專利名稱：在生物液體中滅活微生物的方法、流通式反應(yīng)器以及控制光輻照總劑量從而有效滅活間 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種確定從一個(gè)或者多個(gè)光源發(fā)出的單色光或者多色光滅活在存在于生物體液特別是非透明體液中微生物的有效劑量的方法。本發(fā)明還提供了一種滅活存在于流通式反應(yīng)器中生物液體所含微生物的方法。而且，本發(fā)明有利地提供了一種具備一個(gè)或者多個(gè)熱穩(wěn)定光源的流通式反應(yīng)器。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一個(gè)控制從單個(gè)或多個(gè)光源發(fā)出的單色或者多色光的光輻照總劑量(light sum dose)從而有效滅活間歇反應(yīng)器中微生物的方法。
背景技術(shù)：
在諸如營(yíng)養(yǎng)學(xué)、化妝品，醫(yī)學(xué)診斷或者治療中，通過(guò)輻射處理生物液體是一種得到廣泛研究的滅活微生物的方法。眼下正在研究的輻射方法例子包括短波紫外光、長(zhǎng)波紫外光或者具有光敏化合物的可見(jiàn)光，以及光譜寬的高強(qiáng)閃光。
例如，沙門(mén)氏細(xì)菌屬(Salmonella spp.)、單核細(xì)胞增生癥李斯德氏菌屬(Listeriamonocytogenes)，真菌或者腸道出血性大腸桿菌屬O157:H7等污染食物的細(xì)菌，可以很容易就污染牛奶，果汁，發(fā)酵飲料和其他由此制作而來(lái)的其他飲料等液體。另外一個(gè)微生物污染的例子是，存在于生物液體(如血液及其衍生制品，細(xì)胞培養(yǎng)液上清或裂解液)中的原蟲(chóng)、細(xì)菌以及病毒，一方面可以從這些液體中提取藥物，但同時(shí)也存在由此而將這些微生物傳播到使用這些藥品的病人體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。
為了在一個(gè)小型實(shí)驗(yàn)室的規(guī)模上來(lái)滅活這些微生物，人們開(kāi)發(fā)出了間歇式光滅活反應(yīng)器(batch photoinactivation reactors)。這類間歇式光滅活反應(yīng)器通常主要由一個(gè)被一系列燈光環(huán)繞的空腔組成，將待處理樣品裝在一個(gè)透光的容器內(nèi)的空腔中，并曝光一定的時(shí)間；同時(shí)，也可以通過(guò)攪拌以保證樣品得到均一的光照。位于美國(guó)康涅狄格州Branford的南新英格蘭紫外線公司(Southern England Ultraviolet Company)制造的柱狀“Rayonet”和“Rayonette”反應(yīng)器，以及位于加拿大安大略省渥太華的路茲化學(xué)研究公司(Luzchem Research Inc.)生產(chǎn)的光室型光滅活反應(yīng)器，就是這類光滅活反應(yīng)器的典型例子。
為了確保大容積的待處理液體完全有效地暴露于光場(chǎng)中以防止污染，人們?cè)O(shè)計(jì)了多種流通式反應(yīng)器。這些反應(yīng)器中，有的設(shè)計(jì)成將液體平鋪成一層薄膜或薄層以最大限度減少由于自吸收而造成的光強(qiáng)度的損失；有的在縱向流動(dòng)的液體中加上一個(gè)橫向的混合裝置，使得所有的液體組分都能夠到達(dá)能被光線照射到的淺表外液體層，從而確保所有的液體得到均勻的光照。
Caillet-Fauquet等在2004年描述了一類流通式UV-C(紫外光C)照射來(lái)滅活細(xì)菌和病毒方法，利用腦脊髓炎病毒摻合的樣品作為生物劑量測(cè)定或者內(nèi)部感光測(cè)定樣品，關(guān)于這一點(diǎn)，沒(méi)有更多的細(xì)節(jié)見(jiàn)諸報(bào)道。
過(guò)去，以上提到的流通式照射裝置一般是這樣設(shè)計(jì)的一根傾斜的管圍繞著管形光源旋轉(zhuǎn)，將內(nèi)壁上的液體分布到一層自由流動(dòng)的薄膜上(Habel & Sockrider 1947)，一個(gè)平的透明小室將液體流擠壓成一個(gè)薄層；或者一個(gè)透明的螺旋狀管纏繞在管形光源(Oppenheimer等，1959)。在一個(gè)直徑超過(guò)光照穿透深度的流通式裝置中，橫向的混合可以通過(guò)一個(gè)圈中一種被稱為迪恩渦流(Dean vortices)的二次渦流來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)一個(gè)靜止的位于管中的折流板來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者也可以依靠位于兩個(gè)逆流柱之間的立體環(huán)形泰勒渦漩(toroidal Taylorvortices)，液體在此之間的環(huán)狀間隙流過(guò)。
如果光照的穿透有限，那么可以將液體分布于一層薄膜上經(jīng)過(guò)光源，正如美國(guó)專利5,567,616和6,540,967描述的那樣。在位于深度大于光照穿透深度的液體層中，橫向混合原則上可以主動(dòng)或者被動(dòng)地產(chǎn)生。
一個(gè)廣為人知的主動(dòng)混合的原則就是，在同心逆流旋轉(zhuǎn)柱的表面，誘導(dǎo)泰勒渦旋的產(chǎn)生。這些泰勒渦旋被疊加在縱向流上，造成稱之為T(mén)aylor-Gortler的渦流。美國(guó)專利6,576,201介紹了一類柱狀的UV-C透明流通式小室，它帶有靜止的透明外壁和旋轉(zhuǎn)內(nèi)柱。位于此間的液體層，被水泵驅(qū)動(dòng)通過(guò)該流通式小室的液體依靠逆流泰勒渦流(counter-current TaylorVortices)而混合。一個(gè)連續(xù)性光波或者脈沖激光—紫外光源用來(lái)作為輻射發(fā)生裝置。
另外一種用于主動(dòng)混合的裝置就是基于阿基米德螺旋槳(Archimedean screw)的流通式反應(yīng)器，泵出的液體依靠旋轉(zhuǎn)的螺旋槳在流線圈得到混合(Della Contrada 2004)。
被動(dòng)式混合既可以通過(guò)亂流產(chǎn)生，也可以通過(guò)障礙物繞流(如位于液體流經(jīng)通路上的靜止的混合擋板)來(lái)實(shí)現(xiàn)。早期的滅活反應(yīng)器大多設(shè)計(jì)為，液體流經(jīng)位于管形輻照燈(或者其包被管envelope tube)外壁和同心輻照反應(yīng)器內(nèi)壁之間的角形間隙。這類的薄層輻射發(fā)生器可以從位于奧地利Seewalchen的Wedeco-Visa GmbH公司購(gòu)得。
另外一類被動(dòng)橫向混合的有效技術(shù)就是，在弧形管中(尤其是在螺旋盤(pán)繞的管中)引發(fā)一種被稱為Dean Vortices的二次渦流。例如，Bayha等在1952年介紹了一個(gè)用于消毒牛奶等高吸收液體的盤(pán)管狀反應(yīng)器(coil reactor)，在這一裝置中，一個(gè)石英玻璃盤(pán)管縱向包繞在多重低壓汞燈周圍；Hiatt等在1960年也介紹了一種通過(guò)光敏化滅活存在疫苗或其他生物液體中的病毒的類似的盤(pán)管反應(yīng)器，在Hiatt的裝置中，反應(yīng)器由硼硅玻璃做成，盤(pán)管是包繞在白熾燈絲上的。盤(pán)管在透光性水夾套中被冷卻。在過(guò)去，盡管硼硅玻璃和石英玻璃的特殊工藝以及他們的易碎的特性限制了它們的應(yīng)用，但紫外半透性、抗紫外以及化學(xué)惰性氟多聚體的易得減少了設(shè)計(jì)和規(guī)模化使用這類流通式反應(yīng)器的難度。盤(pán)管纏繞在一個(gè)同心的管狀光源(通常是一個(gè)低壓汞燈)上，同時(shí)依靠加在流體上的一種被稱為Dean vortices的二次渦流而實(shí)現(xiàn)橫向混合。美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0049809A1就介紹了這樣一類的螺旋狀包繞反應(yīng)器(helicalenvelope-reactor)。2004年，Wang等報(bào)道，通過(guò)草酸鐵絡(luò)合物感光測(cè)定法測(cè)得的燈強(qiáng)度、吸收值以及滯留時(shí)間，可以計(jì)算出泵過(guò)反應(yīng)器的液體所接收到的光照劑量滯留。
過(guò)去，有不少人試圖進(jìn)行精確確定在輻射過(guò)程中有效光能的嘗試。光能既可以依靠光敏性電子傳感器、或者也可以依靠光子激發(fā)的光化學(xué)反應(yīng)來(lái)計(jì)算，或者光能也可以依靠測(cè)定生物液體中含有的或者是人為添加的的微生物被滅活的效率來(lái)計(jì)算。其他理論方法還包括數(shù)學(xué)模擬，如簡(jiǎn)單地將一個(gè)體積元的滯留時(shí)間乘以強(qiáng)度來(lái)計(jì)算光照劑量；也可以通過(guò)一種更為精細(xì)的計(jì)算方法，如通過(guò)流體模擬來(lái)球算出滯留時(shí)間和劑量。
化學(xué)感光測(cè)定法也可以測(cè)量光照對(duì)于光化學(xué)反應(yīng)性混和物的影響(Kuhn等，1989；Favaro等，1998)?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)于已知光量子產(chǎn)率和溫度依賴性的已建立的光化測(cè)定法，其測(cè)定的穩(wěn)定性和可重復(fù)性都較電子裝置要好。光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物最好能便利地在線測(cè)量，如依靠光電分光法或者化學(xué)傳感器(Gauglitz 1983)。
另外一種更常選用的方法中，利用了在測(cè)量波長(zhǎng)下測(cè)量感光測(cè)定溶液的阻光度，光化學(xué)反應(yīng)僅僅在表面發(fā)生(Kuhn等，1989；Favaro，1998)。因此，對(duì)于這類方法，應(yīng)當(dāng)盡量選用較高的反應(yīng)物濃度。
在一種滅活流感病毒的疫苗流通式紫外反應(yīng)器中，用尿苷感光計(jì)(actinometer)來(lái)測(cè)量燈光的強(qiáng)度(Zheleznova 1979)。
泰勒渦流(Taylaor-vortex)發(fā)生裝置作為一種光化學(xué)反應(yīng)器，在均相和異相光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中也得到研究(Sczechowski等，1995；Forney & Pierson，2003)。為了對(duì)這類發(fā)生器進(jìn)行感光測(cè)定，通常用到了草酸鐵絡(luò)和物感光計(jì)或者碘化物/碘酸鹽感光計(jì)。然而，還沒(méi)有關(guān)于進(jìn)行吸光度匹配的校正數(shù)據(jù)以確定碘化物溶液中的劑量的報(bào)道(Forney & Pierson，2003)。
對(duì)于UV-C測(cè)定而言，經(jīng)典的感光計(jì)是草酸鈾酰感光計(jì)(Bowen 1949；Kuhn等，1989)和草酸鐵絡(luò)和物感光計(jì)，但是草酸鈾酰感光計(jì)的應(yīng)用由于其鈾放射毒性而受到了限制，草酸鈾酰感光計(jì)的應(yīng)用由于其UV-A，UV-B，以及可見(jiàn)光的敏感性而受到了一定的限制(Kirk &Namasivayam，1983)。硫化氫或三苯甲烷燃料的氫化氰加成物也已知可以作為UV-C敏感的感光計(jì)。例如，溶解于乙醇中的無(wú)色的孔雀石綠無(wú)色氰(malachite green leucocyanide)并沒(méi)有表現(xiàn)出長(zhǎng)波紫外光或者可見(jiàn)光的敏感性，但是綠色的光產(chǎn)物在UV-C區(qū)有一定的吸收(Calvert & Rechen，1952；Fisher等，1967)。溶解于乙醇中偶氮苯(光化發(fā)色團(tuán)2R 245、440)以及雜靠厄二蒽酮內(nèi)過(guò)氧化物(heterocoerdianthrone endoperoxide)(光化學(xué)發(fā)色團(tuán)1R248/334)(Brauer & Schmidet，1983)可以使得這種感光測(cè)定溶液能重新使用(Gauglitz &Hubig，1981，1984，1985)。盡管這些溶解在有機(jī)溶劑中的復(fù)合有機(jī)物是無(wú)害的，人們通常假定感光測(cè)定物質(zhì)和溶液應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒的和無(wú)危險(xiǎn)的。
在20世紀(jì)早期，在多種紫外燈源變得易得后，酸性碘化物立即成為一種感光計(jì)而得到應(yīng)用(Bering & Meyer，1912)。但是，像0.05這么低的光量子產(chǎn)率導(dǎo)致了氮氧化物被用來(lái)作為一種電子清除劑(Dainton & Sills，1960；Rahn，1993)。另外一種較為最近出現(xiàn)的不透光UV-C感光測(cè)定法，是碘酸鹽穩(wěn)定化的碘化物光化學(xué)分解反應(yīng)(Rahn，1997；Rahn等，1999，2003)。在253.7nm波長(zhǎng)下碘化物光解為三碘化物，在352nm波長(zhǎng)下或者更長(zhǎng)波長(zhǎng)下(375nm，400nm)對(duì)這一反應(yīng)進(jìn)行分光光度測(cè)定。該體系具有對(duì)超過(guò)300nm波長(zhǎng)不敏感的優(yōu)點(diǎn)。
有人提出，可以將含有感光計(jì)溶液的流通式或者靜態(tài)式探測(cè)器插入輻射發(fā)生器中，用以替代UV-傳感器。將濃縮的感光計(jì)溶液，如美國(guó)專利6,596,542中的碘化物/碘酸鹽感光計(jì)或者2001年Schulz等報(bào)道的尿苷溶液泵入并通過(guò)紫外通透的管子，該管子同時(shí)還接收來(lái)自光源的紫外線；或者，這些感光計(jì)溶液也可以置于帶有一小窗能接收紫外燈光照的小室。在暴露在光照中一定的時(shí)間后，產(chǎn)生的光化學(xué)產(chǎn)物用光電分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。然而，這些傳感器僅僅能測(cè)量到他們所受到的附帶輻射(radiation incident)的一部分，但是不能測(cè)量對(duì)于輻照反應(yīng)器中所含待輻照液體有效的平均光通量(光劑量)。
水溶性三苯基甲烷染料，4，4’，4”-三(二β羥乙基)氨基三苯乙腈(4，4’，4”-tris-di-β-hydroxyethylaminotriphenyl acetonitrile)作為另外一種感光計(jì)物質(zhì)，可以應(yīng)用于UV-C輻射，對(duì)存在于果汁和植物汁液中的微生物(Koutchma & Adhikari，2002)進(jìn)行“冷滅菌”。實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程的裝置已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，例如由位于紐約Macedon的FPE公司(FPE Inc.)生產(chǎn)的“Cidersure”和“Sap Steady”薄膜輻射器，或者由位于加州Fallbrook的Salcor公司生產(chǎn)的“Light Processed System”環(huán)繞管狀輻射器。從水果中榨取的果汁，由于含有懸浮顆粒而顯示混濁狀，由于含有溶解的苯酚化合物和維生素C而具有很高的UV-C吸收率，由于具有類似蛋白溶液的粘度。經(jīng)過(guò)澄清處理后的蘋(píng)果汁在253.7nm波長(zhǎng)下具有9/cm的吸收系數(shù)。感光計(jì)物質(zhì)被添加到具有高吸收性的果汁中而后放置于準(zhǔn)直光裝置中進(jìn)行光照輻射，就如同完全用紫外光滅活動(dòng)力學(xué)來(lái)確定非吸收性懸浮液中的微生物一樣(Bolton &Linden，2003)。在600nm波長(zhǎng)處，感光計(jì)光產(chǎn)物的光吸收增加，但實(shí)際上，添加的感光計(jì)物質(zhì)僅僅吸收對(duì)應(yīng)于其總吸收中吸收組分的光量子組分。通過(guò)對(duì)增加的感光計(jì)染料的降解進(jìn)行測(cè)量，從而可以計(jì)算出有效光照劑量。在一個(gè)玻璃碟子的蘋(píng)果果汁中，190mJ/cm2的吸收劑量相當(dāng)于滅活不超過(guò)3 log10大腸桿菌K12菌落形成單位(cfu)/mL，將一種感光計(jì)物質(zhì)加入到樣品本身有時(shí)可能造成有效劑量結(jié)果呈明顯的錯(cuò)誤結(jié)果。在非吸收性的懸浮液中，5 Log10cfu/mL大腸桿菌在大約10mJ/cm2下被滅活(Wright & Sakamoto，1999)。然而，在溶液中發(fā)揮作用的照射劑量必須和在微生物中起作用的劑量保持一致。因此，為了實(shí)現(xiàn)精確的有效劑量的測(cè)量，將一種感光計(jì)物質(zhì)加入到一種已經(jīng)存在吸收的介質(zhì)中的做法是不可取的。
利用產(chǎn)氣氣桿菌(肺炎克雷伯氏菌的過(guò)時(shí)的叫法)，盡管沒(méi)有能夠給出生物劑量學(xué)的所有細(xì)節(jié)，利用可被光照滅活的微生物來(lái)進(jìn)行生物劑量，這是第一個(gè)被用來(lái)確定血漿中的可使用的輻照劑量的方法。另外，微小噬菌體科大家族中的單鏈DNA噬菌體，如S13和Phi X174噬菌體隨著紫外輻照劑量的增加，其滴度成線性遞減。基于噬菌體(如PhiX174，或單鏈RNA噬菌體MS2)滅活的劑量測(cè)定法，或者基于枯草桿菌孢子滅活的生物劑量法，已經(jīng)開(kāi)發(fā)為用來(lái)測(cè)試流通式紫外光水消毒器的方法。在被稀釋的紫外光通透性懸浮緩沖液中，在33mm的培養(yǎng)皿中水平攪動(dòng)，并置于均一的9瓦的0.225mW/cm2的UV-C燈中，噬菌體Phi X174的隨劑量的非衰減性滅活速率為-0.44(Log10pfu/mL)/(mJ/cm2)(Anderle等，2004)。
已經(jīng)商業(yè)化的薄層輻照器“CiderSure”(美國(guó)紐約州羅切斯特，F(xiàn)PE公司制造)可適用于果汁，這種裝置基本構(gòu)成為，圍繞著管狀紫外光源，同心并行設(shè)置一個(gè)外部不銹鋼管和一個(gè)內(nèi)部石英管，液體縱向流過(guò)這兩個(gè)管的間隙區(qū)域。通過(guò)生物劑量學(xué)，對(duì)于每一類果汁，可以調(diào)整液體的流速，對(duì)于大腸桿菌O157:H7而言，以達(dá)到減少＞5log10cfu/mL的滅活效果。同時(shí)，因?yàn)闉閯┝縃通常假定為E乘以滯留時(shí)間t，所以光強(qiáng)度的損失可以通過(guò)調(diào)整流速而得到補(bǔ)償(FDA，2000)。不過(guò)，單純依靠這種生物劑量學(xué)上的校正，并不能使得這種流通式反應(yīng)器的滯留時(shí)間分布優(yōu)化在一個(gè)比較窄的分布，從而使得避免對(duì)液體的過(guò)量照射。即便對(duì)于營(yíng)養(yǎng)性液體來(lái)說(shuō)，這一點(diǎn)更應(yīng)該避免，因?yàn)檫^(guò)量的紫外光照射可以使得液體產(chǎn)生變味的不良效果，使得液體不那么可口。
上面提到的那些流通式反應(yīng)器，存在著流變學(xué)和技術(shù)的缺點(diǎn)等待克服。進(jìn)入輻照的每一個(gè)體積元被縱向分配成一個(gè)較快的流體組分，該流體組分由于其較短的滯留時(shí)間而受到較少的輻照劑量；一個(gè)較慢的尾隨組分，該組分受到叫道的輻照劑量；和介于這連個(gè)組分之間的流體組分。圖7是關(guān)于美國(guó)專利6,576,201中，在一個(gè)泰勒渦流發(fā)生室中，滯留時(shí)間的分布取決于內(nèi)部柱體旋轉(zhuǎn)速度的一個(gè)例子。如果輻照劑量太低則不能完全滅活存在的微生物；輻照劑量太高則可能損害流體中的有效成分，如果汁中的維生素和香料，血液衍生物中的蛋白質(zhì)，或者疫苗中的抗原等。這樣，最好是能夠?qū)椪者^(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，使得既能足夠有效地滅活靶微生物，同時(shí)又能夠安全地保存其中的有效成分。對(duì)這一過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化的方法是非常有用的。
前面提到的流通式和間歇式反應(yīng)器的另外一個(gè)技術(shù)性限制是，光源會(huì)在使用壽命期限內(nèi)發(fā)生老化，從而使得使用期間內(nèi)產(chǎn)生的發(fā)光量較剛開(kāi)始時(shí)損失一部分。為了彌補(bǔ)這一缺陷，一種積分計(jì)數(shù)器(integrating counter)可以被用來(lái)保證穩(wěn)定和可重復(fù)的光輻照劑量，但是不能兼顧到待輻照溶液的吸收(Rider & Robert，1951)。另外，在反應(yīng)時(shí)，可能會(huì)由于至少一個(gè)光源的失靈而造成滅活反應(yīng)的不連續(xù)發(fā)生。盡管這種失靈或者不正常關(guān)閉可以僅僅用一個(gè)電子光敏傳感器來(lái)檢測(cè)，但是為了確定一個(gè)有效光輻照劑量對(duì)流體的影響，需要對(duì)這一劑量進(jìn)行測(cè)量以建立燈光強(qiáng)度、吸收、劑量衰減之間的聯(lián)系，以便能夠通過(guò)改變其他過(guò)程變量來(lái)補(bǔ)償這種劑量衰減。這類裝置同時(shí)還需要在特定的時(shí)間間隔進(jìn)行校正，以保證持續(xù)有效的運(yùn)行。一種用于在生物液體中微生物的光滅活期間測(cè)量、控制和補(bǔ)償諸如光輻照波動(dòng)的方法，優(yōu)選能夠兼顧到在間歇反應(yīng)器中待輻照生物液體的吸收的方法是非常有用的；另外，一種用于控制滅活過(guò)程不因?yàn)楣廨椪斩▌?dòng)的方法，也是非常有用的。
而且，在輻照裝置如間歇式和流通式反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中，光源還產(chǎn)生了相當(dāng)數(shù)量的熱能。來(lái)自輻照燈的熱量更進(jìn)一步導(dǎo)致了光發(fā)射產(chǎn)生相當(dāng)大的波動(dòng)。例如，對(duì)于低壓汞燈而言，大部分的輻照燈的能量被轉(zhuǎn)化成了熱能，僅僅只有大約三分之一被轉(zhuǎn)化成了光輻照發(fā)射出去。盡管低壓汞燈很少發(fā)熱到溫度高于60℃，但適中的熱量就能導(dǎo)致對(duì)那些溫度敏感有效成分的破壞。僅僅直接對(duì)光滅活反應(yīng)器中的流體管進(jìn)行冷卻，并不能使得輻照燈恒溫和輻照強(qiáng)度穩(wěn)定；對(duì)輻照燈電壓進(jìn)行調(diào)整來(lái)穩(wěn)定輻照強(qiáng)度不能移去產(chǎn)生的熱量或過(guò)量熱量。因此，如果能開(kāi)發(fā)出這樣一種流通式反應(yīng)器，它既能減少因燈源發(fā)熱而導(dǎo)致的光輻照波動(dòng)，同時(shí)最好還能保證輻照燈溫度基本恒定或者不那么波動(dòng)，那將是十分理想的。這樣一種溫度穩(wěn)定裝置在美國(guó)專利2,725,482中有描述，它使用了一個(gè)六個(gè)輻照燈的離心式膜輻照器(centrifugal filmirradiators)，每一個(gè)輻照燈都配有的一個(gè)靠水冷卻的導(dǎo)熱管可以移去過(guò)量的熱量(Benesi，1956)。其他流通式反應(yīng)器如Dill反應(yīng)器(美國(guó)專利5,567,616)，有擋板的或者其他包含有靜止混合器元件的管狀輻照器(美國(guó)專利6,596,172)，螺旋管形輻照器(WO 02/38191)已經(jīng)有一些嘗試和披露，不過(guò)僅僅是沒(méi)有直接的輻照燈溫度穩(wěn)定裝置。在美國(guó)專利6,586,172中，設(shè)想了一種輔助空氣流冷卻(通風(fēng)式)裝置，不過(guò)這種裝置較直接的液體溫度穩(wěn)定裝置效率更低。其效率取決于環(huán)境空氣溫度。在自由流薄膜輻照器中，穩(wěn)定的冷空氣流可能會(huì)使得生物液體中的水分蒸發(fā)。液體式的輻照燈熱穩(wěn)定也許可以保證，在沒(méi)有內(nèi)燃燒時(shí)間的情況下，在最大的病原體殺滅強(qiáng)度下立即運(yùn)行，例如，對(duì)于低壓汞燈UV-C最大產(chǎn)率在41.5℃；或者也可以從白熾燈光源中過(guò)濾掉紅外輻照，因?yàn)榘坠饪赡鼙簧镆后w吸收而被轉(zhuǎn)化成過(guò)量的熱能。
在1960年，在UV-C輻照疫苗技術(shù)方面的權(quán)威專家認(rèn)為為了計(jì)算出用來(lái)滅活病毒這一過(guò)程本身所用到的能量絕對(duì)量，必須要對(duì)被病毒和培養(yǎng)基所吸收的紫外光能的相對(duì)量進(jìn)行定量化，然而這一點(diǎn)目前還沒(méi)有能夠?qū)崿F(xiàn)。更進(jìn)一步，絕對(duì)的曝光取決于一系列可變的因素，如粘度、溫度、表面張力和流體的摩擦阻力(Taylor，1960)。盡管蛋白溶液或病毒懸浮液經(jīng)常是澄清的或者稍微有點(diǎn)不透明的膠體，但是其他的液體可能包含有可能過(guò)濾掉的固體顆粒。對(duì)于多種粘土類礦物在滅活水中存在的產(chǎn)氣克雷伯菌過(guò)程中的保護(hù)作用的研究表明，這種能吸收紫外的粘土質(zhì)可以對(duì)細(xì)菌有保護(hù)作用，但能發(fā)散紫外光的粘土質(zhì)則沒(méi)有這樣的保護(hù)作用(Bitton，1972)。最近有研究表明，對(duì)于混濁的蘋(píng)果汁和澄清的蘋(píng)果汁，在用分光光度法進(jìn)行測(cè)量時(shí)，這類懸浮溶液具有類似的表觀吸收，但在混濁液中比在澄清液中微生物被滅活得更迅速(Koutchma等，2004)。完全的曝光顯然取決于被顆粒散射到溶液中的一部分光。到目前為止，在科技文獻(xiàn)或者專利中，液體樣品中對(duì)微生物的有效光化學(xué)劑量的確定還沒(méi)有報(bào)道。同樣地，用于確定在生物液體(特別是不透明的生物液體)中滅活微生物的有效光照劑量的方法(特別是對(duì)于流通式反應(yīng)器而言)也沒(méi)有報(bào)道。另外，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種在保證有效的生物活性成分不受影響的同時(shí)，對(duì)于包含在生物液體，特別是不透明的生物液體中的微生物進(jìn)行有效滅活的方法。

發(fā)明內(nèi)容
解決上述技術(shù)問(wèn)題的方案通過(guò)權(quán)利要求限定的具體實(shí)施方式
而實(shí)現(xiàn)，特別需要指出的是，本發(fā)明首要目的在于提供一種用于確定從一個(gè)或多個(gè)光源發(fā)出的單色光或多色光滅活生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測(cè)量所述單色光或多色光對(duì)于劑量測(cè)定溶液的影響，其中所述滅活在流通式反應(yīng)器中進(jìn)行。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種流通式反應(yīng)器中滅活生物液體中微生物的方法，包括用有效輻照劑量的來(lái)自一個(gè)或者多個(gè)光源的單色光或多色光輻照生物液體，其中根據(jù)前述的方法和下面的詳細(xì)描述確定有效光輻照劑量。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于在滅活存在于不透明的生物液體的微生物時(shí)，確定來(lái)自單個(gè)或者多個(gè)光源的單色光或多色光的有效輻照劑量的方法，包括測(cè)量在所用光滅活波長(zhǎng)下單色光或者多色光對(duì)于與生物液體的濁度、與生物液體的濁度和吸光度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物液體的濁度、吸光度和粘度、與生物液體的吸光度、或與生物液體的粘度和吸光度相匹配的劑量測(cè)定溶液的影響，上述測(cè)量是基于采用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對(duì)薄層內(nèi)的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照以施加一能夠?qū)е驴蓽y(cè)量的物理量或化學(xué)量發(fā)生變化的規(guī)定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長(zhǎng)度薄到在規(guī)定時(shí)間內(nèi)只能吸收預(yù)定輻照度的入射光部分，ii)在對(duì)光輻照反應(yīng)器中劑量測(cè)定溶液輻照期間或之后，讀取與這些測(cè)到的量的變化相應(yīng)的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進(jìn)行，反之亦然。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種滅活非光透性生物液體中微生物的方法，包括使用來(lái)自一個(gè)或者多個(gè)光源的單色或者多色光的有效輻照劑量來(lái)輻照生物液體，其中有效輻照劑量依據(jù)前述的方法和下面詳細(xì)描述的方法進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種紫外光滅活流通式反應(yīng)器，在該反應(yīng)器中，封套恒溫器包裹了一個(gè)或者多個(gè)光源，通過(guò)該封套恒溫器，恒溫并且基本透光的液體進(jìn)行流動(dòng)，帶走燈來(lái)自輻照的熱量，從而保證基本上恒定的燈發(fā)光強(qiáng)度。
另外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過(guò)控制發(fā)自單個(gè)或多個(gè)光源的單色或多色光的光輻照總劑量以有效滅活間歇式反應(yīng)器中存在于生物液體中的微生物的方法，包括如下步驟
a)基于滅活生物液體中的微生物時(shí)的單色或多色光的有效輻照劑量，確定取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量、在間歇式反應(yīng)器中有效滅活微生物所需要的光輻照劑量速率和輻照時(shí)間；
b)在滅活間歇式反應(yīng)器中生物液體中的微生物期間，記錄光輻照劑量速率和輻照時(shí)間；
c)基于步驟b)的測(cè)量計(jì)算取決于吸收的輻照源光輻照總劑量；
d)將步驟c)中測(cè)得的取決于吸收的輻照源光輻照總劑量與步驟a)中得到的取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量進(jìn)行比較；和
e)一旦取決于吸收的輻照源光輻照總劑量等于或者大于取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量，則中斷對(duì)生物液體進(jìn)行曝光。
本發(fā)明的其他目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)隨著以下詳細(xì)的描述將會(huì)變得越來(lái)越明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，盡管給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例，這些詳細(xì)的描述和特定的實(shí)施例僅用于闡明本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和改進(jìn)都是顯而易見(jiàn)的。


下述附圖作為本說(shuō)明書(shū)的一部分，說(shuō)明了本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
，連同以上的概述和后面將要給出的詳細(xì)的實(shí)施例描述，可以解釋本發(fā)明的原則。為了更加完全地理解本發(fā)明，包括它的目的和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合下述附圖進(jìn)行描述以供參考。
圖1描述了吸光系數(shù)與碘化物/碘酸物濃度之間的線性相關(guān)性(參見(jiàn)實(shí)施例1)。
圖2描述了粘度的增加與聚乙烯吡咯烷酮濃度之間的非線性相關(guān)性。(參見(jiàn)實(shí)施例1)。
圖3描述了對(duì)于2.5/cm標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正曲線。(參見(jiàn)實(shí)施例1)。
圖4描述了對(duì)于4.5/cm，7.5/cm和10/cm標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正曲線。(參見(jiàn)實(shí)施例1)。
圖5描述了對(duì)于有限定的分子吸光度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及同一種溶液里加入了2g膨潤(rùn)土/L以增加懸浮粒子濁度的溶液的校正曲線。(參見(jiàn)實(shí)施例10)。
圖6描述了吸光系數(shù)與濃度之間的線性關(guān)系(參見(jiàn)實(shí)施例10)。
圖7描述了粘度與聚乙烯吡咯烷酮濃度之間的非線性關(guān)系(參見(jiàn)實(shí)施例10)。
圖8描述了吸光度隨著施用的表面劑量而增加，以及敏感性隨著碘化鉀/碘酸鉀濃度而增加(參見(jiàn)實(shí)施例10)。
圖9描述了敏感性隨著PVP而增加(參見(jiàn)實(shí)施例10)。
圖10描述了輻照燈強(qiáng)度的變化(參見(jiàn)實(shí)施例15)。
圖11描述了具有以Y軸常量表示的誤差的劑量增加(參見(jiàn)實(shí)施例15)。
圖12描述了本發(fā)明的一個(gè)示范性校正裝置(參見(jiàn)實(shí)施例17)。
圖13描述了一個(gè)裝有光強(qiáng)度傳感器和溫度傳感器的恒溫輻照燈固定裝置的橫斷面示意圖(參見(jiàn)實(shí)施例18)。
圖14描述了使用恒溫液體的管狀輻照燈恒溫設(shè)計(jì)(圖14a和14b)的橫斷面示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種滅活生物液體中微生物時(shí)，確定所用的發(fā)自一個(gè)或多個(gè)光源的單色或多色光的有效劑量的方法，包括測(cè)量單色或多色光對(duì)生物劑量溶液的影響，其中的生物滅活反應(yīng)在流通式反應(yīng)器中進(jìn)行。光照對(duì)劑量測(cè)定溶液的影響優(yōu)選通過(guò)一種方法來(lái)測(cè)定，其包括測(cè)量在所用光滅活波長(zhǎng)下單色或多色光對(duì)于與生物液體的吸光度、或與生物液體的吸光度和粘度相匹配的劑量測(cè)定溶液的影響，上述測(cè)量是基于采用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對(duì)薄層內(nèi)的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照以施加一能夠?qū)е驴蓽y(cè)量的物理量或化學(xué)量發(fā)生變化的規(guī)定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長(zhǎng)度薄到在規(guī)定時(shí)間內(nèi)只能吸收預(yù)定輻照度的入射光部分，ii)在對(duì)光輻照反應(yīng)器中劑量測(cè)定溶液輻照期間或之后，讀取與這些測(cè)到的量的變化相應(yīng)的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進(jìn)行，反之亦然。優(yōu)選的實(shí)施方式是實(shí)施例1、2和17。
微生物是指任何選自原核生物界的微生物(monera kingdom)種、原核生物界的孢子、真菌生物(fungi kingdom)中的非致病性性或微生物種、真菌生物界種的孢子、古細(xì)菌(archaea)、原核生物(prokaryotes)，特別是細(xì)菌、真核微生物(eukaryotes)、可以使這些或者類似的微生物被殺死或者減少其活性的病毒、以及噬菌體。病毒優(yōu)選細(xì)小病毒、細(xì)小鼠病毒(MMV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、牛細(xì)小病毒(BPV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、貓細(xì)小病毒(FPV)、環(huán)形病毒、圓環(huán)形病毒、小核糖核酸病毒、噬肝性病毒如甲型肝炎病毒(HAV)和腦心肌炎病毒(EMV)、Anelloviridae viruses、腸RNA病毒(Enteroviridae RNA viruses)、微小病毒DNA噬菌體、以及光滑病毒科RNA噬菌體等。優(yōu)選微生物是指脂質(zhì)包裹的單鏈或雙鏈病毒、脂質(zhì)或非脂質(zhì)包裹的病毒等。
生物液體是指任何一種天然的或人工的生物液體，包括乳、乳清和乳蛋白組分、血液或者血液的一部分、血液制品、血漿、血漿組分、血清、血液衍生液體、血漿衍生液體、血漿組分、血清衍生液體、包含蛋白質(zhì)組分的液體、脊髓和腦髓液體、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核細(xì)胞培養(yǎng)上清、真核細(xì)胞培養(yǎng)上清、原核細(xì)胞裂解液、真核細(xì)胞裂解液、或者任何以上這些液體的液體衍生物。
特別優(yōu)選本發(fā)明的生物液體是指用于內(nèi)部、外部或者皮下給藥方式具有治療作用的液體，它們?cè)诠鉁缁畈ㄩL(zhǎng)下基本上是不透明的并且對(duì)光滅活放射能量的劑量敏感。這些液體包括血液、血液制品、血漿、血漿組分、血清、以及血、血漿和血清的衍生物等。透明或澄清的液體如水、生理鹽水、林格氏(Ringer’s)乳酸鹽溶液或者葡萄糖液體可以經(jīng)受過(guò)量的輻照并且并不總是需要一個(gè)確切的光輻照劑量。
本發(fā)明的另外一種特別優(yōu)選的生物液體是化妝品液體，包括任何經(jīng)腸道的液體，它們基本上不透明，即，有光吸收或者混濁，或者在光滅活波長(zhǎng)下有光吸收或者混濁，對(duì)過(guò)量輻照劑量的光滅活輻照能敏感。透明而澄清的液體如酒精—水揮發(fā)物可以經(jīng)受過(guò)量輻照而且并不總是有一個(gè)確切的光照劑量。
本發(fā)明的另外一種特別優(yōu)選的生物液體是營(yíng)養(yǎng)液，包括任何口服或經(jīng)鼻給藥的液體，特別優(yōu)選為了營(yíng)養(yǎng)或者解渴目的的液體。它們基本上不透明，即它們有光吸收或者混濁，或者在光滅活波長(zhǎng)下有光吸收或者混濁，對(duì)過(guò)量劑量的光滅活輻照能敏感。這些液體包括乳、乳清、乳制品、乳衍生產(chǎn)品、果汁、水果衍生制品、蔬菜汁、蔬菜衍生產(chǎn)品、原生樹(shù)汁、轉(zhuǎn)基因樹(shù)汁、人工合成飲料、加工的飲料、發(fā)酵飲料以及酒精飲料等。透明液體如自來(lái)水、瓶裝礦泉水、或者添加有檸檬酸的檸檬汁、溶解在水中的二氧化碳和糖類等飲料一般要經(jīng)受過(guò)量輻照而且并不總是有一個(gè)確切的光照劑量。
本發(fā)明的再一種特別優(yōu)選的生物液體是液體診斷試劑、或者其衍生液體，即診斷試劑或者診斷試劑盒的液體，如抗體溶液或者含有抗體的溶液等。透明的診斷試劑，如蒸餾水、無(wú)機(jī)鹽緩沖液、或者凝聚前的氯化鈣溶液可以經(jīng)受過(guò)量輻照而且并不總是有一個(gè)確切的光照劑量。
本發(fā)明的生物液體優(yōu)選是這樣的生物液體它們能在病原體光滅活反應(yīng)器中沿著光程方向很大程度地輕易減弱輻照光對(duì)病原體殺滅作用。這種減弱作用要么是由于生物液體中含有分子發(fā)色基團(tuán)導(dǎo)致的，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、染料、或者來(lái)自于添加物質(zhì)如光活化劑或者光保護(hù)劑的分子發(fā)色基團(tuán)引起，要么是由于散光性和有光吸收的生物大分子引起的混濁導(dǎo)致的，要么是由于以上原因綜合引起的。這種減弱作用取決于光程的長(zhǎng)度。一種十進(jìn)制吸收系數(shù)為1/cm的液體呈0.5mm液體層時(shí)，僅僅能吸收5.5％的入射光，因而可以認(rèn)為是透明的。而在10cm深液體層時(shí)，可以吸收95.7％的入射光。優(yōu)選地，如果沿著反應(yīng)器的光程方向，任何可以使得入射光減弱達(dá)到5％以上，更優(yōu)選10％以上，進(jìn)一步優(yōu)選20％更好的生物液體，通常就需要對(duì)發(fā)明進(jìn)行化學(xué)劑量測(cè)定測(cè)定來(lái)確定有效輻照劑量。根據(jù)指數(shù)的光減弱原理，在10倍于半光程長(zhǎng)度時(shí)，光強(qiáng)遞減為開(kāi)始時(shí)的1024分之一，而該長(zhǎng)度下，光強(qiáng)減弱為起始強(qiáng)度值的50％。優(yōu)選地，用于紫外光滅活病原體的生物液體在253.7nm波長(zhǎng)下是高度不透明的，例如疫苗的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)上清(a253.7＝5/cm，d1/2＝0.06cm)、凝血酶原復(fù)合物洗脫液(a253.7＝7.5/cm，d1/2＝0.04cm)(Brummelhuis，1980)，蘋(píng)果汁(a253.7＝10/cm，d1/2＝0.03cm)或者血清(a253.7＝25/cm，d1/2＝0.012cm)。這意味著，在6mm后、優(yōu)選4mm、更優(yōu)選3mm、更優(yōu)選1.2mm后，入射紫外光的能量將被基本上完全消耗完畢，使得該生物液體變得很不透明。
生物液體可以含有天然的或者人工添加的物質(zhì)，這些物質(zhì)不會(huì)引起或抑制微生物核酸的光損傷，但通過(guò)作為活性氧自由基的淬滅劑，可以對(duì)有效成分提供一種對(duì)抗光輻照有利的保護(hù)作用，其中特別是顯著對(duì)抗紫外光輻照，例如蘆丁所含類黃酮(Erdmann，1956)、維他命如抗壞血栓(Erdmann 1956)、肌酸酐(JP 11286453-A)。但是，如果這些添加劑在使用的波長(zhǎng)處增加了附加的吸光度，同時(shí)沒(méi)有對(duì)施用的這一附加光吸收的光強(qiáng)進(jìn)行補(bǔ)償?shù)脑挘赡苤挥泻苌俚牟≡w殺滅光能可以實(shí)際到達(dá)微生物。因此，要求的足夠滅活微生物的紫外光或者可見(jiàn)光劑量強(qiáng)度必須不能過(guò)量，并且一定要盡可能計(jì)算精確，地如同實(shí)施例1、2、11、12和15到17的描述。
光、單色光、或者多色光是指電磁波形式的能量，優(yōu)選波長(zhǎng)和頻率在紫外或者可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，用于滅活微生物的光化學(xué)方法包括使用以下光波輻照
波長(zhǎng)為200到280nm范圍內(nèi)的UV-C區(qū)域的短波長(zhǎng)紫外光，優(yōu)選接近核酸最敏感的有殺菌作用的265nm波長(zhǎng)；
波長(zhǎng)范圍在約280到約320nm之間的UV-B區(qū)的中波長(zhǎng)紫外光；
波長(zhǎng)范圍在約320到約400nm之間的UV-A區(qū)的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光，或者在有至少一種天然或人工添加的光增敏劑存在的情況下，波長(zhǎng)范圍在約400到約700nm之間的可見(jiàn)光；
脈沖單色相干光或非相干光，或者前面提到波長(zhǎng)范圍內(nèi)的脈沖寬譜光，優(yōu)選是連續(xù)發(fā)射的光。
根據(jù)一種用于確定滅活生物液體中微生物的有效光輻照劑量的方法的優(yōu)選具體實(shí)施方式
，沿著光程長(zhǎng)度，大約有100％，更優(yōu)選80％，更優(yōu)選60％，更優(yōu)選50％，更優(yōu)選30％或者以下的入射光輻照被吸收掉。
被生物液體吸收的光數(shù)量是通過(guò)限定的波長(zhǎng)1和通常為1cm的光程長(zhǎng)度d下的透光率和吸光度表示的。從不能超過(guò)100％的透光率T出發(fā)，由公式A＝-log10T計(jì)算出十進(jìn)制吸光率A，對(duì)于d＝1cm，A就變成十進(jìn)制吸光系數(shù)al，單位為1/cm。對(duì)于大多數(shù)264nm波長(zhǎng)附近的殺菌短波紫外光，光的吸收可以降低最大穿透深度至小于1mm。
根據(jù)本發(fā)明的方法和反應(yīng)器，使用的光源通常為管狀的金屬氣體蒸汽放電燈。低壓金屬蒸汽燈，由于僅僅產(chǎn)生適度的熱量，適用于對(duì)熱敏感的生物液體，其特別是對(duì)過(guò)量的熱量敏感。從這種燈發(fā)出的光線最好為單色的，如，在低壓鈉蒸汽燈發(fā)出589nm的橘色光；低壓汞蒸汽燈發(fā)出的253.7nmUV-C區(qū)光。后一種輻照燈可以在內(nèi)層涂上一層磷，以獲得白色熒光，光化藍(lán)+UV-A，黑光UV-A，或者UV-B的寬譜或者窄譜發(fā)射光譜。其他適用本發(fā)明的殺滅病原體的光源有中壓和高壓金屬蒸汽燈，閃爍放電燈，潛水式電弧，激光，激發(fā)態(tài)燈，發(fā)光二極管，白熾燈，等等。
分光光度計(jì)測(cè)量的生物液體的總吸收在模糊云狀或者添加混濁液體而混濁情況下可以包括因分子發(fā)色團(tuán)而產(chǎn)生的分子吸收，即由于膠體樣分散的大分子和懸浮顆粒而成光散射和減弱。對(duì)于有懸浮顆粒(例如細(xì)胞碎片)吸光溶液例如沒(méi)有經(jīng)過(guò)過(guò)濾的混濁的果汁而言，濁度可以這樣求得未經(jīng)過(guò)濾的果汁的吸光率減去過(guò)濾澄清的果汁的吸光率(參見(jiàn)實(shí)施例10)。
光增敏劑是可以與微生物直接發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)，如補(bǔ)骨脂素及其衍生物；或者光增敏劑也可以從存在于溶液的另一種成分產(chǎn)生的反應(yīng)性分子，如來(lái)自于溶解氧的單原子態(tài)氧或者來(lái)自于溶劑化的電子。后一種光增敏劑包括吩噻嗪染料、吖啶、黃素、紫質(zhì)以及酞菁。
微生物對(duì)于光照的敏感性取決于它的基因組大小、它的核酸類型以及它修復(fù)光損傷的能力?？偟膩?lái)說(shuō)，真菌和細(xì)菌的孢子以及真核細(xì)胞對(duì)光的抗性最強(qiáng)，病毒的抗性稍弱，植物細(xì)菌抗性最強(qiáng)。將微生物的活性減少到所要求的水平所需要的光通量，對(duì)于不同的微生物來(lái)說(shuō)，是不同的。光通量是指射入一個(gè)區(qū)域的光能，如，在暴露于光照過(guò)程中的一個(gè)微生物的橫斷面，該橫斷面僅僅吸收利用該光能一部分(Bolton，1999)。名詞光輻照劑量(light dose)也經(jīng)常作為光通量(fluence)的另外一種叫法。
在一個(gè)非吸光性的懸浮液中，在已知的光通量速率下(單位面積上的光通量)，如果微生物被輻照一定的時(shí)間，那么施加在微生物上的光輻照劑量可以被計(jì)算出來(lái)，隨劑量的滅活速率也可以被確定(Bolton & Linden，2003)。已有多種微生物的滅活速率常數(shù)已經(jīng)被確定，其中一些微生物作為標(biāo)志微生物被用來(lái)顯示一個(gè)光化學(xué)處理過(guò)程的效率。
然而生物液體可以同時(shí)伴隨有一些可以吸收光的物質(zhì)或者可以散射殺滅病原體作用的光的顆粒，如蛋白質(zhì)、維生素、酚類化合物，或者脂質(zhì)體和細(xì)胞碎片。大多數(shù)的入射光被這些伴隨的物質(zhì)所消耗或者被這些顆粒所阻擋，僅僅一部分入射光實(shí)際到達(dá)靶微生物而發(fā)揮效果。因此，在這類生物液中將同一種微生物的滅活到所要求的水平所需要的光輻照時(shí)間，大于在非吸收性液體懸浮液中同樣的微生物滅活所需要的時(shí)間，本發(fā)明的也考慮了這一點(diǎn)。
很多種天然篩選的化合物都可以保護(hù)生物體免受到高能量光輻照的有害作用。然而，它們不僅通過(guò)捕獲或者淬滅光作用產(chǎn)生的自由基或激發(fā)分子，也可以僅僅通過(guò)吸收光中具有光生物活性頻率部分的光。將這類保護(hù)性添加劑，例如活性氧類淬滅劑比如類黃酮和微生素C，添加到根據(jù)本發(fā)明的透明或者吸光性生物液體中，如果這些添加劑在殺菌的波長(zhǎng)下有光吸收，那么將導(dǎo)致附加的光吸收和減少的光穿透。將0.1％或者0.5％的維生素C添加到蘋(píng)果汁中，在Hanovia Bio-Steritron燈的輻照下，在平面的0.2mm深流通式比色杯中，較之沒(méi)有添加劑的蘋(píng)果汁，隨滯留時(shí)間的微生物滅活速率從50％下降到20％(Mack等，1959)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，有效輻照量通過(guò)化學(xué)劑量法測(cè)量。劑量測(cè)定溶液是指用在一定波長(zhǎng)下發(fā)生實(shí)質(zhì)性光化學(xué)反應(yīng)的試劑配置而成的待測(cè)溶液，產(chǎn)生的光化學(xué)產(chǎn)物可以被測(cè)量。光化學(xué)產(chǎn)物可在薄層中以和溶液的吸光系數(shù)相當(dāng)?shù)撵`敏度被測(cè)量，因此在這一薄層，僅僅一小部分的入射輻照被吸收，因?yàn)檩椪赵诒拥囊欢▍^(qū)域的光能通過(guò)實(shí)際上沒(méi)有吸收的薄層，從而使得光通量能得到確定。優(yōu)選的實(shí)施方式參見(jiàn)實(shí)施例1～6、10～13以及15～17。
已知有許多化學(xué)感光計(jì)足以應(yīng)用于本發(fā)明。例如，從一組堿金屬鹽、堿土金屬鹽、碘化銨和尿苷磷酸鹽水溶液中，可以選出能用來(lái)作為紫外光C的輻照的劑量測(cè)定溶液。
本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是，提供了一種評(píng)價(jià)光滅活微生物裝置的方法，這一方法使得在輻照波長(zhǎng)下，使得劑量測(cè)定溶液具有預(yù)定的光吸收；或者更優(yōu)選在輻照波長(zhǎng)下，使得劑量測(cè)定溶液具有預(yù)定的光吸收和預(yù)定的粘度，這種光吸收和粘度可以與在滅活微生物過(guò)程中將要被輻照的生物液體的吸光度相匹配或者同時(shí)與其吸光度和粘度相匹配。
許多特別適于濃縮的紫外光C敏感的化學(xué)劑量測(cè)定劑，即高吸光性的生物液體可以與本發(fā)明一起使用。例如，稀釋的碘化鉀/碘酸鉀感光計(jì)優(yōu)選但不限于含有大于或等于6.69mM的KI和大于等于1.16mM的KIO3，具有和這類生物液體吸光度相應(yīng)的高吸光度，例如但不限于a253.7為2/cm、高光量子產(chǎn)率和三碘化物的高比消光系數(shù)。這種劑量測(cè)定溶液可以用相應(yīng)濃度的KI和KIO3來(lái)配制，以便于優(yōu)選但不限于吸光系數(shù)a253.7至少為2/cm)的生物液體相匹配，它能用于薄層吸收池，其光程長(zhǎng)度可為大約0.1到1mm，優(yōu)選約為0.1到0.7mm，更優(yōu)選約為0.1到0.5mm，更優(yōu)選約為0.1到0.3mm，更優(yōu)選約為0.3到1mm，更優(yōu)選約為0.5到1mm，更優(yōu)選約為0.7到1mm。通過(guò)添加已知能穩(wěn)定三碘化物的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可以增加碘化物/碘酸鹽溶液的敏感性，并且蛋白溶液的粘度可以達(dá)到很大的精確度。
另一種優(yōu)選的特別適合稀釋的紫外光C敏感的化學(xué)劑量測(cè)定劑，即低吸光性生物溶液是苯甲酸鈉感光計(jì)，這種感光計(jì)可以在薄層熒光小室中對(duì)光反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，并且這種感光計(jì)可以但不限于稀釋到與如下吸光系數(shù)a253.7相匹配約0.1/cm到大約2/cm更優(yōu)選約0.4/cm到2/cm；更優(yōu)選約0.8/cm到2/cm；更優(yōu)選約1.2/cm到2/cm；更優(yōu)選約1.6/cm到2/c，其中對(duì)于薄層熒光比色杯而言，優(yōu)選但不限于其光程長(zhǎng)度為至少1×10mm。
另外一種更優(yōu)選的而且特別適合極度稀釋的紫外光C敏感的化學(xué)劑量測(cè)定劑，即始終為非吸光性的生物溶液是過(guò)二硫酸鉀/叔丁醇感光計(jì)，優(yōu)選這種感光計(jì)可以但不限于稀釋到與a253.7為0.5/cm的吸光度相匹配。這種劑量測(cè)定溶液更優(yōu)選但不限于適用光程長(zhǎng)度為0.5到1cm的吸收池，更優(yōu)選0.7到1cm的吸收池。光反應(yīng)產(chǎn)物和氫離子可以用插入一個(gè)小型的pH電極的pH計(jì)來(lái)進(jìn)行測(cè)量。
在本發(fā)明的一個(gè)經(jīng)優(yōu)選實(shí)施方式中，劑量測(cè)定溶液可以包含從下列中選取的試劑或試劑組合碘化堿金屬鹽、碘化堿土金屬鹽、碘化銨、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸堿金屬鹽、苯甲酸堿土金屬鹽，苯甲酸銨、過(guò)二硫酸堿金屬鹽、過(guò)二硫酸堿土金屬鹽、過(guò)二硫酸銨、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨潤(rùn)土(bentonite)、云母、蒙脫石(montmorillonite)、囊脫石(nontronite)、鋰榮脫石(Hectorite)、高嶺石、多水高嶺石、地開(kāi)石、粘土礦物、白堊、硅石、煅制二氧化硅、重晶石、石膏、滑石、氧化鎂、氧化鋁、氯氧化鉍、氧化鋅、硫酸堿土金屬鹽、碳酸堿土鹽、磷酸堿土鹽、羥基磷酸堿土鹽、鹵代磷酸堿土鹽、不溶性硅酸鹽、不溶性硅酸鋁鹽、不溶性碳酸鹽、不溶性硫酸鹽、不溶性磷酸鹽、不溶性羥基磷酸鹽、鹵代磷酸鹽、全氟烴或其衍生物、全氟醋酸或其鹽、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
更優(yōu)選劑量測(cè)定劑溶液可以包含稀釋的碘化鉀/碘酸鉀感光計(jì)、稀釋的碘化鉀/碘酸鉀/多聚吡咯烷酮感光計(jì)；優(yōu)選在光滅活反應(yīng)發(fā)生的光波長(zhǎng)下，劑量測(cè)定劑溶液吸光度應(yīng)該和生物液體的吸光度相匹配，或者劑量測(cè)定劑溶液的吸光度和粘度與生物液體的相匹配。
如果可能增加總吸收率的生物液體的濁度必須大于不含有限制性金屬礦物的可增加濁度的添加物，這類限制性金屬礦物包括膨潤(rùn)土、蒙脫石、云母、蒙脫石、囊脫石、鋰榮脫石、高嶺石、多水高嶺石、地開(kāi)石、其他粘土礦物、硅石、煅制二氧化硅、白堊、石膏、重晶石等；或者多聚物如聚乙烯聚吡咯烷酮(PPVP)也可以添加到稀釋的或者吸光度/粘度相匹配的碘化—碘酸鉀—聚乙烯吡咯烷酮感光計(jì)中，或者添加到其他合適的感光計(jì)中。更優(yōu)選劑量測(cè)定溶液可以含有稀釋的苯甲酸鈉感光計(jì)。更優(yōu)選劑量測(cè)定溶液也可以含有稀釋的吸光度相匹配的硫代硫酸鉀/叔丁醇感光計(jì)。
劑量測(cè)定試劑是一些過(guò)量存在的溶解的小分子，它可以很容易地?cái)U(kuò)散到被輻照區(qū)域。因此，入射光子將把這些劑量測(cè)定試劑轉(zhuǎn)化成光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物。輻照燈在幾乎恒定的強(qiáng)度下工作時(shí)，相同多的光子將照射反應(yīng)容積，相同多的光子將在特定時(shí)間間隔施加幾乎相同的有效輻照劑量(mJ/cm2)，產(chǎn)生一定的化學(xué)劑量速率((mJ/cm2)/min)。通過(guò)控制總的燈光輻照劑量可以大致考慮燈的輻照強(qiáng)度。對(duì)于含有噬菌體或者病毒的蛋白質(zhì)溶液而言，輻照劑量最好能和一個(gè)給定的吸光度和粘度一致。
生物樣品溶液的的十進(jìn)制吸光系數(shù)可以在一個(gè)比色杯中(用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，比色杯厚度薄到保持溶液的光吸收率在儀器的測(cè)量范圍之內(nèi)。吸光系數(shù)可以這樣計(jì)算儀器測(cè)得的吸光度除以光程的長(zhǎng)度(一般以厘米cm計(jì))；Napierian吸光系數(shù)這樣計(jì)算十進(jìn)制吸光系數(shù)的Log值即為Napierian吸光系數(shù)。
粘度可以用毛細(xì)管粘度計(jì)測(cè)量流動(dòng)時(shí)間來(lái)確定粘度計(jì)上的結(jié)果乘以本技術(shù)領(lǐng)域通常已知的毛細(xì)管粘度計(jì)常數(shù)。
一般來(lái)說(shuō)，使用的薄層比色杯的光程長(zhǎng)度要和稀釋后的光輻照溶液相配，而且優(yōu)選要小，這樣比色杯僅僅吸收一小部分的入射光。
在這樣的薄層中，用有部分吸收的稀釋的光輻照溶液進(jìn)行校正，可以盡可能精確地計(jì)算出光通量。例如，0.02cm比色杯中a253.7＝15/cm下的光通量為27.3％，0.1cm比色杯中a253.7＝2/cm下的光通量為19.9％。這表示，通過(guò)光程后的入射光輻照的有效輻照劑量分別72.7％和80.1％(Morowitz，1950)。因此，Morowit校正因子對(duì)于第一個(gè)比色杯為72.7％，對(duì)于第二個(gè)為80.1％。這樣可以計(jì)算和校正自吸收誤差。為了達(dá)到準(zhǔn)確的校正，建議一般應(yīng)使用低于50％的Morowitz校正因子，這就意味著比色杯的光程長(zhǎng)度不會(huì)超過(guò)入射光強(qiáng)衰減為起始值25％時(shí)的距離。
為了得出劑量測(cè)定校正曲線，例如可以用電子輻射計(jì)、光譜輻射計(jì)、或者帶有濃縮和完全吸收的感光計(jì)溶液的化學(xué)光輻照方法，對(duì)已知輻照光源進(jìn)行測(cè)量。在確定來(lái)自光源的入射輻照后，對(duì)含有稀釋的吸光度匹配的或者吸光度和粘度匹配的劑量測(cè)定溶液的比色杯，以一定的方位和一定的時(shí)間，以及一定的表面劑量進(jìn)行輻照，得到的光輻照信號(hào)相對(duì)于光的輻照劑量畫(huà)一曲線，即為校正曲線。
例如可以這樣進(jìn)行校正用一個(gè)輻照燈、一個(gè)在光程長(zhǎng)度之內(nèi)用于將比色杯曝光限定的曝光時(shí)間的光閥，將比色杯和輻照燈平行安置于光路經(jīng)的末端。這種光閥通常用作諸如照相機(jī)的膠片—影像平面光快門(mén)，這種光閥機(jī)構(gòu)通過(guò)類似鐘表的機(jī)械裝置進(jìn)行精確控制，或者更優(yōu)選通過(guò)一個(gè)電子振蕩源進(jìn)行控制。振蕩源驅(qū)動(dòng)的光閥和位置固定的比色杯確保了重復(fù)性和對(duì)比色杯進(jìn)行精確的輻照。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，可以對(duì)商品35mm或者中等規(guī)格的膠片單鏡頭反光相機(jī)或者旁軸取景相機(jī)進(jìn)行一定的改進(jìn)，通過(guò)將輻照燈固定裝置附著于相機(jī)鏡頭座，將比色杯附加安放入相機(jī)背面的一個(gè)孔徑中。優(yōu)選相機(jī)背面的孔應(yīng)當(dāng)具有一定的直徑，以使比色杯的整個(gè)表面都能夠得到光輻照，而孔徑的邊緣則可以作為一個(gè)部分瞄準(zhǔn)器。為了提高燈光強(qiáng)度的穩(wěn)定性和輻照光量子產(chǎn)率，可以用諸如風(fēng)扇，環(huán)形流動(dòng)液體或者Peltier元件等的裝置使得輻照燈和比色杯凹槽的溫度保持恒定。
校正裝置可以優(yōu)選包含下述器件一個(gè)光源，一個(gè)光線出口孔，以便光線能夠輻射進(jìn)入光瞄準(zhǔn)器孔，一個(gè)光閥，以及安置在恒溫具有光入射孔的倉(cāng)室內(nèi)的比色杯槽，以便光線輻照入比色杯或者是含有劑量測(cè)定溶液的光學(xué)小池中。對(duì)于輻射計(jì)傳感器裝置，可以提供一個(gè)較好的恒溫座架，以便從光源發(fā)出的光線能夠通過(guò)光閥進(jìn)入比色杯的同時(shí)，還能通過(guò)相機(jī)背部的孔徑進(jìn)入該傳感器的入射窗口，這樣就能夠用這種校正方法對(duì)光源進(jìn)行監(jiān)控，或者能夠?qū)@樣的傳感器進(jìn)行隨時(shí)間而保持不變的那些性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，即通過(guò)對(duì)同時(shí)被曝光的比色杯或者光學(xué)小池中含有的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)感光計(jì)溶液進(jìn)行比對(duì)而進(jìn)行檢測(cè)。特別優(yōu)選光閥由一個(gè)精確的定時(shí)器驅(qū)動(dòng)以獲得精確的可重復(fù)的比色杯或者光學(xué)小池曝光時(shí)間。圖12顯示了一種優(yōu)選的校正設(shè)備。安裝在一個(gè)倉(cāng)室(U)中的優(yōu)選管形輻照燈(T)優(yōu)選恒溫或者恒流，特別優(yōu)選既恒溫又恒流，以確保在整個(gè)校正過(guò)程中光輻照保持不變。如圖12所示，可以通過(guò)一種透光性液體流經(jīng)輻照燈而實(shí)現(xiàn)恒溫。箭頭所標(biāo)示的光線從輻照燈發(fā)出后，通過(guò)孔(V)以及其開(kāi)關(guān)時(shí)間受到控制的開(kāi)放光閥輻照到比色杯上，如果該比色杯比比色杯室(holder)的最大空間更薄，其連同距離調(diào)節(jié)器一起插入到最好是恒溫的比色杯室(X)內(nèi)。在光閥打開(kāi)期間，比色杯中的光輻照溶液或者標(biāo)準(zhǔn)劑量測(cè)定溶液就可以受到精確的光輻照。一個(gè)可選的孔(Y)位于和孔(X)不同的位置，最好能夠空間相似，使得同時(shí)有部分光線從輻照燈射入孔徑X和孔徑Y(jié)?？?Y)也可以設(shè)計(jì)為帶有一個(gè)電子傳感器(Z)，例如優(yōu)選但不限于在反應(yīng)器輻射器中用到的一個(gè)傳感器，這樣基于比色杯室(X)中光輻照方法和使用傳感器(Z)的輻照測(cè)量方法同時(shí)測(cè)到的光強(qiáng)度的比值，提供一種可以對(duì)傳感器進(jìn)行重新校正的精確方法。傳感器(Z)也可以用于監(jiān)控和記錄校正曝光期間燈光的曝光強(qiáng)度，以便于下一步中如果輻照燈強(qiáng)度發(fā)生改變的時(shí)候，用于對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行糾正。在實(shí)施例17中描述的這樣一種校正裝置的用途，并且通過(guò)在輻照燈固定裝置處安裝一個(gè)輻射計(jì)傳感器用座架，可以用來(lái)對(duì)輻射計(jì)傳感器進(jìn)行檢查和重新校正，這樣從輻照燈發(fā)出的光線可以被感光計(jì)比色杯和輻射計(jì)傳感器同時(shí)測(cè)得。
根據(jù)一個(gè)確定滅活生物液體中微生物所需光輻照有效劑量的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，規(guī)定通量可以通過(guò)改變規(guī)定輻照度和/或通過(guò)改變規(guī)定時(shí)間來(lái)改變，所述規(guī)定時(shí)間由流通式反應(yīng)器中生物液體的流速確定。因?yàn)槲⑸飳?duì)于輻照滅活的敏感性也是所用的光的波長(zhǎng)或者波長(zhǎng)譜段的函數(shù)，因此特定的光通量也可以通過(guò)改變發(fā)出的光的波長(zhǎng)或者波長(zhǎng)的譜段進(jìn)行調(diào)整。
為了實(shí)現(xiàn)較高的流量，前面提到的薄層輻照器的制造商Wedeco Visa AG公司推薦通過(guò)將多個(gè)輻射器串聯(lián)或并聯(lián)在一起，以增加流經(jīng)容量。較低的流速下可以通過(guò)增加滯留時(shí)間而增加輻照劑量，或者在基本上恒定的流速下通過(guò)增加聯(lián)在一起的輻射器的個(gè)數(shù)而增加輻照劑量。為了改進(jìn)溶液流動(dòng)性質(zhì)，可以將一個(gè)螺旋形流動(dòng)引導(dǎo)管插入到環(huán)形間隙中(Harrington& Hills，1968)。在美國(guó)專利6,586,172中，對(duì)于處理血液制品的設(shè)備，采用了擋板靜止混合方式，這種設(shè)備用到了輔助的空氣流冷卻裝置來(lái)移去來(lái)自紫外輻照燈的熱量。
在這一方面，一種更為有效的具有更高混合度的方法可以使滯留時(shí)間的分布變得狹窄，并增加滅活率。例如，這種更高程度的混合可以通過(guò)這樣但不限于此的方式實(shí)現(xiàn)如同用擋板穩(wěn)定地施加影響，在縱向流動(dòng)的液體上施加橫向流，或者通過(guò)動(dòng)力學(xué)原理產(chǎn)生泰勒渦流或者迪恩渦流。
為了測(cè)量光輻照有效劑量，例如，在輻照裝置中對(duì)與待測(cè)樣品體積相同的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照，在特定時(shí)間取出一小部分劑量測(cè)定試樣溶液置于薄層比色杯中，對(duì)光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)量。記錄下從所用輻照的劑量測(cè)定溶液得到的信號(hào)，并與相應(yīng)的校正曲線進(jìn)行比較。從校正曲線上可以讀出輻照劑量值。作為選擇之一，至少有一種用于在反應(yīng)器中測(cè)量光輻照有效劑量的手段。對(duì)流通式反應(yīng)器來(lái)說(shuō)，這些手段可以在輻照滅活區(qū)域之前或之后安裝。
可以用一種非常簡(jiǎn)單的UV-C流通式反應(yīng)器，例如將一個(gè)螺旋盤(pán)繞的紫外透射管包繞在發(fā)光低壓汞蒸汽燈上的反應(yīng)器，通過(guò)用吸光度和粘度匹配的、或者吸光度和濁度及粘度匹配的化學(xué)劑量測(cè)定法，對(duì)UV-C輻照裝置進(jìn)行試驗(yàn)性校正。
帶有光輻照溶液的劑量測(cè)定化學(xué)方法能夠測(cè)量薄層比色杯中裝的樣品體積上施用的平均光輻照劑量(光通量)。光化學(xué)反應(yīng)物通常要過(guò)量存在，任何局部過(guò)量的光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物都要充分混合并稀釋，反應(yīng)產(chǎn)物的濃度隨輻照所施加的光量子數(shù)的增加而增加，呈良好的線性相關(guān)性。
一般來(lái)說(shuō)，同樣數(shù)目的光量子數(shù)可以滅活每單位體積或每升液體中殘存的同樣多的活性微生物，滴度在log對(duì)數(shù)上的減少呈線性。而且，局部的過(guò)量光輻照強(qiáng)度并不能將有活性微生物的數(shù)目減少到小于零，不過(guò)局部不足的光輻照劑量卻會(huì)導(dǎo)致樣品中活性微生物的殘留。
為了確定輻照劑量，優(yōu)選該方法還進(jìn)一步包括在監(jiān)測(cè)輻照過(guò)程中一個(gè)或者多個(gè)光源的強(qiáng)度的方法。更優(yōu)選所用的光源在紫外光區(qū)，最好在紫外光C區(qū)。對(duì)于流通式反應(yīng)器，對(duì)光源進(jìn)行輻照劑量的監(jiān)測(cè)是一種通常的做法。輻照燈的功率可以得到持續(xù)性地監(jiān)測(cè)，同時(shí)對(duì)信號(hào)進(jìn)行顯示或者記錄。有利的是，待處理的液體沒(méi)有阻擋光源和劑量測(cè)定傳感器之間的光程，所以液體并沒(méi)有減弱光照強(qiáng)度。如果確實(shí)由于設(shè)計(jì)上的限制而無(wú)法避免這種光強(qiáng)度上的減弱，那么最好在對(duì)液體進(jìn)行輻照之前和之后，應(yīng)當(dāng)對(duì)燈光強(qiáng)度的減弱進(jìn)行測(cè)量，以便于計(jì)算出平均的輻照強(qiáng)度。
為了得出劑量測(cè)定校正曲線，將化學(xué)劑量測(cè)定溶液分布于確定厚度的薄膜層上，這樣溶液就只吸收一小部分入射光。然后將薄膜層置于一定的光輻照劑量中照射，溶液發(fā)生一系列實(shí)質(zhì)性的可量化的化學(xué)變化，將其中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生光吸收或在特定的波長(zhǎng)處發(fā)出熒光，或造成pH值的上升等。對(duì)這些光輻照信號(hào)進(jìn)行測(cè)量并以此信號(hào)值對(duì)光輻照劑量作圖。
在混合的批量體積內(nèi)，對(duì)相應(yīng)的溶液進(jìn)行輻照，抽出一定體積并對(duì)光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)量。從受到輻照的劑量測(cè)定溶液得到的信號(hào)被記錄下來(lái)并與相應(yīng)的校正曲線進(jìn)行比較。從而可以得到和劑量測(cè)定校正曲線上信號(hào)增加相對(duì)應(yīng)的有效輻照劑量。將輻照劑量的增加除以輻照時(shí)間單位，得出輻照劑量速率。有效輻照劑量如上面所定義。
劑量測(cè)定溶液和目標(biāo)蛋白溶液類似，因?yàn)樵谔囟ǖ牟ㄩL(zhǎng)下劑量測(cè)定溶液具有和蛋白質(zhì)溶液相同的吸光度，并且優(yōu)選還有相同的粘度?？梢杂糜行У腢V劑量對(duì)光化學(xué)反應(yīng)中的化學(xué)物質(zhì)例如三碘化物的轉(zhuǎn)化的測(cè)量進(jìn)行糾正?；瘜W(xué)劑量測(cè)定法保證了具有不同吸光度的蛋白質(zhì)溶液可以接收到相同的有效UV劑量。具體細(xì)節(jié)請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例1～56。
根據(jù)在滅活生物液體中微生物時(shí)確定光有效輻照劑量的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，該方法進(jìn)一步還包括有，在對(duì)輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進(jìn)行輻照之前和之后、或者之前、期間和之后，通過(guò)滴定存活微生物的數(shù)量來(lái)確定劑量分布。在另一個(gè)實(shí)施方式中，生物學(xué)上有效的光輻照劑量(光通量)可以通過(guò)生物劑量測(cè)定方法來(lái)確定，這是指通過(guò)對(duì)微生物的光滅活進(jìn)行確定。生物劑量測(cè)定可以通過(guò)流通式或者間歇式反應(yīng)器裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且這一方法已經(jīng)被用來(lái)作為測(cè)量滯留時(shí)間分布(Qualls & Johnson，1983)以及光輻照劑量分布(Cabaj & Sommer，2000)的常規(guī)方法。優(yōu)選的實(shí)施方式參見(jiàn)實(shí)施例3至6，以及12至17。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物劑量測(cè)定方法可以和化學(xué)劑量測(cè)定法聯(lián)合使用來(lái)確定混合效率(參見(jiàn)實(shí)施例3到6，以及12到17)。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的生物液體中可以包含選自如下微生物種類原核生物界、原核生物界的孢子、真菌界的非致病性細(xì)菌或微生物、真菌界的孢子、原蟲(chóng)類、原核細(xì)胞、細(xì)菌、真核細(xì)胞、病毒等，以確保這些或者類似的微生物可以被殺滅或者降低活性，以及噬菌體。
優(yōu)選病毒選自如下病毒種類微小病毒(Parvoviridae viruses)、微小鼠病毒(MinuteMurine Virus，MMV)、犬微小病毒(Canine Parvovirus，CPV)、牛微小病毒(Bovine Parvovirus，BPV)、豬微小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)、貓微小病毒(Feline Parvovirus，F(xiàn)PV)、環(huán)形病毒(Circoviridae Viruses)、圓環(huán)形病毒(Circinoviridae Viruses)、微小RNA病毒(Picornaviridae viruses)，優(yōu)選噬肝性病毒甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)和腦脊髓炎病毒(Encephalomyocarditis Virus，EMC)、阿內(nèi)羅病毒(Anelloviridae Viruse)、腸道RNA病毒(Enteroviridae RNA viruses)、微小病毒DNA噬菌體(Microviridae DNA bacteriophages)，以及光滑病毒RNA噬菌體(Leviviridae RNA bacteriophages)。
為了確保在進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的光滅活處理過(guò)程中，生物液體中的有效生物成分如蛋白質(zhì)或其他重要成分得到良好保存，可以用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)常用的功能分析對(duì)其中的蛋白質(zhì)或維生素的生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定，例如實(shí)施例4中描述的彈性蛋白酶抑制分析，或者實(shí)施例13和16中描述的酰胺水解FX反應(yīng)等。這些活性分析物最好也能包含在劑量測(cè)定溶液中。優(yōu)選地，可以對(duì)劑量測(cè)定溶液的吸光度、粘度或者濁度進(jìn)行調(diào)整，以使得加有活性分析物的劑量測(cè)定溶液的吸光度、粘度或者濁度與將活性分析物加入后測(cè)試的生物液體的吸光度、粘度或者濁度相匹配。這種測(cè)定方法可以確保，在有效滅活污染性微生物的同時(shí)，生物液體和/或其中的有效組分仍然保持其生物活性。
微生物，例如噬菌體、病毒和細(xì)菌最好能在存活能力上表現(xiàn)出呈指數(shù)減少。這意味著，一個(gè)給定的輻照劑量能夠滅活同樣數(shù)量的存活的微生物，例如，如果1mJ/cm2將微生物的滴度滅活到開(kāi)始時(shí)的1/10，那么2mJ/cm2應(yīng)當(dāng)能夠滅活到開(kāi)始時(shí)的1/100，3mJ/cm2可以滅活到1/1000，如此類推。如果通過(guò)使所有的微生物僅僅通過(guò)輻射區(qū)一次以保證所有的微生物得到同等的輻照，那么所有的微生物受到一個(gè)滅活擊(inactivatinghit)。然而，和蛋白質(zhì)相比，即便是最小的微生物，如單鏈DNA噬菌體，也可以看作大顆粒(～25nm)，從而在蛋白溶液對(duì)流和流動(dòng)的過(guò)程中被除去。在一個(gè)反應(yīng)器中，有些微生物在一個(gè)特定的時(shí)間間隔內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)到輻照區(qū)域多次，而其他的微生物僅僅一次，有些可能從沒(méi)有被轉(zhuǎn)運(yùn)到過(guò)輻射區(qū)。因此，基于化學(xué)方法確定的劑量速率的滅活速率(隨著溶液的混合而增加。因此，滅活微生物的過(guò)程進(jìn)行得越快，那么需要得輻照時(shí)間就越短，需要的有效輻照劑量也就越小。因此，可以通過(guò)較高的攪拌效率，來(lái)保存生物液體中的蛋白質(zhì)或者其他生物活性。
在紫外輻照之前、期間和/或或之后，對(duì)在輻照之前或期間、或者之前與期間摻合了存活微生物的生物液體的微生物滴度進(jìn)行測(cè)定，即測(cè)量生物劑量學(xué)滅活性。例如，這一過(guò)程可以通過(guò)計(jì)數(shù)殘留的活細(xì)菌的菌落數(shù)目，或者被裂解的細(xì)菌斑的數(shù)目來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中細(xì)菌斑數(shù)目對(duì)應(yīng)于仍然存活的噬菌體的數(shù)目。以菌落形成單位(cfu)或者斑點(diǎn)形成單位(pfu)表示的存活微生物的滴度，隨后可以計(jì)算為培養(yǎng)皿上每毫升稀釋樣品體積的log10(cfu×10稀釋因子)/mL或log10(pfu×10稀釋因子)/mL。
經(jīng)生物劑量測(cè)定驗(yàn)證，當(dāng)噬菌體滅活速率(其表示為log[滅活的數(shù)目]/紫外光有效劑量)相似或者基本上相等時(shí)，在相同的混合效率下用幾乎相同的有效輻照劑量對(duì)不同的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行輻照。如果樣品中不含任何對(duì)微生物或其宿主有害的或有抑制性作用的成分，那么生物劑量測(cè)定特別適合于驗(yàn)證不同的樣品。同樣地，生物劑量測(cè)定幾乎可以適用于任何生物液體。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，生物劑量測(cè)定用上面提到的方法得到了應(yīng)用。
例如，生物液體可以在薄膜或者橫向混合管形反應(yīng)器中接收輻照。如果光線沒(méi)有直接輻射到液體表面，那么光輻照滅活區(qū)里含液體管道的材料必須在所用的滅活光的波長(zhǎng)下是基本上透明的。對(duì)于小于350nm的紫外光，硼硅玻璃可以認(rèn)為是透光的；對(duì)于小于300nm的紫外光，其他特殊玻璃如無(wú)鐵硼硅玻璃、磷酸鹽玻璃、高硅玻璃，或者熔融石英玻璃可以認(rèn)為是足夠透光的，以及其他特殊的塑料如氟聚合物也特別適用。許多微生物光滅活反應(yīng)器可以這樣設(shè)計(jì)，以便在不同的流速下處理不同的不透明液體。這些液體可以含有至少一種添加劑以減少液體中有效成分的破壞和喪失。
在本發(fā)明的測(cè)定有效輻照劑量的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法可以和至少一種其他的滅菌或者微生物滅活方法聯(lián)合起來(lái)使用。已知有多種滅活、滅菌、消毒或者保存方法，例如有但不限于熱法或者非熱法，或者添加化學(xué)防腐劑等。不同種類的微生物對(duì)不同的處理方法有不同的敏感性，因此，用不同類型滅菌方法的組合來(lái)確保對(duì)不同的病毒進(jìn)行滅活通常是很必要的。本發(fā)明中，輻照處理的一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)是，特定類型的對(duì)其他常采用的處理方法有抗性的病毒對(duì)這種輻照方法敏感。
在另外一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明中用來(lái)確定有效輻照劑量的方法，連同其他已知用于對(duì)生物液體進(jìn)行滅菌或滅病毒的方法被聯(lián)合使用。在本技術(shù)領(lǐng)域已知有多種方法，如傳統(tǒng)的濕熱滅菌法或者常用于對(duì)白蛋白進(jìn)行滅菌的巴斯德氏滅菌法，其中巴斯德氏滅菌法包含在有或沒(méi)有穩(wěn)定劑存在的條件下，在一個(gè)給定的時(shí)間內(nèi)，對(duì)樣品溶液進(jìn)行程序性升溫的保溫過(guò)程。另外一種是干熱滅菌法，適用于對(duì)諸如凝血因子VIII等成分的滅菌，其包括液體被凍干后在給定時(shí)間內(nèi)對(duì)其程序性升溫的保溫過(guò)程。另外一種滅菌方法則包括對(duì)樣品進(jìn)行超濾或者液體去垢劑處理，在這種滅菌方法種，溶液與液體去垢劑系統(tǒng)充分混合后，在一定時(shí)間內(nèi)孵育，然后用疏水層析的方法去掉液體去垢劑成分，其中去垢劑系統(tǒng)例如是1％的磷酸三丁酯，1％的曲通X-100或土溫-80。在WO 94/28120，美國(guó)專利Nos.4,946,648，；4,481,189和4,540,573中，對(duì)液體去垢劑處理方法有詳細(xì)描述。
在另一個(gè)本發(fā)明具體實(shí)施方式
中，用來(lái)確定有效輻照劑量的方法與液體去垢劑系統(tǒng)聯(lián)合使用，該液體去垢劑系統(tǒng)的一個(gè)特點(diǎn)是，它能造成樣品溶液的吸光度顯著上升。因此，本發(fā)明具有以相對(duì)較高的吸光度來(lái)達(dá)到有效滅活液體中病毒的能力是一個(gè)特別優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明確定有效輻照劑量的方法，生物液體中至少要加入至少一種添加劑以減少對(duì)液體中生物活性的損傷或者丟失。已知的多種保護(hù)性添加劑包括，維生素E可以保護(hù)細(xì)胞不收損害，抗壞血酸可以防止血漿不致丟失功能活性，自由基以及活性氧的淬滅劑如組氨酸、蘆丁、槲皮素或其他類黃酮，其他穩(wěn)定劑如包括甘露糖醇在內(nèi)的糖醇和氨基酸用于減少血液組分活性的喪失。因?yàn)閱卧討B(tài)氧的生成需要溶解氧的存在，所以移除溶解在溶液中的氧，例如在進(jìn)行輻照之前或期間用一種諸如氮?dú)獾亩栊詺怏w來(lái)驅(qū)除空氣也能對(duì)于樣品中的有效成分產(chǎn)生保護(hù)作用。如果這些保護(hù)性添加劑能夠影響到到微生物對(duì)輻照的敏感性，為了考慮到這些保護(hù)性添加劑對(duì)于滅活微生物所需的有效輻照劑量的影響，可以依據(jù)實(shí)施例16的方案對(duì)劑量測(cè)定方法進(jìn)行調(diào)整。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法，有效輻照劑量是指能夠滅活所有的，或者至少99.9％、優(yōu)選99.99％、進(jìn)一步優(yōu)選99.999％的生物液體中微生物所需的輻照劑量。更優(yōu)選該方法在流通式反應(yīng)器中進(jìn)行。在實(shí)施例2、5、6、11、15和17中，提供了該方法的優(yōu)選實(shí)施方式。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是，提供了一種用于確定從一個(gè)或者多個(gè)光源發(fā)出的單色或多色光用以滅活非透明生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測(cè)量在所用光滅活波長(zhǎng)下單色或多色光對(duì)于與生物溶液的濁度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物溶液的濁度和吸光度以及粘度、與生物溶液的吸光度、或與生物溶液的粘度和吸光度相匹配的劑量測(cè)定溶液的影響，上述測(cè)量是基于采用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對(duì)薄層內(nèi)的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照以施加一能夠?qū)е驴蓽y(cè)量的物理量或化學(xué)量發(fā)生變化的規(guī)定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長(zhǎng)度薄到在規(guī)定時(shí)間內(nèi)只能吸收預(yù)定輻照度的入射光部分，ii)在對(duì)光輻照反應(yīng)器中劑量測(cè)定溶液輻照期間或之后，讀取與這些測(cè)到的量的變化相應(yīng)的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進(jìn)行，反之亦然。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物溶液是指如上所定義的溶液。
根據(jù)本發(fā)明的一種非透明生物溶液涉及到膠體生物溶液，其看起來(lái)可能澄清或者呈煙霧狀，但沿著光程方向，具有光散射的性質(zhì)。更優(yōu)選該膠體生物溶液含有的顆粒大小在分散體系中為0.1nm到100nm之間，優(yōu)選在1nm到100nm之間，最好是在10nm到50nm之間。更優(yōu)選地，在一種膠體生物溶液中所含膠體中分散的大分子的最大分子光吸收附近，其光散射增強(qiáng)，這樣散射光將可以有助于對(duì)病原體進(jìn)行光滅活。對(duì)于優(yōu)選的膠體生物溶液例如蛋白質(zhì)溶液，有可能可以通過(guò)估算在非吸收波長(zhǎng)和吸收波長(zhǎng)下的濁度測(cè)量，估算出整個(gè)光吸收度中溶液濁度的貢獻(xiàn)部分。然后分子吸光度可以通過(guò)從分光光度法測(cè)得的總吸光度中減去估算的濁度而計(jì)算出來(lái)。為了模仿一種膠體生物溶液中膠體分散體系的光散射特點(diǎn)，可以用沉淀的方法分出溶液中造成混濁的物質(zhì)如上述描述的諸如粘土礦物，并且用含有預(yù)期大小的顆粒組分去與劑量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的濁度相匹配。
更優(yōu)選地，非透明生物溶液是一種含有懸浮的粒經(jīng)至少為約100nm的顆粒的生物液體，該大小在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的并且在上面進(jìn)行了詳細(xì)描述?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量在通過(guò)如過(guò)濾或者離心的方法移除這些懸浮顆粒之前和之后的吸光度，而確定這種生物溶液如蘋(píng)果汁、橘子汁或者蔬菜汁的濁度。經(jīng)過(guò)澄清處理后的沒(méi)有懸浮顆粒的溶液的吸光度是由分子發(fā)色基團(tuán)引起的。測(cè)得的混濁液和澄清液體之間吸光度的差異即為濁度。
還優(yōu)選這種不透明生物溶液是一種乳化液例如乳，它是一種水包油的乳化液，并且其光散射作用引起的混濁導(dǎo)致了對(duì)整個(gè)光的減弱。對(duì)于包含有上述成分的紫外光劑量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)乳化液，需要化學(xué)惰性的和紫外透光的乳化劑和乳化的液體，特別是多氟羧酸鹽類和多氟烴類或者它們的衍生物。
為了調(diào)整劑量測(cè)定溶液以便與不透明生物溶液的吸光度和濁度相匹配，首先，在滅活時(shí)所用的光波長(zhǎng)下測(cè)量這種不透明生物液體的吸光度(也即是它的濁度值)。然后，最好用過(guò)濾的方法除去這種生物溶液中的混濁組分，再在滅活時(shí)所用的光波長(zhǎng)下測(cè)量這時(shí)的吸光度(也即非濁性吸光度)。制備出在光滅活時(shí)所用波長(zhǎng)下其吸光度與非濁性吸光度相匹配的劑量測(cè)定溶液。優(yōu)選這種劑量測(cè)定溶液的粘度值也和已經(jīng)去掉其混濁組分的生物溶液的粘度值相匹配。這種劑量測(cè)定溶液的配制方法在前面已有詳細(xì)描述。隨后，如前述部分所描述的那樣，將一種引起混濁的組分加入到溶液中，以使得在所用的滅活波長(zhǎng)下這種劑量測(cè)定溶液的吸光度和濁度相匹配。更進(jìn)一步的對(duì)這樣的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行校正的細(xì)節(jié)，以及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例4和實(shí)施例10。
根據(jù)一種確定滅活不透明生物溶液中微生物所需要的有效光輻照劑量的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，大約100％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選60％，更優(yōu)選50％，更優(yōu)選30％或更少的入射輻照在沿著光程的方向被吸收掉。
根據(jù)另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，規(guī)定通量可按照上面的描述進(jìn)行調(diào)整。優(yōu)選該方法進(jìn)一步包括有，在確定輻照劑量測(cè)定時(shí)，監(jiān)測(cè)發(fā)自一個(gè)或者多個(gè)光源的光強(qiáng)度。更優(yōu)選所用的光源在紫外光范圍之內(nèi)。在上面的描述中對(duì)該監(jiān)測(cè)裝置也有介紹。
優(yōu)選在一種確定滅活不透明生物液體中的微生物所需的有效光輻照劑量的方法中進(jìn)一步包括，如前所述，在對(duì)輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進(jìn)行輻照之前和之后、或者之前、期間和之后，通過(guò)滴定所述存活微生物的數(shù)量來(lái)確定劑量分布。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物學(xué)上的有效輻照劑量(光通量)可以用生物劑量測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定，最好是用如前所述的化學(xué)劑量測(cè)定方法和生物劑量測(cè)定方法的組合進(jìn)行測(cè)定。更優(yōu)選這種方法還包括，為了確定如前所述的輻照劑量，對(duì)在輻照過(guò)程中發(fā)自一個(gè)或者多個(gè)光源的光強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測(cè)；更優(yōu)選輻照光在紫外光區(qū)，最好是在紫外光C區(qū)。
優(yōu)選劑量測(cè)定溶液是指前面詳細(xì)描述的溶液。
更優(yōu)選地，這種劑量測(cè)定溶液含有稀釋后的碘化鉀/碘酸鉀感光計(jì)，或含有稀釋后的碘化鉀/碘酸鉀聚乙烯吡咯烷酮感光計(jì)，或者含有稀釋的過(guò)二硫酸鉀/叔丁醇感光計(jì)。
進(jìn)一步優(yōu)選這種劑量測(cè)定溶液中還可以含有前述的可以引起混濁的物質(zhì)。這種劑量測(cè)定溶液最好被調(diào)整到在光滅活波長(zhǎng)下其吸光度，或者吸光度和濁度，或者吸光度和粘度以及濁度與生物液體相同，如同前述的和實(shí)施例4和10中所描述的那樣。
可以用于本發(fā)明的方法的微生物如前面部分所描述。
優(yōu)選確定滅活不透明生物溶液中微生物所需有效光輻照劑量的方法與前面介紹的至少一種消毒或滅菌方法聯(lián)合起來(lái)進(jìn)行。更優(yōu)選這種生物液體如上所述含有至少一種添加劑以減少液體中生物活性成分的破壞和喪失。更優(yōu)選該方法如前所述在有液體去垢劑處理的情況下進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的方法，有效輻照劑量是指前面所定義的輻照劑量。
更優(yōu)選該方法在流通式反應(yīng)器中進(jìn)行，優(yōu)選在流通式反應(yīng)器中，包括用來(lái)自單個(gè)或者多個(gè)光源的有效輻照劑量的單色或多色光對(duì)生物液體進(jìn)行輻照；其中有效輻照劑量依據(jù)上述方法和實(shí)施例3、5、16和17所詳述的方法進(jìn)行確定。
另外，本發(fā)明的另外一個(gè)方面是，提供了一種滅活不透明生物溶液中微生物的方法，包括，用發(fā)自單個(gè)或者多個(gè)光源的單色或多色光以有效光輻照劑量對(duì)生物溶液進(jìn)行輻照，其中有效光輻照劑量根據(jù)前述的方法進(jìn)行測(cè)定。這種方法可以在任何一種類型的輻照反應(yīng)器中進(jìn)行，優(yōu)選在間歇式或者流通式反應(yīng)器中進(jìn)行(參見(jiàn)實(shí)施例3至6、12、13以及15至17)。
優(yōu)選在確定光輻照有效劑量和滅活方法中，用到了一種帶有封套恒溫器包裹的一個(gè)或者多個(gè)光源的紫外光滅活流通式反應(yīng)器，通過(guò)該封套恒溫器包層，一種恒溫并基本透明的液體通過(guò)流動(dòng)來(lái)移去來(lái)自輻照燈的熱量，從而保證幾乎不變的燈光強(qiáng)度。優(yōu)選這種流通式反應(yīng)器選自下面這些重力驅(qū)動(dòng)的產(chǎn)薄膜型(gravity-driven thin＝film-generating type)、渦流主動(dòng)混合流型(turbulent actively mixed flow type)、離心驅(qū)動(dòng)的產(chǎn)薄膜型(centrifugally driven thin-film-generating type)、盤(pán)管型(coiled tube type)、擋板管狀型(baffled tube type)、靜止混合管狀型(motionless mixer tube type)、渦流靜止性混合流管型(turbulent statically mixed flow-tube type)、層疊管型(laminar-tube type)，渦流管型(turbulent flow-tube type)。所有這些將在下面詳細(xì)描述。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面還提供了紫外光滅活流通式反應(yīng)器，在這種反應(yīng)器中，一個(gè)或者多個(gè)光源被封套恒溫器所包裹，通過(guò)該封套恒溫器中的恒溫的基本透明液體的流通移除輻照燈發(fā)熱所產(chǎn)生的熱量，優(yōu)選過(guò)量的熱量，從而確保一種基本上不變的光強(qiáng)度優(yōu)選該液體薄膜應(yīng)當(dāng)是一種生物液體薄膜。更優(yōu)選從一個(gè)或者多個(gè)光源發(fā)出的光線用來(lái)滅活這種生物液體。優(yōu)選該封套恒溫器是包含或者由紫外半透光的、抗紫外線的、基本上化學(xué)惰性石英玻璃組成，更優(yōu)選硼硅玻璃，以及半透明、抗紫外線并且基本上化學(xué)惰性的聚合物如含氟聚合物。
本發(fā)明中所提到的過(guò)量發(fā)熱優(yōu)選是在反應(yīng)器中尤其是反應(yīng)器光路經(jīng)上，任何足以將生物液體加熱到一定溫度的熱能或者紅外能量，該溫度對(duì)生物液體中的有效生物活性產(chǎn)生不良作用或者生物活性喪失以及使其中的組分產(chǎn)生不可逆變性失活。該溫度可以取決于液體的組成和是否存在穩(wěn)定劑。對(duì)大多數(shù)酶和凝結(jié)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，將生物液體加熱到大約37℃的最佳生理溫度，就有可能產(chǎn)生不利變化和損失。更優(yōu)選過(guò)量發(fā)熱是指反應(yīng)器中的生物溶液的溫度，在該溫度下大部分的未經(jīng)穩(wěn)定化的血漿蛋白會(huì)發(fā)生聚集，也就是說(shuō)大約55到60℃或者更高的溫度。過(guò)熱果汁等溶液會(huì)發(fā)生變味。
根據(jù)本發(fā)明，這種流通式反應(yīng)器最好是選自下面這些如上所述的反應(yīng)器重力驅(qū)動(dòng)產(chǎn)薄膜型如Dill輻照器、盤(pán)管型(Bayha 1951)，擋板型或者其他含有靜止混合元件的管狀型、渦流靜止混合流管型、層疊管型、渦流管型。
根據(jù)本發(fā)明，這種流通式反應(yīng)器提供了一種穩(wěn)定的燈光強(qiáng)度以確保在輻照過(guò)程中的接近恒定的輻照能，從而減少本技術(shù)領(lǐng)域所知的反應(yīng)器的輻照波動(dòng)(參見(jiàn)實(shí)施例7、8和13)。更進(jìn)一步的穩(wěn)定燈光輻照的方法包括調(diào)整電壓(Cortelyou等，1954)，其可以和其他恒溫方法聯(lián)合使用。如同本發(fā)明的介紹，流通式反應(yīng)器中引入的光源的直接恒溫方案能同時(shí)保證金本上恒定的燈光強(qiáng)度和移除產(chǎn)生的熱，優(yōu)選移除產(chǎn)生的過(guò)量熱量。優(yōu)選使用純水(蒸餾水或去離子水)或者任何其他透光性的、對(duì)光不敏感的、無(wú)毒、不燃的液體來(lái)實(shí)現(xiàn)恒溫。優(yōu)選依據(jù)測(cè)得的與輻照燈預(yù)期溫度的偏差，對(duì)恒溫器封套中的恒溫溶液溫度或者流速進(jìn)行調(diào)整，這樣，依據(jù)輻照燈實(shí)際溫度和目標(biāo)溫度之間的差異，可以對(duì)輻照燈的冷卻程度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
優(yōu)選光源也可以用于其液體深度大于光穿透路徑深度的反應(yīng)器，如攪拌間歇式反應(yīng)器，或者主動(dòng)或被動(dòng)混合流通式反應(yīng)器。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)流通式反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方式，有兩種使用液體使低壓金屬蒸汽燈恒溫的模式，圖14a和14b描繪了相應(yīng)設(shè)計(jì)的橫斷面。使用液體對(duì)整個(gè)輻射輻照燈表面進(jìn)行恒溫，可以最大程度避免金屬蒸汽在較冷的一些點(diǎn)上的聚集，其使用了現(xiàn)有的金屬熱管冷卻系統(tǒng)(Benesi，1956)，并且防止通風(fēng)式冷卻系統(tǒng)產(chǎn)生的灰塵在輻照燈上的留存(美國(guó)專利6,586,172)，從而可以確保輻照燈壁溫度的均勻分布。
在圖14a中，管形輻照燈被(A)一個(gè)內(nèi)置的包層管(B)和一個(gè)外部的包層管(C)所圍繞，優(yōu)選它們同心安裝并且置于在光滅活波長(zhǎng)下透光性足夠的材料構(gòu)成。在輻照燈(A)和內(nèi)包層管(B)之間，有一個(gè)間隙(D)，該間隙一般充滿氣體或者什么都不含，可以對(duì)該間隙的寬度進(jìn)行調(diào)整以優(yōu)化足夠透光的液體(E)的恒溫效率。液體通過(guò)流經(jīng)內(nèi)包層管(B)和外包層管(C)之間的間隙，避免對(duì)生物溶液的過(guò)度加熱?？梢詫?duì)包含液體(E)的間隙的寬度進(jìn)行調(diào)整，以確保依據(jù)需要對(duì)產(chǎn)生的熱量進(jìn)行最有效的移除。這樣的設(shè)計(jì)對(duì)于美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0049809 A1描述的螺旋管流通式反應(yīng)器來(lái)說(shuō)更為適用，在這種反應(yīng)器中，優(yōu)選同心管形流體管直接或者非常接近地和輻照燈包層貼附。這種設(shè)計(jì)也適用于高光強(qiáng)度汞合金燈，這種燈能產(chǎn)生三倍于平常的低壓汞燈的UV-C(a253.7nm)表面輻照。然而，在大約燈壁最佳溫度的80℃附近，需要對(duì)生物液體在這么高的變性溫度下提供一定的保護(hù)，這種保護(hù)可以通過(guò)優(yōu)化間隙(D)寬度而實(shí)現(xiàn)，此寬度可以決定熱量被轉(zhuǎn)移到恒溫液體(E)中的效率。
在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方式中，圖14b所示，提供了一種去掉內(nèi)包層管和空氣間隙的簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)，這樣就可以依靠在輻照燈(A)和外包層管(C)之間流動(dòng)的液體(E)，而實(shí)現(xiàn)對(duì)輻照燈(A)的恒溫效果。如果對(duì)輻照反應(yīng)器的足夠絕熱距離能避免對(duì)待處理的生物液體進(jìn)行過(guò)度加熱，這種設(shè)計(jì)對(duì)于在輻照燈壁溫度40℃下發(fā)射最大UV-C區(qū)(253.7nm)表面輻照的低壓汞燈來(lái)說(shuō)尤為適合。
更優(yōu)選地，如果用一種流動(dòng)的液體來(lái)對(duì)用于反應(yīng)器的光源進(jìn)行恒溫，那么在幾乎不變的燈光強(qiáng)度并且不對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)度加熱的條件下，可以安全而溫和地操作重力驅(qū)動(dòng)產(chǎn)薄膜型反應(yīng)器如Dill輻照器及其衍生類型、螺旋管式或者螺旋管包層輻照器。更優(yōu)選這種對(duì)光源的流動(dòng)液體式恒溫方案也可以用于其他液體深度大于光穿透深度的反應(yīng)器，如攪拌間歇式反應(yīng)器，或者主動(dòng)或被動(dòng)攪拌流通式反應(yīng)器。
任何給定的紫外輻照劑量可以測(cè)量為用mJ/cm2。輻照劑量是指在整個(gè)過(guò)程中總的輻照燈功率。然而，總的輻照劑量中只有一部分是有效輻照，有效輻照可以用化學(xué)劑量測(cè)定法或者通過(guò)對(duì)噬菌體的滅活試驗(yàn)而得出。例如，一個(gè)30升的間歇式反應(yīng)器需要的輻照燈劑量比有效靶輻照劑量高1000倍。如前所示，用化學(xué)劑量測(cè)定法對(duì)有效輻照劑量進(jìn)行確定也可以得出輻照時(shí)間。在輻照燈功率發(fā)生微小變化的情況下，輻照劑量可以取代輻照時(shí)間。這可以通過(guò)記錄在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照試驗(yàn)的過(guò)程中輻照燈強(qiáng)度而測(cè)定。殺滅病毒的有效靶輻照劑量確定后，將在整個(gè)輻照過(guò)程中強(qiáng)度計(jì)數(shù)累計(jì)起來(lái)，可以得出對(duì)應(yīng)于有效靶劑量的輻照劑量靶輻照燈劑量。通過(guò)控制輻照燈劑量這一過(guò)程，可以對(duì)輻照燈功率的變化進(jìn)行補(bǔ)償，并且提高該方法的準(zhǔn)確度。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供了一種通過(guò)控制發(fā)自單個(gè)或多個(gè)光源的單色或多色光的輻照總劑量以有效滅活間歇式反應(yīng)器中存在于生物液體中的微生物的方法，包括如下步驟[151]a)基于滅活生物液體中的微生物時(shí)的單色或多色光的有效輻照劑量，確定取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量、在間歇式反應(yīng)器中有效滅活微生物所需要的光輻照劑量速率和輻照時(shí)間；[152]b)在滅活間歇式反應(yīng)器中生物液體中的微生物期間，記錄光輻照劑量速率和輻照時(shí)間；[153]c)基于步驟b)的測(cè)量，計(jì)算取決于吸收的輻照源光輻照總劑量； d)將步驟c)中測(cè)得的取決于吸收的輻照源光輻照總劑量與步驟a)中得到的取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量進(jìn)行比較；和[155]e)一旦步驟c)中測(cè)得的取決于吸收的輻照源光輻照總劑量等于或大于取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量，則中斷對(duì)生物液體進(jìn)行曝光。優(yōu)選繼續(xù)進(jìn)行該方法，直到取決于吸收的輻照源光輻照總劑量基本上等于取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量，而不管輻照光劑量速率的變化和/或中間至少一個(gè)或者多個(gè)光源的突然關(guān)閉。更優(yōu)選用以上詳述的方法確定有效輻照劑量。進(jìn)一步優(yōu)選用至少一種電子輻射計(jì)、至少一種圖表記錄器和/或至少一種計(jì)數(shù)器(sum counter)來(lái)記錄輻照光劑量速率和輻照時(shí)間。
實(shí)施例7，8和15描述了這種方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式。優(yōu)選該方法還考慮到了輻照波動(dòng)。
優(yōu)選靶光輻照總劑量可以按如下方法確定首先，用具有不同的吸光系數(shù)的不同標(biāo)準(zhǔn)劑量測(cè)定溶液對(duì)間歇式反應(yīng)器進(jìn)行驗(yàn)證，以測(cè)定有效輻照劑量速率(以mJ/cm2/min計(jì))、輻照光劑量速率(以mJ/cm2/min計(jì))、達(dá)到給定有效輻照劑量所需要的輻照時(shí)間。如前所述，優(yōu)選用化學(xué)劑量測(cè)定法來(lái)確定滅活生物液體中的微生物時(shí)，所用的單色或多色光的有效輻照劑量。然后，如同下一段詳細(xì)描述的那樣，對(duì)光輻照劑量速率和輻照時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)整個(gè)輻照過(guò)程中的輻射計(jì)總信號(hào)的增加時(shí)，計(jì)算取決于吸收的輻照源光輻照總劑量。總的說(shuō)來(lái)，因?yàn)檩椛溆?jì)傳感器所接收到的紫外光實(shí)際上不因任何介質(zhì)吸收而減弱，因此光輻照劑量速率要在數(shù)量級(jí)上大于化學(xué)劑量速率。對(duì)于給定的在生物液體中取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量來(lái)說(shuō)，其輻照時(shí)間乘以取決于吸收的輻照源光輻照劑量速率，即得出作為輻照參數(shù)的取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量。
優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)儀器如至少一種電子輻射計(jì)、至少一種圖表記錄器、以及至少一種計(jì)數(shù)器，按照如上所述以及實(shí)施例7和8所述的方法，來(lái)記錄光輻照劑量速率和輻照時(shí)間。輻照燈功率(光輻照劑量速率)可以連續(xù)性地監(jiān)測(cè)，并且對(duì)信號(hào)進(jìn)行顯示或者記錄。待處理液體最好不要阻擋光源和輻射計(jì)傳感器之間的通光程，如此，則液體不會(huì)減弱光的強(qiáng)度。如果由于設(shè)計(jì)上的局限性而不能避免這種對(duì)光強(qiáng)度的減弱，則優(yōu)選需要在液體被輻照之前和之后，對(duì)沒(méi)有減弱的輻照燈的光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，以便能計(jì)算出平均光強(qiáng)度。電子輻射計(jì)優(yōu)選含有一個(gè)對(duì)位移不敏感(drift-insensitive)的光電輻射計(jì)傳感器。這種記錄使得在輻照時(shí)間的過(guò)程中，以光輻照劑量速率的測(cè)量為基礎(chǔ)，而計(jì)算出取決于吸收的輻照源光輻照總劑量。即便輻照發(fā)生波動(dòng)或臨時(shí)被打斷，這樣的設(shè)計(jì)也仍然可以對(duì)生物溶液所接受到的取決于吸收的輻照源光輻照總劑量進(jìn)行計(jì)算。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)對(duì)取決于吸收的輻照源光輻照總劑量和取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量進(jìn)行比較，從而可能確定或者甚至期望在哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)終止輻照滅活反應(yīng)，以便確保生物液體基本上接受到有效輻照劑量而滅活其中的微生物，與此同時(shí)，優(yōu)選本方法還可以確保這種生物液體基本上不會(huì)因?yàn)槭艿竭^(guò)度輻照而受到影響。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，行使對(duì)取決于吸收的輻照源光輻照總劑量和取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量進(jìn)行比較的功能的手段，可以和一個(gè)開(kāi)關(guān)相聯(lián)接，該開(kāi)關(guān)可以關(guān)掉用來(lái)輻照生物溶液的光源。除此之外，在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)也有其他有效地中斷對(duì)生物溶液進(jìn)行輻照的合適的方式。
優(yōu)選該方法持續(xù)進(jìn)行，直至取決于吸收的輻照源光輻照總劑量基本等于相應(yīng)的取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量，即便光輻照劑量速率發(fā)生變化并且/或者至少一個(gè)或多個(gè)光源其間發(fā)生關(guān)閉。這種取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量也可以由在通過(guò)多種不同物質(zhì)測(cè)定的取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量之間進(jìn)行內(nèi)插法而推導(dǎo)出來(lái)。這一方法在實(shí)施例6和7中有詳細(xì)描述。
和流通式輻照方法相比，間歇式輻照有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即其整個(gè)間歇體積在攪拌下受到平均光強(qiáng)的輻照，一直到所有的微生物都被有效地滅活。(Brooks，1920)[161]間歇式輻照反應(yīng)器可以包含一個(gè)待處理溶液用容器，該容器可以是至少一部分使用在光滅活致病微生物波長(zhǎng)下基本上足夠透光的材料制成，并且用設(shè)置在外面的光源對(duì)該容器進(jìn)行輻照?；蛘咴撊萜魉b液體可以用安裝在該液體表面之上的光源照射，也可以用浸入該液體的光源進(jìn)行照射。整攪拌個(gè)體積的溶液，從而保證所有的溶液組分暴露于基本上有效并且均一的光滅活致病微生物的輻照光下。由于沒(méi)有合適的驗(yàn)證和控制方法，直到現(xiàn)在這類裝置還沒(méi)有得到實(shí)際應(yīng)用。
優(yōu)選外部光源將光線輻照到輻照容器內(nèi)，以便待處理吸光性溶液不會(huì)阻擋輻照燈傳感器，并且傳感器受到基本上不衰減的光的輻照，輻照燈的燈強(qiáng)度測(cè)量最好是連續(xù)進(jìn)行。輻照劑量測(cè)定靶燈輻照劑量(the radiometric target lamp dose)隨著蛋白溶液的吸光度以線性比率增加。在較低光強(qiáng)度下工作的輻照燈需要更多的輻照時(shí)間來(lái)達(dá)到輻照劑量測(cè)定靶燈輻照劑量。
下述實(shí)施例闡明了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1高度稀釋的碘化物/碘酸鹽感光計(jì)溶液的吸光系數(shù)和碘化物/碘酸鹽感光計(jì)溶液的劑量測(cè)定響應(yīng)[164]將含有0.24M KI和0.04M KIO3的0.01M，pH 9.25的硼酸緩沖溶液，用0.01M硼酸緩沖溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6和0.8倍，并且在0.1mm比色杯中測(cè)量吸光度。圖1顯示吸光系數(shù)與濃度成線性比(a253.7＝69/cm×稀釋因子)關(guān)系。
將1升含有10g聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90；平均摩爾量360000Da)的0.01M硼酸緩沖溶液和1升含有50g PVP K25(平均摩爾量29000Da)的0.1M硼酸緩沖溶液用相對(duì)應(yīng)的硼酸緩沖溶液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8倍，并且在Schott 0.40mm Ubbelohde毛細(xì)管粘度計(jì)中于22.8℃下熱態(tài)測(cè)量稀釋液和緩沖液粘度。從圖2可以看出，粘度隨濃度以非線性比增加。
在0.1M，pH＝9.25的硼酸緩沖溶液中，分別制備出十進(jìn)制吸光系數(shù)a253.7＝2.5/cm且粘度為1cp的劑量測(cè)定溶液(0.00852M KI+0.00142M KIO3+1.543g PVP K25/L)、a253.7＝4.5/cm且粘度為1cp的劑量測(cè)定溶液(0.01548M KI+0.00258M KIO3+1.543g PVP K25/L)、a253.7＝7.5/cm且粘度為1cp的劑量測(cè)定溶液(0.02591M KI+0.00432 M KIO3+1.543gPVP K25/L)，以及a253.7＝10/cm且粘度為1.25cp的劑量測(cè)定溶液(0.03478M KI+0.00580M KIO3+1.916g PVP K90/L)，使用如在實(shí)施例18中和以上描述的方法，通過(guò)在校準(zhǔn)器中用薄層比色杯(0.5mm相當(dāng)于2.5/cm；0.2mm相當(dāng)于4.5/cm，7.5/cm和10/cm)中的曝光增量記錄校準(zhǔn)曲線。使用Morowitz校正因子(Morowitz 1950)來(lái)校正含有樣品溶液的薄層比色杯的自吸收。圖3描述了2.5/cm樣品溶液的校準(zhǔn)曲線，而圖4描述了4.5/cm、7.5/cm和10/cm樣品溶液的校準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例2在螺旋流通式反應(yīng)器(helical flow-through-reactor)中的輻照有效劑量確定[167]將裝配了在23mm直徑套筒內(nèi)11W的UV-C燈的水箱紫外線消毒用浮動(dòng)浸泡燈(微浮沉子1/0，Aqua Concept有限公司，卡爾斯魯厄，德國(guó))倒置安裝，并且將一個(gè)帶卷直徑7/8英寸(2.22cm)、17.5cm長(zhǎng)、5mm筒徑和0.63mm壁厚的含氟聚合物盤(pán)管，(美國(guó)賓夕法尼亞州普利茅斯米挺市Markel公司制造，材料為意大利Bollate市Solvay Solexis S.p.A.公司生產(chǎn)的Hyflon MFA)緊緊纏繞在燈的周圍，使得15cm照射長(zhǎng)度被盤(pán)管完全利用。當(dāng)在劑量測(cè)定測(cè)量開(kāi)始以前和結(jié)束后用去離子水沖洗掉盤(pán)管時(shí)，使用安裝在盤(pán)管中段的帶有日光遮蔽UVC-TLB探測(cè)器的Dr.Groebel UV-Elektronik RM-12輻射計(jì)核對(duì)燈強(qiáng)度。使用一個(gè)具有ISM719三滾子泵頭部和壁厚5mm ID×1.5mm壁厚硅橡膠管的Ismatec BVP蠕動(dòng)泵，以100、200、300、400、500和600ml/min的流量將樣品溶液經(jīng)由盤(pán)管反應(yīng)器(coiled tube reactor)泵出，并且由367nm處0.2mm比色杯吸光度得到的校準(zhǔn)曲線讀出劑量。
表1
UV劑量對(duì)回流速率的相關(guān)性(＝駐留時(shí)間，min/ml)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。
實(shí)施例3對(duì)人血清白蛋白和a1-抗胰蛋白酶進(jìn)行輻照以用于MFA盤(pán)管內(nèi)基于化學(xué)劑量測(cè)定和生物劑量測(cè)定的病毒滅活[169]用20mM磷酸鹽緩沖的0.15M NaCl溶液(磷酸鹽緩沖鹽水，PBS)稀釋人血清白蛋白(20％)，并且噬菌體Phi-X174溶菌液(～1×109噬菌斑形成單位(PFU)/ml)以1∶100(V/V)的摻入比率添加，得到吸光系數(shù)a253.7＝7.5/cm且粘度為1.05cp的蛋白質(zhì)溶液。該溶液經(jīng)由如在實(shí)施例2中描述的MFA盤(pán)管泵出。按照實(shí)施例2的方法測(cè)量輻照強(qiáng)度(平均強(qiáng)度為11.40mW/cm2)。通過(guò)滴定寄主細(xì)菌進(jìn)行連續(xù)的十進(jìn)制稀釋后，確定0.9mL樣品溶液的Phi-X174滴度。從具有至少10個(gè)高達(dá)200個(gè)溶解噬菌斑的陪氏培養(yǎng)皿上計(jì)算出滅活率。矯正施用劑量用于輻照強(qiáng)度(輻照度/劑量測(cè)定)比率。
表2
從相應(yīng)的噬菌體滴度可以看出，隨劑量的滅活率達(dá)到-0.3369 log10pfu/(mJ/cm2)。
從血漿純化得到人a1抗胰蛋白酶(a1蛋白酶抑制因子，ARALAST)，并且稀釋至吸光系數(shù)a253.7＝4.5/cm。噬菌體摻入比率是1∶100(V/V)。平均輻照強(qiáng)度是11.45mW/cm2。矯正施用劑量用于輻照強(qiáng)度(輻照度/劑量測(cè)定)比率。抗胰蛋白酶活性通過(guò)嗜中性彈性蛋白酶抑制試驗(yàn)確定。
表3
可見(jiàn)，通過(guò)應(yīng)用流通式(flow-through)輻照工藝用化學(xué)劑量測(cè)定和生物劑量測(cè)定，可以確定完全滅活靶微生物的最低劑量。
實(shí)施例4對(duì)蘋(píng)果汁進(jìn)行輻照以用于在MFA盤(pán)管內(nèi)基于化學(xué)劑量測(cè)定的UV巴氏消毒[173]購(gòu)買(mǎi)巴氏滅菌的蘋(píng)果汁(a253.7＝10.1/cm，η＝1.25cp)。面包酵母(Saccharomycescerevisiae釀酒酵母)是新購(gòu)買(mǎi)的食品級(jí)，并且用100mg新鮮的面包酵母接種50mL蘋(píng)果汁，于37℃下培養(yǎng)3h。該巴氏滅菌蘋(píng)果汁中摻入酵母懸浮液(9.5ml懸浮液摻入950mL汁中)，并且以100、150和200ml/min的流速輻照。平均輻照強(qiáng)度是11.46mW/cm2。由實(shí)施例2得到的結(jié)果插入用于150ml/min的劑量。矯正施用的劑量用于輻照強(qiáng)度(如同實(shí)施例2中的輻照度/劑量測(cè)定)比率。在環(huán)境光下滴定橙色血清瓊脂中的酵母細(xì)胞，并且通過(guò)50ml未受輻照與輻照汁液37℃下培養(yǎng)72h的發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)定殘余的感染性。評(píng)價(jià)未受輻照的和輻照樣品的香味(中性＝巴氏滅菌蘋(píng)果汁)。
表4
從結(jié)果可見(jiàn)，通過(guò)化學(xué)劑量測(cè)定可以精確地評(píng)價(jià)出大于40mJ/cm2的較高劑量對(duì)于使對(duì)UV-C高度吸收的蘋(píng)果汁中大于5log10cfu/ml面包酵母失去活性來(lái)說(shuō)是必需的。
實(shí)施例5使用劑量測(cè)定和生物劑量測(cè)定用于評(píng)價(jià)產(chǎn)生泰勒渦流(Taylor vortex)的流通式反應(yīng)器(flow-through-reactor)流動(dòng)。
用多至六個(gè)低壓水銀燈從側(cè)面照射裝配有外石英管(7cm內(nèi)徑，2.7mM壁厚，13.2cm高)和旋轉(zhuǎn)的同心內(nèi)不銹鋼圓柱(直徑54.85mm)、總?cè)萘?96.1ml的泰勒旋渦反應(yīng)器(Taylorvortex reactor)，每個(gè)低壓水銀燈安裝在浸沒(méi)于同心環(huán)形水浴中的石英套筒內(nèi)，該水浴具有同心內(nèi)石英窗，并且后面裝配有不銹鋼反射鏡。向上經(jīng)過(guò)垂直安裝的槽的液體流速可以通過(guò)Watson-Marlow 505 U蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)。圓柱轉(zhuǎn)速也可調(diào)整。來(lái)自恒溫器的冷卻水經(jīng)由輻照燈封套水浴泵出，以保持燈溫和UV-C輸出基本上恒定。每次改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)之后，在抽出樣品之前經(jīng)由槽泵出5個(gè)槽體積。
改變流速，同時(shí)保持轉(zhuǎn)速恒定在60rpm。通過(guò)實(shí)施例2給出的樣品溶液測(cè)量UV劑量。在60rpm下，用6個(gè)輻照燈測(cè)量表5中顯示的下述劑量
表5
在駐留時(shí)間(＝1/流速)和劑量之間的相關(guān)性是非線性的，表明低流量和高轉(zhuǎn)速下主動(dòng)增加的駐留時(shí)間分散(如同美國(guó)專利6,576,201中的描述，圖7)。
實(shí)施例2的樣品溶液(a253.7＝10/cm，h＝1.25cp)是經(jīng)由槽泵出，并且用6只輻照燈照射，流速保持恒定，同時(shí)改變內(nèi)圓筒轉(zhuǎn)速。其結(jié)果顯示于表6中。
表6
實(shí)施例2的樣品溶液(a253.7＝7.5/cm，η＝1.25cp)是經(jīng)由槽泵出，并且用6只輻照燈照射，保持流量恒定在192ml/min，同時(shí)改變轉(zhuǎn)速。然后輻照如在實(shí)施例3中描述的摻入細(xì)菌-噬菌體的白蛋白溶液，并且測(cè)定噬菌體滴度。其結(jié)果顯示于表7中。
表7
在改變流量并恒定轉(zhuǎn)速在60rpm情況下，經(jīng)由泰勒槽泵出相同的樣品溶液。測(cè)量劑量，得出劑量與駐留時(shí)間成線性相關(guān)。然后輻照如在實(shí)施例3中描述的摻入細(xì)菌-噬菌體的白蛋白溶液，并且測(cè)定噬菌體滴度。在劑量測(cè)定和噬菌體輻照期間，測(cè)量這6只輻照燈的平均輻照強(qiáng)度，計(jì)算輻照校正因子。其結(jié)果顯示于表8中。
表8
在輻照噬菌體期間測(cè)定劑量時(shí)，需要通過(guò)輻照校正因子乘以測(cè)定的劑量以計(jì)算有效劑量，該輻照校正因子確定是1.011。
表9
從顯示于表9中相應(yīng)的噬菌體滴度可以看出，得到了-0.2(log10pfu/mL)/(mJ/cm2)的隨劑量的滅活率。
用樣品溶液(a253.7＝2.6/cm，η＝1cp)和僅2只輻照燈進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。然后輻照相同吸光度和粘度的摻入噬菌體的白蛋白溶液。該輻照校正因子(噬菌體溶液/劑量測(cè)定)是0.988。其結(jié)果顯示于表10中。
表10
基于相應(yīng)樣品溶液的劑量測(cè)定，用摻入噬菌體的白蛋白溶液(a253.7＝4.5/cm，η＝1.05cp)，在恒定流量192ml/min并且內(nèi)圓筒轉(zhuǎn)速可變的情況下進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。在此，從離開(kāi)槽(由于駐留時(shí)間較短，該槽具有較低的劑量)的前面體積中抽出附加的樣品。其結(jié)果顯示于表11中。
表11
從通過(guò)化學(xué)和生物學(xué)的劑量測(cè)定組合得到的結(jié)果可見(jiàn)，可以組合應(yīng)用這些方法測(cè)量出駐留時(shí)間分散(如同美國(guó)專利6,576,201中的描述，圖7)。
實(shí)施例6使用化學(xué)劑量測(cè)定、生物劑量測(cè)定和輻照測(cè)量的間歇反應(yīng)器的有效性[186]一種大規(guī)模微生物滅活用光照滅活反應(yīng)器，其具有一圓柱形石英管(25cm內(nèi)徑，5mm壁厚，75cm長(zhǎng)度)、一平頂蓋和一不銹鋼滾花的凸出底部，并且裝配有裝填和取樣閥，一套包含三個(gè)三槳葉葉輪的堆疊式葉輪攪拌器，并且每個(gè)外槳葉邊緣有一刮水片。該反應(yīng)器四周環(huán)繞著10盞水恒溫的UV-C輻照燈(Philips TUV 55W HO)，輻照燈安裝在如在實(shí)施例18中描述的輻照燈箱內(nèi)，每個(gè)輻照燈都用Dr.Groebel UVC-SE輻射計(jì)傳感器監(jiān)控。此反應(yīng)器最大容量是30L。使用輻射計(jì)傳感器將每個(gè)輻照燈的輻照功率記錄在圖表記錄器上，并且將首次使用的相對(duì)輻照功率歸一化地設(shè)定為100％。
在30L光照滅活反應(yīng)器中，在用吸光度和粘度相同的樣品溶液校準(zhǔn)劑量測(cè)定后，輻照摻入噬菌體Phi X 174的白蛋白溶液(a253.7＝7.1/cm，η＝1.05cp)。攪拌的速度設(shè)定為90rpm。如此確定了1.1634mJ/cm2的劑量率，并且每隔2min 8s抽出噬菌體滅活樣品，直到17min 4s，即，劑量增加量為2.48mJ/cm2，直到大約20mJ/cm2的靶劑量。同時(shí)地從底部和頂部取樣閥抽出樣品以研究混合的均一性。其結(jié)果顯示于表12中。
表12
由大于10pfu/0.9ml_的噬菌體滴度，確定了-0.3940log10pfu/ml)/(mJ/cm2)的最高滅活率和-0.3912log10(pfu/mL)/(mJ/cm2)。-0.3926log10(pfu/ml)/(mJ/cm2)的平均隨劑量的滅活率顯示出優(yōu)良均一性和有效的混合，并且顯示出與實(shí)施例3的-0.3369 log10pfu/(mJ/cm2)以及實(shí)施例4的大約-0.2log10pfu/(mJ/cm2)流通式滅活率相比較較窄的劑量分布。相比未衰減的-0.44log10pfu/(mJ/cm2)噬菌體滅活率，由于混合最有效，分批輻照顯示最均一和均勻的微生物UV-C燈曝光。
一種實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的微生物滅活用光照滅活反應(yīng)器，其基本上由一具有平面塑料頂蓋的圓柱形石英容器(7cm內(nèi)徑，3mm壁厚，13cm高)和一凸出的塑料底部組成，該塑料頂蓋上有取樣閥，并且反應(yīng)器裝配有具有近壁刮水片(2個(gè)葉輪，攪拌速度可調(diào))的堆疊式葉輪攪拌器，用兩個(gè)10W低壓水銀燈從側(cè)面照射該反應(yīng)器。該反應(yīng)器最大容量是450ml。用數(shù)字式雙重傳感器-輻射計(jì)(Dr.Groebel UV-Elektronik RM21，具有UVC-SE傳感器)將照明強(qiáng)度記錄在計(jì)算機(jī)上。由生物劑量測(cè)定取樣時(shí)間間隔乘以化學(xué)劑量測(cè)定劑量率而得到的輻照劑量增量，再除以在劑量測(cè)定校準(zhǔn)期間得到的輻照劑量率，計(jì)算出在生物劑量測(cè)定輻照期間的劑量增量。
在450mL的光照滅活反應(yīng)器中，按照實(shí)施例2的做法，在用相同的樣品溶液進(jìn)行劑量測(cè)定校準(zhǔn)后，輻照與實(shí)施例3相同的摻入噬菌體的抗胰蛋白酶溶液。劑量率是2.5989(mJ/cm2)/min，并且每隔1min 1s抽出樣品，直到17min 4s。在20mJ/cm2的劑量下，彈性蛋白酶抑制的活性是未輻照溶液的97％。其結(jié)果顯示于表13中。
表13
-0.4406log10(pfu/ml)/(mJ/cm2)的隨劑量的滅活率顯示出優(yōu)良的均一性和有效的混合，并且狹窄的劑量分布顯然引起了與實(shí)施例3中描述的直流法的17.34mJ/cm2相比較的下降，下降了-5.53log10pfu/ml，甚至為12.24mJ/cm2。
實(shí)施例7通過(guò)組合使用化學(xué)劑量測(cè)定和輻照測(cè)量確定30反應(yīng)器的取決于吸收的輻照源靶光總劑量以確保燈故障下安全可靠的工藝[192]對(duì)實(shí)施例5中描述的30L反應(yīng)器(只是裝配了9個(gè)帶有反射鏡的可分別地?fù)Q向恒溫輻照燈)用10種不同的樣品劑量試液和4個(gè)輻照燈(a253.7＝3/cm至12/cm，以1/cm增加，η＝1.15cp)驗(yàn)證，以確定有效劑量率((mJ/cm2)/min)、光輻照劑量率((mJ/cm2)/min)和有效劑量20mJ/cm2必需的照射時(shí)間。用電子輻射計(jì)監(jiān)控輻照燈輻照強(qiáng)度并且用圖表記錄器做記錄，并且安裝計(jì)數(shù)器用來(lái)計(jì)算在輻照期間來(lái)自所有輻射計(jì)的信號(hào)的總數(shù)。當(dāng)輻射計(jì)相加信號(hào)隨照射時(shí)間增加時(shí)，計(jì)算出取決于吸收的輻照源光總劑量。輻照光劑量率呈數(shù)量級(jí)地高于化學(xué)劑量率，因?yàn)檩椛溆?jì)傳感器接受到實(shí)際上未被任何吸收介質(zhì)衰減的紫外線。用于溶液中有效的給定靶劑量的照射時(shí)間例如20mJ/cm2，乘以輻照光劑量率，以計(jì)算出取決于吸收的輻照源靶光總劑量，作為輻照參數(shù)。其結(jié)果顯示于表14中。
表14
由表14可見(jiàn)，輻照燈的取決于吸收的輻照源光總劑量與吸光度線性相關(guān)，可用公式Hlamp＝5058.9×a253.7-1413表示，相關(guān)系數(shù)接近于1，R2＝0.9972。取決于吸收的輻照源靶光總劑量，其本身與強(qiáng)度的任何變化無(wú)關(guān)，所以對(duì)于可靠的輻照工藝來(lái)講是理想?yún)?shù)，保證了施用合適的靶劑量。該輻照工藝通過(guò)取決于吸收的輻照源光總劑量控制，控制方式是一達(dá)到預(yù)定的取決于吸收的輻照源靶光總劑量，就關(guān)掉輻照燈以終止輻照，其中將靶光總劑量增加至每次吸收都在有效范圍內(nèi)。
實(shí)施例8模擬輻照在取決于吸收的輻照源靶光總劑量控制的輻照工藝期間燈關(guān)閉以及正確的在溶液中有效的靶劑量的驗(yàn)證[194]按照在實(shí)施例5中描述的方法輻照30L反應(yīng)器的樣品溶液(a253.7＝8/cm，η＝1.15cp)。在四個(gè)輻照燈之一關(guān)掉10min后，并且輻照燈要么被打開(kāi)不同的燈替代、要么不持續(xù)輻照并且僅用3只輻照燈，進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)。通過(guò)化學(xué)劑量測(cè)定，測(cè)定輻照光劑量率，并且一達(dá)到由實(shí)施例6中描述的有效性公式計(jì)算出的取決于吸收的輻照源靶光總劑量Hlamp＝39058mJ/cm2，就關(guān)掉輻照燈，并且抽出樣品以測(cè)定溶液中有效的劑量。
在用另一個(gè)燈替代輻照燈10min后做的第一次試驗(yàn)，16min 43s后達(dá)到取決于吸收的輻照源光總劑量，并且樣品溶液中測(cè)得的劑量是19.7mJ/cm2量。第二實(shí)驗(yàn)沒(méi)有輻照燈替代物，19min 55s后達(dá)到取決于吸收的輻照源光總劑量，并且樣品溶液中測(cè)量的劑量是19.9mJ/cm2。
以達(dá)到預(yù)定的取決于吸收的輻照源靶光總劑量所需的時(shí)間作為照射時(shí)間，從該照射時(shí)間后測(cè)量的有效劑量可見(jiàn)，取決于吸收的輻照源靶光總劑量控制的工藝甚至不靈敏，并且在輻照期間對(duì)燈關(guān)閉有強(qiáng)烈抵制，因?yàn)槿Q于吸收的輻照源靶光總劑量確保了應(yīng)用恰當(dāng)?shù)挠行┝俊?br> 實(shí)施例9調(diào)整樣品溶液以與具有高分子和低分子吸光度的混濁流體的吸光度和濁度相匹配[197]將自然混濁的蘋(píng)果汁濾過(guò)0.22μm注射濾過(guò)器。在253.7nm處未過(guò)濾的蘋(píng)果汁吸光度是18/cm，而過(guò)濾的澄清蘋(píng)果汁僅為10.4/cm，二者粘度皆為1.25cp。
在與過(guò)濾蘋(píng)果汁吸光度和粘度(a253.7＝10.4/cm，η＝1.25cp)匹配的碘化物/碘酸鹽/PVP樣品溶液中，添加膨潤(rùn)土以匹配混濁蘋(píng)果汁的混濁度。濃度2g膨潤(rùn)土發(fā)現(xiàn)增加混濁度7.6/cm。其結(jié)果顯示于表15中。
表15
如同圖5中描述的校準(zhǔn)曲線表明，混濁溶液的靈敏度僅有輕微降低，這里吸光度和混濁度使用的都是Morowitz校正因子(Morowitz1950)。對(duì)于吸光系數(shù)2.6/cm并且粘度1cp(＝1.543g PVP K25/L)的溶液，添加2g膨潤(rùn)土/L達(dá)到總吸光度9.3/cm。如圖5所示，校準(zhǔn)曲線中還沒(méi)有相應(yīng)的差異。將100ml澄清和混濁的樣品溶液在一個(gè)攪拌的4cm石英試管中進(jìn)行輻照，該試管插入如在實(shí)施例5中描述的相同的中相同燈罩內(nèi)，用2只相面對(duì)的輻照燈或者1只輻照燈照射。在40min照射時(shí)間期間每4分鐘抽出1ml試樣。在每次輻照期間記錄輻照燈強(qiáng)度，18/cm溶液的第二次輻照照明強(qiáng)度是10.4/cm溶液的第一次輻照的1.0416倍，并且9.3/cm溶液的第二次輻照照明強(qiáng)度是2.6/cm溶液的第一次輻照的0.9928倍。理論上取決于吸光系數(shù)倒數(shù)1/a的劑量率未顯示出如下預(yù)期差異100％對(duì)應(yīng)于10.4/cm并且57％對(duì)應(yīng)于18.0/cm，或者100％對(duì)應(yīng)于2,6/cm并且28％對(duì)應(yīng)于9.3/cm，但替代的差異是(用2只輻照燈)1.748(mJ/cm2)/min對(duì)應(yīng)于10.4/cm并且1.603(mJ/cm2)/min除以1.0416等于1.539(mJ/cm2)/min，對(duì)應(yīng)于18.0/cm，即，88％對(duì)應(yīng)于具有高分子吸光度的混濁溶液，而(有1只輻照燈)3.415(mJ/cm2)/min對(duì)應(yīng)于2.6/cm并且1.854(mJ/cm2)/min除以0.9928等于1.868(mJ/cm2)/min，即55％對(duì)應(yīng)于有低分子吸光度的混濁溶液。這表明附加的混濁度使光散射入溶液，可通過(guò)化學(xué)劑量測(cè)定測(cè)量。
實(shí)施例10高度稀釋的碘化物/碘酸鹽感光計(jì)溶液的吸光系數(shù)、碘化物/碘酸鹽感光計(jì)溶液的劑量測(cè)定響應(yīng)以及通過(guò)聚乙烯吡咯烷酮由UV-C產(chǎn)生的三碘化物的穩(wěn)定性。
將含有0.24M KI和0.04M KIO3的0.01M，pH 9.25的硼酸鹽緩沖液，用0.01M硼酸鹽緩沖液分別稀釋至0.2、0.4、0.6和0.8倍，并且在0.1mm比色杯中測(cè)量吸光度。圖6顯示吸光系數(shù)與濃度成線性比(a253.7＝69/cm×稀釋因子)關(guān)系。
將1升0.01M硼酸鹽緩沖液中含有10g聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90；平均摩爾量360000Da)的溶液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8倍，并且在Schott 0.40mm Ubbelohde毛細(xì)管粘度計(jì)中于22.8℃下熱態(tài)測(cè)量稀釋液和緩沖液粘度。從圖7可以看出，粘度隨濃度以非線性比率增加。
制備0.01M，pH 9.25的硼酸鹽緩沖液中含有0.24M KI和0.04M KIO3的儲(chǔ)備溶液的稀釋液，使其在253.7nm處的吸光度為6.1/cm(0.0212M KI+0.0035M KIO3+0.95g PVP K90/L；用于從DEAE葡聚糖凝膠陰離子交換凝膠(Brummelhuis 1980)的凝血酶原復(fù)合物洗出液)，和16/cm(0.06M KI+0.01M KIO3+6.25g PVP K90/L；用于2.5％(W/V)的纖維蛋白原溶液)，并且裝入0.2mm比色杯。通過(guò)將裝滿測(cè)定溶液的比色杯放置在比色杯位置，保持限定的時(shí)間，在具有已知發(fā)光輻照度的CAMAG TLC燈(Rahn光度計(jì)測(cè)量)下，進(jìn)行薄層校準(zhǔn)。于367nm下測(cè)量吸光度。由圖8可見(jiàn)，吸光度隨使用的表面劑量而增加，并且靈敏度隨KI/KIO3濃度而增加。
在0.01M，pH 9.25的硼酸鹽緩沖液中含有0.06M KI和0.01M KIO3的劑量測(cè)定溶液，吸光系數(shù)a253.7＝16/cm，并且制備出“相同KI和KIO3”濃度和6.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K90/L的溶液。如上所述，通過(guò)將裝滿劑量測(cè)定溶液的0.2mm比色杯在CAMAG TLC燈下放置限定的時(shí)間而進(jìn)行薄層校準(zhǔn)。于352nm處(僅有KI+KIO3)或者367nm處(KI+KIO3+PVP)測(cè)量吸光度。由圖9可見(jiàn)，PVP提高了方法的靈敏度。
實(shí)施例11裝有輻照劑量測(cè)定溶液的具有固定幾何尺寸間歇式光滅活反應(yīng)器中的輻照時(shí)間測(cè)定。
制備出十進(jìn)制吸光系數(shù)a253.7為2.1/cm(0.0072M KI+0.0012M KIO3+0.5g PVP K90/L，用于FVIII濃縮物)、6.1/cm(參見(jiàn)實(shí)施例10)、10/cm(0.0346M KI+0.0058M KIO3+1.21g PVP K90/L；用于2％(W/V)免疫球蛋白溶液)和16/cm(參見(jiàn)實(shí)施例10)的劑量測(cè)定溶液，并且如在實(shí)施例6中描述的方法記錄校準(zhǔn)曲線。直徑4cm石英試管裝滿100mL劑量測(cè)定溶液，在磁力攪拌器上用磁力攪拌棒攪拌，并且在2只配備有拋光不銹鋼反射鏡的低壓水銀蒸汽燈之間進(jìn)行輻照。在預(yù)定的間隔，抽出樣品并裝入0.2mm比色杯用于分光光度測(cè)定，并且從校準(zhǔn)曲線讀出劑量。然后劑量率計(jì)算為(mJ/cm2)/min，而劑量率倒數(shù)即為每單位劑量的比輻照時(shí)間min/(mJ/cm2)。其結(jié)果顯示于表16中。并且可以計(jì)算出用于表示吸光系數(shù)和(具體的)輻照時(shí)間之間關(guān)系的常數(shù)k1t＝k1×a表16
根據(jù)吸光系數(shù)對(duì)比輻照時(shí)間進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.989。結(jié)果表明，基于薄膜校準(zhǔn)的吸光度和經(jīng)薄層校正的粘度匹配樣品溶液的劑量測(cè)定適合于攪拌間歇式光照滅活反應(yīng)器的驗(yàn)證。
實(shí)施例12在薄層和分批輻照中MWIV和Phi-X174的滅活。
來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)上清液(～108組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/mL)的MMV儲(chǔ)備溶液，并且來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli)增殖的噬菌體Phi-X174溶菌液(～1×109噬菌斑形成單位(PFU)/mL)用20mM磷酸緩沖液0.15M NaCl(磷酸鹽緩沖鹽水，PBS)稀釋，并且分別取2.5mL，放入32mm聚苯乙烯陪氏培養(yǎng)皿水平振蕩，在CAMAG TLC燈下用不同的UV-C劑量輻照。用帶有日光遮蔽UV-C傳感器的Dr.Groebel RM21輻射計(jì)測(cè)定樣品表面距離輻照度，并且在分光光度計(jì)上測(cè)量的溶液自身吸光度用以校正有效積分通量(UV劑量)(Morowitz1950)。通過(guò)在寄主細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)菌寄主上滴定，分別測(cè)定MMV和Phi-X 174滴度。其結(jié)果顯示于表17中。
表17
在100ml帶有4cm攪拌棒的石英瓶中裝入80ml摻入MMV或者Phi-X 174的蛋白質(zhì)溶液(凝血酶原復(fù)合物DEAE葡聚糖凝膠洗脫液，a253.7＝6.9/cm)，放置于磁力攪拌器上，攪拌速度～250rpm，并且用CAMAG TLC燈從側(cè)面輻照。按照在實(shí)施例11中描述的方法，使用樣品溶液(a253.7＝6.9/cm)進(jìn)行校準(zhǔn)。在測(cè)量劑量率后計(jì)算出的時(shí)間間隔抽出病毒或者噬菌體滴定用樣品，并且進(jìn)行滴定以測(cè)定殘存的感染性病毒或者噬菌體滴度。其結(jié)果顯示于表18中。
表18
從Phi-X174和MMV滅活率可以推導(dǎo)出它們?cè)?53.7nm處對(duì)UV-C光的靈敏度是相仿的。因此Phi-X174被用作生物放照量物。還可以清楚地看到，由于有效的混合方法確保了微生物向輻照區(qū)域的遷移，間歇攪拌式設(shè)備中UV-C吸收液滅活率幾乎是相同的。
實(shí)施例13使用劑量測(cè)定和生物劑量測(cè)定用于攪拌間歇式反應(yīng)器的優(yōu)化。
如在實(shí)施例6中描述的配備有堆疊式葉輪攪拌器(3個(gè)葉輪，可調(diào)整攪拌速度)的450ml間歇式反應(yīng)器(7cm內(nèi)徑，3mm壁厚，13cm高)，用兩個(gè)低壓水銀燈從側(cè)面照射，每個(gè)燈安裝在兩個(gè)同心石英管的封套內(nèi)，并且在后面配備有不銹鋼反射鏡。來(lái)自恒溫器的冷卻水經(jīng)由輻照燈封套泵出，以保持燈溫和UV-C輸出常量。
將攪拌速度調(diào)節(jié)至每分鐘轉(zhuǎn)60(rpm)(慢攪拌)、150rpm(中快攪拌)和240rpm(快攪拌)。按照如在實(shí)施例11中描述的方法，測(cè)定用于輻照450ml吸光度和粘度匹配的樣品溶液的UV劑量率，該樣品溶液用于摻入噬菌體的凝血酶原復(fù)合物(prothrombin complex)洗脫液(a253.7＝8.0/cm，η＝1.15cp，0,1M硼酸鹽緩沖液中含有27.83mM KI，4.64mM KIO3，1.3g PVP K90/L，pH＝9.25)。研究發(fā)現(xiàn)，比在文獻(xiàn)中給出(0.01M)的更高硼酸鹽濃度(≥0.1M)會(huì)帶來(lái)更高的靈敏度和更好的放射量測(cè)定溶液穩(wěn)定性。輻照摻入噬菌體的凝血酶原復(fù)合物洗脫液，并且按照實(shí)施例12中描述的方法測(cè)定噬菌體滅活情況。作為附加參數(shù)，通過(guò)使用酰胺水解分析法(amidolytic assay)測(cè)量0、10、15、20、25、50、75和100mJ/cm2劑量的凝血因子X(jué)(FX)活性。結(jié)果是顯示于表19中。
表19
從該實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，通過(guò)樣品溶液放射量測(cè)定和生物劑量測(cè)定，可以優(yōu)化病毒滅活用間歇式光照滅活反應(yīng)器，因?yàn)閮煞N驗(yàn)證方法都給出了混合有效性的結(jié)果。也明顯可以看出，在可能的對(duì)蛋白質(zhì)溶液的最高攪拌速度(避免產(chǎn)生泡沫)下，就可以完成最快的微生物滅活。這樣優(yōu)化的好處是，通過(guò)最有效的混合，在靶劑量例如20mJ/cm2處的病毒滅活安全容限達(dá)到最高，或者能夠?qū)袆┝拷档蜑楸４娴鞍踪|(zhì)的附加生物活性。
實(shí)施例14用于使用化學(xué)劑量測(cè)定、生物劑量測(cè)定和輻照測(cè)量的凝血酶原復(fù)合物洗脫液分批輻照的驗(yàn)證和過(guò)程監(jiān)控。
如在實(shí)施例6中描述的30L病毒滅活用光照滅活反應(yīng)器，其帶有三個(gè)三槳葉葉輪且每個(gè)外槳葉邊緣具有刮水片的堆疊式葉輪攪拌器，四周環(huán)繞著10盞水恒溫的UV-C輻照燈(Philips TUV 55W HO)，安裝在如在實(shí)施例18中描述的恒溫器燈箱內(nèi)，每個(gè)等都用Dr.Groebel UVC-SE輻射計(jì)傳感器監(jiān)控。使用輻射計(jì)傳感器將每個(gè)輻照燈的輻照燈功率記錄在圖表記錄器上，并且將首次使用的相對(duì)輻照燈功率歸一化地設(shè)定為100％。
將29.5L凝血酶原復(fù)合物洗脫液與來(lái)源于E.coli的Phi X-174溶菌液(～4×109pfu/mL)摻合。所得溶液吸光系數(shù)為a253.7＝6.0/cm。使用如在實(shí)施例11中描述的吸光度和粘度匹配的樣品溶液，在病毒滅活進(jìn)行試驗(yàn)之前，測(cè)定反應(yīng)器劑量率，該樣品溶液為在0.1M、pH＝9.25的硼酸緩沖溶液中含有20.87mM KI、3.48mM KIO3和1.304g PVP K90/L。在90rpm的攪拌速度下劑量率是1.3435(mJ/cm2)/min，并且輻照燈劑量率是第一次噬菌體輻照的98.5％。測(cè)定出用于靶劑量20mJ/cm2的輻照時(shí)間是14min，并且假定劑量率基本上恒定。為證實(shí)燈功率作為誤差源的影響，第三次輻照采用28℃至24.5℃，使燈溫較低，從而降低燈功率至大約最大功率的90％。按照實(shí)施例12中描述的方法，測(cè)定Phi-X174的滅活速率(基于假定劑量率恒定)，并且表示為(log(pfu/ml))/(mJ/cm2)。其結(jié)果顯示于表20中。
表20
由上表可見(jiàn)，燈功率是一個(gè)間歇輻照過(guò)程參數(shù)，并且要將劑量測(cè)定的劑量率和生物劑量測(cè)定的滅活率兩者都?xì)w一化為燈功率。
實(shí)施例15基于由劑量測(cè)定和輻照測(cè)定得到的輻照測(cè)量靶劑量對(duì)蛋白質(zhì)溶液間歇輻照的過(guò)程設(shè)計(jì)。
按照實(shí)施例6中描述的450ml光照滅活反應(yīng)器用于驗(yàn)證劑量率和輻照時(shí)間，輻照樣品溶液的吸光系數(shù)是6.0/cm、7.0/cm、8.0/cm、9.0/cm和10.0/cm。200rpm下攪拌450ml體積的樣品。打開(kāi)輻照燈，并且通過(guò)在3、6、9、12、15、18、21和24min時(shí)抽樣樣品溶液的測(cè)量而測(cè)定劑量率。通過(guò)連接到電腦上的雙頭輻射計(jì)監(jiān)控并記錄照明強(qiáng)度。
圖10顯示，開(kāi)燈3分鐘后照明強(qiáng)度達(dá)到最大值，并且使用的劑量在第一個(gè)3分鐘期間低于接下來(lái)的3分鐘時(shí)段內(nèi)使用的基本上恒定的劑量增量。圖11顯示了隨著Y軸表示的誤差恒定在零以下而相應(yīng)的劑量增量。因此，將劑量率公式的Y軸常量加上靶劑量(20mJ/cm2)，得到校正的增加的靶劑量，通過(guò)增加的靶劑量除以劑量率而計(jì)算出輻照時(shí)間，并且計(jì)算在輻照時(shí)間內(nèi)測(cè)量出的1秒間隔內(nèi)的輻照強(qiáng)度(mW/cm2)總和，得到隨吸光系數(shù)的靶輻照燈劑量(mJ/cm2)。其結(jié)果顯示于表21中?？梢杂?jì)算出常量k2Q＝k2×a表21
從上表可見(jiàn)，輻照測(cè)量的靶輻照燈劑量隨著吸光系數(shù)以線性比(R2＝0.996)增加。
實(shí)施例16用于抗壞血酸測(cè)定作為防止光變性保護(hù)劑的UV-C吸收效果的劑量測(cè)定補(bǔ)償。
在FEIBA DEAE葡聚糖凝膠G50洗脫物(18.2mg蛋白質(zhì)/ml)中、添加抗壞血酸鈉至濃度1mmol/L。添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液的a253.7處吸光系數(shù)是16/cm，而未添加抗壞血酸的洗脫液為7.3/cm。
對(duì)于化學(xué)劑量測(cè)定，制備出在0.1M、pH＝9.25的硼酸鹽緩沖液中含有0.0254M KI、0.0042M KIO3和1.61g PVP K90/L的樣品溶液(a253.7＝7.3cm)，以及在0.1M、pH＝9.25硼酸鹽緩沖液中含有0.06M KI、0.01M KIO3和1.61g PVP K90/L的樣品溶液(a253.7＝16/cm)，用0.2mm薄層比色杯記錄校準(zhǔn)曲線，并且在有1盞輻照燈(a253.7＝7.3/cm，劑量率1.41(mJ/cm2)/min)和2盞輻照燈(a253.7＝16/cm，劑量率1.33(mJ/cm2)/min)的如實(shí)施例11中描述的間歇光照滅活反應(yīng)器中輻照110ml樣品溶液。將110ml未添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液和添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液都進(jìn)行各個(gè)劑量率的輻照，并且在5；10；15；20；25；30和35mJ/cm2處抽出樣品。按照實(shí)施例13的方法測(cè)定凝血因子X(jué)(FX)活性。結(jié)果是顯示于表22中。
表22
從上表可見(jiàn)，在未添加抗壞血酸和添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液之間FX滅活速率(UFX/(mJ/cm2))沒(méi)有相關(guān)差異。因此，本身為高度UV-C吸收的抗壞血酸未發(fā)揮對(duì)FX蛋白質(zhì)的光保護(hù)作用。這就表明，這樣的因添加物而增加的UV-C吸光度可以容易地通過(guò)所述吸光度匹配的化學(xué)劑量測(cè)定得到補(bǔ)償。
實(shí)施例17用燈強(qiáng)度和量子產(chǎn)額穩(wěn)定化的以及曝光時(shí)間受控制的校準(zhǔn)器校準(zhǔn)輻照劑量溶液。
對(duì)于薄層比色杯中輻照劑量溶液可再現(xiàn)和精確的曝光量，將開(kāi)槽于水恒溫夾套的比色杯安裝到單鏡頭反射式照相機(jī)門(mén)樞背板上，并且在此背板內(nèi)銑出一個(gè)窗口，以便透過(guò)照相機(jī)快門(mén)曝光比色杯。照相機(jī)鏡頭卡口安裝在水恒溫的石英玻璃夾套內(nèi)含有低壓水銀蒸汽燈的燈罩法蘭上。
用外循環(huán)水自動(dòng)調(diào)溫器控制輻照燈恒溫溫度，在最大UV-C輸出點(diǎn)操作輻照燈。比色杯槽溫度設(shè)定在Rahn(1997)限定的所給碘化物/碘酸鹽光度計(jì)量子產(chǎn)額范圍內(nèi)，并且用外循環(huán)水低溫保持器控制。該照相機(jī)快門(mén)設(shè)定為1秒曝光時(shí)間，并且使用連接到電腦聲卡擴(kuò)音器塞子上的光電二極管，測(cè)定快門(mén)精度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)快門(mén)維持1.000±0.002s的正常曝光時(shí)間。
對(duì)于比色杯入射窗的有效輻照度測(cè)定，將吸收完全所有入射光的0.6M碘化物/0.1M碘酸鹽的感光計(jì)溶液(Rahn 1997)裝入0.2mm的比色杯中，在自動(dòng)調(diào)溫器比色杯槽內(nèi)遞增曝光1、2和3s，以確?；旧虾愣ǖ牧孔赢a(chǎn)額。在曝光以前，將分光光度計(jì)352nm處的吸光度設(shè)定為零，并且在每次曝光步驟以后，在分光光度計(jì)上測(cè)量352nm的吸光度增加值。從吸光度增量、三碘化物濃度、從隨溫度而變的量子產(chǎn)額、入射光子的數(shù)量，以及從光電能量和比色杯橫截面積，計(jì)算出輻照度E。因此這樣就能由曝光時(shí)間t(秒)時(shí)的吸光度增量Dabs、比色杯表面A(cm2)和比色杯體積V(L)、光程長(zhǎng)度d處的消光系數(shù)e(264.5相應(yīng)于0.01cm)、能量W/einstein(在253.7nm處)＝471528J、以及21℃時(shí)＝0.7545的量子產(chǎn)額Φ(Rahn1997)，根據(jù)公式E＝(Δabs×V×W×1000)/(e×A×Φ×t)，計(jì)算出E(mW/cm2)。因此，在1s曝光時(shí)間后，0.0392的吸光度增量對(duì)應(yīng)于0.9262mW/cm2的輻照度，在累積2s以后，0.0781的累積吸光度增量對(duì)應(yīng)于0.9227mW/cm2，并且在3s以后，0.1170的累積吸光度增量對(duì)應(yīng)于0.9215mW/cm2。平均輻照度是0.9235mW/cm2，而標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.0020mW/cm2，表明通過(guò)電子控制快門(mén)的校準(zhǔn)，曝光量非常精確。
將相當(dāng)于UV-C吸光度a253.7＝6.5/cm并且粘度1.16cp的輻照劑量溶液裝入0.2mm比色杯，并且曝光由3s增加到75s。每次曝光量增加之后，以未受輻照溶液作為空白對(duì)照讀出吸光度增量。得到的校準(zhǔn)曲線與二階方程相關(guān)，367nm處吸光度取決于曝光量積分通量H。
其結(jié)果顯示于表23中。
吸光度(367nm，0.2mm)＝A×H2+B×H+C表23
相關(guān)系數(shù)R2接近于1，顯示出通過(guò)電子控制快門(mén)的方法記錄的校準(zhǔn)曲線之精確。該二階方程具有另外的優(yōu)點(diǎn)，即對(duì)于吸收值測(cè)定例如如同在實(shí)施例18中描述的劑量率測(cè)量，可以容易地計(jì)算出差不多符合此公式的溶液。校準(zhǔn)曲線也可以分割，并且可以計(jì)算每個(gè)部分的二階方程，以得到盡可能接近于1的相關(guān)系數(shù)R2。這種校準(zhǔn)器實(shí)施例如圖12所示。
實(shí)施例18可用在實(shí)施例2、4-6、13和14中描述的反應(yīng)器中的紫外燈溫度穩(wěn)定性[226]將Philips TUV55 HO輻照燈(55W，直徑28mm，長(zhǎng)900mm)安裝在具有不銹鋼室(1)的輻照燈箱(圖13)內(nèi)，燈箱內(nèi)含有三個(gè)同心恒溫封套石英玻璃筒(3)中的輻照燈(2)，使得恒溫水流入在石英玻璃套筒(3)和不銹鋼壁(1)間的空隙。每個(gè)輻照燈都由Dr.GroebelUVC-SE輻射計(jì)傳感器(4)監(jiān)控，由PT100探針(5)測(cè)量溫度。不銹鋼室正視圖上有石英玻璃窗，穿過(guò)該窗將UV-C燈光輻照到反應(yīng)容器上。石英管內(nèi)徑為30mm并且壁厚為3mm。水以6L/min的流量從循環(huán)低溫恒溫器泵出。溫度從15℃增加到30℃，并且每上升大約0.50℃間隔，測(cè)量一次光強(qiáng)度。其結(jié)果顯示于表24中。
表24
在27℃時(shí)達(dá)到最大光強(qiáng)度，該溫度作為溫和的溫度不會(huì)過(guò)度加熱產(chǎn)品，與冷卻水溫度必須在大約40℃的直接恒溫相反。通過(guò)增加在輻照燈表面和恒溫封套內(nèi)管之間的空隙和水流量，在保證最大輻照燈UV-C強(qiáng)度方面，甚至更低的溫度也可以有效果。在這樣一種自動(dòng)調(diào)溫輻照燈周圍，或者緊接其后，可以操作每個(gè)類型的流通式反應(yīng)器或者間歇式反應(yīng)器，而沒(méi)有因加熱、特別是過(guò)熱而損害產(chǎn)品的危險(xiǎn)。
參考文獻(xiàn)表[228]Anderle H，Matthiessen HP，Spruth M，Kreil T，Schwarz H-P，Turecek PLAssessment of theefficacy of virus inactivation by UV-C treatment of therapeutic proteins.Proceedings(CD-ROM)ofthe 2nd International Congress on Ultraviolet Technologies，International Ultraviolet Association，Vienna，July 9-11，2003(CD-ROM published by and available from the International UltravioletAssociation，P.O.Box 1110，Ayr，ON，Canada NOB 1 E0，http//www.iuva.org)[229]Bayha HDie Ultraviolett-Entkeimung von Flüssigkeiten geringer Strahlen-durchlssigkeit(The ultraviolet disinfection of liquids with low radiation transmission).Zeitschrift für Hygiene 135(1952)，1-26[230]Benesi EDesign of a centrifugal filmer for the ultraviolet irradiation of liquids.GeneralMotors Engineering Journal 3(1956)，2-8[231]Bering E，Meyer HMethoden zur Messung der Wirksamkeit violetter undUV-Strahlenquellen (Methods for the measurement of the effectiveness of violet and ultravioletradiation sources).Strahlentherapie 1(1912)，189-207. Bitton G，Henis Y，Lahav NEffect of several clay minerals and humic acid on the survival ofKlebsiella aerogenes exposed to ultraviolet irradiation.Applied Microbiology 23(1972)，5870-874[233]Bolton JRUltraviolet principles and applications.EPA Newsletter 66(1999)，9-36[234]Bolton JR，Linden KGStandardization of methods for fluence(UV dose)determination inbench-scale UV experiments.Journal of Environmental Engineering 129(2003)，3209-215[235]Brauer H-D，Schmidt RA new reusable chemical actinometer for UV irradiation in the 248-334 nm range.Photochemistry and Photobiology 37(1983)，5587-591. Brooks SCThe kinetics of inactivation of complement by light.Journal of GeneralPhysiology 3(1920)169-123[237]Brummelhuis HGJPreparation of the prothrombin complex.InMethods of plasma proteinfractionation，edited by Curling JM，LondonAcademic Press，1980，p.117-128. Bowen EJThe chemical aspects of light，2nd revised edition，OxfordClarendon Press 1949[239]Cabaj A，Sommer RMeasurement of ultraviolet radiation with biological dosemeters.Radiation Protection and Dosimetry 91(2000)，1-3139-142 Caillet-Fauquet，Di.Giambattista M，Draps M-L，Sandras F，Branckaert T，de Launoit Y，LaubRContinuous-flow UVC irradiationa new，effective，protein activity-preserving system forinactivating bacteria and viruses，including erythrovirus B19.J.Virol.Meth.118(2004)131-139[241]Calvert JG，Rechen HJLPrecision actinometry at low light intensities with malachite greenleucocyanide.Journal of the American Chemical Society 74(April 20，1952)，2101-2103. Cortelyou JR，McWhinnie MA，Riddiford MSl Semrad JEThe effects of ultravioletirradiation on large populations of certain water-borne bacteria in motion.II.Some physical factorsaffecting the effectiveness of germicidal ultraviolet irradiation.Applied Microbiology 2(1954)，269-273[243]Dainton FS，Sills SAUse of nitrous oxide to discriminate between various forms ofhydrogen atoms existing in aqueous solutions of potassium iodide irradiated with ultraviolet light.Nature 186(June 11，1960)879[244]Delia Contrada JInvention could revolutionize decontamination and purification of liquids.University at Buffalo Reporter 35(27)，March 25，2004，online editionhttp//www.buffalo.edu/reporter/vol35/vol35no27/articles/PatraPumD.html，accessed May 10，2004[245]Erdmann KVersuche zur Aufhebung der koagulierenden Wirkungen von ultraviolettem Lichtund von Rntgenstrahlen auf Euglobulin mit Strahlen-Schutzstoffen.Protoplasma 45(1956).3293-314[246]Favaro G.Actinometryconcepts and experiments.InDrugsPhotochemistry andPhotostability，Special Publications of the Royal Society of Chemistry 225(1998)，295-304. FDA(Food and Drug Administration，US Department of Health and Human Services)Kinetics of microbial inactivation for alternative food processing technologies.Washington，DC2000.http//vm.cfsan.fda.gov/～comm/ift-uv.html[248]Fisher GJ，LeBlanc JC，Johns HEA calorimetric determination of the quantum yield for theionization of malachite green cyanide by ultraviolet radiation.Photochemistry and Photobiology 6(1967)，757-767. Forney LJ，Pierson JAOptimum photolysis in Taylor-Couette flow.American Institute ofChemical Engineers Journal 49(2003)3727-733[250]Gauglitz G.Modern chemical actinometry.EPA Newsletter(November 1983)，49-53[251]Gauglitz G，Hubig SAzobenzene as a convenient actinometerevaluation values for UVmercury lines and for the N2 laser lines.Journal of Photochemistry 15(1981)，255-257. Gauglitz G，Hubig SChemical actinometry in the UV by azobenzene in concentrated solutiona convenient method.Journal of Photochemistry 30(1985)，121-125. Gauglitz G，Hubig SPhotokinetische Grundlagen modemer chemischer Aktinometer(Photokinetic bases of modem chemical actinometers).Zeitschrift für Physikalische Chemie，NeueFolge 139(1984)，237-246. Habel K，Sockrider BTA continuous flow method of exposing antigens to ultravioletradiation.Journal of Immunology 56(1947)，273-279[255]Harrington WO，Hills CHReduction of the microbial population of apple cider by ultravioletradiation.Food Technology 22(1968)，117-120[256]Hiatt CWPhotodynamic inactivation of viruses.Transactions of the New York Academy ofScience 23(1960)，66-78[257]Kirk AD，Namasivayam CErrors in ferrioxalate actinometry.Analytical Chemistry 55(1983)，2428-2429. Koutchma T，Keller S，Chirtel S，Parisi BUltraviolet disinfection of juice products in laminarand turbulent flow reactors.Innovative Food Science and Emerging Technologies 5(2004)，2179-189[259]Koutchma T，Adhikari CEffectiveness of the UV disinfection of juice.IUVA News 4(2002)，521-23. Kuhn HJ，Braslavsky SE，Schmidt RChemical actinometry.Pure & Applied Chemistry 61(1989)2187-210. Mack SD，Albrecht JJ.Litchfield JH.Parker MEStudies on the cold sterilization of liquidfood using mercury radiation.II.Apple juice.Food Research 24(1959)，383-391[262]Morowitz HJAbsorption effects in volume irradiation of microorganisms.Science 111(1950)，229-230[263]Oppenheimer F，Benesi E，Taylor ARThe ultraviolet irradiation of biological fluids inthin-flowing films.American Journal of Public Health 49(1959)，7903-923[264]Quails RG，Johnson JDBioassay and dose measurement in UV disinfection.Applied andEnvironmental Microbiology 45(1983)3872-877[265]Rahn RO，Stefan Ml，Bolton JR，Goren E，Shaw P-S，Lykke KRQuantum yield of theiodide/iodate chemical actinometerdependence on wavelength and concentration.Photochemistryand Photobiology 78(2003)，2146-152[266]Rahn RO，Xu P，Miller SLDosimetry of room-air germicidal(254nm)radiation usingspherical actinometry.Photochemistry and Photobiology 70(1999)，3314-318[267]Rahn ROPotassium iodide as a chemical actinometer for 254nm radiationuse of iodate asan electron scavenger.Photochemistry and Photobiology 66(1997)，4450-455[268]Rahn ROUse of potassium iodide as a chemical actinometer. Photochemistry andPhotobiology 58(1993)，6874-880[269]Rideal EK，Roberts RThe photochemistry of native proteins.Proceedings of the RoyalSociety AA205391-408.1951. Sczechowskii JG，Koval CA，Noble RDA Taylor vortex reactor for heterogeneousphotocatalysis.Chemical Engineering Science 50(1995)203163-3173[271]Schulz CR，Cervantes P，and Laplace CDevelopment of a flow-through actinometry monitorfor dose measurements in UV disinfection reactors.Conference Prooceedings(on CD-ROM)of theInternational Ultraviolet Association′s lst International Congress on Ultraviolet Technologies，Washington DC.June 15-16.2001. Wang J，Mauser A，Chao S-F，Remington K，Treckmann R，Kaiser K，Pifat D，Hotta JVirusinactivation and protein recovery in a novel ultraviolet-C reactor.Vox Sanguinis 86(2004)230-238[273]Wright HB and Sakamoto GUV Dose required to achieve incremental log inactivation ofbacteria，viruses，and protozoa.Trojan Technologies，London ON/Canada，2001. Zheleznova NV.Determination of the light flow intensity of uviol-type bactericidal lamps.Trudy lnstituta lmeni Pastera 52(1979)133-135[275]本發(fā)明附加的優(yōu)點(diǎn)、特征和改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是很容易理解的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述細(xì)節(jié)、有代表性的設(shè)備、此處所顯示和描述的內(nèi)容。因此，在不背離附后的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明構(gòu)思精神或范圍情況下，可以做出多種改進(jìn)和等效替換。
在此引用的所有參考文獻(xiàn)，包括所有公開(kāi)的內(nèi)容以及所有美國(guó)和國(guó)外專利及專利申請(qǐng)?jiān)趦?nèi)，都已具體并完全地引入本發(fā)明作為參考。說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例的意圖應(yīng)認(rèn)為僅具有示范性，本發(fā)明的真正保護(hù)范圍和精神通過(guò)權(quán)利要求書(shū)的記載予以表明。
權(quán)利要求
1.一種用于確定從一個(gè)或多個(gè)光源發(fā)出的單色或多色光滅活生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測(cè)量所述單色或多色光對(duì)于劑量測(cè)定溶液的影響，其中所述滅活在流通式反應(yīng)器中進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，包括測(cè)量在所用光滅活波長(zhǎng)下單色或多色光對(duì)于與生物液體的吸光度、或與生物液體的吸光度和粘度相匹配的劑量測(cè)定溶液的影響，上述測(cè)量是基于采用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對(duì)薄層內(nèi)的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照以施加一能夠?qū)е驴蓽y(cè)量的物理量或化學(xué)量發(fā)生變化的規(guī)定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長(zhǎng)度薄到在規(guī)定時(shí)間內(nèi)只能吸收預(yù)定輻照度的入射光部分，ii)在對(duì)光輻照反應(yīng)器中劑量測(cè)定溶液輻照期間或之后，讀取與這些測(cè)到的量的變化相應(yīng)的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進(jìn)行，反之亦然。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，沿著所述光程長(zhǎng)度，100％或以下的所述入射光被吸收。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，沿著所述光程長(zhǎng)度，50％或以下的所述入射光被吸收。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述規(guī)定通量可以通過(guò)改變規(guī)定輻照度和/或通過(guò)改變規(guī)定時(shí)間來(lái)改變，所述規(guī)定時(shí)間由流通式反應(yīng)器中生物液體的流速確定。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括，在對(duì)輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進(jìn)行輻照之前和之后，或者之前、期間和之后，通過(guò)滴定所述存活微生物的數(shù)量來(lái)確定劑量分布。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括在輻照過(guò)程中對(duì)一個(gè)或多個(gè)光源的強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確定輻照劑量。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光在紫外區(qū)。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，劑量測(cè)定溶液包含從下列中選取的試劑或試劑組合碘化堿金屬鹽、碘化堿土金屬鹽、碘化銨、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸堿金屬鹽、苯甲酸堿土金屬鹽、苯甲酸銨、過(guò)二硫酸堿金屬鹽、過(guò)二硫酸堿土金屬鹽、過(guò)二硫酸銨、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨潤(rùn)土、云母、蒙脫石、囊脫石、鋰榮脫石、高嶺石、多水高嶺石、地開(kāi)石、粘土礦物、白堊、硅石、煅制二氧化硅、重晶石、石膏、滑石、氧化鎂、氧化鋁、氯氧化鉍、氧化鋅、硫酸堿土金屬鹽、碳酸堿土金屬鹽、磷酸堿土金屬鹽、羥基磷酸堿土金屬鹽、鹵代磷酸堿土金屬鹽、不溶性硅酸鹽、不溶性硅酸鋁鹽、不溶性碳酸鹽、不溶性硫酸鹽、不溶性磷酸鹽、不溶性羥基磷酸鹽、鹵代磷酸鹽、全氟烴或其衍生物、全氟羧酸或其鹽、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀感光計(jì)。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀/聚乙烯吡咯烷酮感光計(jì)。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的苯甲酸鈉感光計(jì)。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的過(guò)二硫酸鉀/叔丁醇感光計(jì)。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物選自下述種構(gòu)成的組原核生物界種、原核生物界種的孢子、真菌界種、真菌界種的孢子、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞以及病毒。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒選自下述構(gòu)成的組微小病毒、微小鼠病毒、犬微小病毒、牛微小病毒、豬微小病毒、貓微小病毒、環(huán)形病毒、圓環(huán)形病毒、微小RNA病毒、噬肝性病毒甲型肝炎病毒、以及腦脊髓炎病毒、阿內(nèi)羅病毒、腸道RNA病毒、微小病毒DNA噬菌體，以及光滑病毒RNA噬菌體。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，是與至少一種其他滅菌和/或微生物滅活方法聯(lián)合使用。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物液體包含至少一種添加劑，以減少對(duì)生物液體生物活性的破壞和/或喪失。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，是與用液體去垢劑處理同時(shí)進(jìn)行。
19.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用以滅活生物液體中微生物的光的有效劑量是指滅活生物液體中至少99.9％的存活微生物的劑量。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物液體選自如下液體構(gòu)成的組乳、乳清、乳制品、來(lái)源于乳的制品、果汁、來(lái)源于果汁的制品、蔬菜汁、來(lái)源于蔬菜的制品、原生植物汁、轉(zhuǎn)基因植物汁、配制飲料、加工飲料、發(fā)酵飲料、酒精飲料、血液、血漿、血漿組分、血清、來(lái)自于血液的液體、來(lái)自于血清的液體、來(lái)自于血漿的液體、包含蛋白組分的液體、脊髓液、腦液、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核細(xì)胞培養(yǎng)上清、真核細(xì)胞培養(yǎng)上清、原核細(xì)胞裂解液、真核細(xì)胞裂解液、外用治療性液體、經(jīng)腸道治療性液體、非腸道治療性液體、外用美容液體、診斷用液體。
21.一種用于確定從一個(gè)或多個(gè)光源發(fā)出的單色或多色光用以滅活非透明生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測(cè)量在所用光滅活波長(zhǎng)下單色或多色光對(duì)于與生物溶液的濁度、與生物溶液的濁度和吸光度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物溶液的濁度和吸光度以及粘度、與生物溶液的吸光度、或與生物溶液的粘度和吸光度相匹配的劑量測(cè)定溶液的影響，上述測(cè)量是基于采用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對(duì)薄層內(nèi)的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照以施加一能夠?qū)е驴蓽y(cè)量的物理量或化學(xué)量發(fā)生變化的規(guī)定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長(zhǎng)度薄到在規(guī)定時(shí)間內(nèi)只能吸收預(yù)定輻照度的入射光部分，ii)在對(duì)光輻照反應(yīng)器中劑量測(cè)定溶液輻照期間或之后，讀取與這些測(cè)到的量的變化相應(yīng)的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進(jìn)行，反之亦然。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，沿著所述光程長(zhǎng)度，100％或以下的所述入射光被吸收。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，沿著所述光程長(zhǎng)度，50％或以下的入射光被吸收。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，在流通式反應(yīng)器中對(duì)所述生物液體進(jìn)行滅活，所述規(guī)定通量可以通過(guò)改變規(guī)定輻照度和/或通過(guò)改變規(guī)定時(shí)間來(lái)改變，所述規(guī)定時(shí)間由流通式反應(yīng)器中生物液體的流速確定。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步包括，在對(duì)輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進(jìn)行輻照之前和之后，或者之前、期間和之后，通過(guò)滴定所述存活微生物的數(shù)量來(lái)確定劑量分布。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步包括在輻照過(guò)程中對(duì)一個(gè)或多個(gè)光源的強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確定輻照劑量。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述光在紫外區(qū)。
28.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，劑量測(cè)定溶液包含從下列中選取的試劑或試劑組合碘化堿金屬鹽、碘化堿土金屬鹽、碘化銨、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸堿金屬鹽、苯甲酸堿土金屬鹽、苯甲酸銨、過(guò)二硫酸堿金屬鹽、過(guò)二硫酸堿土金屬鹽、過(guò)二硫酸銨、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨潤(rùn)土、云母、蒙脫石、囊脫石、鋰榮脫石、高嶺石、多水高嶺石、地開(kāi)石、粘土礦物、白堊、硅石、煅制二氧化硅、重晶石、石膏、滑石、氧化鎂、氧化鋁、氯氧化鉍、氧化鋅、硫酸堿土金屬鹽、碳酸堿土金屬鹽、磷酸堿土金屬鹽、羥基磷酸堿土金屬鹽、鹵代磷酸堿土金屬鹽、不溶性硅酸鹽、不溶性硅酸鋁鹽、不溶性碳酸鹽、不溶性硫酸鹽、不溶性磷酸鹽、不溶性羥基磷酸鹽、鹵代磷酸鹽、全氟烴或其衍生物、全氟羧酸或其鹽、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
29.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀感光計(jì)。
30.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀/聚乙烯吡咯烷酮感光計(jì)。
31.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的苯甲酸鈉感光計(jì)。
32.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含稀釋的過(guò)二硫酸鉀/叔丁醇感光計(jì)。
33.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述劑量測(cè)定溶液包含導(dǎo)致混濁的試劑。
34.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述微生物選自下述種構(gòu)成的組原核生物界種、原核生物界種的孢子、真菌界種、真菌界種的孢子、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞以及病毒。
35.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述病毒選自下述構(gòu)成的組微小病毒、微小鼠病毒、犬微小病毒、牛微小病毒、豬微小病毒、貓微小病毒、環(huán)形病毒、圓環(huán)形病毒、微小RNA病毒、噬肝性病毒甲型肝炎病毒、以及腦脊髓炎病毒、阿內(nèi)羅病毒、腸道RNA病毒、微小病毒DNA噬菌體，以及光滑病毒RNA噬菌體。
36.如權(quán)利要求21所述的方法，是與至少一種其他滅菌或微生物滅活方法聯(lián)合使用。
37.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物液體包含至少一種添加劑，以減少對(duì)生物液體生物活性的破壞和/或喪失。
38.如權(quán)利要求21所述的方法，是與用液體去垢劑處理同時(shí)進(jìn)行。
39.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，用以滅活生物液體中微生物的光的有效劑量是指滅活生物液體中至少99.9％的存活微生物的劑量。
40.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，在流通式反應(yīng)器中對(duì)所述生物液體進(jìn)行滅活。
41.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物液體選自如下液體構(gòu)成的組乳、乳清、乳制品、來(lái)源于乳的制品、果汁、來(lái)源于果汁的制品、蔬菜汁、來(lái)源于蔬菜的制品、原生植物汁、轉(zhuǎn)基因植物汁、配制飲料、加工飲料、發(fā)酵飲料、酒精飲料、血液、血漿、血漿組分、血清、來(lái)自于血液的液體、來(lái)自于血清的液體、來(lái)自于血漿的液體、包含蛋白組分的液體、脊髓液、腦液、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核細(xì)胞培養(yǎng)上清、真核細(xì)胞培養(yǎng)上清、原核細(xì)胞裂解液、真核細(xì)胞裂解液、外用治療性液體、經(jīng)腸道治療性液體、非腸道治療性液體、外用美容液體、診斷用液體。
42.一種紫外光滅活流通式反應(yīng)器，其中一個(gè)或者多個(gè)光源被封套恒溫器包裹，恒溫并基本透明的液體流過(guò)所述封套恒溫器以移去來(lái)自輻照燈的熱量，從而保證幾乎不變的燈光強(qiáng)度。
43.如權(quán)利要求42所述的流通式反應(yīng)器，其特征在于，所述流通式反應(yīng)器選自下述類型構(gòu)成的組重力驅(qū)動(dòng)的產(chǎn)薄膜型、渦流主動(dòng)混合流型、離心驅(qū)動(dòng)的產(chǎn)薄膜型、盤(pán)管型、擋板管狀型、靜止混合管狀型、渦流靜止性混合流管型、層疊管型、渦流管型。
44.一種通過(guò)控制發(fā)自單個(gè)或多個(gè)光源的單色或多色光的光輻照總劑量以有效滅活間歇式反應(yīng)器中存在于生物液體中的微生物的方法，包括如下步驟a)基于滅活生物液體中的微生物時(shí)的單色或者多色光的有效輻照劑量，確定取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量、在間歇式反應(yīng)器中有效滅活微生物所需要的光輻照劑量速率和輻照時(shí)間；b)在滅活間歇式反應(yīng)器中生物液體中的微生物期間，記錄光輻照劑量速率和輻照時(shí)間；c)基于步驟b)的測(cè)量計(jì)算取決于吸收的輻照源光輻照總劑量；d)將步驟c)中測(cè)得的取決于吸收的輻照源光輻照總劑量與步驟a)中得到的取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量進(jìn)行比較；和e)一旦取決于吸收的輻照源光輻照總劑量等于或大于取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量，則中斷對(duì)生物液體進(jìn)行曝光。
45.如權(quán)利要求44所述的控制取決于吸收的輻照源靶光輻照總劑量的方法，其特征在于，繼續(xù)進(jìn)行所述方法，直到取決于吸收的輻照源光總劑量基本上等于取決于吸收的輻照源靶光總劑量，而不管輻照光劑量速率的變化和/或中間至少一個(gè)或者多個(gè)光源突然關(guān)閉。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，通過(guò)測(cè)量所述單色或多色光對(duì)于劑量測(cè)定溶液的影響來(lái)確定有效劑量，包括測(cè)量在所用光滅活波長(zhǎng)下單色或多色光對(duì)于與生物溶液的濁度、與生物溶液的濁度和吸光度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物溶液的濁度和吸光度以及粘度、與生物溶液的吸光度、或與生物溶液的吸光度和粘度相匹配的劑量測(cè)定溶液的影響，上述測(cè)量是基于采用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對(duì)薄層內(nèi)的劑量測(cè)定溶液進(jìn)行輻照以施加一能夠?qū)е驴蓽y(cè)量的物理量或化學(xué)量發(fā)生變化的規(guī)定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長(zhǎng)度薄到在規(guī)定時(shí)間內(nèi)只能吸收預(yù)定輻照度的入射光部分，ii)在對(duì)光輻照反應(yīng)器中劑量測(cè)定溶液輻照期間或之后，讀取與這些測(cè)到的量的變化相應(yīng)的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進(jìn)行，反之亦然。
47.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，使用至少一種電子輻射計(jì)、至少一種圖表記錄器和/或至少一種計(jì)數(shù)器來(lái)記錄所述輻照光劑量速率和所述輻照時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種確定從一個(gè)或者多個(gè)光源發(fā)出的單色光或者多色光用以滅活存在于生物體液特別是非透明液體中微生物的有效劑量的方法。另外，本發(fā)明液提供了一種滅活存在于流通式反應(yīng)器中生物液體所含微生物的方法。而且，本發(fā)明有利地提供了一種具有一個(gè)或者多個(gè)熱穩(wěn)定光源的流通式反應(yīng)器。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一個(gè)控制從一個(gè)或多個(gè)光源發(fā)出的單色或者多色光的光輻照總劑量從而有效滅活間歇反應(yīng)器中微生物的方法。
文檔編號(hào)G01N23/00GK101065154SQ200580034827
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者海因茨·安德利, 皮特·馬西森, 漢斯·皮特·施瓦茨, 皮特·圖雷切克, 托馬斯·克萊爾, 丹尼爾·R·博格斯 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司, 巴克斯特保健股份有限公司