專利名稱：微生物培養(yǎng)物制備預(yù)防老年性黃斑變性滴眼液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制備預(yù)防和抑制老年性黃斑變性的眼底康滴眼液的方法，該方法的產(chǎn)品對老年性黃斑變性有明顯的預(yù)防和抑制作用，對睫狀肌有調(diào)節(jié)作用，還能改善眼部微循環(huán)。
背景技術(shù)：
老年性黃斑部變性(AMD)亦稱年齡相關(guān)性黃斑部變性(age-related macular degeneration)或衰老性黃斑部變性(aging maculardegeneration)。大多始發(fā)于50歲上下，年齡越大發(fā)病率越高。發(fā)病與性別、種族無明顯關(guān)系。雙眼同時或受先后受害。因臨床表現(xiàn)不同而分成萎縮性(干性)與滲出性(濕性)兩型，前者比較多見，后者則僅為前者的1/15～1/10，萎縮型以慢性視力下降，眼前有黑點或黑影出現(xiàn)，視物疲勞，閱讀困難，中晚期嚴(yán)重影響視力，滲出型以視物變形，急劇視力下降為特征，預(yù)后嚴(yán)重影響中心視力，萎縮型也可以轉(zhuǎn)為滲出型?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)還沒有對AMD有好的預(yù)防和治療方法。目前國內(nèi)外對黃斑疾病的治療方法主要有激光治療、手術(shù)治療、光動力治療、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ㄖ委?、藥物治療，但效果都不好，為國際眼科疑難病癥。
目前在國內(nèi)市場上用于治療老年性黃斑變性的藥物主要有德國產(chǎn)的施圖倫滴眼液，該產(chǎn)品主要成份為洋地黃葉的水浸膏、七葉甙、硼酸，適應(yīng)癥為眼底黃斑變性；所有類型的眼疲勞，包括肌肉性的，適應(yīng)性的或神經(jīng)性的。此外法國樂康美的瀾藥廠生產(chǎn)的遞法明100片，據(jù)報道具有提高近視和老年黃斑變性病人的視力和暗適應(yīng)，該產(chǎn)品的主要成分為歐洲越桔提取物、β-胡蘿卜素，藥物可增加靜脈張力及起到保護血管的作用，臨床用途用于糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變。上述兩種藥品經(jīng)臨床驗證其療效不甚理想。
眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)對藥物治療有著很大需求，而且一直沒有得到滿足。不只因為疾病復(fù)雜，還因視網(wǎng)膜和大腦的神經(jīng)形成柵欄，阻擋靠口服或體液循環(huán)進入的分子去路。有些藥物可以直接注射到大腦或眼中，但對于慢性病或需長期治療的特殊情況來說，這種方法實在是難以實行，這就是蛋白質(zhì)很難被應(yīng)用在眼睛治療方面的原因。眼底康滴眼液主要成份由金黃色葡萄球菌經(jīng)培養(yǎng)后滅活制成的生物制品，該產(chǎn)品設(shè)計獨特，避開了藥物由經(jīng)角膜、晶狀體、房水正面途徑很難進入球后部位的難題，選擇由結(jié)膜囊滴入、經(jīng)旁路系統(tǒng)進入眼循環(huán)系統(tǒng)，保證球后部位能達到有效的藥物濃度，能顯著改善眼底微循環(huán)、消除微血管痙攣、補充營養(yǎng)因子、調(diào)節(jié)新陳代謝、促進視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的生長，能夠有效地保護和保持視網(wǎng)膜及黃斑區(qū)細(xì)胞的旺盛的生命活力對AMD具有顯著的療效。適用于各種類型的黃斑變性、視神經(jīng)萎縮癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制備預(yù)防和抑制老年性黃斑變性的眼底康滴眼液的方法。
本發(fā)明的方法采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)(1)培養(yǎng)基的制備豬心培養(yǎng)基配方和工藝流程豬心胨培養(yǎng)基為豬心浸出液15ml％～25ml％、蛋白胨1g％～3g％、氯化鈉0.6g％～1.2g％；按配方稱取蛋白胨，氯化鈉，量取豬心浸出液，加注射用水至所需配方量，加熱溶解，攪拌均勻，滅菌，即得豬心胨培養(yǎng)基。
豬心浸出液的制備取新鮮豬心，去除血塊、脂肪及筋膜，用水沖洗干凈，攪碎，稱重，加二倍量的注射用水置4℃下保存14小時，取出，煮沸二小時趁熱用八層紗布過濾，再用布氏漏斗抽濾，得澄清黃色液體備用。
(2)金黃色葡萄球菌種子液的制備將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCCNo.0910)接種豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時，再將種子菌轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂平板中，劃分離培養(yǎng)24小時，選取典型菌落接種于豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時，得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)菌液的制備將上述制得的種子培養(yǎng)液接種于豬心胨培養(yǎng)基中，35℃～37℃發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時，中止培養(yǎng)，固液分離，用0.22μm微孔濾膜除菌，0.1MPa高壓下滅菌，得培養(yǎng)菌液。
(4)利用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制備預(yù)防和抑制老年性黃斑變性的眼底康滴眼液以1000ml眼底康滴眼液計，培養(yǎng)菌液80ml～150ml、氯化鈉5g～12g，加注射用水至1000ml；制備方法將氯化鈉溶解于注射用水中，加入所需的培養(yǎng)菌液中，補水至全量，充分?jǐn)嚢韬笥?.22μm微孔濾膜過濾，熱壓滅菌，冷卻，分裝。
本發(fā)明采用的金黃色葡萄球菌系金黃色葡萄球菌黃色亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)是一種新菌株，在申請日前已送往中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供微生物樣品。
提供微生物樣品的請求人是鄒慶宇，地址杭州市上城區(qū)佑圣觀路101號三幢1單元36室，時間2003年03月24日，保藏號0910。
此菌株自1998年在實驗室被發(fā)現(xiàn)以來，共傳代50次左右。一般情況下是4～8℃菌種斜面?zhèn)鞔４?，兩個月轉(zhuǎn)移一次，但在轉(zhuǎn)移的過程中要純化菌種與活化3～4次。特殊情況時保存時間稍長些，三個月傳代一次。
菌種穩(wěn)定性自發(fā)現(xiàn)此菌株以來，在4℃～8℃的條件下進行傳代保存(保存期2個月左右。)在這么多次的傳代、純化復(fù)壯、活化及生產(chǎn)培養(yǎng)過程中，尚未發(fā)現(xiàn)有異常現(xiàn)象。在30℃～37℃溫度培養(yǎng)，其菌落形態(tài)，細(xì)菌個體形態(tài)的穩(wěn)定性均佳，細(xì)菌體培養(yǎng)分泌產(chǎn)物成分及有關(guān)成分的含量也較穩(wěn)定。
生物特性細(xì)胞球形，直徑0.5μm～1.5μm。單個，成對和不規(guī)則堆狀。革蘭氏陽性，不運動，不生芽孢，兼性厭氧?；墚愷B(yǎng)，即有呼吸亦有發(fā)酵二種代謝型。菌落不透明，黃到橙色。接觸酶通常陽性；有細(xì)胞色素，但氧化酶陰性。10％NaCl生長，pH值7左右，最適菌體生長溫度30℃～37℃。
本發(fā)明眼底康滴眼液的主要藥效學(xué)試驗對光線照射所致的眼底黃斑變性有預(yù)防和抑制作用。用紫外線對家兔眼造成輻射損傷實驗證明，眼底康滴眼液(滴入眼瞼內(nèi))對家兔眼紫外線輻射所致瞼結(jié)膜、球結(jié)膜、瞬膜、角膜、虹膜的炎性損傷具有顯著保護作用。眼底康滴眼液具有降低兔眼睫狀肌張力，對痙攣狀態(tài)的睫狀肌具有明顯解痙作用。眼底康滴眼液對小鼠腸系膜血管局部給藥具有顯著改善微循環(huán)作用，對小鼠醋酸致痛和熱板法致痛有鎮(zhèn)痛作用。該藥對眼睛光輻射損傷的保護作用、對睫狀肌的調(diào)節(jié)作用和該藥改善微循環(huán)、減少疼痛等作用，為該藥治療眼疲勞的適應(yīng)癥提供了實驗基礎(chǔ)。
毒性試驗實驗用家兔進行，以臨床滴眼用日劑量85倍、40倍和20倍劑量，經(jīng)眼結(jié)膜囊內(nèi)給藥連續(xù)5周，同時設(shè)空白對照組，滴空白溶劑。結(jié)果給藥各組對家兔行為活動、進食、飲水、毛色、口、眼、鼻、肛門等均沒發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象。給藥各組對家兔體重增長與空白對照組比較均無明顯差異(P＞0.05)。測定給藥前后各組家兔WBC及其分類、RBC、PLT、Hb和凝血時等16項血液學(xué)指標(biāo)，結(jié)果均在正常值范圍內(nèi)。測定TP、ALB、GLO、A/G、TBIL、ALT、ALP、TC、BUN、CRE、GLU、AST等12項血液生化學(xué)指標(biāo)、藥前、藥后、恢復(fù)期均與空白對照組比較沒有明顯差異。對家兔心率也沒有明顯影響；對給藥后和恢復(fù)期家兔心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、前列腺、睪丸或卵巢、子宮、胸腺、甲狀腺等臟器重量指數(shù)測定結(jié)果，各組間或恢復(fù)期比較均無明顯差異(P＞0.05)。對心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、甲狀腺、睪丸或卵巢、子宮、眼角膜、眼瞼、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等病理切片檢查，均未發(fā)現(xiàn)因施加藥物因素而致的病理改變，表明該藥毒性小，用藥比較安全。
急性毒性試驗眼底康滴眼液向家兔眼結(jié)膜囊內(nèi)多次給藥沒產(chǎn)生毒性反應(yīng)，為進一步了解該藥毒性反應(yīng)又作了小鼠靜脈給藥，結(jié)果測不出LD50，測得最大給藥量為20ml/kg。
眼底康滴眼液局部刺激、過敏反應(yīng)和溶血實驗眼底康滴眼液向兔眼結(jié)膜囊內(nèi)給藥，無論一次給藥、多次給藥和破損結(jié)膜給藥均沒呈現(xiàn)局部刺激反應(yīng)。經(jīng)豚鼠體內(nèi)給藥的過敏實驗證明，眼底康滴眼液沒發(fā)現(xiàn)有過敏反應(yīng)；經(jīng)溶血實驗證明該藥不產(chǎn)生溶血。
本發(fā)明用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制備預(yù)防和抑制老年性黃斑變性的眼底康滴眼液的方法，不加任何防腐劑，是滅菌制劑，無任何副作用，采用本發(fā)明制備的眼底康滴眼液，質(zhì)量穩(wěn)定，在遮光，密閉，陰涼處保存，保存期達一年半，用法滴入眼瞼內(nèi)，一日3～4次，每次1～2滴，用于預(yù)防和抑制老年性黃斑變性的發(fā)生和發(fā)展，并改善由此造成的視力疲勞癥狀。經(jīng)毒理檢查證明完全無任何副作用。該眼底康滴眼液選擇由結(jié)膜囊滴入、經(jīng)旁路系統(tǒng)進入眼循環(huán)系統(tǒng)，保證球后部位能達到有效的藥物濃度，能顯著改善眼底微循環(huán)、消除微血管痙攣、補充營養(yǎng)因子、調(diào)節(jié)新陳代謝、促進視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的生長，對睫狀肌有調(diào)節(jié)作用，還能改善眼部微循環(huán)，能夠有效地保護和保持視網(wǎng)膜及黃斑區(qū)細(xì)胞的旺盛的生命活力，對AMD具有顯著的療效。適用于各種類型的黃斑變性、視神經(jīng)萎縮癥。
(四)具體實施方案參照附隨的實施例對本發(fā)明進行更詳細(xì)的描述，這些實施例決不是對本發(fā)明的限制。
實施例1(1)培養(yǎng)基的制備豬心浸出液的制備取新鮮豬心，去除血塊、脂肪及筋膜，用水沖洗干凈，攪碎，稱重，加二倍量的注射用水置4℃下保存14小時，取出，煮沸二小時趁熱用八層紗布過濾，再用布氏漏斗抽濾，得澄清黃色液體備用。
豬心胨培養(yǎng)基的配制稱取蛋白胨2g、氯化鈉0.9g，量取豬心浸出液20ml，加注射用水至100ml，加熱溶解，攪拌均勻，滅菌，制得豬心胨培養(yǎng)基備用。
(2)金黃色葡萄球菌種子液的制備金黃色葡萄球菌菌種啟開后，轉(zhuǎn)入豬心胨培養(yǎng)基中，36℃±1℃培養(yǎng)24小時，再轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂平板中，劃分離培養(yǎng)24小時，選取典型菌落接種轉(zhuǎn)入裝有15ml的豬心胨培養(yǎng)基的小三角瓶中，在36℃±1℃搖床內(nèi)培養(yǎng)24小時，如此反復(fù)3次，即得種子培養(yǎng)液。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)菌液的制備(供下面實例使用)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液15ml倒入已有400ml豬心胨培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置搖床內(nèi)36℃±1℃培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)后的菌液離心分離，5000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液。用塞氏濾器0.22μm過濾除菌，裝入500ml輸液瓶中，再置于高壓滅菌器內(nèi)0.1MPa滅菌35分鐘，取出，冷卻，即得發(fā)酵菌液。
實施例2
眼底康滴眼液配方發(fā)酵菌液 100ml氯化鈉 8.1g加注射用水，制取1000ml眼底康滴眼液制備方法稱取氯化鈉8.1g，用約800ml注射用水溶解，然后加入發(fā)酵菌液100ml，攪拌均勻，補注射用水至總量為1000ml，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?.22μm的微孔濾膜過濾，115℃熱壓滅菌，冷卻，分裝成1ml，包裝，既得，產(chǎn)品的pH值為5.0～7.0。
實施例3眼底康滴眼液配方發(fā)酵菌液 80ml氯化鈉 6.1g加注射用水，制取1000ml眼底康滴眼液制備方法同實施例2。
實施例4眼底康滴眼液配方發(fā)酵菌液 120ml氯化鈉 10g加注射用水，制取1000ml眼底康滴眼液制備方法同實施例2。
實施例5眼底康滴眼液配方發(fā)酵菌液 150ml氯化鈉 12g加注射用水，制取1000ml眼底康滴眼液制備方法同實施例2。
權(quán)利要求
1.一種用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制備預(yù)防和抑制老年性黃斑變性的眼底康滴眼液的方法，其特征在于(1)將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCCNo.0910)接種于豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時，再將種子菌轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂平板中，劃分離培養(yǎng)24小時，選取典型菌落接種于豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時，得種子培養(yǎng)物；其中所用的豬心胨培養(yǎng)基，為豬心浸出液15ml％～25ml％，蛋白胨1g％～3g％，氯化鈉0.6g％～1.2g％；(2)將種子培養(yǎng)物接種于豬心胨培養(yǎng)基中，35℃～37℃發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時，中止培養(yǎng)，固液分離，用0.22μm微孔濾膜除菌，0.1MPa高壓下滅菌，得金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液；(3)以1000ml滴眼液計，其中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液80ml～150ml，氯化鈉5g～12g，其余為注射用水；按配方將氯化鈉溶解于注射用水中，加入培養(yǎng)菌液，補水至全量，充分?jǐn)嚢韬笥?.22μm微孔濾膜過濾，熱壓滅菌，冷卻，分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以1000ml滴眼液計，其中培養(yǎng)菌液100ml，氯化鈉8.1g，其余為注射用水。
全文摘要
一種用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制備預(yù)防和抑制老年性黃斑變性的眼底康滴眼液的方法，包括金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇、在豬心胨培養(yǎng)基制備種子培養(yǎng)液和發(fā)酵培養(yǎng)菌液；以1000ml滴眼液計，其中培養(yǎng)菌液80ml～150ml，氯化鈉5g～12g，其余為注射用水，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，熱壓滅菌，制得眼底康滴眼液。本發(fā)明制得的產(chǎn)品對老年性黃斑變性有明顯的預(yù)防和抑制作用，對睫狀肌有調(diào)節(jié)作用，還能改善眼部微循環(huán)。
文檔編號A61P27/02GK1718199SQ20051004966
公開日2006年1月11日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者鄒慶宇 申請人:鄒慶宇