專(zhuān)利名稱(chēng)：治療細(xì)胞外基質(zhì)紊亂的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)締組織生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及治療細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)相關(guān)的結(jié)締組織紊亂，例如纖維化，和繼發(fā)性疾病，例如腎臟疾病，糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化。
前言ECM是一種膠樣物質(zhì)，通常在結(jié)締組織中具有結(jié)構(gòu)功能。ECM由基質(zhì)和纖維組成。基質(zhì)是無(wú)定形物質(zhì)，其填充間質(zhì)組織，由組織液，細(xì)胞吸附蛋白和蛋白聚糖組成。細(xì)胞吸附蛋白使得結(jié)締組織細(xì)胞附著到基質(zhì)元件上。蛋白聚糖能保持水份，從而形成半硬水合膠。
多聚糖的相關(guān)數(shù)量和種類(lèi)有助于決定基質(zhì)的性能。例如，多聚糖數(shù)量越多，基質(zhì)越硬?；|(zhì)支撐細(xì)胞，將其連接在一起，并作為一種介質(zhì)，通過(guò)該介質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)成分和其他溶解物質(zhì)能在毛細(xì)血管和細(xì)胞之間擴(kuò)散。
基質(zhì)中的纖維提供強(qiáng)度。結(jié)締組織基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)三種纖維膠原，彈性和網(wǎng)狀纖維。膠原纖維(白纖維)極為強(qiáng)韌，提供高抗張強(qiáng)度，該強(qiáng)度是抵抗縱向應(yīng)力的能力。由于新鮮膠原纖維具有閃亮的白色外觀，該纖維有時(shí)也被稱(chēng)之為“白纖維”。彈性纖維(黃纖維)能伸展到原長(zhǎng)度的1-1.5倍，但松解后又能回縮到初始長(zhǎng)度。在需要更大彈性的組織中能發(fā)現(xiàn)他們，例如肺，血管壁。新鮮的彈性纖維外觀呈黃色，也稱(chēng)之為黃纖維。網(wǎng)狀纖維是一種纖細(xì)成膠纖維。該纖維形成精巧分枝狀的網(wǎng)狀物，支撐著柔軟器官，例如肝臟和脾臟。
雖然ECM在機(jī)體內(nèi)明顯地起到重要的結(jié)構(gòu)功能，但ECM紊亂也是常見(jiàn)和嚴(yán)重的。纖維化是在動(dòng)物體中源于ECM超量產(chǎn)生導(dǎo)致瘢痕組織產(chǎn)生的普通術(shù)語(yǔ)。已經(jīng)證實(shí)，在美國(guó)，45％的死亡歸因于纖維增生紊亂。
纖維化可能源于多種原因，包括外傷，手術(shù)，感染，環(huán)境污染，酒精和其它類(lèi)毒素。有多種纖維化的實(shí)例，包括心臟病發(fā)作后的瘢痕組織形成，結(jié)果損傷心臟泵功能。糖尿病經(jīng)常引起腎臟損傷和瘢痕形成，結(jié)果導(dǎo)致腎功能進(jìn)行性損傷。甚至手術(shù)后，瘢痕組織能在內(nèi)部器官之間形成，從而引起攣縮、疼痛，在某些情況下還引起不孕。
盡管纖維化紊亂可以是急性或者慢性的，但都具有相同的特征過(guò)度膠原聚集，和正常組織被瘢痕組織代替后，出現(xiàn)相關(guān)功能喪失。
急性纖維化(通常伴隨突然和嚴(yán)重的發(fā)作和短期持續(xù))作為各種外傷形式的共同反應(yīng)而發(fā)生，所述外傷包括事故損傷、感染、手術(shù)、燒傷、放射和化療治療。所有外傷損傷組織都傾向于瘢痕化且變?yōu)槔w維化，尤其是反復(fù)損傷時(shí)。
慢性纖維化可源于病毒感染、糖尿病、高血壓和其他慢性狀況誘導(dǎo)進(jìn)行性纖維化，結(jié)果引起組織功能持續(xù)喪失。影響最普遍的是肝臟、腎臟和肺。深度器官纖維化常常是極為嚴(yán)重的，因?yàn)槠鞴俟δ苓M(jìn)行性喪失導(dǎo)致發(fā)病、住院治療、透析、殘疾和甚至死亡。
盡管ECM紊亂廣泛普遍存在，使人衰弱，且經(jīng)常威脅生命，但目前沒(méi)有有效的治療。由于這種ECM相關(guān)紊亂的多種形式的不利臨床反應(yīng)，顯然需要有效的治療。
申請(qǐng)人克服或減輕了現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)一種已知細(xì)胞蛋白參與ECM紊亂的病理生理過(guò)程。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供一種改變細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白水平的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂自身抗原(cell division autoantigen，CDA)的表達(dá)或活性。申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，CDA參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的ECM蛋白水平的控制途徑。本發(fā)明涉及多種ECM相關(guān)紊亂，例如腎臟纖維化和動(dòng)脈粥樣硬化。
CDA可以是細(xì)胞分裂自身抗原1(CDA1)，或其功能等同物或衍生物。
本發(fā)明另一方面提供一種治療或預(yù)防ECM蛋白合成相關(guān)狀況的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)CDA的表達(dá)和/或活性。
本發(fā)明還提供一種非-人動(dòng)物，用于研究ECM紊亂，所述動(dòng)物包含以改變水平表達(dá)CDA1的細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面提供一種篩選能調(diào)節(jié)ECM合成的試劑的方法，該方法包括以下步驟提供能表達(dá)CDA1的動(dòng)物或者細(xì)胞，將所述動(dòng)物或者細(xì)胞暴露到試劑中，和測(cè)定試劑對(duì)CDA1表達(dá)和/或活性的影響。
本發(fā)明進(jìn)一步包括通過(guò)本發(fā)明的篩選方法鑒定的試劑，以及包括該試劑的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種治療或預(yù)防ECM相關(guān)狀況的方法，該方法包括對(duì)需要所述治療或預(yù)防的動(dòng)物施予有效量的本發(fā)明的藥物組合物。
本發(fā)明還提供一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中CDA1表達(dá)和/或活性的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露在能調(diào)節(jié)下列因子活性的試劑中，所述因子選自血管緊張素II，TGFβ和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種診斷ECM蛋白合成相關(guān)狀況的方法，所述方法包括從動(dòng)物體中獲得生物樣本，測(cè)定樣本中的CDA1水平，和比較樣本中的CDA1水平和參考值其中，樣本中的CDA1水平統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著高于或低于參考值時(shí)，診斷為陽(yáng)性。


附圖1顯示遠(yuǎn)端小管和集合管中的CDA1表達(dá)。該部分(sections)用HE對(duì)染(核染為藍(lán)色)。板A人組織。板B大鼠腎臟組織。
附圖2顯示響應(yīng)于體內(nèi)Ang II刺激，腎臟內(nèi)CDA1表達(dá)增高。板ACDA1表達(dá)對(duì)照。板B暴露于血管緊張素II后的CDA1表達(dá)。板C暴露于血管緊張素II后的TGFβ1表達(dá)。圖D暴露于血管緊張素II后的TGFβ2表達(dá)。
附圖3顯示腎臟質(zhì)量減少后CDA1表達(dá)和纖維化增加。該部分用HE對(duì)染(核染為藍(lán)色)。板A次全部腎切除術(shù)時(shí)的CDA1表達(dá)。板B暴露于纈沙坦(valsartan)后次全部腎切除術(shù)時(shí)的CDA1表達(dá)。
附圖4顯示近端小管細(xì)胞(proximal tubule cells)中CDA1過(guò)表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生。板A在載體轉(zhuǎn)染的NRK細(xì)胞中的膠原IV染色。板B在CDA1轉(zhuǎn)染的NRK細(xì)胞中的膠原IV染色。板C在載體轉(zhuǎn)染的NRK細(xì)胞中的纖連蛋白染色。板D在CDA1轉(zhuǎn)染的NRK細(xì)胞中的纖連蛋白染色。
附圖5顯示糖尿病大鼠腎臟中的CDA1表達(dá)。該部分用HE對(duì)染(核染為藍(lán)色)。板A對(duì)照腎臟中的CDA1表達(dá)。板B8周時(shí)的CDA1表達(dá)。板C32周時(shí)的CDA1表達(dá)。
附圖6顯示動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的CDA1表達(dá)。CDA1染色為棕色，核染色為藍(lán)色。板A非糖尿病小鼠動(dòng)脈。板B糖尿病(apoE)小鼠動(dòng)脈。
附圖7顯示編碼人CDA1的DNA序列。
附圖8顯示人CDA1蛋白質(zhì)序列。
發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明提供一種改變細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白水平的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂自身抗原(CDA)的表達(dá)或活性。申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，CDA參與控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的ECM蛋白水平的途徑。
ECM是一種復(fù)雜結(jié)構(gòu)實(shí)體，圍繞并支撐著哺乳動(dòng)物組織中的細(xì)胞。ECM經(jīng)常被認(rèn)為是結(jié)締組織。ECM由三個(gè)主要的生物分子類(lèi)別組成結(jié)構(gòu)蛋白(膠原和彈性蛋白)，特化蛋白(原纖蛋白，纖連蛋白，和層粘連蛋白)和蛋白聚糖。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選ECM蛋白選自膠原，彈性蛋白，原纖蛋白，纖連蛋白，層粘連蛋白和蛋白聚糖。更為優(yōu)選，ECM蛋白為纖連蛋白或膠原IV。
本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)CDA的表達(dá)或活性”是指和非更改水平比較，更改或改變CDA的表達(dá)和/或活性。調(diào)節(jié)表達(dá)可以包括誘導(dǎo)或增加表達(dá)和/或活性或者減少表達(dá)和/或活性。
細(xì)胞中CDA的表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)可通過(guò)使用CDA拮抗劑、抑制劑、模擬物或衍生物而獲得。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”或“抑制劑”是指阻滯或調(diào)節(jié)CDA生物活性的試劑。拮抗劑和抑制劑蛋白，核酸，碳水化合物，抗體或其他任何分子或配體。蛋白可以包括酶，該酶能降解CDA，因而影響細(xì)胞內(nèi)外的CDA水平。其他CDA活性和/或表達(dá)調(diào)節(jié)劑包括一些合理設(shè)計(jì)的，合成的抑制劑。
CDA的表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)可通過(guò)直接或間接方法而獲得。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的直接方法可以獲得CDA的表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)，所述方法包括但不僅限于，敲除技術(shù)，反義技術(shù)，三鏈螺旋(triplehelix)技術(shù)，靶向突變，基因治療，作用于轉(zhuǎn)錄的試劑調(diào)節(jié)。CDA的表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)的間接方法包括但不僅限于，靶向上游或下游調(diào)節(jié)子，例如細(xì)胞因子。
術(shù)語(yǔ)“活性”涉及CDA在細(xì)胞中的功能，包括CDA結(jié)合到陪伴分子，上游或下游效應(yīng)分子的能力，因而活化或抑制影響ECM蛋白產(chǎn)生的上游或下游途徑。
優(yōu)選地，細(xì)胞來(lái)源于腎臟組織或血管組織。以前沒(méi)有報(bào)道腎臟中CDA1表達(dá)。申請(qǐng)人的研究顯示，CDA1在包括末端小管(distaltubules)和集合管(參見(jiàn)附圖4)的腎臟中表達(dá)。CDA1在正常大鼠的末端小管和集合管的表達(dá)證實(shí)了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核模式。CDA1很少在正常大鼠腎的腎小球中表達(dá)。
更為優(yōu)選地，細(xì)胞選自腎足細(xì)胞，腎近端小管細(xì)胞，腎集合管細(xì)胞，泡沫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
也觀察到次全部腎切除術(shù)(STNx)后殘留腎中的CDA1表達(dá)和纖維化的共定位(附圖3)。腎重量減少后，在腎小球內(nèi)的足細(xì)胞中出現(xiàn)了CDA1表達(dá)(附圖6A)，但該表達(dá)在正常腎中沒(méi)有。細(xì)胞質(zhì)和核染色模式很明顯，尤其是在硬化腎小球中和小管間質(zhì)性纖維化位點(diǎn)上。我們的初期資料也提示，阻滯血管緊張素II例如AT1受體拮抗劑-纈沙坦的治療方法和更少的細(xì)胞損傷和CDA1表達(dá)衰減關(guān)聯(lián)(附圖3B)。
用現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的相同的CDA1轉(zhuǎn)染技術(shù)(Chai等人，(2001)SET-related Cell Division Autoantigen-1(CDA1) Arrests Cell Growth.J.Biol.Chem.27633665-33674，以下引用為“Chai等人，2001”)。申請(qǐng)人將CDA1轉(zhuǎn)染到近端小管細(xì)胞系，NRK-52E。我們的初步研究表明，和只轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞(附圖4A和4C)相比，CDA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生的包括膠原IV(附圖4B)和纖連蛋白(附圖4D)的基質(zhì)蛋白增加。該結(jié)果提示CDA1可能直接關(guān)系到細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和隨后的腎纖維化進(jìn)展。
本發(fā)明的CDA的優(yōu)選形式是細(xì)胞分裂自身抗原1(CDA1)，或其片段，功能等價(jià)物，類(lèi)似物，或突變體或變體。
CDA1是最近用盤(pán)形紅斑狼瘡患者的血清鑒定出的新的核蛋白，申請(qǐng)人以前詳細(xì)公開(kāi)了CDA1的分子克隆和結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)PCT/AU01/0148，公開(kāi)號(hào)WO02/36768)。簡(jiǎn)而言之，CDA1的cDNA有2808個(gè)堿基對(duì)，其2079個(gè)堿基對(duì)的開(kāi)放性閱讀框編碼推測(cè)的693個(gè)氨基酸的多肽，命名為CDA1。CDA1推測(cè)的分子量為79,430道爾頓，pI為4.26。
CDA1包括N-端脯氨酸富集區(qū)，中心堿性區(qū)(basic domain)和C-端雙酸區(qū)。申請(qǐng)人最初的研究證實(shí)，CDA1包含四個(gè)推定的核定位信號(hào)，cAMP和cGMP依賴(lài)性激酶，蛋白激酶C，胸苷激酶，酪蛋白激酶II，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDKs)的磷酸化潛在位點(diǎn)。CDA1在HeLa細(xì)胞中磷酸化，體外經(jīng)細(xì)胞周期蛋白D1/CDK4，細(xì)胞周期蛋白A/CDK2和細(xì)胞周期蛋白B/CDK1磷酸化。CDA1的堿性和酸性區(qū)包含與幾乎完整的人白血病相關(guān)SET蛋白同源的區(qū)域。
CDA1表達(dá)在細(xì)胞周期中是動(dòng)態(tài)的，其表達(dá)水平和細(xì)胞周期的不同期和培養(yǎng)條件直接相關(guān)。血清饑餓細(xì)胞(G0期)中，CDA1表達(dá)水平非常低。將血清加到培養(yǎng)基中刺激細(xì)胞周期(G1期)和CDA1表達(dá)增高關(guān)聯(lián)。加入2mM胸苷到培養(yǎng)基中阻滯細(xì)胞在G1/S，CDA1表達(dá)達(dá)到高峰。加入0.15μg/ml秋水仙酰胺使細(xì)胞停止在M期，CDA1表達(dá)下降，但比G0期高。
其他研究隨后鑒定出CDA1，并證實(shí)CDA1是TGFβ1靶基因，命名為差異表達(dá)核仁TGF-β1靶點(diǎn)(differentially expressed nucleolarTGF-β1target，DENTT)。已經(jīng)證實(shí)，體外TGFβ1使CDA1表達(dá)增加。CDA1(也稱(chēng)為DENTT)在腦垂體中高表達(dá)，在腎上腺，腦，胰島，睪丸和卵巢中中等表達(dá)，提示在內(nèi)分泌器官中該蛋白的優(yōu)勢(shì)。
更為優(yōu)選地，CDA1由附圖7所示的核苷酸序列或編碼其功能等價(jià)物或衍生物的序列編碼。CDA1可以包含如附圖8所示的氨基酸序列或其功能等價(jià)物或衍生物。
本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“功能等價(jià)物或衍生物”包括但不僅限于片段，所述片段具有CDA1的功能活性，或其同源物，類(lèi)似物，突變體，變體和衍生物。這包括來(lái)自天然、重組或合成來(lái)源包括融合蛋白的同源物，類(lèi)似物，突變體，變體和衍生物。述及“同源物”應(yīng)當(dāng)理解為，述及來(lái)源于其他物種，而不是被處理的物種的CDA1核酸分子或蛋白質(zhì)。
衍生物包括來(lái)自天然、合成或重組來(lái)源包括融合蛋白的片段，部分，部份，突變體，變體和模擬物。部分或者片段包括，例如CDA1的活性區(qū)。衍生物可以來(lái)自氨基酸的插入，缺失或取代。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸段內(nèi)序列插入。插入氨基酸序列變體是指那些一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被引入到蛋白質(zhì)預(yù)定位點(diǎn)的變體，盡管，用合適的終產(chǎn)品篩選方法隨機(jī)插入也是有可能的。缺失變體的特征在于序列中去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。取代氨基酸變體是指那些序列中至少一個(gè)殘基被去除，在其位置上插入了不同的殘基。一個(gè)取代氨基酸變體的實(shí)例是保守氨基酸取代。典型的保守氨基酸取代包括下列組的取代甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴(lài)氨酸和精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。添加到氨基酸序列包括和其他肽，多肽或蛋白融合。
應(yīng)當(dāng)理解，CDA1核酸或蛋白分子的化學(xué)和功能等價(jià)物包括表現(xiàn)上述分子的任意一種或多種功能活性的分子，并且可以是任何來(lái)源，例如化學(xué)合成或通過(guò)篩選方法，例如天然產(chǎn)品篩選鑒定的分子。
衍生物包括具有完整蛋白的特定表位或部分的片段，所述完整蛋白融合到肽，多肽，其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子中。
本發(fā)明預(yù)期的(contemplated)類(lèi)似物包括，但不僅限于，側(cè)鏈修飾，在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成時(shí)的非天然氨基酸和/或其衍生物的引入和使用交聯(lián)劑和其他給蛋白質(zhì)分子或其類(lèi)似物施加構(gòu)象限制的方法。
相似的，核酸序列的衍生物可以來(lái)源于單個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、缺失和/或添加，包括和其他核酸分子融合。本發(fā)明的核酸分子衍生物包括寡核苷酸，PCR引物，反義分子，適合用于核酸分子共抑制和融合的分子。核酸序列衍生物還包括簡(jiǎn)并變體。
本發(fā)明預(yù)期的側(cè)鏈修飾實(shí)例包括氨基修飾，例如通過(guò)氨基和醛反應(yīng)的還原烷基化，然后在NaBH4下還原，與亞氨逐乙酸甲酯(methylacetimidate)脒化；和乙酸酐反應(yīng)?；?；和氰酸酯反應(yīng)的氨基的甲酰化；和2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)反應(yīng)的氨基的三硝基芐基化；和琥珀酸酐和四氫化鄰苯二甲酸酐反應(yīng)的氨基的?；慌c吡哆醛-5-磷酸反應(yīng)的賴(lài)氨酸的吡哆酸化(pyridoxylation)，然后NaBH4還原。
精氨酸殘基的胍基可以通過(guò)和試劑，例如2，3丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛反應(yīng)形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物進(jìn)行修飾。
羧基修飾可以是通過(guò)形成O-?；愲宓奶级啺坊罨?，然后衍生為，例如相應(yīng)的酰胺。
巰基的修飾方法可以是例如，和碘乙酸或碘乙酰胺反應(yīng)的羧甲基化；過(guò)甲酸氧化為磺丙氨酸；與其他硫醇化合物形成混合的二硫化物，和馬來(lái)酰亞胺，馬來(lái)酸酐或其他取代的馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)；利用4-氯汞基苯甲酸酯(4-chloromercuribenzoate)，4-氯汞基苯磺酸，苯汞基氯，2-氯汞基-4-硝基苯酚和其他汞制劑形成汞衍生物，在堿性pH下和氰酸酯的氨甲酰化。
色氨酸殘基的修飾可以是，通過(guò)例如，用N-溴基琥珀酰亞胺進(jìn)行的氧化；或用2-羥基-5-硝基芐基溴或者磺苯鹵化物(sulphenylhalides)反應(yīng)使得吲哚環(huán)烷基化。另一方面，酪氨酸殘基可通過(guò)用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而改變。
組氨酸殘基的咪唑環(huán)的修飾可以通過(guò)和碘乙酸衍生物發(fā)生烷基化反應(yīng)或者和焦碳酸二乙酯發(fā)生N-羰基乙氧基化(N-carboethoxylation)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在蛋白合成中引入非天然氨基酸和衍生物的實(shí)例包括，但不僅限于使用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸，6-氨基己酸，叔-丁基甘氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥(niǎo)氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D型異構(gòu)體。
本發(fā)明的另一方面提供一種治療或預(yù)防ECM蛋白合成相關(guān)狀況的方法，該方法包括調(diào)節(jié)CDA的表達(dá)和/或活性。
ECM蛋白合成相關(guān)狀況包括纖維化，所述纖維化源于外傷，尤其是脊柱和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。還包括燒傷，其他肥大瘢痕，心臟病發(fā)作后的心臟瘢痕，血療法藥物誘導(dǎo)的纖維化，放射誘導(dǎo)的纖維化，肺纖維化(急性呼吸窘迫綜合征)和手術(shù)瘢痕。
狀況可以是主要器官纖維化，包括腎疾病(例如，由于糖尿病或高血壓)，肝臟纖維化(例如，由于病毒性肝炎或酒精濫用)，肺纖維化，心臟纖維化，黃斑變性、視網(wǎng)膜和玻璃體視網(wǎng)膜病變。
狀況也可以是紊亂，例如全身和局部硬皮病、瘢痕瘤、肥大瘢痕、動(dòng)脈粥樣硬化或再狹窄。
更優(yōu)選的，本發(fā)明的狀況是糖尿病引起的腎臟纖維化。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，8周齡糖尿病大鼠的CDA1表達(dá)增加(附圖6)。而且，糖尿病誘導(dǎo)后32周，腎臟CDA1表達(dá)進(jìn)一步增加。CDA1表達(dá)增加還發(fā)現(xiàn)于腎小管和間質(zhì)組織中。
尤其有趣的是，在糖尿病大鼠的足細(xì)胞(podocytes)中從頭(denovo)表達(dá)CDA1，而在正常大鼠的腎臟中沒(méi)有表達(dá)(附圖2)。申請(qǐng)人證實(shí)，在糖尿病腎病中足細(xì)胞發(fā)生損傷，裂孔隔膜蛋白例如腎升壓素(nephrin)表達(dá)不足可能部分對(duì)糖尿病中的蛋白尿負(fù)責(zé)?；谶@些CDA1相關(guān)資料和已知的糖尿病腎病的病理生理學(xué)知識(shí)，申請(qǐng)人認(rèn)為，這種新蛋白是糖尿病腎病的功能和結(jié)構(gòu)臨床表現(xiàn)之間的重要連接。
不希望受理論限制，認(rèn)為在糖尿病中通過(guò)血管緊張素II、TGFβ和CTGF活化的血液動(dòng)力學(xué)和代謝途徑，增加CDA1表達(dá)，因而增加ECM蛋白例如纖連蛋白和膠原IV的產(chǎn)生。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述狀況是動(dòng)脈粥樣硬化。申請(qǐng)人研究顯示，在糖尿病ApoE敲除小鼠的動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，CDA1染色增加(附圖6)，提示CDA1可能在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中起作用。動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈的常見(jiàn)紊亂。脂肪、膽固醇和其他物質(zhì)在動(dòng)脈壁聚集并形成“粉瘤”或斑塊。最終脂肪組織可腐蝕動(dòng)脈管壁，減少動(dòng)脈彈性和影響血流。
血凝塊可以在斑塊沉積四周形成，進(jìn)一步干擾血流。當(dāng)動(dòng)脈到心肌的血流變得嚴(yán)重受阻時(shí)，心肌損害就不可避免。
風(fēng)險(xiǎn)因素包括吸煙，糖尿病，肥胖，高血壓，高血膽固醇，高脂肪飲食，具有心臟病個(gè)人或家庭史。腦血管疾病，外周血管疾病和涉及透析的腎臟疾病也是可能和動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)連的紊亂。本發(fā)明預(yù)期治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。
本方法還可用于治療某些狀況，在所述狀況中，ECM蛋白的增加是令人期望的，例如動(dòng)脈瘤，更具體而言是腹部動(dòng)脈的動(dòng)脈瘤。
本發(fā)明還提供一種用于研究ECM紊亂的非-人動(dòng)物，所述動(dòng)物包含能以改變的水平表達(dá)CDA1的細(xì)胞。所述動(dòng)物可以是“敲除”動(dòng)物，根本不表達(dá)CDA1。所述動(dòng)物可以表達(dá)具有下降活性的CDA1。預(yù)期這種動(dòng)物將用作研究ECM相關(guān)狀況或篩選試劑的模型，所述試劑用于任何ECM相關(guān)狀況的治療或預(yù)防。
本發(fā)明的另一方面提供一種篩選能調(diào)節(jié)ECM合成的試劑的方法，所述方法包括下列步驟提供能表達(dá)CDA1的動(dòng)物或者細(xì)胞，將所述動(dòng)物或者細(xì)胞暴露到所述試劑中，和測(cè)定試劑對(duì)CDA1表達(dá)和/或活性的影響。
本發(fā)明進(jìn)一步包括通過(guò)本文所述的篩選方法鑒定的試劑以及包括用于治療ECM相關(guān)疾病的藥物組合物。制備藥物和化妝品組合物的方法和載體在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，如教科書(shū)所述(例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PublishingCompany，Easton’Pennsylvania，USA)，其中的內(nèi)容在此引入。
藥物組合物可以以治療或預(yù)防ECM相關(guān)狀況的治療或預(yù)防有效量施予。此處的術(shù)語(yǔ)“治療或預(yù)防有效量”含義是指下列效果的必需量至少部分獲得預(yù)期的效果，或者延遲發(fā)作，抑制進(jìn)展，或完全停止ECM相關(guān)狀況的發(fā)作或進(jìn)展。當(dāng)然，這些量可依賴(lài)于具體治療的狀況，狀況的嚴(yán)重性，和個(gè)體參數(shù)，包括年齡，生理狀態(tài)，身材，體重和其他并行的治療。這些因素對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的，只要常規(guī)試驗(yàn)就能確定。一般優(yōu)選地，最小有效劑量可根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)或治療判斷確定。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，由于醫(yī)療或其他原因可以用更高的劑量。技術(shù)人員對(duì)適用于本發(fā)明的一系列給藥途徑和劑量方案也熟悉。對(duì)于一個(gè)特定的臨床應(yīng)用，只要用常規(guī)的試驗(yàn)就能確定最佳的制劑，給藥途徑或劑量方案。
本發(fā)明進(jìn)一步包括治療或預(yù)防ECM相關(guān)狀況的方法，所述方法包括對(duì)需要所述治療或預(yù)防的動(dòng)物施予本發(fā)明公開(kāi)的有效量的藥物組合物。所述ECM相關(guān)狀況是上文描述的任何狀況。
本發(fā)明還提供一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中CDA1表達(dá)和/或活性的方法，所述方法包括暴露細(xì)胞到能調(diào)節(jié)下列因子活性的試劑中，所述因子選自血管緊張素II，TGFβ和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子。
申請(qǐng)人顯示，注入血管緊張素II后，CDA1表達(dá)增加(附圖5B)。CDA1免疫組織化學(xué)染色顯示，近端小管的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色水平都增加。血管緊張素II注入后的CDA1表達(dá)增加可以通過(guò)纈沙坦(valsartan)，一種AT1受體拮抗劑處理來(lái)防止(資料未顯示)。
血管緊張素II注入后CDA1表達(dá)增加的小管(tubular)模式(附圖5B)和TGFβ(附圖2C)和TGFβ2(附圖2D)相似。而且，觀察到增加的近端小管CDA1表達(dá)的位點(diǎn)和兩個(gè)重要原細(xì)胞凋亡蛋白p53和bax增加的表達(dá)的位點(diǎn)相同(資料未顯示)。p53和bax的共表達(dá)和CDA1參與到細(xì)胞增殖的抑制相一致。
本發(fā)明還提供一種診斷ECM蛋白合成相關(guān)狀況的方法，所述方法包括從動(dòng)物體中獲得生物樣本，
測(cè)定該樣本中的CDA1水平，和比較該樣本中的CDA1水平和參考值其中，如果該樣本中的CDA1水平統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著高于或低于參考值時(shí)，診斷為陽(yáng)性。
所述方法預(yù)期用于診斷本發(fā)明公開(kāi)的與ECF異常相關(guān)的任何疾病。
實(shí)施例實(shí)施例1CDA1表達(dá)和Ang II時(shí)間和劑量關(guān)系8周齡雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，皮下嵌入微泵持續(xù)注入Ang II3或14天，劑量為升壓劑量(pressor doses)(60ng/min)和非升壓劑量(6ng/min)(Cao等人，Z；The angiotensin type 2receptoris expressed in adult rat kidney and promotes cellular proliferation andapoptosis.Kidney Int.2000；582437-2451)。結(jié)果如附圖2所示。
實(shí)施例2殘留腎臟中的CDA1表達(dá)和纖維化通過(guò)右腎切除術(shù)進(jìn)行次全部腎切除術(shù)(subtotal nephrectomy)(STNx)，隨后，除了左腎動(dòng)脈的一個(gè)腎外分支外選擇性結(jié)扎其他所有動(dòng)脈使得大約2/3左腎梗塞(CIA40)。腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(60mg/kg)進(jìn)行麻醉。假手術(shù)大鼠作為對(duì)照。手術(shù)后，大鼠分別在1，2，4，8和12周處死，收集組織，用于檢測(cè)CDA1表達(dá)，纖維化生長(zhǎng)因子以及基質(zhì)蛋白。結(jié)果如附圖3所示。
實(shí)施例3存在或缺乏AngII、TGFβ和CTGF刺激下，CDA1過(guò)表達(dá)對(duì)膠原、骨橋蛋白、纖連蛋白表達(dá)的影響通過(guò)CDA1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的正常大鼠腎臟上皮細(xì)胞系得到CDA1過(guò)表達(dá)。通過(guò)CDA1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的正常大鼠腎臟上皮細(xì)胞系(NRK52E)得到CDA1過(guò)表達(dá)。使用表達(dá)Myc-標(biāo)記CDA1的構(gòu)建體，即CDNA3-2M-CDA1，和pCDNA3-2M載體對(duì)照DNA，通過(guò)前述的轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的電穿孔方法(參見(jiàn)Chai，等，2001)轉(zhuǎn)染NRK52E細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞平鋪到蓋玻片上，用沒(méi)有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)3天。免疫組織化學(xué)檢測(cè)纖連蛋白和其他基質(zhì)蛋白。可以用下述引用文獻(xiàn)中的方法，用實(shí)時(shí)RT-PCR或免疫化學(xué)檢測(cè)TGFβ、膠原I、和纖連蛋白的基因表達(dá)Cao等，Blockade of the renin angiotensin andendothelin systems on progressive renal injury.Hypertension 2000；36561-568；Twigg等Renal connective tissue growth factor induction inexperimental diabetes is prevented by aminoguanidine.Endocrinology.2002；1434909-4913。
存在或缺乏CDA1或載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白用免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果如附圖4所示。
8周齡SD大鼠通過(guò)靜脈內(nèi)注射鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病(Allen等Role of angiotensin II and bradykinin in experimental diabeticnephropathy-functional and structural studies.Diabetes.1997；461612-1618)。動(dòng)物在糖尿病8和32周后處死，摘取腎臟，用于隨后免疫組織化學(xué)檢測(cè)CDA1。結(jié)果如附圖5所示。
在ApoE敲除小鼠中誘導(dǎo)STZ糖尿病(每天一次STZ，注射6天)，糖尿病20周后，摘取動(dòng)脈，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果如附圖6所示。
實(shí)施例4CDA1免疫組織化學(xué)方法在石蠟包埋部分(sections)用兔抗人CDA1血清進(jìn)行CDA1染色(chai等，2001)。簡(jiǎn)而言之，脫蠟后，石蠟包埋部分在微波爐中用低火在10mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH＝6.0)中處理10分鐘。用3％雙氧水(H2O2)甲醇溶液作用20分鐘失活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。該部分用蛋白封閉試劑封閉20分鐘。然后將其和兔抗人CDA1血清室溫孵育2小時(shí)。用生物素化山羊抗兔免疫球蛋白(DAKO A/S)作為第二抗體，隨后用抗生物素蛋白生物素辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC Elite kit，Victor Laboratories，Burlingame，CA)。通過(guò)與3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四氯化氫(DAB，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)反應(yīng)完成檢測(cè)。(參見(jiàn)，Cao Z等.The angiotensin type 2 receptor is expressed in adult ratkidney and promotes cellular proliferation and apoptosis.Kidney Int.2000；582437-2451)。
最后，可以理解，在不背離本發(fā)明的精神下，可得到多種其他的修正和/或改變。
權(quán)利要求
1.一種改變細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白水平的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂自身抗原(CDA)的表達(dá)或活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ECM蛋白選自膠原、彈性蛋白、原纖蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ECM蛋白是纖連蛋白或膠原IV。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞來(lái)源于腎臟組織或者血管組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞選自腎足細(xì)胞，腎近端小管細(xì)胞，腎集合管細(xì)胞，泡沫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述CDA包括N-端脯氨酸富集區(qū)，中心堿性區(qū)和C-端雙酸區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述CDA是細(xì)胞分裂自身抗原1(CDA1)，或其片段，功能等同物，類(lèi)似物，突變體或變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述CDA1由如附圖7所示核苷酸序列編碼。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述CDA1包含附圖8所示氨基酸序列或其功能等同物或衍生物。
10.一種治療或預(yù)防ECM蛋白合成相關(guān)狀況的方法，該方法包括調(diào)節(jié)CDA的表達(dá)和/或活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述狀況是纖維化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述纖維化是由于燒傷、心臟病發(fā)作、化療藥物治療、暴露于放射線或手術(shù)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述纖維化是主要器官纖維化。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述主要器官選自腎臟、肝臟、心臟和眼睛。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述主要器官纖維化是由于選自由以下成員構(gòu)成的組的狀況糖尿病、高血壓、病毒性肝炎、酒精濫用、黃斑變性、視網(wǎng)膜病變和玻璃體視網(wǎng)膜病變。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述狀況是糖尿病引起的腎臟纖維化。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述狀況選自全身和局部硬皮病、瘢痕瘤、肥大瘢痕、動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述狀況是動(dòng)脈粥樣硬化。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述狀況是動(dòng)脈瘤。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述動(dòng)脈瘤是腹部動(dòng)脈動(dòng)脈瘤。
21.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述CDA是CDA1。
22.一種用于研究ECM紊亂的非-人動(dòng)物，所述動(dòng)物包含能以改變的水平表達(dá)CDA的細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的非-人動(dòng)物，其中所述CDA是CDA1。
24.一種篩選能夠調(diào)節(jié)ECM合成的試劑的方法，所述方法包括下列步驟提供能表達(dá)CDA的動(dòng)物或者細(xì)胞，將所述動(dòng)物或者細(xì)胞暴露于所述試劑，和測(cè)定試劑對(duì)CDA表達(dá)和/或活性的影響。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述CDA是CDA1。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求24所述方法鑒定的試劑。
27.一種藥物組合物，所述組合物包括權(quán)利要求26所述試劑。
28.一種治療或預(yù)防ECM蛋白相關(guān)狀況的方法，所述方法包括對(duì)需要所述治療或預(yù)防的動(dòng)物施予有效量的權(quán)利要求27所述的藥物組合物。
29.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中CDA表達(dá)和/或活性的方法，所述方法包括將細(xì)胞暴露于能調(diào)節(jié)因子表達(dá)和/或活性的試劑，所述因子選自血管緊張素II、TGFβ和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述方法，其中所述CDA是CDA1。
31.一種診斷動(dòng)物中ECM蛋白合成相關(guān)狀況的方法，所述方法包括從所述動(dòng)物中獲得生物樣本，測(cè)定所述樣本中的CDA水平，和比較所述樣本中的CDA水平和參考值其中，如果所述樣本中的CDA水平統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著高于或低于參考值，則診斷為陽(yáng)性。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其中所述CDA是CDA1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種改變細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)水平的方法，該方法包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂自身抗原(CDA)的表達(dá)或活性。申請(qǐng)人驚奇的發(fā)現(xiàn)，CDA參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的ECM蛋白水平的控制途徑。本發(fā)明涉及多種ECM相關(guān)紊亂，例如腎臟纖維化和動(dòng)脈粥樣硬化。
文檔編號(hào)A61P13/12GK1863548SQ200480025091
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月1日
發(fā)明者Z·柴 申請(qǐng)人:迪亞－B技術(shù)有限公司