專利名稱：禽傳染性支氣管炎三基因組合dna疫苗及應(yīng)用的制作方法
專利說(shuō)明禽傳染性支氣管炎三基因組合DNA疫苗及應(yīng)用 本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，是一種禽傳染性支氣管炎三基因組合DNA疫苗及應(yīng)用。禽傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是冠狀病毒科冠狀病毒屬的禽傳染性支氣管炎病毒引起的雞的一種急性、高度接觸性的傳染病，其特征為病雞出現(xiàn)呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋數(shù)量和品質(zhì)下降以及腎臟病變等。禽傳染性支氣管炎病毒可感染所有日齡的雞，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、死亡、增重和飼料報(bào)酬降低；還常常引起霉形體混合感染以及大腸桿菌病等繼發(fā)感染而提高雞群的死亡率，給養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。目前，該病呈世界廣泛流行，是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一。
禽傳染性支氣管炎病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬的代表種，其抗原性異常復(fù)雜，目前世界上分離的臨床毒株已超過(guò)100多株，分屬30種以上血清型。禽傳染性支氣管炎病毒屬于單股正鏈的RNA病毒，基因組全長(zhǎng)27.6kb，主要編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核蛋白(N)。許多研究表明，S蛋白裂解為S1和S2兩個(gè)亞單位，其中S1蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體，為IBV的主要免疫原。N蛋白攜帶著T細(xì)胞表位，在免疫和保護(hù)上可能發(fā)揮作用。M蛋白的免疫原性較低，也有報(bào)道M蛋白上可能存在著具有重要免疫作用的抗原決定簇，能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(參見(jiàn)殷震，劉景華等。動(dòng)物病毒學(xué)(第二版)。北京科學(xué)出版社，1997)。
禽傳染性支氣管炎病毒不同毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異，不同血清型毒株之間交叉保護(hù)力弱。在防制上，常規(guī)單一毒株疫苗常有免疫失敗的報(bào)道，多價(jià)疫苗可較好解決防治問(wèn)題。滅活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返強(qiáng)的問(wèn)題，且能激發(fā)良好的體液免疫反應(yīng)。其不足之處是使用劑量大，需要配合佐劑，制備比較復(fù)雜，因而成本較高。加之滅活疫苗不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，而一系列的研究證實(shí)在IBV的免疫保護(hù)中，體液免疫和細(xì)胞免疫占有重要地位(參見(jiàn)王紅寧主編。禽呼吸系統(tǒng)疾病。北京農(nóng)業(yè)科技出版社，2002；B W卡爾尼克主編。禽病學(xué)(第九版)。北京北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991，407-418；Kusters J G，Niesters，H G M，et al.Virology，1989，169217-221；AvellanedaG E，Villeges P，Jackwood M W，et al.Avian Dis，1994，38589-597)。隨著禽傳染性支氣管炎病毒流行病學(xué)調(diào)查、分子生物學(xué)研究、免疫機(jī)制等研究的逐步深入，構(gòu)建該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因的真核表達(dá)載體，研制DNA疫苗用于該病預(yù)防具有重要意義。
近年來(lái)許多研究者試圖研究禽傳染性支氣管炎病毒的DNA疫苗，并取得了一定的進(jìn)展。步志高等(參見(jiàn)步志高，江國(guó)托等。中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18(6)527-530)以國(guó)內(nèi)類M41地方流行株IBV纖突糖蛋白S1基因?yàn)槊庖咴?，?gòu)建了DNA免疫表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明該表達(dá)質(zhì)?？赏瑫r(shí)誘導(dǎo)機(jī)體形成針對(duì)IBV的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。陳洪巖等(參見(jiàn)陳洪巖，江國(guó)托，楊奇?zhèn)サ?。中?guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21(4)250-253)將雞傳染性支氣管炎病毒腎型T株S1基因cDNA連接于pcDNA3構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)肌肉注射免疫SPF雞后血清IgG抗體逐漸升高，至35日齡左右達(dá)到高峰，但血清IgG抗體升高幅度不及IB油苗。免疫攻毒后有40％的雞可耐過(guò)強(qiáng)毒的攻擊。劉思國(guó)等(參見(jiàn)劉思國(guó)，康麗鵑，江國(guó)托等。中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，21(1)14-16)將雞傳染性支氣管炎HB株的N基因亞克隆到pcDNA3，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-N。用該質(zhì)粒兩次免疫SPF雛雞一周后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果保護(hù)率為40％，表明N蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗感染中發(fā)揮了作用。
王紅寧等(參見(jiàn)Wang H N，Wu Q Z，Huang Y，et al.Avian Disease，1997，41(2)279-282)完成了我國(guó)主要養(yǎng)雞地區(qū)禽傳染性支氣管炎冠狀病毒流行病學(xué)調(diào)查，探明了禽傳染性支氣管炎冠狀病毒主要流行株類型及其分布分離，并用RT-PCR對(duì)多株國(guó)內(nèi)分離株的S1、M、N基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定分析，在國(guó)際基因庫(kù)Genbank中注冊(cè)禽傳染性支氣管炎病毒中國(guó)株的3個(gè)S1基因序列(AY397527～AY397529)、8個(gè)M基因序列(AY302742～AY302749)和3個(gè)N基因序列(AY167729～AY167731)。本發(fā)明的目的是將由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的禽傳染性支氣管炎病毒中國(guó)分離株的S1、M、N結(jié)構(gòu)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例進(jìn)行組合，研制成禽傳染性支氣管炎三基因組合的DNA疫苗。
本發(fā)明進(jìn)行了禽傳染性支氣管炎三基因組合的DNA疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)工藝研究，對(duì)生產(chǎn)真核表達(dá)質(zhì)粒的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選，確定出含有質(zhì)粒IBS1、pIBM和pIBN的工程菌的最優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
本發(fā)明對(duì)禽傳染性支氣管炎三基因組合的DNA疫苗的免疫原性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明三基因組合的DNA疫苗的免疫保護(hù)率達(dá)到90％。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果在于將禽傳染性支氣管炎病毒中國(guó)分離株的S1、M、N結(jié)構(gòu)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例進(jìn)行組合，使DNA疫苗的免疫保護(hù)率達(dá)到90％。1.本發(fā)明所使用的真核表達(dá)質(zhì)粒pIBS1、pIBM和pIBN由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并提供；宿主大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存；禽傳染性支氣管炎病毒攻毒用毒株SAIBk株由實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。
2.本發(fā)明種子培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基，主要成分胰蛋白胨10g/L，母提取物5g/L，NaCl 10g/L，5mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0?；A(chǔ)培養(yǎng)基M96g/L Na2HPO4，g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，2g/L NH4Cl，0g/L酵母提取物，2g/L葡萄糖。以上均以115℃高壓蒸汽滅菌20min。
3.對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化從LB固體培養(yǎng)基中挑取單菌落，接種于盛有10ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。在100ml的三角瓶中加入10ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入500μl的菌種，37℃，200rpm/min，培養(yǎng)20h。
菌量的測(cè)定菌體濃度測(cè)定采用比色法，將培養(yǎng)液稀釋到一定程度，在752型分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600nm處測(cè)定光吸收值，光程為1cm。
質(zhì)粒的制備和純化質(zhì)粒制備和純化(參見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)?？茖W(xué)出版社，2000)，并加以優(yōu)化。
質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)定取一接種環(huán)菌液接入3ml LB培養(yǎng)基，攪勻后取1ml稀釋3倍，根據(jù)菌液濃度取20-40μl涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，檢查長(zhǎng)出的菌落個(gè)數(shù)。為驗(yàn)證質(zhì)粒的存在與大小，再?gòu)钠桨迳瞎稳∵m量菌落對(duì)其進(jìn)行質(zhì)粒的快速抽提、電泳，并對(duì)其進(jìn)行酶切以檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
質(zhì)粒濃度分析取1.5ml菌液，離心后以優(yōu)化的堿裂解法提質(zhì)粒，采用比色法，將質(zhì)粒稀釋到一定程度，在752型分光光度計(jì)于波長(zhǎng)260nm處測(cè)定光吸收值，光程為1cm，即為質(zhì)粒DNA含量，D260為10時(shí)質(zhì)粒DNA含量為50μg/ml。
研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基的碳源、氮源和它們不同的組合及接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度對(duì)質(zhì)粒的產(chǎn)量有很大的影響。通過(guò)單因子分析和正交實(shí)驗(yàn)，確定出含有質(zhì)粒pcDNA-S1、pcDNA-M、pcDNA-N的工程菌的最優(yōu)化培養(yǎng)基組成為5g/L葡萄糖，6ml/L甘油，12g/L胰蛋白胨，15g/L酵母提取物，3.0g/L氯化氨，6g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl。而適合工程菌生長(zhǎng)的最佳條件是接種量2％，裝液量10ml/100ml，培養(yǎng)溫度37℃。
4.真核表達(dá)質(zhì)粒的大量提取及純化采用優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)真核表達(dá)質(zhì)粒pIBS1、pIBM和pIBN進(jìn)行了大量提取及純化。質(zhì)粒的提取及純化方法(參見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版).科學(xué)出版社，2000)。
將純化后的質(zhì)粒用PBS稀釋，在紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280，并計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度，最后將純化的質(zhì)粒按1μg/μl溶于PBS溶液中備用。將pIBS1、pIBM和pIBN按照1∶1∶1的比例混合，研制成禽傳染性支氣管炎S1、M、N三基因組合的DNA疫苗。
5.免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)雛雞進(jìn)行隨機(jī)分組，7日齡時(shí)腿部肌肉分點(diǎn)注射研制成禽傳染性支氣管炎S1、M、N三基因組合的DNA疫苗(質(zhì)粒含量200μg)。并設(shè)立空白對(duì)照組，肌注生理鹽水0.5ml/只。免疫后第4周用強(qiáng)毒株SAIBk株對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行攻毒，觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)病及死亡雞只，同時(shí)做病理剖檢觀察，直至攻毒后4周。結(jié)果表明三基因組合的DNA疫苗的免疫保護(hù)率達(dá)到90％。
權(quán)利要求
1.禽傳染性支氣管炎三基因組合DNA疫苗及應(yīng)用，其特征在于將禽傳染性支氣管炎病毒中國(guó)分離株的S1、M、N結(jié)構(gòu)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例進(jìn)行組合，研制成禽傳染性支氣管炎三基因組合的DNA疫苗，并對(duì)其免疫原性和生產(chǎn)真核表達(dá)質(zhì)粒的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選。
2.權(quán)利要求1禽傳染性支氣管炎三基因組合DNA疫苗，其特征在于將S1、M、N結(jié)構(gòu)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照1∶1∶1的比例，研制成禽傳染性支氣管炎三基因組合的DNA疫苗，其免疫保護(hù)率達(dá)到90％，可用于禽傳染性支氣管炎的預(yù)防。
3.權(quán)利要求1生產(chǎn)真核表達(dá)質(zhì)粒的工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，其特征在于工程菌的最優(yōu)化培養(yǎng)基組成為5g/L葡萄糖，6ml/L甘油，12g/L胰蛋白胨，15g/L酵母提取物，3.0g/L氯化氨，6g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl。而適合工程菌生長(zhǎng)的最佳條件是接種量2％，裝液量10ml/100ml，培養(yǎng)溫度37℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)藥生物工程研究領(lǐng)域，是一種禽傳染性支氣管炎三基因組合DNA疫苗及應(yīng)用。本發(fā)明的目的是將構(gòu)建并保存的禽傳染性支氣管炎病毒中國(guó)分離株的S1、M、N結(jié)構(gòu)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例進(jìn)行組合，研制成禽傳染性支氣管炎三基因組合的DNA疫苗，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了研究。本發(fā)明進(jìn)行了真核表達(dá)質(zhì)粒生產(chǎn)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件篩選，確定出含有質(zhì)粒IBS1、pIBM和pIBN的工程菌的最優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1903372SQ20051002135
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者王紅寧, 周生, 唐夢(mèng)君, 黃勇, 吳琦, 陳惠 , 柳萍, 胡慧瓊, 李曉英, 陳萍, 余祖華, 汪洋, 白天, 潘勝 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 王紅寧, 周生