專利名稱：一種檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及檢測中藥產(chǎn)品質(zhì)量的方法，具體涉及一種檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法。
背景技術(shù)：
靈芝是中醫(yī)藥用藥歷史較長的中藥之一，兩千年前東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》中將靈芝列為上品，認(rèn)為“久食，輕身不老，延年神仙”。明朝李時(shí)珍編著的《本草綱目》中記載靈芝味苦、平，無毒，益心氣，活血，入心充血，助心充脈，安神，益肺氣，補(bǔ)肝氣，補(bǔ)中，增智慧，好顏色，利關(guān)節(jié)，堅(jiān)筋骨，祛痰，健胃。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明靈芝含有多種生理活性物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)、增強(qiáng)人體免疫力，對神經(jīng)衰弱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、高血壓、肝炎、糖尿病、腫瘤等有良好的協(xié)同治療作用，已有研究表明其中的靈芝多糖肽可通過抑制腫瘤新生血管的形成及抑制癌細(xì)胞的侵襲而抑制腫瘤的生長(CN200410014681.3)。最新研究表明靈芝還具有抗疲勞，美容養(yǎng)顏，延緩衰老，防治愛滋病等功效。故，芝多糖肽被同業(yè)認(rèn)同為靈芝類產(chǎn)品質(zhì)量檢測的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。
目前，市場上靈芝產(chǎn)品繁多，質(zhì)量良莠不齊。雙靈固本(商品名)口服制劑是在中醫(yī)藥理論的基礎(chǔ)指導(dǎo)下，研制成的含有靈芝多糖肽成分的口服制劑。經(jīng)臨床觀察證明具滋補(bǔ)強(qiáng)身，扶正固本的功效。對消化道腫瘤及術(shù)后，放、化療引起的體弱，厭食，失眠等癥有較好的康復(fù)保健作用。為保持雙靈固本口服制劑其臨床恒定的有效性，必須進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。通常采用的檢測手段存在較繁瑣，周期長靈敏度低等缺陷，目前尚缺少一種能有效檢測靈芝產(chǎn)品中活性成分靈芝多糖肽的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法，具體涉及一種以牛血清白蛋白為對照品對靈芝類產(chǎn)品中靈芝多糖肽成分的含量的測定方法。
研究證實(shí)靈芝多糖肽是靈芝起主要藥理作用的成分之一，本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，能有效地測得靈芝及靈芝產(chǎn)品中多糖肽的肽的含量，并能克服靈芝多糖及植物中脂類物質(zhì)的干撓，檢測靈敏高、重復(fù)性好，有利于靈芝及靈芝產(chǎn)品制劑質(zhì)量的調(diào)控及其療效的發(fā)揮及對產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、貯藏期質(zhì)量的控制。
本發(fā)明采用雙靈固本口服制劑為測試產(chǎn)品，其內(nèi)含生理活性物質(zhì)靈芝多糖肽，所述的靈芝多糖肽是由6-7種單糖和5-20個(gè)氨基酸組成的糖肽，可從靈芝(Ganogerma lucidum)提取而得，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)所述的多糖蛋白GL-PP(申請?zhí)?00410014681.3)具有較強(qiáng)藥理活性的成分。所述的雙靈固本口服制劑通過下述方法制備取靈芝孢子，經(jīng)超音速噴霧負(fù)壓低溫干燥法破壁，備用。取靈芝粉碎成粗粉，加乙醇，加熱回流提取3次，濾過(藥渣備用)，合并濾液，減壓回收乙醇，并濃縮成浸膏，備用；藥渣加水煎煮3次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮成浸膏，備用；合并上述兩種浸膏，加水稀釋成清膏，噴霧干燥，加入上述破壁的靈芝孢子，混勻，制成口服制劑。
本發(fā)明依據(jù)雙靈固本口服制劑內(nèi)容物的特征，以牛血清白蛋白為對照品，采用蛋白質(zhì)測定法(Folin-酚試劑法)對制劑中靈芝多糖肽成分進(jìn)行含量測定。
本發(fā)明利用多糖蛋白GL-PP其氨基酸肽類物質(zhì)的共性，即蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵(-CO-NH-)，因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物；Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)Folin試劑(磷鉬酸-磷鎢酸試劑)，和/或蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，在堿性條件下不穩(wěn)定，生成藍(lán)色化合物(鉬藍(lán))的原理，通過比色便可測知產(chǎn)品樣本中的肽類含量。本方法經(jīng)對雙靈固本口服制劑測定，突出體現(xiàn)出操作簡便、靈敏度高、且不受溶液中多糖干擾的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明技術(shù)方案通過如下步驟實(shí)現(xiàn)(1)制備肽對照品溶液取牛血清白蛋白(市購)對照品加水制成每1ml含0.3mg的溶液，即得；(2)制備測試品溶液 A法取雙靈固本口服制劑1g，精密稱定，加水溶解制成每1ml中含0.6mg的溶液，過濾，備用；B法取供試品1g，加水制成每1ml含中10mg的溶液，60℃水浴加熱10分鐘，超聲10分鐘，放冷，過濾，取濾液4ml，加無水乙醇12ml，攪拌，以10000rpm離心10分鐘，棄去上清夜，沉淀加水溶解并定容至10ml，即得；
(3)堿性銅試液取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合，作為乙液，臨用前，合并兩液，并加水至500ml；福林酚試液 取2mol/L市售福林酚貯備液，按1∶16比例稀釋，即得；(4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再加堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林酚試液4.0ml，搖勻，于55℃水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫。以0管為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)在750nm波長處測定吸收度，以牛血清白蛋白的量與其對應(yīng)的吸收度計(jì)算回歸方程。
(5)測定 精密量取測試品溶液1.0ml，再加堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林酚試液4.0ml，搖勻，于55℃水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫；以標(biāo)準(zhǔn)曲線0管為空白，在750nm波長處測定吸收度，由回歸方程計(jì)算，即得；按干燥品計(jì)算，其中含肽量以牛血清白蛋白計(jì)不得少于3.0％。
本發(fā)明對上述靈芝多糖肽含量測定的方法進(jìn)行了驗(yàn)證a.最大吸收波長的選擇精密量取對照品溶液和供試品液各0.5ml，分別置于具塞試管中，加水至1.0ml，再加堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林酚試液4.0ml，搖勻，于55℃水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫。以蒸餾水2ml同上操作制做空白溶液，在400～800nm波長范圍內(nèi)掃描。掃描結(jié)果顯示牛血清白蛋白對照品和供試品的入max均為750nm。說明此波長對肽類物質(zhì)測定具有共性，對被測物有一定的選擇性和代表性。表1是供試品和對照品400~800nm的吸收情況表1

b.顯色的穩(wěn)定性依照選擇的最大吸收波長對供試品溶液及對照品溶液測定方法及在入max處對供試品及對照品的顯色穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果表明，樣品在1-3小時(shí)內(nèi)可測定出結(jié)果。表2是顯色穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果。
表2

c.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再加堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林酚試液4.0ml，搖勻，于55℃水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫。以0管為空白，照分光光度法，在750nm波長處測定吸收度。以牛血清白蛋白的量與其對應(yīng)的吸收度計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明，牛血清白蛋白吸收強(qiáng)度在62.8～314ug范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。表3是線性關(guān)系結(jié)果。
表3

d.精密度精密量取對照品溶液0.6ml，取6份照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定，結(jié)果表明，精密度良好。表4是精密度測定結(jié)果。
表4

e.重復(fù)性以雙靈固本口服制劑批號為040601供試品，照供試品溶液制備法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液1ml，共6份，照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定，表5是重復(fù)性測定結(jié)果。
表5

f.回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品1g，共計(jì)稱得5份，于每份樣本中加入0.2ml對照品溶液，加水制成每1ml含中10mg的溶液，60℃水浴加熱10分鐘，超聲10分鐘，放冷，過濾，取濾液4ml，加無水乙醇12ml，攪拌，以10000rpm離心10分鐘，棄去上清夜，沉淀加水溶解并定容至10ml。分別各加水至1.0ml，再加堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林酚試液4.0ml，搖勻，于55℃水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫。以0管為空白，照分光光度法，在750nm波長處測定吸收度，結(jié)果表明牛血清白蛋白回收率達(dá)100.04％，RSD％為1.33％，方法準(zhǔn)確性良好。。表6是回收率試驗(yàn)結(jié)果。
表6



圖1是選擇最大吸收波長圖。
圖2是牛血清白蛋白吸收強(qiáng)度線性關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用以牛血清白蛋白為對照品對雙靈固本口服制劑中靈芝多糖肽成分進(jìn)行含量測定。
制備肽對照品溶液取牛血清白蛋白對照品加水制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。
分別配制下述溶液①供試品溶液A法取本品1g，精密稱定，加水溶解制成每1ml中含0.6mg的溶液，過濾，備用；B法取供試品1g，加水制成每1ml含中10mg的溶液，60℃水浴加熱10分鐘，超聲10分鐘，放冷，過濾，取濾液4ml，加無水乙醇12ml，攪拌，以10000rpm離心10分鐘，棄去上清夜，沉淀加水溶解并定容至10ml，即得。
②堿性銅試液 取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合，作為乙液。
臨用前，合并兩液，并加水至500ml。
③福林酚試液 取2mol/L市售福林酚貯備液，按1∶16比例稀釋，即得。
制備標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再加堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林酚試液4.0ml，搖勻，于55℃水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫。以0管為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)在750nm波長處測定吸收度。以牛血清白蛋白的量與其對應(yīng)的吸收度計(jì)算回歸方程。
測定分別對各劑型雙靈固本口服制劑樣品靈芝多糖肽中肽的含量進(jìn)行測定，精密量取供試品溶液1.0ml，再加堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林酚試液4.0ml，搖勻，于55℃水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫。以標(biāo)準(zhǔn)曲線0管為空白，在750nm波長處測定吸收度，由回歸方程計(jì)算，即得。按干燥品計(jì)算，含肽以牛血清白蛋白計(jì)算其樣品的含量％值。
表7本發(fā)明檢測方法對各劑型雙靈固本口服制劑檢測結(jié)果。
表7

權(quán)利要求
1.一種檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法，特征在于采用以牛血清白蛋白為對照品，對靈芝產(chǎn)品中靈芝多糖肽進(jìn)行含量測定，包括如下步驟(1)制備肽對照品溶液；(2)制備測試品溶液；(3)配制堿性銅試液和福林酚試液；(4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)含肽量測定。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法，其中所述的靈芝產(chǎn)品是雙靈固本口服制劑，包括雙靈固本片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑和軟膠囊劑。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法，其特征在于所述的對照品溶液其中每1ml含0.3mg牛血清白蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法，其特征在于所述的測試品溶液通過A法制備取雙靈固本口服制劑1g，加水溶解成每1ml含0.6mg所述制劑的溶液，過濾，備用；或通過B法制備取供試品1g，加水制成每1ml含10mg的溶液，60℃水浴加熱10分鐘，超聲10分鐘，放冷，過濾，取濾液4ml，加無水乙醇12ml，攪拌，10000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀加水溶解并定容至10ml，即得。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法，其特征在于所述的堿性銅試液通過下述方法制備取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400ml使溶解，為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合，為乙液，用前，合并兩液，并加水至500ml。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法，其特征在于所述的福林酚試液是將2mol/L福林酚貯備液，按1∶16稀釋制得。
全文摘要
本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及檢測中藥產(chǎn)品質(zhì)量的方法，具體涉及一種檢測靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的方法。本發(fā)明以牛血清白蛋白為對照品對雙靈固本口服制劑中靈芝多糖肽成分的含量測定。本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，能有效地測得靈芝及靈芝產(chǎn)品中多糖肽的肽的含量，并能克服靈芝多糖及植物中脂類物質(zhì)的干撓，檢測靈敏高、重復(fù)性好，有利于靈芝及靈芝產(chǎn)品制劑質(zhì)量的調(diào)控及其療效的發(fā)揮及對產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、貯藏期質(zhì)量的控制。
文檔編號A61P1/00GK1939351SQ20051003027
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者林樹錢, 林志彬, 劉梅英, 李寶棣, 王賽貞, 劉斌, 曹琦珍, 王峰, 吳云鳴 申請人:西安綠谷制藥有限公司, 福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所