。
圖1(e)顯示被DAP-PEG 2000包被的納米顆粒具有球形形狀并且表面光滑。表5顯示這些納米顆粒的一般特性。結果表明隨DAP-PEG 2000量的增加，其與納米顆粒結合的量也增加。然而，當所用DAP-PEG 2000的量大于35mg時，不形成納米顆粒。
觀察到，增加結合程度產生具有更大尺寸以及更高分散性的納米顆粒。ζ電位觀測顯示，被包被的納米顆粒所測到的負值顯著降低(值接近零)。這些結果表明DAP-PEG 2000鏈優(yōu)選位于納米顆粒表面。
表5.DAP-PEG的量對納米顆粒的物理化學特性的影響。數(shù)據(jù)表示平均值±S.D.(n＝3)。

*與納米顆粒結合的DAP-PEG 2000的量(以μg DAP-PEG/mg納米顆粒表示)，根據(jù)比色法測定。
**ND-未檢測到。
實施例5對方法產率以及聚乙二醇化的納米顆粒結構的研究圖3顯示聚乙二醇的類型對PVM/MA轉化成納米顆粒的百分比以及對本方法的總產率的影響。通常，共聚物轉變?yōu)榧{米顆粒的百分比接近73％。據(jù)觀察，當以PEG或mPEG修飾納米顆粒時，PVM/MA轉化成納米顆粒的百分比沒有顯著改變。然而，以DAE-PEG或DAP-PEG使納米顆粒聚乙二醇化時使方法的產率降低。
聚乙二醇與納米顆粒的結合通過元素分析法(Leco CHN-900，U.S.A.)已證實。根據(jù)該技術，當與其它組分(如PEG)結合時，它們可顯示氧、氫或氮組成的改變。
表6包括不同類型的聚乙二醇化的納米顆粒的C、H、O和N元素組成。與常規(guī)納米顆粒(NP)相比，所有聚乙二醇化的納米顆粒顯示氫(H)的百分含量增加和氧含量相對降低。另一方面，DAE-PEG NP和DAP-PEG NP顯示有氮存在，而在未修飾的納米顆粒中未發(fā)現(xiàn)。
表6.聚乙二醇化的納米顆粒和未修飾的顆粒(NP)之間元素百分含量的對比。

聚乙二醇的位置(納米顆粒的內部或表面)通過核磁共振(H-NMR)(Bruker 400 UltrashieldTM，德國)分析，該方法為將5mg聚乙二醇化納米顆粒溶解在0.5ml的氘化的二甲亞砜后進行分析。以PEG和mPEG聚乙二醇化的納米顆粒的圖譜在應用6400掃描后獲得，而DAE-PEG-NP和DAP-PEG-NP的圖譜在12800掃描后獲得。圖譜顯示聚亞乙基(polyethylene)單體的典型氫峰(在3.51ppm，-OCH2CH2-)以及羥基基團中的氫峰(對PEG和mPEG的情況)，或DAE-PEG和DAP-PEG的氨基的氫峰(在4.58ppm)(圖4)。計算在聚乙二醇化的顆粒圖譜中和游離聚乙二醇的圖譜中的這兩峰面積的比值。該比值可提供聚乙二醇鏈在聚乙二醇化的納米顆粒中的定位信息。
據(jù)觀察，羥基基團的氫峰(4.58ppm)出現(xiàn)在以PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒的圖譜中(圖5a)。表7顯示之前提到PEG-NP和游離PEG的兩峰的面積(在3.51ppm和在4.58ppm)以及它們之間的比值。計算兩峰的比值，納米顆粒的約是游離PEG 2000的兩倍。對于這些納米顆粒來說，這些數(shù)據(jù)意味著羥基基團的比例低兩倍，因此可得出結論，大量的這些官能團(其未出現(xiàn)在圖譜中)與共聚物的酸酐基團連接。根據(jù)這些觀察，一小部分PEG2000鏈包含在納米顆粒的內部，而大部分PEG鏈排列在其表面。該事實與表1所示的ζ電位數(shù)據(jù)相符。
表7顯示了涉及m-PEG-NP和游離mPEG的兩峰面積的數(shù)據(jù)?？梢钥闯觯垡叶蓟募{米顆粒的兩峰之間比例與mPEG 2000的兩峰之間比例類似(177對217)。該結果說明，兩種情況(納米顆粒和游離mPEG)下mPEG羥基基團比例相似，僅小比例的羥基與共聚物的酸酐基團反應?？傻贸鼋Y論，這些顆粒的結構不同于PEG-NP的結構。該情況下，更大比例的mPEG鏈包含在內部，其僅有一小部分位于納米顆粒表面。因此，mPEG鏈的表面分布為不均一的，這與在這些顆粒的ζ電位分析中看到的較大偏差相一致(表3)。
表7.利用核磁共振(H-NMR)方法分析PEG 2000以及用PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒的圖譜

表8顯示涉及DAP-PEG-NP和游離DAP-PEG 2000的峰面積的數(shù)據(jù)。在DAP-PEG 2000的圖譜中，有兩個對應于位于鏈末端的兩種不同氨基基團的氫的信號一雙重峰在δ＝4.55ppm，另一個在δ＝4.45ppm(圖6b)。在以DAP-PEG 2000聚乙二醇化的納米顆粒的圖譜中看到，沒有這些氨基基團的氫(圖6a)，這表明該類型聚乙二醇的所有氨基基團與聚合物酸酐基團反應形成納米顆粒。而且，DAP-PEG鏈以兩末端氨基基團與納米顆粒表面連接并且表面完全包被。該結果得到這些顆粒的ζ電位值(接近0)的支持(表5)。
表8.利用核磁共振(H-NMR)方法分析DAP-PEG 2000和聚乙二醇化的納米顆粒(DAP-PEG-NP)的圖譜。

對于DAE-PEG 2000，由于在4.58ppm峰的低強度以及低分辨率(與濃度和掃描數(shù)無關)(圖7b)，所以不可能同樣計算兩峰之間的比例。任何情況下，可看到該峰出現(xiàn)在納米顆粒圖譜上，也出現(xiàn)在DAE-PEG 2000的圖譜上。因此，可得出結論，一部分DAE-PEG鏈包含在顆粒內部。然而，其大多數(shù)位于表面，僅在該聚乙二醇鏈的末端連接。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，可得出聚乙二醇化的納米顆粒具有不同的結構的結論。對不同劑型所主張的結構顯示于圖8。某些聚乙二醇，如PEG 2000、DAE-PEG和DAP-PEG，修飾成形的納米顆粒表面。對于PEG-NP和DAE-PEG-NP的情況，包被產生“毛刷”形結構(圖8a和c)，而對于DAP-PEG的情況，在其鏈的兩末端連接，產生“環(huán)”形結構(圖8d)。只有當使用mPEG2000時，未觀察到納米顆粒表面的修飾情況。發(fā)現(xiàn)大部分mPEG在納米顆粒內部(圖8b)。
實施例6聚乙二醇化的納米顆粒在大鼠胃腸道的生物附著性研究根據(jù)符合歐洲動物實驗法(86/609/EU)的Navarra大學倫理委員會規(guī)章進行該項研究。
該測定中所用的聚乙二醇化的納米顆粒被若丹明B異硫氰酸酯熒光標記。為此，利用PVM/MA和不同類型的聚乙二醇同時孵育形成納米顆粒(根據(jù)實施例1.1、2、3和4中的方法)。然后，在攪拌下將10ml乙醇和10ml蒸餾水加入至該相中。使得到的混合物均勻化5分鐘。有機溶劑提供減壓蒸發(fā)(Buchi R-144，瑞士)除去，濃縮納米顆粒懸浮液。納米水懸浮液體積用蒸餾水調至9ml并加入1ml若丹明B異硫氰酸酯水溶液(1.25mg/ml)。納米顆粒與熒光標記物的孵育在攪拌下進行5分鐘。然后，熒光修飾的納米顆粒懸浮液通過離心(20分鐘，17000rpm，兩次)(Sigma 3K30，德國)純化。除去上清液，剩余物在蔗糖水溶液(5％w/v)中重懸浮。最后，將納米顆粒懸浮液在Genesis 12EL設備(Virtis，USA)中冷凍并凍干。
表9包括用在該測定中的以若丹明B異硫氰酸酯熒光標記的制劑的特性。
表9.在生物附著性研究中考慮的納米顆粒的物理化學特性。平均值±SD(n＝3)。

*與納米顆粒結合的聚乙二醇的量(μg PEG/mg納米顆粒)。
**通過比色法在540nm測定的與納米顆粒連接的若丹明B異硫氰酸酯的量(以μg/mg納米顆粒表示)。
獲得的納米顆粒(10mg)分散在1ml水中后，對雄性大鼠(Wistar型，重220.0g)口服給藥。口服給藥后，動物在不同時間通過頸脫位法處死0.5、1、3和8小時。打開腹腔并取出胃腸道。各區(qū)段劃分為以下解剖部分胃、小腸和盲腸。各段沿腸系膜縱向切開并用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4；0.15M)清洗，除去未附著的納米顆粒部分。此外，各段切成2cm長的部分并用1ml 3M氫氧化鈉消化24小時(Arbos et al.，Int.J.Pharm.，242(2002)129-136)。然后以2ml甲醇取出若丹明，并且樣品4000rpm離心10分鐘。上清液(1ml)用3ml水稀釋，并利用λex＝540nm和λem＝580nm的熒光光譜(GENios，澳大利亞)測定。根據(jù)該方法可評估附著在粘膜上的納米顆粒部分。
聚乙二醇化的納米顆粒在胃腸道不同部分的特異性分布見圖9。所有制劑顯示在胃粘膜上最初附著顯著。給藥30分鐘后，附著在該器官的劑量的百分比在PEG-NP的13％和DAP-PEG-NP的9％之間。所有聚乙二醇化的納米顆粒劑型也顯示對小腸I3部分的某種親合性；然而，在給藥后3小時，PEG-NP和DAE-PEG-NP顯示為最有效的制劑，維持附著在小腸的量，接近劑量的20％。最后，給藥后8小時，發(fā)現(xiàn)附著的納米顆粒的峰值在小腸的最后部分(對于PEG-NP)或在盲腸(對于mPEG和DAP-PEG-NP)。對于PEG-NP和DAP-PEG-NP來說，仍可定量相對大部分(接近10％)的附著在粘膜上的納米顆粒。結論是，可斷言以PEG 2000和mPEG 2000包被的納米顆粒顯示非常均一的分布，并且8小時內遍布在消化道的所有部分(圖9a和b)。以DAE-PEG聚乙二醇化的納米顆粒優(yōu)選附著在小腸中間部分(圖9c)，而以DAP-PEG 2000修飾的納米顆粒主要積聚在小腸消化道末端區(qū)域(圖9d)。這些結果意味著本發(fā)明開發(fā)的納米顆?？商峁┨禺愋运幬镝尫?。
生物附著性參數(shù)(Arbos et al.，Int.J.Pharm.，242(2002)129-136)各制劑的附著曲線是通過表示在大鼠胃腸粘膜中附著的聚乙二醇化的納米顆粒部分隨時間的變化而獲得。以下生物附著參數(shù)由該曲線計算AUCadh、kadh和MRTadh。kadh表示附著部分的清除率，并用WinNonlin程序1.5版(Scientific Consulting，Inc.)輔助計算。表示隨時間變化的附著部分的AUCadh或曲線下面積(以相對于時間的附著標記物的量的形式表示)可通過至tz(最后的取樣點)的梯形法(trapezoid method)計算，并能夠定量生物附著現(xiàn)象的強度。最后，MRTadh指納米顆粒的附著部分的平均保留時間，并且使用最后樣品點作為界線，其能夠評估附著作用的相對持續(xù)時間。
圖10顯示聚乙二醇化的納米顆粒在整個胃腸道8小時的生物附著曲線。所有聚乙二醇化的納米顆粒顯示的生物附著曲線與未修飾的顆粒(NP)的曲線不同。NP的最大生物附著發(fā)生在其口服給藥30分鐘后，并且隨后迅速降低。相反，聚乙二醇化的納米顆粒通常具有較低的產生生物附著作用的初始能力。然而，該附著能力保持至少3小時。因此給藥3小時后，附著于胃腸粘膜的納米顆粒的量的范圍在PEG-NP給藥劑量的25％和DAP-PEG-NP給藥劑量的16％之間，所有情況均高于對照(NP)。另一方面，獲得的PEG-NP的曲線尤其令人感興趣。這些納米顆粒在其給藥后1小時顯示最大附著(約劑量的32％)，并且給藥3小時后，顆粒附著于粘膜的水平與最初水平類似。對于其它聚乙二醇化的納米顆粒，其初始附著保持至少3小時。
生物附著參數(shù)可提供關于納米顆粒附著特性的更多細節(jié)(表10)。如前所述，聚乙二醇化的納米顆粒與粘膜作用的初始能力(Qmax)比未包被的顆粒(NP)低。然而，聚乙二醇化的納米顆粒的曲線下生物附著面積(AUCadh)更高；這意味著附著強度更大。該現(xiàn)象尤其在PEG-NP的情況中觀察到，其中AUCadh是NP的1.6倍。而且，與未包被的顆粒相比，所有聚乙二醇化的納米顆粒制劑具有更低的附著部分清除程度(kadh)以及更長保留時間(MRTadh)。因此，DAP-PEG-NP顯示比常規(guī)顆粒更慢的附著部分清除，表明這些納米顆粒維持長時間的生物附著的可能性。據(jù)觀察，所有聚乙二醇化的納米顆粒在胃腸道中顯示長保留時間(MRTadh)。關于附著部分的平均保留時間(MRTadh)，尤其令人關注的是所有聚乙二醇化的納米顆粒顯示保留時間比NP顯著延長。因此，這些納米顆粒顯示保留時間比常規(guī)顆粒保留時間延長17至48分鐘。
圖10.根據(jù)聚乙二醇化的納米顆粒在整個胃腸道隨時間的分布計算的生物附著參數(shù)。

實施例7觀察在胃腸粘膜中的聚乙二醇化的納米顆粒利用熒光和光學顯微鏡觀察在胃腸粘膜中的聚乙二醇化的納米顆粒。為此，聚乙二醇化的納米顆粒用諸如若丹明B異硫氰酸酯(RBITC)和熒光素異硫氰酸酯(FITC)的熒光分子標記。大鼠口服給藥后，收集腸的不同部分并用磷酸鹽緩沖液洗滌(pH＝7.4；0.15M)，如上所述。
第一種情況，腸段(包含RBITC標記的納米顆粒)固定在Tissue-TekO.C.T.介質(Sakura，荷蘭)中，并通過干冰和2-甲基丁烷冷凍。然后，在低溫下(-22℃)在低溫恒溫器(Leica，德國)中將腸段切成5μm的切片。獲得的切片放置在包被有聚-L-賴氨酸(Sigma，西班牙)的載波片上，并在熒光顯微鏡(Olympus CH-40，日本)下觀察。
另一方面，將腸段(含有FITC標記的納米顆粒)在福爾馬林溶液(4％)中固定24小時。固定后，組織包埋在石蠟中并切成3μm的切片。將這些切片放在包被有Vectabond(Vector Labs，U.S.A.)的載波片上。然后，使獲得的切片去石蠟、再水合并通過加入過氧化氫溶液(3％)10分鐘阻斷內源性過氧化物酶。然后，用蒸餾水洗滌支持物(5分鐘)，放入檸檬酸鹽緩沖液(pH＝6.0；0.01M)中，微波爐加熱(最大火力15分鐘和最小火力15分鐘)，用水洗，最后用Tris緩沖鹽水(TBS)(pH＝7.36；NaCl 0.5M；0.05M)洗滌。為了防止非特異性標記，切片用正常的山羊血清(1∶20，DAKO，U.S.A.)室溫孵育30分鐘，然后與特異性抗-血清(1∶100單克隆抗-FITC，M0878，DAKO，U.S.A.)4℃孵育24小時。用Tris緩沖鹽水(TBS)洗滌后，將樣品與山羊抗-小鼠Ig二抗孵育(室溫，30分鐘)，該二抗偶聯(lián)到標記有過氧化物酶的右旋糖苷。樣品用TBS緩沖液洗滌，通過二氨基聯(lián)苯胺顯示過氧化物酶活性。該切片以蘇木精形成弱反差、脫水并置于DPX。最后，樣品在光學顯微鏡(Nicon Eclipse E 800M，日本)下觀察。
圖11顯示小腸上皮細胞中存在PEG-NP。顆粒通常位于細胞的頂部區(qū)域(圖11a)，但也可觀察到某些部分滲透進腸上皮細胞間(圖11b)。
納米顆粒在腸上皮細胞中的強烈滲透可用光學顯微鏡觀察(圖12)。用熒光顯微鏡，觀察在細胞頂部區(qū)域的分布。另一方面，圖12b也顯示在基底側區(qū)域的分布。觀察到某些細胞核含有標記物或標記的納米顆粒，這使得可推測使用該納米顆?？纱龠M不同生物活性分子向細胞核的遞送。
最后，圖13顯示這些系統(tǒng)在派爾結細胞中的分布。尤其令人感興趣的是，觀察到這些納米顆粒似乎集中在被認為是派爾結的“圓頂(dome)”的區(qū)域。該圓頂?shù)奶卣髟谟谄錇閱魏司奘杉毎毎奂膮^(qū)域?？梢酝茢噙@些聚乙二醇化的納米顆粒在開發(fā)口服疫苗和在免疫治療中的意義。
權利要求
1.用于攜帶生物活性分子的聚乙二醇化的納米顆粒，其包含生物可降解的聚合物和聚乙二醇或其衍生物。
2.如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于所述生物可降解的聚合物為乙烯基甲基醚和馬來酸酐(PVM/MA)共聚物。
3.如權利要求2所述的納米顆粒，其中所述共聚物具有100KDa至2400KDa的分子量，更優(yōu)選200KDa至2000KDa的分子量，尤其優(yōu)選180KDa至250KDa的分子量。
4.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，其中所述聚乙二醇或其衍生物具有400Da至35,000Da的分子量。
5.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，其中所述聚乙二醇選自聚乙二醇、聚丙二醇、包含所述兩類單體的嵌段或隨機共聚物、其混合物或其衍生物。
6.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，其中所述聚乙二醇具有至少一個被修飾的末端羥基，優(yōu)選以烷氧基、丙烯酸基、甲基丙烯酸基、烷基、氨基、磷酸基、異硫氰酸基、硫氫基、巰基或硫酸基修飾。
7.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，其中聚亞烴基二醇選自聚乙二醇2000、聚乙二醇甲基醚2000、O，O’-雙-(2-氨基乙基)聚乙二醇2000、O，O’-雙-(2-氨基丙基)聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇2000或其混合物。
8.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，其中聚乙二醇與所述生物可降解的聚合物重量比為1∶2-6，優(yōu)選1∶2-4，更優(yōu)選約1∶4。
9.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，包含蛋白質或肽作為活性分子。
10.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，包含選自DNA、RNA、核苷、核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸的化合物作為活性分子。
11.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，包含抗腫瘤劑或腫瘤抗原作為活性分子。
12.如前述權利要求中任一項所述的納米顆粒，包含中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護劑或糖皮質激素作為活性分子。
13.如前述權利要求任何一項的納米顆粒，包含用于疫苗接種的抗原或用于免疫治療的變應原作為活性分子。
14.藥物組合物，包含權利要求1-13中任一項所述的聚乙二醇化的納米顆粒以及賦形劑、載體或佐劑。
15.如權利要求14所述的藥物組合物，用于通過提供到達生物體粘膜的途徑給藥，優(yōu)選通過口、直腸、鼻、陰道或眼給藥。
16.如權利要求15所述的藥物組合物，用于口服給藥。
17.如權利要求15所述的藥物組合物，用于眼部給藥。
18.權利要求1-13中任一項所述的納米顆粒在制備藥物中的用途。
19.凍干產物，包括權利要求1-13中任一項所述的聚乙二醇化的納米顆粒。
20.制備權利要求1-13中任一項所述的聚乙二醇化的納米顆粒的方法，包括在以水醇溶液使所述聚合物除溶劑之前，將所述聚合物和所述聚乙二醇在有機溶劑中同時孵育的步驟。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于所述生物可降解的聚合物濃度為0.001％w/v至10％w/v，聚亞烷基二醇的濃度為0.001％w/v至5％w/v。
22.如權利要求20或21所述的方法，其特征在于所述有機相/水醇溶液比例為1/1-1/10。
23.如權利要求20-22中任一項所述的方法，其特征在于包括另外的用于去除有機溶劑和/或純化的步驟。
24.如權利要求20-23中任一項所述的方法，其特征在于所述活性分子在所述聚合物和所述聚乙二醇在有機溶劑中同時孵育的步驟中加入。
25.如權利要求20-23中任一項所述的方法，其特征在于所述活性分子加入至已形成的納米顆粒的水懸浮液中。
26.如權利要求20-25中任一項所述的方法，其特征在于包括另外的凍干步驟，任選地在防冷凍劑、優(yōu)選蔗糖或甘露醇存在下進行。
27.如權利要求20-26中任一項所述的方法，其中所述生物可降解聚合物為乙烯基甲基醚和馬來酸酐(PVM/MA)共聚物，優(yōu)選包括的分子量為100KDa至2400KDa。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有生物可降解的聚合物和聚乙二醇或其衍生物的納米顆粒，該生物可降解的聚合物優(yōu)選乙烯基甲基醚和馬來酸酐(PVM/MA)共聚物。這些納米顆粒易于生產并提供優(yōu)良的生物附著性、尺寸和ζ電位特性，使得它們適合于活性分子的給藥。對生產所使用的聚乙二醇類型的進行選擇可適當調節(jié)這些納米顆粒的特性，這可根據(jù)待攜帶的藥物的類型和/或藥物制劑的給藥方法有利地加以利用。聚乙二醇化通過將提到的兩種大分子短時間的簡單孵育而進行，不需要借助于高毒性的有機溶劑或長時間艱苦的有機合成過程。而且，聚乙二醇化過程可與生物活性分子包裹過程相結合。
文檔編號A61K47/48GK1976688SQ200580021839
公開日2007年6月6日 申請日期2005年4月28日 優(yōu)先權日2004年4月29日
發(fā)明者胡安馬紐埃爾·伊拉切爾賈立塔, 克拉斯米爾帕烏勞娃·尤恩切爾娃 申請人:納瓦拉公司科學與技術研究所