專(zhuān)利名稱(chēng)：表達(dá)新型腫瘤抑制基因p53的重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人新型腫瘤抑制基因p53的重組腺病毒備制方法，其備制的重組腺病毒表達(dá)一種具有較野生型P53的細(xì)胞凋亡功能更強(qiáng)的新型腫瘤抑制基因p53蛋白，用于多種癌癥的治療。因此其所在的技術(shù)領(lǐng)域與生命醫(yī)藥和生物技術(shù)有關(guān)。
背景技術(shù)：
P53基因是腫瘤抑制基因家族中的主要成員，是目前發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)腫瘤發(fā)生的相關(guān)性最高的基因。野生型p53基因在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、抑制惡性腫瘤細(xì)胞增生中起重要作用。環(huán)境中各種的因素，如紫外線(xiàn)、放射線(xiàn)和化學(xué)物質(zhì)以及機(jī)體自身產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物等都可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷。在正常生理情況下，這些細(xì)胞DNA能在某些基因產(chǎn)物作用下進(jìn)行修復(fù)或被降解清除，防止其遺傳下去而保持正常DNA的復(fù)制，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞的正常功能運(yùn)作。否則損傷的DNA會(huì)繼續(xù)復(fù)制、隨染色體分離，導(dǎo)致染色體組中出現(xiàn)大量的DNA突變和染色體畸變。這些突變的進(jìn)一步積聚將便正常細(xì)胞最終惡化，發(fā)展成癌細(xì)胞。
現(xiàn)有的大量研究表明野生型P53蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著“基因衛(wèi)士”的生物功能作用，監(jiān)視著細(xì)胞基因組的完整性和穩(wěn)定性。在細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，P53迅速活化P21基因的轉(zhuǎn)錄，抑制多種原癌基因，如c-Fos、c-jun、Rb和其他相關(guān)基因如IL-6、PCNA的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞分裂停滯在G1期節(jié)點(diǎn)。同時(shí)，野生型P53蛋白質(zhì)與復(fù)制因子(RPA)相互作用，參與DNA的復(fù)制和修復(fù)。更為重要的是，野生型P53蛋白質(zhì)能啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，誘導(dǎo)細(xì)胞自殺，防止具有惡變傾向的細(xì)胞進(jìn)一步分裂、增殖，從而防止癌癥的發(fā)生。
P53基因突變是人類(lèi)惡性腫瘤中最常見(jiàn)的遺傳變異。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有50％的人類(lèi)腫瘤發(fā)生與P53基因突變有關(guān)，有30％-40％的乳腺癌、50％的肺癌和70％的結(jié)腸癌存在P53基因突變；幾乎100％的小細(xì)胞性肺癌有P53基因突變。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)異常P53基因蛋白的小鼠100％的發(fā)生腫瘤。
由于P53基因如此重要的生物學(xué)功能及其與人類(lèi)腫瘤發(fā)生和惡性程度有密切關(guān)系，在八十年代以來(lái)，科學(xué)家就開(kāi)始了應(yīng)用外源野生型P53基因的生物學(xué)功能，啟動(dòng)P53基因缺陷型腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞程序性凋亡過(guò)程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自殺死亡的實(shí)驗(yàn)研究和臨床腫瘤基因治療研究?，F(xiàn)在眾多的研究報(bào)告以及臨床研究結(jié)果證明，野生型P53基因冶療安全、有效，而且毒副作用小。
臨床研究結(jié)果表明，野生型P53基因?qū)θ祟^頸腫瘤、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌有較好療效。同時(shí)研究還表明野生型P53基因還具有抑制腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的作用，因而減少腫瘤組織內(nèi)血管的形成，減少腫瘤組織的血供，起著進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的作用。
野生型P53基因的某些氨基位點(diǎn)在自然狀態(tài)下存在多態(tài)性，例如在47位點(diǎn)存在脯氨酸/絲氨酸多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)野生型P53此47位點(diǎn)為脯氨酸，但在不足5％的非州藉美國(guó)人為絲氨酸。已知47位點(diǎn)脯氨酸介導(dǎo)的激酶p38MAPK使鄰近的46位點(diǎn)絲氨酸磷酸化可大大增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力；而47位點(diǎn)為絲氨酸的變異，則使p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力下降2-5倍以上。同樣，野生型P53基因的72位點(diǎn)存在常見(jiàn)的脯氨酸(P72，下同)/精氨酸(R72，下同)多態(tài)性，這種多態(tài)性對(duì)于野生型P53基因的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)功能上有很大的意義。P53基因?yàn)镽72型的，其細(xì)胞調(diào)亡能力比P72型的強(qiáng)2-15倍以上(Murphy M，et al2003，3(3)357-65，Nat.genetics)，其機(jī)理被認(rèn)為至少部份是由于R72型p53基因增加了在線(xiàn)粒體的聚集，能直接與促細(xì)胞調(diào)亡蛋白BAK相互作用，破壞線(xiàn)粒體，使細(xì)胞缺乏能量而導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)。通過(guò)對(duì)P53基因第72號(hào)密碼子多態(tài)變異體功能性研究導(dǎo)致了檢測(cè)這種多態(tài)性對(duì)人類(lèi)癌癥危險(xiǎn)性和發(fā)展影響的許多研究。有些研究表明p53基因?yàn)镻72型的，因其細(xì)胞調(diào)亡能力較弱，與增加的患癌危險(xiǎn)性相關(guān)；另一報(bào)告表明在易于患結(jié)腸癌的家族中，p53基因?yàn)镻72純合子的個(gè)體比為R72純合子的個(gè)體，其患癌的發(fā)病年齡較早，且傾向于多發(fā)腫瘤。上述研究結(jié)果為使用第72位點(diǎn)為精氨酸的野生型p53對(duì)腫瘤進(jìn)行更有效地基因治療奠定了基礎(chǔ)。
毫無(wú)疑問(wèn)，抗癌基因治療的成敗取決于整個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu)三大元件的最佳組合。第一個(gè)元件為進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的腺病毒載體，要求安全、高效；第二個(gè)元件為治療基因的有效性；第三個(gè)元件為驅(qū)動(dòng)抗癌基因表達(dá)的啟動(dòng)子的強(qiáng)弱和組織/細(xì)胞特異性。
目前，將野生型P53基因?qū)塍w內(nèi)的載體多為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。這種載體具有感染能力強(qiáng)、靶細(xì)胞可以是處于分裂期或是非分裂期、轉(zhuǎn)染細(xì)胞后腺病毒載體基因不整合進(jìn)入人類(lèi)基因組、可大量生產(chǎn)高滴度腺病毒及其瞬時(shí)表達(dá)等特點(diǎn)，故復(fù)制缺陷型腺病毒載體是目前在腫瘤基因治療中的首選載體。在腫瘤基因治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。但同時(shí)由于這種病毒載體自身的原因，如因其感染細(xì)胞須與細(xì)胞上的受體結(jié)合才能起作用，故其感染與細(xì)胞膜上的受體數(shù)量呈正比。因此對(duì)某些組織細(xì)胞而言，由于受體數(shù)量少，尤其是腫瘤細(xì)胞表面的CAR受體偏少，Ad5對(duì)它們的感染有限，故這種病毒難以感染并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，有效發(fā)揮其攜帶基因的治療作用。為了克服這種載體的陷缺，近年研究人員通過(guò)基因突變技術(shù)，使5型腺病毒的纖突結(jié)突變或利用Ad35的纖突結(jié)(fiber knob)替代5型腺病毒的纖突結(jié)，使感染細(xì)胞的范圍更廣、感染效率更高，對(duì)各種造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的感染效率高于普通Ad5，外源基因表達(dá)量更多，包裝系統(tǒng)高效且穩(wěn)定。而且，使用的腺病毒數(shù)量呈至少一個(gè)數(shù)量級(jí)減少。因此，這應(yīng)是新一代復(fù)制缺陷型腺病毒載體。
重組腺病毒驅(qū)動(dòng)治療基因表達(dá)的啟動(dòng)子可以有多種來(lái)源的啟動(dòng)子。目前使用較多是mCMV啟動(dòng)子，這是一種超強(qiáng)啟動(dòng)子，屬一種突變型CMV啟動(dòng)子，比hCMV啟動(dòng)子的活性強(qiáng)若干倍，但沒(méi)有組組織/細(xì)胞的特導(dǎo)性，對(duì)某些毒性作用較大的治療基因不大適合。因此，研究人員發(fā)展了一些組織/細(xì)胞特殊性啟動(dòng)子，如與原發(fā)性肝癌有關(guān)的胎兒甲種球蛋白基因的啟動(dòng)子。此啟動(dòng)子僅在表達(dá)胎兒甲種球蛋白的原發(fā)性肝癌細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動(dòng)治療基因的表達(dá)，屬于一種靶向性基因治療。不過(guò)目前證明這種啟動(dòng)了活性較低，有待進(jìn)一步研究。但無(wú)論如何，靶向性基因治療是目前和將來(lái)癌癥治療研究的一個(gè)非常重要的發(fā)展方向。
綜上所述，構(gòu)建以新一代復(fù)制缺陷型腺病毒為表達(dá)載體，利用超強(qiáng)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)R72型的腫瘤抑制基因P53的表達(dá)系統(tǒng)，為臨床治療惡性腫瘤提供一種新的、抗癌作用更強(qiáng)的腫瘤基因治療的藥物，將擁有巨大市場(chǎng)前景的，產(chǎn)生誘人的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的以細(xì)胞調(diào)亡功能更強(qiáng)的R72型腫瘤抑制基因P53為治療基因，以新一代復(fù)制缺陷型腺病毒載體和超強(qiáng)啟動(dòng)子mMCV為調(diào)控元件，構(gòu)建新一代抗癌作用更強(qiáng)的腫瘤基因P53表達(dá)系統(tǒng)，使其成為臨床惡性腫瘤的基因治療的新一代產(chǎn)品。本發(fā)明的表達(dá)新型抑癌基因P53腺病毒表達(dá)結(jié)構(gòu)，其主要特點(diǎn)為1)，野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；2).該P(yáng)53抑癌基因在其N(xiāo)-末端以?xún)?nèi)切酶Nhe1和C-末端以?xún)?nèi)切酶BamH1片段拼接于穿梭質(zhì)粒pDC315超強(qiáng)啟動(dòng)子mMCV的下游；3).重組的腺病毒載體為以Ad35纖突結(jié)取代Ad5型腺病毒的纖突結(jié)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體；4).該新型p53抑癌基因腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有感染力強(qiáng)、感染組織/細(xì)胞譜廣、新型p53抑癌基因表達(dá)強(qiáng)、具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡生物功能。


附圖1人野生型腫瘤抑制因子P53基因的PCR產(chǎn)物應(yīng)用人工合成的特異性引物，以人正常組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖電泳分離；純化后進(jìn)行克隆。第一泳道和第二泳道為PCR產(chǎn)物、第三泳道為Φ174/BsuRI DNA分子量標(biāo)記物。PCR產(chǎn)物約為1200堿基對(duì)。
附圖2腫瘤抑制因子P53突變型R72的內(nèi)切酶圖譜R72突變型腫瘤抑制因子P53在突變位點(diǎn)形成新的核苷酸內(nèi)切酶smal1位點(diǎn)。用內(nèi)切酶smal1分別消化R72突變型和野生型腫瘤抑制因子P53后，R72突變型產(chǎn)生二個(gè)DNA片段；野生型僅產(chǎn)生一個(gè)DNA片段。圖示電泳第一泳道為landa/Hind111 DNA分子量標(biāo)記物，第二泳道為1kB DNA分子量標(biāo)記物；第三泳道為為野生型腫瘤抑制因子P53；第四泳道R72突變型腫瘤抑制因子P53。
附圖3表達(dá)R72型腫瘤抑制因子P53重組腺病毒的工藝流程圖敘述了從人正常組織提取總核糖核酸、互補(bǔ)脫氧核糖核酸合成、人腫瘤抑制因子P53基因的克隆和突變、真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建、腺病毒穿突變?nèi)四[瘤抑制因子P53穿梭質(zhì)粒構(gòu)建以及表達(dá)R72型腫瘤抑制因子P53重組腺病毒的整個(gè)工藝過(guò)程。附圖4表達(dá)R72型腫瘤抑制因子P53重組腺病毒結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖中兩瑞分別為腺病毒的左臂和右臂，表達(dá)盒由超強(qiáng)CMV啟動(dòng)子、R72型腫瘤抑制因子P53和SV40多聚腺苷酸組成。
具體實(shí)施例方式
一、R72型腫瘤抑制因子P53的形成其方法是采用基因突變技術(shù)，使野生型第72位脯氨酸的密碼子ccc(P72)突變成精氨酸的密碼子cgg(R72)，在突變區(qū)形成新的核苷酸內(nèi)切酶smal1位點(diǎn)。
1).人野生型腫瘤抑制因子P53基因5’-端Nco1至笫72位密碼子片段擴(kuò)增以人野生型P72腫瘤抑制因子P53基因cDNA中N’-端-Nco1-突變區(qū)片段作為模板，用人工合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR引物設(shè)計(jì)如下引物1N端5’-gccttccgggtcactg aggagccg-3’30mer Nco1引物2ccg為精氨酸密碼子N端5’-gaatgccagaggctgctccc gtggcccctgca-3’35merPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測(cè)序確定。
2).人野生型腫瘤抑制因子P53基因第72密碼子區(qū)至C-端Nco1片段擴(kuò)增以上述的片段區(qū)cDNA為模板，用人工合成的下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR引物設(shè)計(jì)如下引物3ccg為精氨酸密碼子N端5-aggggccac gggagcagcctctggcattc-332mer引物4N端5’-gtagatgg cgcggacgcgggtg-3’28mer Nco1將PCR擴(kuò)增的二個(gè)產(chǎn)物按1)的方法聯(lián)接至T-easy載體，經(jīng)DNA測(cè)序正確無(wú)誤。
3).上述二個(gè)PCR片段產(chǎn)物的拼接，形成Nco1～Nco1片段將1)和2)中含上述DNA片段的T-easy載體質(zhì)粒DNA分別用Nco1和Smal1完全酶切，純化后，再與經(jīng)Nco1酶切的野生型p53基因cDNA進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化細(xì)菌、質(zhì)粒抽提和經(jīng)酶切檢測(cè)拼接方向正確后，構(gòu)建成R72型的野生型p53基因表達(dá)質(zhì)粒pCMV-neo-p53二、構(gòu)建含R72型p53抑癌基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒1).PCR擴(kuò)增72型P53全長(zhǎng)DNA片段以R72型的野生型p53基因表達(dá)質(zhì)粒pCMV-neo-p53為模板，用人工合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
引物設(shè)計(jì)如下引物5(在N-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)Nhe1)N端5’-tagctagctcactgccatggaggagccg-3’28mer Nhe1
引物6(在N-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH1)::
N端5’-ggcggatcctgtcagtctgagtgagg-3’26merBamH1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測(cè)序確定。
2).含R72抑瘤基因p53的腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315含有超強(qiáng)啟功子mMCV和病毒SV40的聚腺嘌吟核苷酸。為了構(gòu)建含R72抑瘤基因p53的腺病毒穿梭質(zhì)粒，分別以?xún)?nèi)切酶Nhe1和BamH1消化上述1)的T-easy質(zhì)粒DNA和腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315。經(jīng)瓊脂糖電泳分離、純化后，將含R72抑瘤基因p53和腺病毒穿梭質(zhì)粒的酶切片段進(jìn)行拼接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌種，培養(yǎng)擴(kuò)增、提取重組質(zhì)粒DNA。最后再經(jīng)酶切消化和DNA測(cè)序證實(shí)。
三、表達(dá)R72型抑癌基因p53的重組腺病毒1).制備線(xiàn)性化含R72型的重組穿梭質(zhì)粒pDC315-p53取適量質(zhì)粒DNA，經(jīng)核苷酸內(nèi)切酶LoxP消化、電泳分離、純化loxP酶切線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA。備用。
2).培養(yǎng)胚胎腎293細(xì)胞，用預(yù)先混勺的腺病毒載體和線(xiàn)性化的穿梭質(zhì)粒pDC315-p53共轉(zhuǎn)染表達(dá)E1區(qū)基因的胚胎腎293細(xì)胞。
3).篩選陽(yáng)性克隆，分離、純化，并鑒定重組腺病毒。
序列表Individual Applicant--------------------Street科學(xué)城國(guó)際企業(yè)孵化器A區(qū)610房City廣州市State廣東省Country中國(guó)PostalCode510633PhoneNumber020-32290208FaxNumber020-38491559EmailAddressshangwu_w@yahoo.com<110>LastName王<110>FirstName尚武<110>MiddleInitial<110>SuffixApplication Project-------------------<120>Title表達(dá)新型腫瘤抑制基因p53的重組腺病毒<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber1<141>CurrentFilingDate2005-10-25Sequence--------<213>OrganismNameHuman noraml tissue<400>PreSequenceStringtagctagctc actgccatgg aggagccgca gtcagatcct agcgtcgagc cccctctgag 60tcaggaaaca ttttcagacc tatggaaact acttcctgaa aacaacgttc tgtccccctt120gccgtcccaa gcaatggatg atttgatgct gtccccggac gatattgaac aatggttcac180tgaagaccca ggtccagatg aagctcccag aatgccagag gctgctcccc gggtggcccc240tgcaccagca gctcctacac cggcggcccc tgcaccagcc ccctcctggc ccctgtcatc300ttctgtccct tcccagaaaa cctaccaggg cagctacggt ttccgtctgg gcttcttgca360ttctgggaca gccaagtctg tgacttgcac gtactcccct gccctcaaca agatgttttg420ccaactggcc aagacctgcc ctgtgcagct gtgggttgat tccacacccc cgcccggcac480ccgcgtccgc gccatggcca tctacaagca gtcacagcac atgacggagg ttgtgaggcg540
ctgcccccac catgagcgct gctcagatag cgatggtctg gcccctcctc agcatcttat 600ccgagtggaa ggaaatttgc gtgtggagta tttggatgac agaaacactt ttcgacatag 660tgtggtggtg ccctatgagc cgcctgaggt tggctctgac tgtaccacca tccactacaa 720ctacatgtgt aacagttcct gcatgggcgg catgaaccgg aggcccatcc tcaccatcat 780cacactggaa gactccagtg gtaatctact gggacggaac agctttgagg tgcatgtttg 840tgcctgtcct gggagagacc ggcgcacaga ggaagagaat ctccgcaaga aaggggagcc 900tcaccacgag ctgcccccag ggagcactaa gcgagcactg cccaacaaca ccagctcctc 960tccccagcca aagaagaaac cactggatgg agaatatttc acccttcaga tccgtgggcg1020tgagcgcttc gagatgttcc gagagctgaa tgaggccttg gaactcaagg atgcccaggc1080tgggaaggag ccagggggga gcagggctca ctccagccac ctgaagtcca aaaagggtca1140gtctacctcc cgccataaaa aactcatgtt caagacagaa gggcctgact cagactgaca1200ggatccgcc1209<212>TypeDNA<211>Length1209SequenceNamehuman P53SequenceDescriptionp53(R72)MetGluGluProGlnSerAspProSerValGluProProLeuSerGlnGluThrPheSer1 5 10 15 20AspLeuTrpLysLeuLeuProGluAsnAsnValLeuSerProLeuProSerGlnAlaMet25 30 35 40AspAspLeuMetLeuSerProAspAspIleGluGlnTrpPheThrGluAspProGlyPro45 50 55 60AspGluAlaProArgMetProGluAlaAlaProArgValAlaProAlaProAlaAlaPro65 70 75 80ThrProAlaAlaProAlaProAlaProSerTrpProLeuSerSerSerValProSerGln85 90 95 100
LysThrTyrGlnGlySerTyrGlyPheArgLeuGlyPheLeuHisSerGlyThrAlaLys105110115120SerValThrCysThrTyrSerProAlaLeuAsnLysMetPheCysGlnLeuAlaLysThr125130135140CysProValGlnLeuTrpValAspSerThrProProProGlyThrArgValArgAlaMet145150155160AlaIleTyrLysGlnSerGlnHisMetThrGluValValArgArgCysProHisHisGlu165170175180ArgCysSerAspSerAspGlyLeuAlaProProGlnHisLeuIleArgValGluGlyAsn185190195200LeuArgValGluTyrLeuAspAspArgAsnThrPheArgHisSerValValValProTyr205210215220GluProProGluValGlySerAspCysThrThrIleHisTyrAsnTyrMetCysAsnSer225230235240SerCysMetGlyGlyMetAsnArgArgProIleLeuThrIleIleThrLeuGluAspSer245250255260SerGlyAsnLeuLeuGlyArgAsnSerPheGluValHisValCysAlaCysProGlyArg265270275280AspArgArgThrGluGluGluAsnLeuArgLysLysGlyGluProHisHisGluLeuPro285290295300ProGlySerThrLysArgAlaLeuProAsnAsnThrSerSerSerProGlnProLysLys305310315320LysProLeuAspGlyGluTyrPheThrLeuGlnIleArgGlyArgGluArgPheGluMet325330335340PheArgGluLeuAsnGluAlaLeuGluLeuLysAspAlaGlnAlaGlyLysGluProGly345350355360
GlySerArgAlaHisSerSerHisLeuLysSerLysLysGlyGlnSerThrSerArgHis365370375380LysLysLeuMetPheLysThrGluGlyProAspSerAspTer385390
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)新型腫瘤抑制基因p53的重組腺病毒的表達(dá)結(jié)構(gòu)。其主要特征為a).人野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；b).該P(yáng)53抑癌基因在其N(xiāo)-末端以?xún)?nèi)切酶Nhe1和C-末端以?xún)?nèi)切酶BamH1片段拼接于穿梭質(zhì)粒pDC315超強(qiáng)啟動(dòng)子mMCV的下游；c).重組的腺病毒載體為以Ad35纖突結(jié)取代Ad5型腺病毒的纖突結(jié)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體；d).該新型p53抑癌基因腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有感染力更強(qiáng)、感染組織/細(xì)胞譜更廣、新型p53抑癌基因表達(dá)更強(qiáng)、具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡生物功能。
2.根椐權(quán)利要求1的一種多肽，其含有下列氨基酸序列a).與人腫瘤抑制基因P53的親本多肽的氨基酸序列基本一致，僅有一個(gè)氨基酸的取代，即此腫瘤抑制基因P53的第72位氨基酸由精氨酸(R72)代替野生型P53同一位置的脯氨酸(P72)；b).根椐權(quán)利1要求，所述腫瘤抑制基因P53親本來(lái)源于人；
3.根椐權(quán)利要求1所述重組腺病毒，其特征在于，新型人腫瘤抑制基因p53表達(dá)盒中所含的啟動(dòng)子序列選自巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，包括其增強(qiáng)突變型；牛乳頭瘤病毒啟動(dòng)子；肝胎兒甲型球蛋白啟動(dòng)子(AFP，胎甲球蛋白啟動(dòng)子)；人前列腺癌特異因子啟動(dòng)子和腫瘤特異性PEG-3基因啟動(dòng)子。
4.根椐權(quán)利要求1所述重組腺病毒，其特征在于，該復(fù)制缺陷型腺病毒為Ad5、Ad2和/或突變型Ad5型腺病毒載體，后者即為Ad5型腺病毒的纖突結(jié)突變的復(fù)制缺陷型腺病毒載體-Ad35；以及R72型p53在腺相關(guān)病毒(AAVs)或其它病毒載體的表達(dá)。
5.人腫瘤抑制基因P53基因第72位氨基酸密碼子核苷酸突變方法、設(shè)計(jì)引物、真核細(xì)胞表達(dá)載體及其腺病毒穿梭質(zhì)粒，其特征在于，該方法包括采用基因突變技術(shù)，使野生型第72位脯氨酸的密碼子(P72)突變成精氨酸的密碼子(R72)。a).以人腫瘤抑制基因P53基因cDNA為模板，用人工合成的，人腫瘤抑制基因P53基因N-末端序列核苷酸的正向引物和含有編碼第72位氨基酸核苷酸序列的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行人腫瘤抑制基因P53基因克隆及其N(xiāo)-未端的改建。PCR引物設(shè)計(jì)如下引物1N端5’-gccttccgggtcactg aggagccg-3’30mer Nco1引物2N端5’-gaatgccagaggctgctccccgggtggcccctgca-3’35merPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測(cè)序確定。b).人野生型腫瘤抑制因子P53基因第72密碼子區(qū)至C-端Ncol片段擴(kuò)增以上述的片段區(qū)cDNA為模板，用人工合成的下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)如下引物3N端5-aggggccacccggggagcagcctctggcattc-332mer引物4N端5’-gtagatgg cgcggacgcgggtg-3’28mer Nco1將PCR擴(kuò)增的二個(gè)產(chǎn)物按1)的方法聯(lián)接至T-easy載體，經(jīng)DNA測(cè)序正確無(wú)誤。c).上述二個(gè)PCR片段產(chǎn)物的拼接，形成Nco1~Nco1片段以及完整R72突變型p53基因cDNA的拼接將上述a)項(xiàng)和b)項(xiàng)中T-easy載體質(zhì)粒DNA分別用Nco1和Smal1完全酶切，純化后，再與經(jīng)Nco1酶切的野生型p53基因cDNA進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化細(xì)菌、質(zhì)粒抽提和經(jīng)酶切檢測(cè)拼接方向正確后，構(gòu)建成R72型的野生型p53基因表達(dá)質(zhì)粒pCMV-neo-p53。d).構(gòu)建含R72型p53抑癌基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒1).PCR擴(kuò)增72型P53全長(zhǎng)DNA片段以R72型的野生型p53基因表達(dá)質(zhì)粒pCMV-neo-p53為模板，用人工合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)如下引物5(在N-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)Nhe1)N端5’-tagctagctcactgccatggaggagccg-3’28mer Nhe1引物6(在N-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH1)N端5’-ggatccgaatgtcagtctgagtcagg-3’26merPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測(cè)序確定。2).含R72型抑瘤基因p53的腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315含有超強(qiáng)啟功子mMCV和病毒SV40的聚腺嘌吟核苷酸。為構(gòu)建含R72型抑瘤基因p53的腺病毒穿梭質(zhì)粒，分別以?xún)?nèi)切酶Nhe1和BamH1消化上述1)的T-easy質(zhì)粒DNA和腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315。經(jīng)瓊脂糖電泳分離、純化后，將含R72抑瘤基因p53和腺病毒穿梭質(zhì)粒的酶切片段進(jìn)行拼接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌種，培養(yǎng)擴(kuò)增、提取重組質(zhì)粒DNA。最后再經(jīng)酶切消化和DNA測(cè)序證實(shí)。
6.一種用于治療多種癌癥疾病的基因治療藥物，其特征在于權(quán)利要求1所述的表達(dá)R72型人P53基因的重組腺病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
7.如權(quán)利要求6所述的基因治療藥物，其特征在于，該重組腺病毒為Ad5型的纖突結(jié)突變型-Ad35，即Ad-p53(R72)；所述的有效抗癌成份為R72型人P53基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1、6和7的基因治療組合藥物，其特征除權(quán)利要求1所述的表達(dá)R72型人P53基因重組腺病毒之外，還包括含有其他具有抗癌治療效果的細(xì)胞因子和/或免疫調(diào)節(jié)因子通過(guò)內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)與R72型人P53基因相連接的表達(dá)盒的重組腺病毒。
9.一種制備表達(dá)人R72型人P53基因的重組腺病毒的方法，其特征在于，該方法包括a).提供復(fù)制缺陷型以及纖突結(jié)突變的腺病毒；b).提供線(xiàn)性化的上述第5款d項(xiàng)的pDC315-p53(R72)；c).應(yīng)用磷酸鈣或脂質(zhì)體將a)的腺病毒和b)pDC315-p53(R72)共轉(zhuǎn)染表達(dá)E1區(qū)基因缺失的胚胎腎293細(xì)胞；d).篩選陽(yáng)性克隆；e).從陽(yáng)性克隆中分離純化重組腺病毒Ad-p53(R72)；f).用從e)中的重組腺病毒感染正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，觀察人p53(R72)的表達(dá)及其功能。
全文摘要
本發(fā)明為一種表達(dá)新型腫瘤抑制基因p53的重組腺病毒的表達(dá)結(jié)構(gòu)，其主要特征為1)野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；2)該P(yáng)53抑癌基因在其N(xiāo)－末端以?xún)?nèi)切酶Nhe1和C－末端以?xún)?nèi)切酶BamH1片段拼接于穿梭質(zhì)粒pDC315超強(qiáng)啟動(dòng)子mMCV的下游；和3)重組的腺病毒載體為以Ad35纖突結(jié)取代Ad5型腺病毒的纖突結(jié)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。該新型p53抑癌基因腺病毒具有感染力更強(qiáng)、感染組織/細(xì)胞譜更廣、表達(dá)新型p53抑癌基因更強(qiáng)、其產(chǎn)物具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡生物功能。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1966683SQ20051010127
公開(kāi)日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月17日
發(fā)明者王尚武, 朱雅南 申請(qǐng)人:王尚武, 朱雅南