專利名稱：用于基因沉默的hbv和hcv保守序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)和轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)，用已知的乙型肝炎病毒(HBV)株和丙型肝炎病毒(HCV)株的保守基因序列來(lái)調(diào)節(jié)HBV和/或HCV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的方法和組合物。
背景技術(shù)：
人丙型肝炎(HCV)是一個(gè)主要的公共健康問(wèn)題，估計(jì)全球有2億人被感染。美國(guó)2001年新增的感染人數(shù)約25,000，由于對(duì)供血者的篩選，該數(shù)字已比80年代估計(jì)的每年新增240,000病例有所下降。然而，估計(jì)已有390萬(wàn)(1.8％)美國(guó)人感染了HCV，其中270萬(wàn)為慢性感染。在全球人口中，丙型肝炎顯示出明顯的基因多樣性，證明了該病毒的頻繁突變和快速進(jìn)化。HCV有6個(gè)基本的基因型，15個(gè)有記錄的亞型，在世界上的不同地區(qū)流行的基因型有所不同。各種主要的基因型可能在生物學(xué)效應(yīng)方面，如復(fù)制、突變率、肝臟損壞的類型和嚴(yán)重程度以及檢查和治療的手段上有明顯差異，但這種差異還未完全弄清。
目前尚無(wú)預(yù)防HCV的疫苗，現(xiàn)有治療藥物包括利巴韋林和干擾素只是部分有效。估計(jì)約有75-85％的感染者將會(huì)發(fā)展成慢性感染，70％的慢性感染者將發(fā)展為包括肝細(xì)胞癌的慢性肝臟疾病。慢性HCV相關(guān)肝臟疾病是肝臟移植的主要指征。
雖然人乙型肝炎疫苗在1982年已經(jīng)問(wèn)世，估計(jì)全球有3.5億人有HBV慢性感染。雖然美國(guó)每年新感染人數(shù)已從80年代的平均260,000下降到2001年的78,000，估計(jì)仍有125萬(wàn)乙肝病毒攜帶者，即乙肝病毒表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性持續(xù)6個(gè)月以上的患者。這種攜帶者的發(fā)展成肝硬化、肝失代償和肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)在增多。雖然大多數(shù)攜帶者不會(huì)從慢性乙型肝炎病毒感染發(fā)展成為肝并發(fā)癥，但約有15％到40％的人在其一生中會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的后遺癥，慢性感染者中死于慢性肝臟疾病的約占15-25％。
因此，需要開(kāi)發(fā)對(duì)感染HBV和HCV的患者，特別是慢性感染的患者(二者相加占全球肝臟疾病的75％)更有效的治療藥物。同時(shí)極其需要開(kāi)發(fā)預(yù)防HCV的方法和藥物。
人們已認(rèn)識(shí)到核酸(如DNA、RNA、雜合體、雜合雙鏈和修飾核酸)是有著各種明顯生物學(xué)活性的極有價(jià)值的物質(zhì)，包括它們作為治療部分在預(yù)防和/或治療人類和動(dòng)物疾病方面的用途。例如，通過(guò)反義原理設(shè)計(jì)使寡核苷酸與靶mRNA雜交，從而調(diào)節(jié)mRNA的活性。另一種用核酸作為治療物的方法是利用三螺旋或三鏈的形成，其中設(shè)計(jì)單鏈核苷酸(如DNA或RNA)去與雙鏈靶DNA結(jié)合而獲得需要的結(jié)果，如抑制靶DNA的轉(zhuǎn)錄。還有一種以核酸作為治療物的方法是利用核酶，其中設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)RNA或修飾的核酸與靶RNA或靶雙鏈DNA結(jié)合而獲得需要的結(jié)果，例如，對(duì)靶RNA和DNA進(jìn)行靶向切割從而抑制其表達(dá)。核酸也可被用作免疫物質(zhì)，例如，將DNA分子導(dǎo)入生物體的組織或器官，以表達(dá)能夠刺激免疫反應(yīng)的蛋白。還工程改造核酸，使其編碼具有反義、核酶或三螺旋活性的RNA，或產(chǎn)生可翻譯生成具有生物功能的蛋白質(zhì)的RNA。
近來(lái)，RNAi或雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象已經(jīng)被識(shí)別，它是通過(guò)與細(xì)胞或生物體內(nèi)靶基因區(qū)域互補(bǔ)的dsRNA來(lái)抑制靶基因的表達(dá)(參見(jiàn)例如Fire等公開(kāi)于1999年6月1日的WO99/32619；和U.S.6,506,559″Genetic Inhibition by Double-StrandedRNA；″Pachuk和Satishchandran的WO 00/63364″Methods andCompositions for Inhibiting the Function of Polynucleotide Sequences，″；和2002年10月18日提交的U.S.S.N.60/419,532)。人們期待著dsRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)使用提供至少部分雙鏈RNA的組合物，以提供極有價(jià)值的治療和/或預(yù)防藥物來(lái)抵抗病毒感染，包括HBV和/或HCV感染，包括極其困難的慢性HBV和/或HCV感染問(wèn)題。
發(fā)明概述本申請(qǐng)人的發(fā)明提供了抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括給予所述細(xì)胞雙鏈RNA效應(yīng)分子，該效應(yīng)分子含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T。在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，可將來(lái)自不止一種SEQ ID序列的效應(yīng)序列給予同一細(xì)胞，和/或?qū)?lái)自同一SEQ ID序列的不止一種效應(yīng)序列給予同一細(xì)胞。
本申請(qǐng)人的方法進(jìn)一步提供了抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，包括給予所述細(xì)胞雙鏈RNA效應(yīng)分子，該效應(yīng)分子含選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T。在該方法的此方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，來(lái)自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12二者的效應(yīng)分子可給予同一細(xì)胞；和/或來(lái)自同一SEQ ID NO中的不止一種效應(yīng)分子可用于同一細(xì)胞。
本申請(qǐng)人的方法進(jìn)一步提供了抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸和丙型肝炎病毒的多核苷酸二者在同一體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，包括給予所述細(xì)胞雙鏈RNA效應(yīng)分子，第一效應(yīng)分子含選自SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ IDNO10的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T；第二雙鏈RNA效應(yīng)分子含選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T。在本發(fā)明此方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，來(lái)自不止一種SEQ ID NO1到SEQ IDNO10的效應(yīng)序列可給予同一細(xì)胞；和/或來(lái)自SEQ ID NO11和SEQID NO12二者的效應(yīng)序列可給予同一細(xì)胞；和/或不止一種來(lái)自同一SEQ ID NO的效應(yīng)序列可用于同一細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制乙型肝炎多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的組合物，其包含雙鏈RNA效應(yīng)分子，該效應(yīng)分子含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9和SEQ ID NO10的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T。組合物的優(yōu)選實(shí)施方案包括其中來(lái)自不止一種SEQ IDNO1到SEQ ID NO10的效應(yīng)分子存在于組合物中，和/或其中來(lái)自同一SEQ ID NO的不止一種效應(yīng)分子存在于組合物中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制丙型肝炎病毒多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的組合物，其包含雙鏈RNA效應(yīng)分子，該效應(yīng)分子含有選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T。該組合物的優(yōu)選實(shí)施方案包括其中來(lái)自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12二者的效應(yīng)序列存在于組合物中；和/或其中來(lái)自同一SEQ ID NO的不止一種效應(yīng)分子存在于組合物中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制乙型肝炎病毒多核苷酸序列和丙型肝炎病毒多核苷酸序列二者在單個(gè)體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的組合物，其包含雙鏈RNA效應(yīng)分子，第一效應(yīng)分子含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T；第二效應(yīng)分子含選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T。該組合物的優(yōu)選實(shí)施方案包括其中來(lái)自不止一種SEQ ID NO1到SEQ ID NO10的效應(yīng)分子存在于組合物中；和/或其中來(lái)自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12二者的效應(yīng)分子存在于組合物中；和/或其中來(lái)自同一SEQ ID NO的不止一種效應(yīng)分子可存在于組合物中。
在本發(fā)明上述方法和組合物的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，多核苷酸序列為RNA，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制乙型肝炎病毒多核苷序列和/或丙型肝炎病毒多核苷酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的組合物，其中所述組合物含有至少19個(gè)連續(xù)核苷酸序列，其選自SEQ ID NO1到SEQ IDNO12、SEQ ID NO1到SEQ ID NO12的互補(bǔ)序列和這種序列的混合物。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中，“至少19個(gè)連續(xù)核苷酸序列”優(yōu)選DNA，哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選人細(xì)胞。此外還提供了含有任何上述任何組合物的表達(dá)構(gòu)建體和含有所述表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了含有選自SEQ ID NO14到SEQ IDNO26的序列的多核苷酸序列。本發(fā)明的另一方面提供了包含選自SEQ ID NO14到SEQ ID NO26的序列的1-19、1-20、1-21、2-20、2-21或3-21核苷酸的多核苷酸序列。本發(fā)明的另一方面提供了含有選自SEQ ID NO27到SEQ ID NO44的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的多核苷酸序列。
本發(fā)明的另一方面提供了抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的組合物，該組合物含雙鏈RNA效應(yīng)分子，其包含SEQ ID NO27中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列，其中U取代T。
序列簡(jiǎn)述
SEQ ID NO1到SEQ ID NO10代表乙型肝炎病毒基因組的保守區(qū)域。
SEQ ID NO11到SEQ ID NO12代表丙型肝炎病毒基因組的保守區(qū)域。
SEQ ID NO13代表人U6啟動(dòng)子的核苷酸序列。
SEQ ID NO14和SEQ ID NO15代表具有定位在SEQ ID NO5內(nèi)的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO16和SEQ ID NO17代表具有定位在SEQ ID NO4內(nèi)的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO18代表具有定位在SEQ ID NO10內(nèi)的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO19到SEQ ID NO22代表具有定位在SEQ ID NO3內(nèi)的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO23和SEQ ID NO24代表具有定位在SEQ ID NO2內(nèi)的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO25和SEQ ID NO26代表具有定位在SEQ ID NO1內(nèi)的HBV序列的eiRNA。
SEQ ID NO27代表HCV 3′UTR的″X″區(qū)段。
SEQ ID NO28到SEQ ID NO36代表定位于HCV 3′UTR的siRNA。
SEQ ID NO37到SEQ ID NO44代表定位于HCV 3′UTR的″X″區(qū)段的siRNA。
SEQ ID NO45代表定位于HCV核心的siRNA。
SEQ ID NO46代表定位于核纖層蛋白的siRNA。
SEQ ID NO47代表T7 RNA聚合酶基因。
SEQ ID NO48代表編碼發(fā)夾RNA的基于T7的eiRNA載體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為標(biāo)明T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和T7 RNA聚合酶位置的載體圖解，并顯示包含了發(fā)夾狀eiRNA序列。
圖2圖示了與表2數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖3圖示了與表3數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖4圖示了與表4數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖5圖示了與表5數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖6圖示了與表6數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖7圖示了與表7數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖8圖示了與表8數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖9為闡明有效HBV-AYW shRNA插入的圖解。
圖10圖示了與表9數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖11為通過(guò)Nothern印跡分析顯示HBV RNA下調(diào)的柱圖。
圖12圖示了與表12數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的HBsAg抑制。
圖13為蛋白質(zhì)印跡，顯示所鑒別的siRNA為0、9和20pmole時(shí)HCV NS5A蛋白水平(l到r)，在實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)1中有更詳細(xì)描述。
圖14為蛋白質(zhì)印跡，顯示所鑒別的siRNA為0、9和20pmole，“核心”陽(yáng)性對(duì)照siRNA為0、3和9pmole時(shí)HCV NS5A蛋白水平(l到r)，在實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)2中有更詳細(xì)描述。
發(fā)明詳述RNA干擾(RNAi)是動(dòng)物和植物體內(nèi)序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默或轉(zhuǎn)錄基因沉默的方法，由序列與被沉默基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)起始。因?yàn)镽NA干擾以序列特異的方式發(fā)揮作用，所以用作藥物的RNAi分子必須具有靶特異性。病毒基因組是可變的，以容納對(duì)環(huán)境變化的抗性。雖然HBV和HCV是RNAi理想的病毒目標(biāo)，但病毒的變異性和突變性以及很高的轉(zhuǎn)錄率使HBV和HCV成為任何治療和/或預(yù)防手段的挑戰(zhàn)性目標(biāo)。為了用RNAi來(lái)抑制病毒基因組的復(fù)制，需要鑒別病毒基因組中保守且獨(dú)特的區(qū)域。同時(shí)，為了避免毒性，用于基因沉默的所選序列不存在于人基因組中是非常重要的。
人乙型肝炎病毒(HBV) 人乙型肝炎病毒屬于嗜肝病毒家族，HBV基因組為約3200個(gè)堿基對(duì)的松散環(huán)狀、部分雙鏈DNA。有4個(gè)部分重疊的可讀框分別編碼包膜蛋白(pre-S/S)、核心蛋白(precore/core)、聚合酶和X蛋白。pre-S/S可讀框編碼大(L)、中(M)、小(S)表面糖蛋白。precore/core可讀框被翻譯成前核心多肽，其被修飾為可溶性蛋白即乙肝e抗原(HBeAg)和核殼蛋白即乙肝核心抗原。核心蛋白啟動(dòng)子和前核心蛋白區(qū)域的突變已證明可降低或阻斷HBeAg的產(chǎn)生。聚合酶蛋白具有逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的功能。X蛋白是強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄激活子，可能在致肝癌方面有作用。
HBV的復(fù)制周期始于病毒顆粒與肝細(xì)胞的附著。在肝細(xì)胞核內(nèi)，正鏈HBV DNA合成完成后，病毒基因組轉(zhuǎn)化成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，大多數(shù)目前已測(cè)試過(guò)的抗病毒藥物對(duì)cccDNA無(wú)效或幾乎無(wú)效，這就是在抗病毒治療停止后血清HBV DNA很快復(fù)現(xiàn)的原因。治療慢性乙肝的目標(biāo)是要達(dá)到對(duì)HBV復(fù)制和/或HBV抗原表達(dá)的穩(wěn)固抑制和肝臟疾病的緩解。
在GenBank132.0中，共有4500種HBV序列和340種HBV完整基因組序列(317例人分離株、22例其他靈長(zhǎng)類分離株，1例土撥鼠HBV分離株)。這樣的多變性對(duì)序列特異性的藥學(xué)手段如RNAi構(gòu)成了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。為了鑒別出適合于RNAi應(yīng)用的保守序列，用改進(jìn)型的ClustalW對(duì)所有完整基因組進(jìn)行了比對(duì)。產(chǎn)生了兩種多項(xiàng)比對(duì)方案，第一包含所有339種HBV完整基因組序列，第二僅限于人HBV分離株。對(duì)多項(xiàng)對(duì)比的結(jié)果進(jìn)行了比較，且產(chǎn)生了包含HBV基因組中各位點(diǎn)序列保守性得分的表。進(jìn)行滑動(dòng)窗搜尋(slidingwindow search)，以鑒別長(zhǎng)度大于19nt的最長(zhǎng)序列保守區(qū)域。鑒別了三個(gè)主要保守區(qū)域，定位于GenBank檢索號(hào)AF090840的人HBV分離株。用該HBV保守序列對(duì)人基因組和cDNA文庫(kù)(人染色體數(shù)據(jù)庫(kù))的GenBank序列進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn)該鑒別的病毒保守序列從21核苷酸向上是獨(dú)一無(wú)二的。對(duì)于人體治療目的，確保同源的人體序列不被不可逆轉(zhuǎn)地沉默與選擇用于RNAi的保守病毒序列同樣重要。
人丙型肝炎病毒HCV是小包膜單鏈RNA病毒(直徑40-60nm)，屬于黃病毒(Flavivirida)科和肝病毒(hepacivirus)屬。其基因組接近10000個(gè)核苷酸，編碼約3000氨基酸的單個(gè)多蛋白，該蛋白在轉(zhuǎn)錄后被切割成10種多肽，包括3種主要的結(jié)構(gòu)蛋白(C、E1和E2)和多種非結(jié)構(gòu)蛋白([NS]NS2至NS5)。NS蛋白包括蛋白加工(蛋白酶)和病毒復(fù)制(RNA聚合酶)必需的酶。因?yàn)樵摬《究焖偻蛔儯さ鞍椎淖兓兄谄浔荛_(kāi)免疫系統(tǒng)。已知HCV至少有6種主要基因型和90種亞型。不同的基因型有著不同的地域分布。基因型1a和1b在美國(guó)最為常見(jiàn)(占70％)，基因型2a和2b(約15％)和3型(約7％)較少見(jiàn)。
患者感染不同基因型后的病情嚴(yán)重程度和后果幾乎沒(méi)有差異，然而感染2型和3型的患者對(duì)干擾素治療的應(yīng)答較好。HCV病毒在肝臟中高速?gòu)?fù)制并且具有明顯的序列多樣性。治療慢性HCV的主要目標(biāo)在于清除血液中可檢測(cè)的病毒RNA。完成治療后連續(xù)6個(gè)月血中無(wú)可檢出的病毒RNA已知為持續(xù)應(yīng)答。研究提示持續(xù)應(yīng)答等同于良好的預(yù)后，可相當(dāng)于治愈。治療還可能有其他微妙益處，如減緩不能達(dá)到持續(xù)應(yīng)答的患者中肝臟結(jié)痂(纖維化)的進(jìn)程。
在GenBank 134.0中，共有20,000種HCV序列和93種HCV完整基因組序列。用改進(jìn)型的ClustalW對(duì)所有完整基因組進(jìn)行了比對(duì)。對(duì)多項(xiàng)對(duì)比的結(jié)果進(jìn)行了比較，且產(chǎn)生了包含HCV基因組中各位點(diǎn)序列保守性得分的表。進(jìn)行滑動(dòng)窗搜尋，以確定長(zhǎng)度大于19nt的最長(zhǎng)序列保守區(qū)域。鑒別了三個(gè)主要的保守區(qū)域，定位于GenBankRefSeq(參考序列)檢索號(hào)NC_004102，這是GenBank注釋HCV完整基因組。用該保守序列對(duì)人基因組和cDNA文庫(kù)(人染色體數(shù)據(jù)庫(kù))的GenBank序列進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)這種序列在21個(gè)核苷酸上是獨(dú)一無(wú)二的。
與人類序列非同源同樣重要的是，確保用作本發(fā)明沉默靶目標(biāo)的保守病毒序列基本上與任何天然產(chǎn)生的、正常行使功能的及基本人多核苷酸序列不同源，這樣，當(dāng)dsRNA用于本發(fā)明的方法時(shí)，不對(duì)任何基本天然哺乳動(dòng)物多核苷酸序列的功能產(chǎn)生負(fù)面影響。這種天然功能性哺乳動(dòng)物多核苷酸序列包括在健康哺乳動(dòng)物中編碼所需蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物序列和非編碼但提供基本調(diào)節(jié)序列的哺乳動(dòng)物序列?；旧?，本發(fā)明中使用的RNA分子序列必須與使用本發(fā)明任何方法后其功能不希望被干擾的任何哺乳動(dòng)物多核苷酸序列有明顯不同。計(jì)算機(jī)算法可以用來(lái)確定RNA分子多核苷酸序列與正常哺乳類序列之間的基本缺乏同源性。
由于通常認(rèn)為能夠結(jié)合和激活RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的連續(xù)dsRNA序列長(zhǎng)度是19-27堿基對(duì)，鑒別的HBV和HCV保守序列與人基因組文庫(kù)相當(dāng)，或許更重要的是與人cDNA文庫(kù)相當(dāng)。由于人cDNA文庫(kù)代表mRNA形式的表達(dá)序列，這種mRNA序列特別容易被導(dǎo)入細(xì)胞的同源dsRNA序列沉默。
因此，用該HBV和HCV保守序列與人基因組和cDNA序列進(jìn)行比對(duì)。鑒別沒(méi)有與人cDNA文庫(kù)匹配的HBV和HCV保守序列。(雖然有某些匹配其最終鑒別為cDNA文庫(kù)中的HBV污染)。與人基因組文庫(kù)序列的比對(duì)顯示，無(wú)任何21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的序列匹配，有一個(gè)20個(gè)核苷酸的序列和一個(gè)19個(gè)核苷酸的序列匹配，但它們均在非編碼區(qū)，且可能不以mRNA的形式出現(xiàn)，因?yàn)橥次镂丛赾DNA文庫(kù)中出現(xiàn)。因此，認(rèn)為它們可能沒(méi)有安全風(fēng)險(xiǎn)，但如果需要可排除。
HBV和HCV的保守序列HBV保守區(qū)域1
GAACATGGAGA[A(89％)/G(11％)]CA[T(76％)/C(24％)][C(78％)/A(20％)/T(2％)][A(78％)/G(21％)/T(1％)]CATCAGGA[T(65％)/c(35％)]TCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGG[G(88％)/t(12％)]GT[T(89％)/G(11％)]TTTCT[T(94％)/C(6％)]GTTGACAA[G(64％)/A(36％)]AATCCTCACAATACC[A(56％)/G(43％)/T(1％)]CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGG[G(92％)[G(5％)/A(3％)]A[A(41％)/G(30％)/T(18％)/C(11％)][C(90％)/T(10％)]HBV保守區(qū)域2TGGATGTGTCT[G(99％)/A(1％)]CGGCGTTTTATCATHBV保守區(qū)域3AAGGCCTTTCT[A(43％)/G(43％)/C(14％)][T(56％)/A(37％)/C(7％)]GT[A(87％)/C(13％)]AACA[A(57％)/G(43％)]TA[T(59％)/C(41％)][C(59％)/A(41％)]TG[A(92％)/C(8％)][A(93％)/C(7％)]CCTTTACCCCGTTGC[T(54％)/C(46％)][C(92％)/A(8％)]GGCAACGG[C(74％)/T(24％)]C[A(50％)/T(43％)/c(7％)]GG[T(87％)/C(13％)]CT[G(70％)/C(19％)/T(7％)/A(4％)]TGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGG[C(48％)/T(38％)/A(14％)]TGGGGCTTGG[C(84％)/T(16％)][C(84％)/T(12％)/G(4％)]AT[A(47％)/T(23％)/G(17％)/C(13％)]GGCCATC[A(83％)/G(17％)][G(92％)/C(8％)]CGCATGCGTGGAACCTTT[G(84％)/C(13％)/T(3％)][T(92％)/A(4％)/C(3％)/G(1％)]G[G(78％)/T(22％)]CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT[A(88％)/T(9％)/G(1％)/C(1％)]GC[C(57％)/A(35％)/T(6％)/G(2％)]GC[T(92％)/C(7％)/G(1％)]TGTTT[T(88％)/C(12％)]GCTCGCAGC[C(64％)/A(36％)]GGTCTGG[A(87％)/G(13％)]GCHBV保守區(qū)域4[C(62％)/T(38％)]ACTGTTCAAGCCTCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTT[G(88％)/A(12％)]GG[G(92％)/A(8％)]CATGGACATTGAC[C(92％)/A(8％)]C[T(65％)/G(35％)]TATAAAGAATTTGGAGCT[A(65％)/A(35％)]CTGTGGAGTTACTCTC[G(62％)/T(35％)/A(3％)]TTTTTGCCTTTC[T(92％)/C(8％)]GACTT[C(92％)/T(8％)]TTTCCTTCHBV保守區(qū)域5[G(69％)/del(31％)]A[G(85％)/T(11％)/C(4％)]GCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG[C(61％)/A(39％)]G[A(62％)/G(38％)]TCTCAATCG[C(88％)/A(12％)]CGCGTCGCAGAAGATCTCAAT[C(92％)/T(8％)]TCGGGAATCT[C(88％)/T(12％)]AATGTTAGTATHBV保守區(qū)域6TTGG[C(84％)/t(16％)][C(84％)/t(12％)/g(4％)]AT[A(47％)/t(23％)/g(17％)/c(13％)]GGCCATC[A(83％)/g(17％)][G(92％)/c(8％)]CGCATGCGTGGAACCTTT[G(84％)/c(13％)/t(3％)][T(92％)/a(4％)/c(3％)/g(1％)]G[G(78％)/t(22％)]CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT[A(88％)/t(9％)/g(1％)/c(1％)]GC[C(57％)/a(35％)/t(6％)/g(2％)]GC[T(92％)/c(7％)/g(1％)]TGTTT[T(88％)/c(12％)]GCTCGCAGC[C(64％)/a(36％)]GGTCTGG[A(87％)/g(13％)]GCHBV保守區(qū)域7CTGCCAACTGGAT[C(86％)/T(10％)/A(4％)]CT[C(69％)/T(25％)/A(6％)]CGCGGGACGTCCTTTGT[T(75％)/C(25％)]TACGTCCCGTC[G(93％)/A(7％)]GCGCTGAATCC[C(86％)/T(7％)/A(7％)]GCGGACGACCC[C(52％)/G(25％)/T(19％)/A(4％)]HCV保守區(qū)域1[A(74％)/G(19％)/T(7％)][G(82％)/A(15％)/T(3％)]ATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT[C(92％)/T(7％)]GTGCAGC[C(89％)/T(10％)]TCCAGG[A(76％)/T(14％)/C(8％)/G(1％)]CCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCC[A(90％)/G(9％)]GGA[C(78％)/T(16％)/A(5％)]GACCGGGTCCTTTCTTGGAT[G(78％)/T(11％)/A(10％)]AACCCGCTC[A(94％)/T(5％)]ATGCC[T(90％)/C(9％)]GGA[G(91％)/C(4％)/A(4％)]ATTTGGGCGTGCCCCCGC[G(85％)/A(14％)]AGAC[T(94％)/C(5％)]GCTAGCCGAGTAG[T(92％)/C(7％)]GTTGGGT[C(94％)/T(5％)]GCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCA[C(62％)/T(30％)/A(8％)]CATGAGCAC[A(50％)/G(50％)][A(92％)/C(8％)][A(89％)/T(11％)]TCC[T(92％)/A(5％)/C(3％)]AAACC[T(84％)/C(14％)/A(2％)]CAAAGAAAAACCAAA[C(84％)/A(16％)]G[T(84％)/A(16％)]AACACCAACCG[C(77％)/T(23％)]CGCCCACAGGACGT[C(81％)/T(18％)/A(1％)]AAGTTCCCGGG[C(89％)/T(11％)]GG[T(80％)/C(20％)]GG[T(80％)/C(17％)/A(3％)]CAGATCGTTGG[T(91％)/C(8％)/G(1％)]GGAGT[T(87％)/A(11％)/C(2％)]TAC[C(74％)/T(20％)/G(6％)]TGTTGCCGCGCAGGGGCCC[C(87％)/T(8％)/A(4％)/G(1％)][A(92％)/C(8％)][G(92％)/A(5％)/C(2％)][G(87％)/A(12％)/T(1％)]TTGGGTGTGCGCGCGAC[T(78％)/G(13％)/A(7％)/C(2％)]AGGAAGACTTC[C(90％)/G(5％)/T(5％)]GA[G(90％)/A(10％)]CGGTC[G(79％)/C(12％)/A(8％)/T(1％)]CA[A(86％)/G(14％)]CC[T(88％)/A(6％)C(6％)]CG[T(82％)/C(9％)A(9％)]GG[A(87％)/T(8％)/G(3％)/C(2％)]AGHCV保守區(qū)域2ATGGC[T(76％)/A(12％)/C(10％)/G(2％)]TGGGATATGATGATGAACTGG[T(81％)/C(19％)]C以SEQ ID格式表示的保守共有序列以下序列以WIPO Standard ST.25(1998)要求的格式表示，使用37 CFR 1.821下規(guī)定的代碼。SEQ ID NO1到SEQ ID NO10來(lái)自HBV基因組，SEQ ID NO11和SEQ ID NO12來(lái)自HCV基因組。
GAACATGGAGArCAyhdCATCAGGAyTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGkGTkTTTCTyGTTGACAArAATCCTCACAATACCdCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGdAnySEQ ID NO2 HBVTGGATGTGTCTrCGGCGTTTTATCATSEQ ID NO3 HBVAAGGCCTTTCTvhGTmAACArTAymTGmmCCTTTACCCCGTTGCymGGCAACGGyChGGyCTnTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGhTGGGGCTTGGybATnGGCCATCrsCGCATGCGTGGAACCTTTbnGkCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTnGCnGCbTGTTTyGCTCGCAGCmGGTCTGGrGCSEQ ID NO4 HBVyACTGTTCAAGCCTCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTrGGrCATGGACATTGACmCkTATAAAGAATTTGGAGCTwCTGTGGAGTTACTCTCdTTTTTGCCTTCyGACTTyTTTCCTTCSEQ ID NO5 HBVCGAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTATSEQ ID NO6 HBVAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTATSEQ ID NO7 HBVCAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTAT
SEQ ID NO8 HBVGAbGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGmGrTCTCAATCGmCGCGTCGCAGAAGATCTCAATyTCGGGAATCTyAATGTTAGTATSEQ ID NO9 HBVTTGGybATnGGCCATCrsCGCATGCGTGGAACCTTTbnGkCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTnGCnGCbTGTTTyGCTCGCAGCmGGTCTGGrGCSEQ ID NO10 HBVCTGCCAACTGGAThCThCGCGGGACGTCCTTTGTyTACGTCCCGTCrGCGCTGAATCChGCGGACGACCCnSEQ ID NO11 HCVDdATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTyGTGCAGCyTCCAGGnCCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCrGGAhGACCGGGTCCTTTCTTGGATdAACCCGCTCwATGCCyGGAvATTTGGGCGTGCCCCCGCrAGACyGCTAGCCGAGTAGyGTTGGGTyGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCAhCATGAGCACrmwTCChAAACChCAAAGAAAAACCAAAmGwAACACCAACCGyCGCCCACAGGACGThAAGTTCCCGGGyGGyGGhCAGATCGTTGGbGGAGThTACbTGTTGCCGCGCAGGGGCCCnmvdTTGGGTGTGCGCGCGACnAGGAAGACTTCbGArCGGTCnCArCChCGhGGnAGSEQ ID NO12 HCVATGGCnTGGGATATGATGATGAACTGGyC*雙鏈RNA基因沉默/RNAi “核酸組合物”或“核苷酸”組合物指任何一種或多種化合物，其中一種或多種磷酸分子與糖(如戊糖和己糖)結(jié)合，繼而又與衍生自嘌呤(如腺嘌呤)和嘧啶(胸腺嘧啶)的堿基結(jié)合。具體地說(shuō)，天然核酸分子包括基因組脫氧核糖核酸(DNA)和宿主核糖核酸(RNA)，以及后者的幾種不同的形式，如信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)。DNA也包括與不同RNA分子互補(bǔ)的DNA分子(cDNA)。也可使用合成DNA或它們與天然DNA的雜合體，以及DNA/RNA雜合體和肽核酸分子(PNA)(Gambari，Curr Pharm Des 2001 Nov；7(17)1839-62)。
當(dāng)期望的核酸分子為RNA時(shí)，預(yù)期將本文提供的序列中的T(胸腺嘧啶)被U(尿嘧啶)取代。例如，本文公開(kāi)的SEQ ID NO1到SEQ IDNO44均為DNA序列。對(duì)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，含有任何上述SEQ ID NO序列的RNA效應(yīng)分子用U替代T。
核酸典型有兩個(gè)或更多個(gè)以共價(jià)鍵連接的天然或修飾脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。修飾核酸包括，例如，肽核酸核和含有非天然堿基的核苷酸。
“dsRNA”指含有兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸的區(qū)段的雙鏈構(gòu)型核酸。預(yù)期本發(fā)明的保守病毒序列可用于任何本領(lǐng)域已知的或隨后開(kāi)發(fā)的通過(guò)dsRNA介導(dǎo)基因沉默或RNAi機(jī)理發(fā)揮作用的組合物。在各種實(shí)施方案里，dsRNA完全由核糖核苷酸組成或由核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的混合物組成，例如，提交于2000年4月19日的WO00/63364或提交于1999年4月21日的U.S.S.N.60/130,377中公開(kāi)的RNA/DNA雜合體。dsRNA可以是含有自身互補(bǔ)區(qū)段的單分子，即分子一個(gè)片段中的核苷酸與分子另一個(gè)片段中的核苷酸形成堿基配對(duì)。在各種實(shí)施方案中，由單個(gè)分子組成的dsRNA完全由核糖核苷酸組成或包含與脫氧核糖核苷酸區(qū)段互補(bǔ)的核糖核苷酸區(qū)段?；蛘?，dsRNA可以包含具有彼此互補(bǔ)區(qū)段的兩條不同的鏈。在各種實(shí)施方案中，兩條鏈均完全由核糖核苷酸組成；一條鏈完全由核糖核苷酸組成，另一條鏈完全由脫氧核糖核苷酸組成；或一條或兩條鏈含核糖核酸和脫氧核糖核酸的混合物。理想的互補(bǔ)區(qū)域?yàn)橹辽?0、80、90、95、98或100％互補(bǔ)。理想的雙鏈構(gòu)型dsRNA區(qū)段包括至少19、20、21、22、23、24、30、50、75、100、200、500、1000、2000或5000個(gè)核苷酸或包括該dsRNA所代表的cDNA中的所有核苷酸。在某些實(shí)施方案中，dsRNA不含任何單鏈區(qū)段例如單鏈末端，或dsRNA為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，dsRNA有一種或多種單鏈區(qū)段或突出端。理想的RNA/DNA雜合體包括為反義鏈或區(qū)段的DNA鏈或區(qū)段(例如與靶核酸至少70、80、90、95、98或100％互補(bǔ))和為正義鏈或區(qū)段的RNA鏈或區(qū)段(例如與靶核酸至少70、80、90、95、98或100％同一)。在各種實(shí)施方案中，RNA/DNA雜合體在體外用酶或化學(xué)合成方法制備，如本文所描述的或2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.S.N.60/130,377中所描述的方法。在其他實(shí)施方案中，體外合成的DNA鏈在其轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞之前、之后或同時(shí)與體內(nèi)或體外合成的RNA鏈復(fù)合。在另一些實(shí)施方案中，dsRNA為含有正義和反義區(qū)段的單環(huán)核酸，或dsRNA包括環(huán)狀核酸和第二環(huán)狀或線狀核酸(參見(jiàn)，例如，2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.S.N.60/130,377)。示例性環(huán)狀核酸包括套索狀結(jié)構(gòu)，其中核苷酸的游離5’磷酰基與另一個(gè)核苷酸的2’羥基以環(huán)回(loop back)方式連接。
在其他實(shí)施方案中，dsRNA包括一種或多種修飾核苷酸，其中糖的2’位含有鹵素(如氟基團(tuán))或含有烷氧基(如甲氧基)，與2’位含有氫或羥基的對(duì)應(yīng)dsRNA相比，其增加dsRNA在體外和體內(nèi)的半壽期。在另一些實(shí)施方案中，dsRNA除了天然磷酸二酯鍵外，相鄰分子間還有一種或多種其他鍵。這種鍵的實(shí)例包括磷酰胺鍵、硫代磷酸酯鍵和二硫代磷酸酯鍵。dsRNA也可為化學(xué)修飾的核酸分子，如美國(guó)專利號(hào)6,673,661的教導(dǎo)。在其他實(shí)施方案中，dsRNA含一個(gè)或兩個(gè)加帽鏈，如2000年4月19日提交的WO 00/63364和1999年4月21日提交的U.S.S.N.60/130,377公開(kāi)的。在其他實(shí)施方案中，dsRNA含編碼序列或非編碼序列，例如，調(diào)節(jié)序列(如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子或mRNA的5’或3’非翻譯區(qū)(UTR))。此外，dsRNA可以是任何2000年4月19日提交的WO 00/63364中公開(kāi)的至少部分dsRNA分子(參見(jiàn)，例如，8-22頁(yè))，和提交于2002年6月31日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/399,998和提交于2003年7月31日的PCT/US2003/024028；提交于2002年10月18日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466中描述的任何dsRNA分子，其教導(dǎo)通過(guò)引用結(jié)合在本文中。用本文描述的方法或標(biāo)準(zhǔn)方法，如提交于2000年4月19日的WO 00/63364(參見(jiàn)例如16-22頁(yè))中描述的方法，可以在體外或體內(nèi)表達(dá)任何dsRNA分子。
dsRNA“發(fā)夾”構(gòu)建體編碼單分子發(fā)夾dsRNA的構(gòu)建體在某些應(yīng)用中較編碼雙螺旋dsRNA的構(gòu)建體(即由一個(gè)含有正義區(qū)段的RNA分子和一個(gè)分開(kāi)的含有反義區(qū)段的RNA分子組成的dsRNA)更為理想，因?yàn)閹в蟹聪蛑貜?fù)序列的單鏈RNA能更有效的形成dsRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這種較高的效率部分是由于產(chǎn)生雙螺旋dsRNA的含合并(converging)啟動(dòng)子的載體會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄干擾。轉(zhuǎn)錄干擾導(dǎo)致各RNA鏈合成不完全，從而降低了可相互堿基配對(duì)并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的完整正義和反義鏈的數(shù)量。如果需要，可通過(guò)下述途徑來(lái)克服轉(zhuǎn)錄干擾(i)使用兩個(gè)載體系統(tǒng)，一個(gè)載體編碼正義RNA，另一個(gè)載體編碼反義RNA；(ii)使用一個(gè)雙順?lè)醋虞d體，其中各鏈由同一質(zhì)粒編碼但使用分開(kāi)的順?lè)醋樱?iii)使用編碼發(fā)夾dsRNA，即正義序列和反義序列編碼在同一RNA分子中的RNA的單一啟動(dòng)子載體。相對(duì)雙螺旋載體來(lái)說(shuō)，發(fā)夾表達(dá)載體具有某些優(yōu)勢(shì)。例如，在編碼雙螺旋RNA的載體中，RNA鏈在轉(zhuǎn)錄完成后需要很快找到其互補(bǔ)配對(duì)物并與其形成堿基配對(duì)。如果這種雜交未能發(fā)生，單鏈RNA將會(huì)從轉(zhuǎn)錄模板上擴(kuò)散開(kāi)，正義鏈相對(duì)于反義鏈的局部濃度降低。由于每個(gè)細(xì)胞中模板水平較低，此效應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的RNA較體外轉(zhuǎn)錄的RNA更明顯。此外，RNA以毗鄰法則折疊，導(dǎo)致RNA分子的折疊與轉(zhuǎn)錄同步進(jìn)行(即邊轉(zhuǎn)錄邊折疊)，這樣，一定百分比的完整RNA轉(zhuǎn)錄物不能和互補(bǔ)的第二條RNA鏈形成堿基配對(duì)，因?yàn)檫@種分子中的分子內(nèi)堿基配對(duì)。隨著轉(zhuǎn)錄時(shí)間的延長(zhǎng)這種不可用分子的百分比將增加。這種分子可再也不形成雙螺旋，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)是穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)。在發(fā)夾RNA中，RNA序列總與其互補(bǔ)RNA物理上最近。因?yàn)镽NA結(jié)構(gòu)是非靜態(tài)的，當(dāng)RNA瞬時(shí)解折疊時(shí)，因?yàn)槠渚嚯x近，互補(bǔ)序列可瞬間獲得，可參與堿基配對(duì)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)一旦形成，預(yù)期比原非發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定許多。尤其理想的是，例如，“強(qiáng)制性”發(fā)夾構(gòu)建體、能夠被RNA依賴的RNA聚合酶延伸形成dsRNA發(fā)夾的部分發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如2002年7月31日提交的USSN 60/399,998P、2003年7月31日提交的PCT/US2003/024028，″Double Stranded RNAStructures and Constructs and Methods for Generating and Using theSame，″中所教導(dǎo)的；以及″乳房狀″結(jié)構(gòu)的發(fā)夾、帶有錯(cuò)配區(qū)段的發(fā)夾和多表位構(gòu)建體，如提交于2002年10月18日的USSN 60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466，″Double-StrandedRNA Structures and Constructs，and Methods for Generating and Usingthe Same，″中所教導(dǎo)的。
“短dsRNA”指長(zhǎng)度為約50、45、40、35、30、27、25、23、21、20或19個(gè)連續(xù)核苷酸的雙鏈構(gòu)型dsRNA。理想的短dsRNA長(zhǎng)度為至少19個(gè)堿基對(duì)。在理想實(shí)施方案中，雙鏈區(qū)長(zhǎng)度為19-50、19-40、19-30、19-25、20-25、21-23、25-30或30-40個(gè)連續(xù)堿基對(duì)，包括端點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，短dsRNA長(zhǎng)度為30-50、50-100、100-200、200-300、400-500、500-700、700-1000、1000-2000或2000-5000個(gè)核苷酸，包括端點(diǎn)，并且具有長(zhǎng)度為38-60個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈區(qū)段，包括端點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，短dsRNA為完整雙鏈。在某些實(shí)施方案中，dsRNA長(zhǎng)度為11-30個(gè)核苷酸，整個(gè)RNA為雙鏈。在其他實(shí)施方案中，短dsRNA有一個(gè)或兩個(gè)單鏈區(qū)。在某些具體實(shí)施方案中，短dsRNA與PKR或dsRNA介導(dǎo)的應(yīng)激通路中的另一種蛋白結(jié)合。理想地，短dsRNA抑制至少20、40、60、80、90或100％的PKR二聚化和激活。在某些理想實(shí)施方案中，短dsRNA抑制至少20、40、60、80、90或100％的長(zhǎng)RNA與PKR或dsRNA介導(dǎo)的應(yīng)激通路中的另一種蛋白結(jié)合。參見(jiàn)Pachuk，2003年4月28日提交的USSN 10/425,006″Methods of Silencing Genes Without InducingToxicity″的教導(dǎo)，聯(lián)合使用短dsRNA與其他dsRNA以避免dsRNA介導(dǎo)的毒性。
“至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列”指可以從公開(kāi)序列任何核苷酸起始的核苷酸序列，只要從起始位點(diǎn)可產(chǎn)生至少19個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸。例如，至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列可包括核苷酸1-19、核苷酸2-20、核苷酸3-21等，以形成19聚體。因此，20聚體可包括核苷酸1-20、核苷酸2-21、核苷酸3-22等。預(yù)想類似的20個(gè)以上連續(xù)核苷酸的序列。
“表達(dá)載體”指任何設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄RNA的雙鏈DNA或雙鏈RNA，例如，含至少一個(gè)操作性地連接到下游基因或目的編碼區(qū)(例如，編碼蛋白的cDNA或基因組DNA片段，或任何目的RNA，例如，操作性連接到編碼區(qū)外序列、反義RNA編碼區(qū)、dsRNA編碼區(qū)或編碼區(qū)外RNA序列)的啟動(dòng)子的構(gòu)建體。表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到接受細(xì)胞中允許細(xì)胞表達(dá)該表達(dá)載體編碼的RNA或蛋白質(zhì)。表達(dá)載體可以是基因工程質(zhì)粒、病毒或人工染色體物質(zhì)，衍生自例如噬菌體、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒或皰疹病毒。
“表達(dá)構(gòu)建體”指任何設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄RNA的雙鏈DNA或雙鏈RNA，例如，含至少一個(gè)操作性地連接到下游基因或目標(biāo)編碼區(qū)(例如，編碼蛋白的cDNA或基因組DNA片段，或任何目的RNA)的啟動(dòng)子的構(gòu)建體。表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到接受細(xì)胞中允許細(xì)胞表達(dá)該表達(dá)構(gòu)建體編碼的RNA或蛋白質(zhì)。表達(dá)構(gòu)建體可以是基因工程質(zhì)粒、病毒或人工染色體物質(zhì)，衍生自例如細(xì)胞噬菌體、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒或皰疹病毒。表達(dá)構(gòu)建體不一定要在活細(xì)胞中復(fù)制，也可合成制得。
“操作性地連接”指核酸分子與一種或多種調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子)以一定方式連接到一起，以致合適的分子連接到調(diào)節(jié)序列后，允許mRNA的轉(zhuǎn)錄或允許核酸分子產(chǎn)物(如多肽)的表達(dá)和/或分泌。
“啟動(dòng)子”指足以指導(dǎo)共價(jià)連接的核酸分子轉(zhuǎn)錄的核酸序列。此定義也包括轉(zhuǎn)錄控制元件(如增強(qiáng)子)，這種控制元件足以使啟動(dòng)子依賴的基因表達(dá)以細(xì)胞類型特異性、組織特異性或時(shí)間特異性可控，或可受外部信號(hào)和物質(zhì)誘導(dǎo)；這種技術(shù)人員熟知的元件可發(fā)現(xiàn)于基因的5’或3’端或內(nèi)含子中。理想地，啟動(dòng)子以一定方式有效連接到核酸序列，例如，cDNA或基因上，以允許核酸序列表達(dá)。
本發(fā)明的RNA分子可以作為組合物中的RNA分子、部分雙鏈的RNA序列或RNA/DNA雜合體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物或?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在的細(xì)胞外病原體內(nèi)，這種RNA分子可以通過(guò)常規(guī)酶合成方法，例如，根據(jù)Promega Protocols and Applications Guide，(3rd ed.1996)，eds.Doyle，ISBN No.1 57所描述的常規(guī)方法，用噬菌體T7、T3或SP6RNA聚合酶在體外制備。或者這種分子也可以在體外通過(guò)化學(xué)合成方法制得[參見(jiàn)，例如，Xu等.，Nucleic Acids Res.，24(18)3643-4(Sept.1996)；N.Naryshkin等.，Bioorg.Khim.，22(9)691-8(Sept.1996)；J.A.Grasby等.，Nucleic Acids Res.，21(19)4444-50(Sept1993)；C.Chaix et al.，Nucleic Acids Res.177381-93(1989)；S.H.Chou等.，Biochem.，28(6)2422-35(Mar.1989)；0.Odal等.，NucleicAcids Symp.Ser.，21105-6(1989)；N.A.Naryshkin等.，Bioorg.Khim，22(9)691-8(Sept.1996)；S.Sun等.，RNA，3(11)1352-1363(Nov.1997)；X.Zhang等.，Nucleic Acids Res.，25(20)3980-3(Oct.1997)；S.M.Grvaznov等.，Nucleic Acids Res.，2-6(18)4160-7(Sept.1998)；M.Kadokura等.，Nucleic Acids Symp.Ser.，3777-8(1997)；A.Davison等.，Biorned.Pept.Proteins.Nucleic Acids，2(1)1-6(1996)；和A.V.Mudrakovskaia等.，Bioorg.Khirn.，17(6)819-22(Jun.1991)]。
還或者，本發(fā)明的RNA分子還可在重組微生物，例如細(xì)菌和酵母內(nèi)，或在重組宿主細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)制備，通過(guò)常規(guī)方法從它們的培養(yǎng)物中分離而得。參見(jiàn)，例如，Sambrook等的MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989(其為示例性實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，對(duì)該技術(shù)有詳細(xì)描述)和美國(guó)專利號(hào)5.824,538；5,877,159；和5,643,771中描述的技術(shù)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
當(dāng)在體外制備時(shí)，這種在體外制備或合成的RNA分子可以直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物。結(jié)合本文提供的教導(dǎo)，上述參考書給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了產(chǎn)生任何下列具體實(shí)施方案的必要技術(shù)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的“藥物”為雙螺旋(即由雙鏈組成)，其為或完整雙鏈或部分雙鏈RNA。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物為單鏈RNA正義鏈。在另一實(shí)施方案中，組合物中的藥物為單鏈RNA反義鏈。
優(yōu)選單鏈RNA正義或反義鏈在其一邊或兩邊的末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。理想的單鏈RNA正義或反義鏈在其末端之間的某些中間區(qū)域形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這種單鏈RNA正義或反義鏈也可以被設(shè)計(jì)為能夠自我反向折疊而在體外或體內(nèi)形成部分雙鏈的結(jié)構(gòu)。還有另一個(gè)實(shí)施方案，其中組合物中作為有效藥物的單鏈RNA分子含有正義多核苷酸序列和反義多核苷酸序列兩者，中間有非配對(duì)堿基序列相隔。優(yōu)選地，一旦進(jìn)入細(xì)胞或在體外合成過(guò)程中，這種單鏈RNA序列有形成雙鏈的能力。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中為以上描述的RNA/DNA雜合體。
在另一實(shí)施方案中，合成的RNA分子是一個(gè)可以形成桿狀結(jié)構(gòu)的或部分雙鏈結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA分子，可以通過(guò)S.Wang等，NucleicAcids Res.，22(12)2326-33(June 1994)；Y.Matsumoto等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，87(19)7628-32(Oct.1990)；E.Ford&M.Ares，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(8)3117-21(Apr.1994)；M.Tsagris等，Nucleic Acids Res.，197)1605-12(Apr.1991)；S.Braun等，NucleicAcids Res.24(21)4152-7(Nov.1996)；Z.Pasman等，RNA，2(6)603-10(Jun.1996)；P.G.Zaphiropoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，93(13)6536-41(Jun.1996)；D.Beaudry等，Nucleic Acids Res.，23(15)3064-6(Aug.1995)描述的技術(shù)制備(全部通過(guò)引用結(jié)合于此)。另一種藥物為含有DNA和RNA雙鏈分子，其中DNA和RNA為不同的鏈或DNA、RNA分散在同一條鏈中。
或者，RNA分子可以在體內(nèi)形成，由“導(dǎo)入劑”導(dǎo)入，該導(dǎo)入劑被導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物后在體內(nèi)產(chǎn)生這種部分雙鏈的RNA分子。所以，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，形成本發(fā)明的組合物的劑是雙鏈DNA分子，該雙鏈DNA分子編碼以上描述的RNA分子的一種。該DNA組分提供在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄而形成雙鏈RNA的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA序列提供的脫氧核糖核苷酸序列在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄成為以上描述的正義或反義RNA單鏈，該RNA鏈機(jī)會(huì)性地在一邊或兩邊末端形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)或反向自我折疊形成部分雙鏈。作為組合物中導(dǎo)入劑的DNA分子能提供含正義多核苷酸序列和反義多核苷酸序列兩者的單鏈RNA序列、其間有非堿基配對(duì)的多核苷酸序列相隔，其中該單鏈RNA序列有形成雙鏈的能力?；蛘?，作為導(dǎo)入劑的DNA分子在體內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄提供以上描述的可形成桿狀結(jié)構(gòu)或部分雙鏈結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA分子。DNA分子也可在體內(nèi)產(chǎn)生以上描述的RNA/DNA雜合體或含有一條RNA鏈和一條DNA鏈的雙螺旋。這種不同的DNA分子可以通過(guò)以上引用的Sambrook和Promega reference中描述的那些常規(guī)方法來(lái)設(shè)計(jì)。
本發(fā)明中的能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成任何以上描述的RNA分子的導(dǎo)入劑可以是單鏈或雙鏈的質(zhì)粒或載體。設(shè)計(jì)用于在體外或體內(nèi)產(chǎn)生本文描述的RNA的表達(dá)載體可以含有受任何RNA聚合酶控制的序列，包括線粒體RNA聚合酶、RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、病毒聚合酶和噬菌體聚合酶，如T7和Sp6。根據(jù)本發(fā)明，這種載體可以用于在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄需要的RNA分子。可以有意地設(shè)計(jì)載體利用內(nèi)源性線粒體RNA聚合酶(例如，人線粒體RNA聚合酶，在此種情況下，載體可用相應(yīng)的人線粒體啟動(dòng)子)。線粒體聚合酶可以用來(lái)在體內(nèi)產(chǎn)生加帽的(通過(guò)capping酶的表達(dá))或非加帽的信使RNA。RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄子也可以在體內(nèi)產(chǎn)生。這種RNA可以被加帽或不加帽。如果需要，胞質(zhì)加帽可以通過(guò)各種方式包括用加帽酶如痘苗加帽酶或α病毒加帽酶來(lái)完成。但是，所有聚合酶II的轉(zhuǎn)錄子是加帽的。設(shè)計(jì)的DNA載體可含其中一個(gè)啟動(dòng)子或含多個(gè)聯(lián)合啟動(dòng)子(線粒體、RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、病毒、細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，并與同源聚合酶一起使用)。優(yōu)選的，當(dāng)啟動(dòng)子為RNA聚合酶II啟動(dòng)子，編碼RNA分子的序列有一個(gè)大于300核苷酸的可讀框時(shí)，必須遵循避免無(wú)意義密碼子介導(dǎo)的核酸降解的設(shè)計(jì)規(guī)則。這樣的質(zhì)?；蜉d體可以包含來(lái)自細(xì)菌、病毒或噬菌體的序列。
這種載體包括染色體、游離體和病毒衍生的載體，例如，衍生自細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、酵母游離體、酵母染色體原件和病毒以及它們的聯(lián)合的載體，如那些衍生自質(zhì)粒和噬菌體基因原件的粘粒和phagemids。
這樣，一種示例性載體為單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體。另一種示例性載體是單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。通過(guò)已知的將DNA和RNA導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)，這種載體可以以多核苷酸，優(yōu)選DNA的形式導(dǎo)入細(xì)胞。對(duì)于噬菌體和病毒載體也可以用已知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式優(yōu)選以包裝好的或帶核殼的病毒導(dǎo)入細(xì)胞。病毒載體可以是復(fù)制型或復(fù)制缺陷型，后者只能在其互補(bǔ)宿主細(xì)胞中復(fù)制。
另一個(gè)實(shí)施方案導(dǎo)入劑含不止一種的單鏈DNA或RNA質(zhì)?；蜉d體。正如一個(gè)例子中第一DNA質(zhì)粒能提供以上描述的單鏈RNA正義多核苷酸序列，第二DNA質(zhì)粒能提供以上描述的單鏈RNA反義多核苷酸序列，其中正義和反義多核苷酸序列能夠進(jìn)行堿基配對(duì)形成雙鏈。這種質(zhì)?？珊衅渌Ｒ?guī)的質(zhì)粒序列，例如，已知的用于構(gòu)建重組蛋白表達(dá)的質(zhì)粒和載體的細(xì)菌序列。然而更理想的質(zhì)粒是不含這種能夠使重組蛋白得以表達(dá)的序列，如不含Kozak區(qū)域等的質(zhì)粒。
本發(fā)明中用于產(chǎn)生dsRNA的載體設(shè)計(jì)理想的可設(shè)計(jì)能產(chǎn)生兩個(gè)或多個(gè)，包括多個(gè)與靶序列同源或互補(bǔ)的不同的dsRNA。理想的方式是用一個(gè)單一載體產(chǎn)生多個(gè)行使獨(dú)立功能dsRNA，而不是從一個(gè)單一轉(zhuǎn)錄單位生成一個(gè)單一dsRNA，并且，多個(gè)不同的dsRNA生成后，可以經(jīng)過(guò)自我選擇達(dá)到最佳效應(yīng)。達(dá)到此目的方法有許多，包括利用自動(dòng)催化序列和切割序列來(lái)產(chǎn)生隨機(jī)和/或預(yù)期的剪切位點(diǎn)。
其他提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成以上描述的理想RNA分子的必要信息的導(dǎo)入劑包括活的、減毒的、滅活的和失活的重組細(xì)菌，它們?cè)谠O(shè)計(jì)上含有本發(fā)明中所需RNA的必要序列。這種重組細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞及其類似物可以通過(guò)如美國(guó)專利號(hào)5,824,538；5,877,159；和5,643,771，(以參考的形式結(jié)合于此)所描述的常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。能夠用于制備這種導(dǎo)入劑的微生物包括以上被引用的參考中所列出的那些，包括但不限于，大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和各種假單孢菌(Pseudomonas)、鏈酶菌(Streptomyces)和葡萄球菌(Staphylococcus)。
另一些在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)提供形成以上描述的理想的RNA分子必要信息的導(dǎo)入劑包括活的、減毒的或滅活的、失活的病毒，尤其是攜帶有以上所述的需要的RNA多核苷酸序列的重組病毒。這種病毒在設(shè)計(jì)上可以類似目前用于基因治療或其他方面的將基因?qū)爰?xì)胞的重組病毒，但是最好無(wú)表達(dá)蛋白或蛋白的功能片段的能力。在這種可經(jīng)操控來(lái)給體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供所需RNA分子的病毒或病毒序列中，包括但不限于α病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、桿狀病毒、δ病毒、痘病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、乳頭多瘤空皰病毒(如SV40)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、假性狂犬病病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢性病毒、痘苗病毒、正鏈和負(fù)鏈RNA病毒、類病毒和擬病毒或其片段。這種不同的病毒導(dǎo)入劑可以應(yīng)用如M.Di Nocola等在Cancer Gene Ther.，5(6)350-6(1998)描述的常規(guī)技術(shù)及其他包括本發(fā)明中的描述的技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)。
術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)”意在涵蓋任何含有完整的細(xì)胞DNA或RNA復(fù)制機(jī)制的體系，包括組織培養(yǎng)體系和單細(xì)胞或多細(xì)胞活生物體。
″多序列表位(multiple sequitope)dsRNA″或″多序列表位(multisequitope)dsRNA″指含有來(lái)自多個(gè)靶核酸的片段的RNA分子或含有來(lái)自同一靶核酸上不連續(xù)的片段的RNA分子。例如，多序列表位dsRNA可以含有來(lái)自(i)單一生物體的多個(gè)基因的序列；(ii)不同生物體的一種或多種基因的序列；和/或(iii)一個(gè)特殊基因上不同區(qū)域的序列(例如來(lái)自啟動(dòng)子的一種或多種序列和來(lái)自mRNA的一種或多種序列)的片段。理想狀態(tài)是，各片段有相當(dāng)多的序列與靶核酸的對(duì)應(yīng)序列相同。在各種理想實(shí)施方案中，與靶核酸有相當(dāng)多的序列相同的片段的長(zhǎng)度為至少19、20、21、22、23、24、30、40、50、100、200、500、750或更多的堿基對(duì)。在理想實(shí)施方案中，多序列表位dsRNA抑制至少2、4、6、8、10、15、20或更多的基因至少20、40、60、80、90、95或100％的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，多序列表位dsRNA含有來(lái)自同一靶基因的不連續(xù)的片段，它們的順序可以是也可以不是天然發(fā)生的5’到3’順序，并且它們比只含有其中一個(gè)片段的dsRNA對(duì)核酸表達(dá)的抑制至少高出50、100、200、500或1000％。
“序列表位(sequitope)”指與RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)有關(guān)并激活RISC的連續(xù)的雙鏈多核苷酸序列，通常包括一個(gè)長(zhǎng)度為19到27個(gè)堿基對(duì)的序列，含有至少一個(gè)來(lái)自本文鑒別的一種或多種HBV和/或HCV的保守核苷酸序列的序列表位序列可以用于本文所講的dsRNA介導(dǎo)的基因沉默。
多表位dsRNA 2002年10月18日提交的USSN 60/419,532和2003年10月10日提交的PCT/US2003/033466中談到的多表位或多序列表位方法的優(yōu)勢(shì)適用于本發(fā)明的HBV和/或HCV保守序列。因?yàn)橐粋€(gè)單一dsRNA可同時(shí)沉默許多靶基因(例如來(lái)自多個(gè)病原體的基因、來(lái)自單個(gè)病原體的多個(gè)基因或序列或與多種疾病有關(guān)的基因)，一個(gè)多表位dsRNA可用于同一受試者(subject)的許多不同指征或用于一個(gè)受試者的一系列指征和另一受試者的另一系列指征。對(duì)于這樣的應(yīng)用，以能夠表達(dá)長(zhǎng)dsRNA分子(例如多基因序列的dsRNA分子)而又不引起dsRNA應(yīng)激反應(yīng)為最理想。例如，通過(guò)使用連續(xù)序列，如每個(gè)短至19到21個(gè)核苷酸，理想情況100到600個(gè)核苷酸，或者大至1、2、3、4、5千或更多的核苷酸，使它們的總長(zhǎng)度在所選質(zhì)粒的最大容量(例如容納20000個(gè)堿基的長(zhǎng)度)之內(nèi)，一個(gè)單一的這樣的藥用組合物能夠以相對(duì)低的價(jià)格和相對(duì)低的毒性使機(jī)體免受病原和/或毒素如HBV、HCV、HIV等的侵害。
應(yīng)用來(lái)自高度變化和快速突變的病原如HBV和/或HCV的一種或多種基因的多表位很有優(yōu)勢(shì)。例如，一個(gè)單一種的識(shí)別和以HBV和/或HCV的不同株和變種為目標(biāo)的dsRNA可被用作治療和預(yù)防HBV和/或HCV的不同株和變種的通用藥物。
沉默特殊病原如HBV和/或HCV的多個(gè)基因能夠避免HBV和/或HCV逃逸突變株被選擇出來(lái)。相比之下，典型的只針對(duì)一個(gè)基因或蛋白的小分子藥物治療或疫苗療法可導(dǎo)致那些在靶基因或靶蛋白上有持續(xù)突變的病原株被選擇出來(lái)，從而對(duì)這種治療產(chǎn)生抗性。通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明中同時(shí)以病原的多個(gè)基因或序列或病原基因的廣范區(qū)域?yàn)榘心繕?biāo)的多表位方法，這樣的“逃逸突變株”的出現(xiàn)可被有效排除。
例如，特別具有優(yōu)勢(shì)的是用來(lái)自HCV SEQ ID NO11和SEQ IDNO12二者的序列的混合，即一種或多種來(lái)自HCV SEQ ID NO11的序列與一種或多種來(lái)自HCV SEQ ID NO12的序列，以一個(gè)單一的dsRNA構(gòu)建體給藥，或以混合構(gòu)建體給藥，或以伴隨給藥的方式用于患者，以降低其產(chǎn)生逃逸突變株的能力。類似，使用保守HBV序列的混合也同樣具有優(yōu)勢(shì)，在某些情況下，還可以與本發(fā)明中的一種或多種保守HCV序列聯(lián)合使用。
同樣，將兩個(gè)或多個(gè)來(lái)自HBV SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，和SEQ ID NO3的序列，以一個(gè)單一的dsRNA構(gòu)建體給藥，或以混合構(gòu)建體給藥，或以這種構(gòu)建體伴隨給藥的方式用于患者也很理想。SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，和SEQ ID NO3定位于表面抗原基因。由于HBVmRNA的重疊性質(zhì)，一種或多種這種序列將以以下mRNA為靶目標(biāo)表面抗原(sAg)、前核心抗原、核心抗原和聚合酶抗原mRNA。由于表面抗原的mRNA存在量最多，如果基因沉默機(jī)制可被飽和，其mRNA最有可能成為靶目標(biāo)，但是其他所列出的mRNA也有成為靶目標(biāo)的可能。期望降低表面抗原有以下原因a)表面抗原為包裝感染性病毒所必須；b)感染過(guò)程中表面抗原的過(guò)度表達(dá)被認(rèn)為與慢性感染過(guò)程中的免疫耐受有關(guān)；c)表面抗原在感染個(gè)體的肝內(nèi)表達(dá)(即使無(wú)病毒存在，即從整合到宿主細(xì)胞的表面抗原序列進(jìn)行表達(dá))誘發(fā)肝炎。所以，降低表面抗原很可能會(huì)降低病毒滴度、克服免疫耐受并降低/預(yù)防肝炎。
HBV SEQ ID NO4定位于前核心和核心抗原的獨(dú)特區(qū)域，特異性地以這種mRNA為靶目標(biāo)，核心蛋白為有活性病毒毒粒所必須，所以下調(diào)此mRNA預(yù)計(jì)能降低病毒滴度。應(yīng)該不存在這種效應(yīng)RNA與表面抗原、聚合酶抗原或X蛋白的mRNA的競(jìng)爭(zhēng)。
HBV SEQ ID NO5到SEQ ID NO8定位于聚合酶基因。其效應(yīng)RNA預(yù)計(jì)只以前核心/核心抗原和聚合酶轉(zhuǎn)錄子為靶目標(biāo)。應(yīng)該沒(méi)有與表面抗原或XmRNA的競(jìng)爭(zhēng)。聚合酶為病毒基因組合成所必須，因此如果聚合酶減少，病毒滴度也應(yīng)該減少。
HBV SEQ ID NO9定位于X基因。由于所有mRNA都存在末端冗余，這種效應(yīng)RNA有以所有mRNA為靶目標(biāo)的潛力。X蛋白有許多推測(cè)(沒(méi)有證實(shí))的功能。在慢性活動(dòng)性肝炎的個(gè)體的HBV整合序列中經(jīng)?？梢?jiàn)X基因，下調(diào)X基因的表達(dá)預(yù)期可以減緩疾病。
總的來(lái)說(shuō)，使用的來(lái)自不同的鑒別序列的序列越多(例如，SEQID NO1、SEQ ID NO2，和/或SEQ ID NO3的序列加上來(lái)自SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9，和SEQ ID NO10的序列)，病毒產(chǎn)生有效逃逸突變株的可能性越小。而且，越多的不同mRNA作為靶目標(biāo)，病毒的滴度降低和病情緩解將會(huì)越顯著。
多表位構(gòu)建體、混合構(gòu)建體或不同dsRNA構(gòu)建體伴隨給藥的理想序列組合包括來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO4的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO5的序列；來(lái)自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO6的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ IDNO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的序列；來(lái)自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ IDNO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ IDNO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ IDNO5和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ IDNO5和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQID NO6和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO6和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ IDNO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO6和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO7和SEQ IDNO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO7和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ IDNO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQID NO1、SEQ ID NO2，或SEQ ID NO3的序列加來(lái)自SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的序列；來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的序列；來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的序列；來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO5和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO6和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO6和SEQID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO7和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO7和SEQ IDNO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQID NO8和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO9和SEQ IDNO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；和SEQ ID NO6的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ IDNO6和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6和SEQ IDNO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7和SEQ ID NO 9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；和SEQ ID NO7序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；和SEQ ID NO8序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；和SEQ ID NO9序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7；和SEQ ID NO8序列；
來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7；和SEQ ID NO9序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO8；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7；和SEQ ID NO8序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7；和SEQ ID NO9序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO8；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8的；和SEQ ID NO9序列；來(lái)自SEQ ID NO7、SEQ ID NO8；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO7、SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO8、SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；和SEQ ID NO7的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；和SEQ IDNO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ IDNO7；和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQID NO7；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ IDNO5；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ IDNO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ IDNO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6；SEQ ID NO；和SEQID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7；SEQ IDNO8；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ IDNO6；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ IDNO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO8；和SEQ IDNO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6；SEQ IDNO7；和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6；SEQID NO7；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ IDNO7；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；和SEQ ID NO；10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ IDNO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ ID NO7；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQ IDNO8；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQID NO8；和SEQ ID NO10；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6；SEQID NO9；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ IDNO7；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ IDNO6、SEQ ID NO7；SEQ ID NO8；和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7；SEQ ID NO9；和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO8；SEQ ID NO9；和SEQ IDNO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQID NO7和SEQ ID NO8的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ IDNO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO7和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ IDNO8和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQID NO6；SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8，和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8，和SEQ ID NO1 0的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8，和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6，SEQ IDNO7、SEQ ID NO8，和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6，SEQ ID NO7、SEQ ID NO9，和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8，和SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8，和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9，和SEQ ID NO10的序列來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9，andSEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9，和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9，and SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8，and SEQ ID NO9的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8，和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ IDNO7、SEQ ID NO9，和SEQ ID NO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ IDNO10序列；來(lái)自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10序列；來(lái)自SEQ ID NO4，SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ IDNO10的序列；來(lái)自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列；和來(lái)自SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ D NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自任何以上提到的序列的序列表位和較長(zhǎng)序列的聯(lián)合(如SEQ ID NO1到SEQ ID NO12)可以以單一dsRNA構(gòu)建體給藥、混合構(gòu)建體給藥，或通過(guò)伴隨給藥用于患者。
正如本文其他部分討論過(guò)的那樣，本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案應(yīng)用dsRNA表達(dá)構(gòu)建體或載體內(nèi)源性導(dǎo)入本發(fā)明的dsRNA，尤其是以上描述的多個(gè)不同的序列。這種dsRNA可以在表達(dá)載體，如質(zhì)粒，的同一順?lè)醋又畠?nèi)，也可在表達(dá)載體的不同順?lè)醋又畠?nèi)，或者在不同的表達(dá)構(gòu)建體或質(zhì)粒上，例如，一種或多種質(zhì)粒和/或一種或多種載體，包括病毒載體。這樣的多個(gè)不同序列也能以一種或多種dsRNA結(jié)構(gòu)，雙螺旋和/或發(fā)夾結(jié)構(gòu)外源性提供，和/或與一種或多種內(nèi)源性表達(dá)的dsRNA聯(lián)合使用。
核酸給藥的理想方式 本發(fā)明的DNA和/或RNA構(gòu)建體可以以“裸”DNA、RNA或DNA/RNA的形式與不含任何促轉(zhuǎn)染劑的藥用載體一起用于宿主細(xì)胞/組織/生物體，正如那些DNA和RNA導(dǎo)入領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，更有效的導(dǎo)入可以通過(guò)使用，例如，多核苷酸促轉(zhuǎn)染劑來(lái)達(dá)到。以下是示例性促轉(zhuǎn)染劑陽(yáng)離子雙性分子，包括局部麻醉藥如布比卡因(bupivacaine)、陽(yáng)離子脂、脂質(zhì)體或脂質(zhì)顆粒、多價(jià)陽(yáng)離子如多溶素、分枝三維多價(jià)陽(yáng)離子如樹(shù)狀聚合物、碳水化合物、清潔劑或表面活性劑，包括苯甲基胺鹽表面活性劑，如苯扎氯。適用于本發(fā)明的這種促進(jìn)劑或協(xié)同劑的非獨(dú)占性例子在美國(guó)專利號(hào)5,593,972；5,703,055；5,739,118；5,837,533；5,962,482；6,127,170；6,379,965；6,482,804和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US98/22841中有描述，這種教導(dǎo)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。美國(guó)專利號(hào)5,824,538；5,643,771；和5,877,159(據(jù)此被引為參考)描述了不同于多核苷酸組合物的組合物的導(dǎo)入，例如，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的供者細(xì)胞或含有本發(fā)明的dsRNA-編碼組合物的細(xì)菌的導(dǎo)入。
在某些實(shí)施方案中，dsRNA或dsRNA表達(dá)載體與一種或多種陽(yáng)離子脂或陽(yáng)離子雙性分子組成復(fù)合體，如US 4,897,355(Eppstein等1 987年10月29日提交)，US 5,264,61 8(Felgner等1991年4月16日提交)或US 5,459,127(Felgner等1993年9月16日提交)公開(kāi)的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA或dsRNA表達(dá)載體與脂質(zhì)體或脂質(zhì)體組合物，包括陽(yáng)離子脂，可選性地包括另一種成分如中性脂，形成復(fù)合物(參見(jiàn)，例如，US 5,279,833(Rose)，US 5,283,185(Epand)，and US 5,932,241)。
特別理想的藥學(xué)適用的本發(fā)明多核苷酸組合物的導(dǎo)入方法，包括對(duì)肝細(xì)胞的靶向性導(dǎo)入，在2003年5月6日提交的PCT/US03/14288上有描述，其教導(dǎo)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
研究和其他非治療目的細(xì)胞轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染可以通過(guò)各種方式來(lái)進(jìn)行，包括但不限于，脂染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、磷酸鈣沉淀、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入、電穿孔或基因槍轉(zhuǎn)染。RNA或RNA表達(dá)載體(DNA)可以是裸RNA或DNA或與局麻藥復(fù)合的RNA或DNA(參見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)6,217,900和6,383,512，″VesicularComplexes and Methods of Making and Using the Same，Pachuk等.，supra)。
另一理想的適于藥用的導(dǎo)入本發(fā)明的dsRNA或dsRNA表達(dá)構(gòu)建體的技術(shù)是基于含環(huán)糊精的多價(jià)陽(yáng)離子的自我裝配(self-assembling)的CyclosertTM雙成分核酸導(dǎo)入系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以從Insert Therapeutics，Pasadena，CA獲得(參見(jiàn)，Bioconjug Chem 2003 May-Jun；14(3)672-8；Popielarski等；″Structural effects of carbohydrate-containingpolycations on gene delivery.3.Cyclodextrin type and functionalization″；和Bioconjug Chem 2003 Jan-Feb；14(1)247-54 and 255-61)。第一成分為一種線狀、含環(huán)糊精的陽(yáng)離子多聚體，當(dāng)與DNA混合后，與核酸的磷酸鹽“骨架”結(jié)合，引起DNA凝聚并自我裝配成均勻一致的膠體納米粒子，保護(hù)DNA不被血清中的核酸酶降；第二成分為一種帶有末端金剛硼(amamantine)-PEG分子的表面修飾劑，當(dāng)與環(huán)糊精多聚體結(jié)合后，形成表面帶有環(huán)糊精的包絡(luò)物，預(yù)防聚合、增強(qiáng)穩(wěn)定性，使系統(tǒng)給藥能夠進(jìn)行。另外，可以將細(xì)胞表面受體的靶配體與改性劑(the modifier)附著直接將DNA靶向性導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。因?yàn)楦渭?xì)胞對(duì)HBV和HCV易感，用這種方法將本發(fā)明中的dsRNA表達(dá)構(gòu)建體靶向性導(dǎo)入肝細(xì)胞被認(rèn)為特別有優(yōu)勢(shì)，例如，可以通過(guò)帶有半乳糖或乳糖殘基，如半乳糖多聚體的合成配體來(lái)針對(duì)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞上的去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)靶。
總的來(lái)說(shuō)，將本發(fā)明中的dsRNA構(gòu)建體有選擇的靶向性導(dǎo)入肝細(xì)胞為優(yōu)選，靶向性導(dǎo)入肝細(xì)胞可以通過(guò)連接肝細(xì)胞特異性的受體的配體來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，脫唾液酸血清類粘蛋白(多聚)，L-賴氨酸脫-唾液酸血清類粘蛋白，或任何其他唾液酸糖蛋白受體的配體(Spiess，Biochemistry 29(43)10009-10018，1990；Wu等.，J.Biol.Chem.267(18)12436-12439，1992；Wu et al.，Biotherapy 387-95，1991)。同樣，多核苷酸可以通過(guò)與抗肝細(xì)胞特異性受體的單克隆抗體連接來(lái)靶向性導(dǎo)入肝細(xì)胞，多核苷酸也可通過(guò)以下描述的特異性載體來(lái)導(dǎo)入肝細(xì)胞。
導(dǎo)入本發(fā)明的dsRNA或dsRNA表達(dá)構(gòu)建體的特別優(yōu)選的組合物是2003年5月6日提交的PCT/US03/14288中所描述的多功能組合物，其中包括三乳糖(trilactosyl)精胺作為肝細(xì)胞ASG受體的配體?？梢灾苽淙樘悄戠薮季放c本發(fā)明中的多核苷酸形成復(fù)合物用于所描述的體內(nèi)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明中的dsRNA多核苷酸可以外源性地提供給肝細(xì)胞?？蛇x性地，dsRNA也可在靶細(xì)胞內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄含有被操作性地連接到編碼dsRNA的序列的啟動(dòng)子的核酸序列產(chǎn)生。在這種方法中，核酸分子含于非復(fù)制的線狀或環(huán)狀DNA或RNA分子中，或者含于自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《据d體中，或整合于宿主基因組中。任何能夠轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞的載體都可用于本發(fā)明。優(yōu)選載體為病毒載體，包括那些衍生至復(fù)制缺陷型肝炎病毒(例如，HBV和HCV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(參見(jiàn)，例如W089/07136；Rosenberg等.，N.Eng.J.Med.323(9)570-578，1990)、腺病毒(參見(jiàn)，例如.，Morsey等.，J.Cell.Biochem.，Supp.17E，1993；Graham等.，in Murray，ed.，Methods in Molecular BiologyGeneTransfer and Expression Protocols.Vol.7，Clifton，N.J.the HumanPress 1991109-128)、腺相關(guān)病毒(Kotin等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872211-2215，1990)、復(fù)制缺陷型單純皰疹病毒(HSV；Lu等.，Abstract，page 66，Abstracts of the Meeting on Gene Therapy，Sep.22-26，1992，Cold Spring Harbor Laboraory，Cold Spring Harbor，N.Y.)及任何這種載體的改良型。構(gòu)建這種表達(dá)載體的方法在本領(lǐng)域已人盡皆知(參見(jiàn)，如.，Molecular CloningA Laboraory Manual，Sambrook等.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd Edition，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989).。
合適的調(diào)節(jié)序列可以通過(guò)本領(lǐng)人員所知的方法插入到本發(fā)明的載體中，例如，同源重組的方法(Graham等.，J.Gen.Virol.3659-72，1977)，或其他適宜的方法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等.，eds.，Cold Spring Harbor Laboraory，2nd Edition，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)。
啟動(dòng)子 啟動(dòng)子插入載體時(shí)，典型情況是被操作性地連接到編碼dsRNA多核苷酸的5’端，但也不是一成不變。任何能夠在真核細(xì)胞中指引轉(zhuǎn)錄的起始的啟動(dòng)子都可用于本發(fā)明。例如，非組織特異性啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(DeBernardi等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 889257-9261，1991，and references therein)、小鼠金屬硫蛋白基因(Hammer，等.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288，1982)、HSV胸苷激酶(McKnight，Cell 31355-365 1982)、SV40早期基因(Benoist等.，Nature290304-310，1981)可被使用。非組織特異性啟動(dòng)子能夠用于本發(fā)明，是由于非組織特異性啟動(dòng)子在非肝臟細(xì)胞中引起的HBV和/或HCVdsRNA的表達(dá)對(duì)非肝臟細(xì)胞無(wú)害，因?yàn)楸景l(fā)明中的HBV和HCVdsRNA為病毒特異。然而，本發(fā)明中優(yōu)選使用的啟動(dòng)子為肝細(xì)胞特異的啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子的使用確保了本發(fā)明的RNA主要在肝細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選的肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子包括，但不限于血清白蛋白、甲胎蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)、脫唾液酸糖蛋白受體啟動(dòng)子。病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，如那些來(lái)自巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒(I和II型)、肝炎病毒(A、B、C)和Rous肉瘤病毒(RSV；Fang等.，Hepatology 10781-787，1989)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子也可用于本發(fā)明。
dsRNA表達(dá)載體可以包含RNA聚合酶I、RNA聚合酶II啟動(dòng)子，包括但不限于HCMV、SCMV、MCMV、RSV、EF2a、TK和其他HSV啟動(dòng)子如ICP6、ICP4和ICPO啟動(dòng)子、HBV前基因組啟動(dòng)子，RNA聚合酶III啟動(dòng)子包括但不限于U6和tRNA啟動(dòng)子、線粒體輕鏈和重鏈啟動(dòng)子。理想情況下，dsRNA表達(dá)載體包含至少一個(gè)RNA聚合酶II啟動(dòng)子，例如人CMV介導(dǎo)的早期啟動(dòng)子(HCMV-IE)或猿CMV(SCMV)啟動(dòng)子、至少一個(gè)RNA聚合酶I啟動(dòng)子或至少一個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可是T7啟動(dòng)子，在此情況下，細(xì)胞另外含有T7RNA聚合酶?？蛇x性的，啟動(dòng)子可以是SP6啟動(dòng)子，在此種情況，細(xì)胞進(jìn)一步含有SP6RNA聚合酶。啟動(dòng)子可以是一個(gè)趨同T7啟動(dòng)子和趨同SP6啟動(dòng)子(？)，可以通過(guò)用含有T7或SP6聚合酶的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞而使細(xì)胞分別含有T7聚合酶和SP6聚合酶。在某一實(shí)施方案中，T7啟動(dòng)子或RNA聚合酶III啟動(dòng)子被操作性地連接到編碼一個(gè)短dsRNA(如，一個(gè)長(zhǎng)度短于200、150、100、75、50、或25堿基對(duì))上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為允許載體上的核酸在胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄的線粒體啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如，2000年4月19日提交的WO 00/63364和2001年1月9日提交的WO/US2002/00543上描述的線粒體質(zhì)粒。可選性的，啟動(dòng)子為可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如lac(Cronin等.Genes & Development 151506-1517，2001)、ara(Khlebnikov等.，J Bacteriol.2000 Dec；182(24)7029-34)、ecdysone(Rheogene website)、RU48(mefepristone)(類固醇拮抗劑)(Wang XJ，Liefer KM，Tsai S，O′Malley BW，Roop DR，ProcNatl Acad Sci U S A.1999 Jul 20；96(1 5)8483-8)，或tet啟動(dòng)子(Rendal等，Hum Gene Ther.2002；13(2)335-42和Larnartina等.，Hum Gene Ther.2002；13(2)199-210)或提交于2000年4月19日的WO 00/63364中所公開(kāi)的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的方法和組合物中還可用2003年4月22日提交的USSN 60/464中描述的結(jié)構(gòu)嵌合的啟動(dòng)子。另外，參見(jiàn)Pachuk，C.，and Satishchandran，C.提交于2003年8月22日提交的美國(guó)臨床申請(qǐng)?zhí)?0/497,304″Multiple-CompartmentEurkaryotic Expression Systems，″中描述的啟動(dòng)子系統(tǒng)，該系統(tǒng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的方法和組合物特別理想的系統(tǒng)。
用于本發(fā)明的dsRNA表達(dá)構(gòu)建體的肝特異性啟動(dòng)子包括血清白蛋白啟動(dòng)子、甲胎蛋白啟動(dòng)子(尤其在肝癌細(xì)胞)、甲一型抗胰蛋白酶啟動(dòng)子、乙肝啟動(dòng)子，例如，包括抗原基因，如核心抗原、e抗原、聚合酶和X蛋白的啟動(dòng)子。
T7啟動(dòng)子/T7聚合酶表達(dá)系統(tǒng) 本發(fā)明中的一個(gè)理想方法是用T7dsRNA表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)在脊椎動(dòng)物細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)胞質(zhì)中表達(dá)dsRNA(長(zhǎng)或短的dsRNA分子)。該T7表達(dá)系統(tǒng)利用T7啟動(dòng)子表達(dá)需要的dsRNA，轉(zhuǎn)錄由T7 RNA聚合酶驅(qū)動(dòng)，該T7 RNA聚合酶可以在另一個(gè)質(zhì)粒上或在同一個(gè)質(zhì)粒上。細(xì)胞噬菌體T7 RNA聚合酶(T7 Pol)是T7基因1的產(chǎn)物，它可以特異性地識(shí)別對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子序列并有很高的轉(zhuǎn)錄活性。完整的T7基因組序列，含關(guān)于該細(xì)菌噬菌體的不同區(qū)域的詳細(xì)信息，包括啟動(dòng)子序列公開(kāi)在Dunn &Studier，1983，J.Mol.Biol.166(4)，477-535上(也見(jiàn)NCBI′Genome′database，Accession No.NC 00 1 604)，T7啟動(dòng)子不能被T7噬菌體聚合酶(有極嚴(yán)格的啟動(dòng)子特異性)以外的其他聚合酶利用(Chamberlin等.，1970，Nature 228227-231)。當(dāng)用T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)dsRNA時(shí)，例如，第一質(zhì)粒構(gòu)建體可用T7啟動(dòng)子控制下的表達(dá)正義和反義鏈二者的質(zhì)粒，第二質(zhì)粒可用RSV啟動(dòng)子控制下表達(dá)T7RNA聚合酶的質(zhì)粒。dsRNA和T7RNA聚合酶也可更方便地用具有雙順?lè)醋拥膯我毁|(zhì)粒構(gòu)建體來(lái)表達(dá)，尤其是當(dāng)dsRNA由含有能夠形成至少部分雙鏈區(qū)的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的自我互補(bǔ)的反向重復(fù)序列或區(qū)域的單鏈RNA形成時(shí)。自我裝配形成dsRNA的各正義和反義鏈可以由一個(gè)單一的質(zhì)粒構(gòu)建體合成，例如，趨同啟動(dòng)子如T7啟動(dòng)子分別被插入到所選被轉(zhuǎn)錄的序列的互補(bǔ)鏈的5′和3′端。也見(jiàn)，例如，WO 0063364中有關(guān)T7RNA表達(dá)系統(tǒng)的講述，和提交于2002年7月31日的USSN 60/399,998P及提交于2002年10月18日的USSN 60/399,998P中的內(nèi)容。
本發(fā)明的治療組合物 本發(fā)明中的dsRNA和含有編碼該核酸序列的重組載體可以用于治療性組合物以預(yù)防和治療HCV和/或HBV感染。本發(fā)明中的組合物可以單獨(dú)使用或混合使用，或與一種或多種物質(zhì)，包括其他抗病毒劑聯(lián)合使用。目前，拉米呋啶、阿的福韋和α-干擾素被證明對(duì)治療肝炎有效，預(yù)期本發(fā)明的組合物能與這種或其他抗HBV藥物包括，恩曲他濱(FTC)和恩替韋聯(lián)合使用。因?yàn)閐sRNA通過(guò)一個(gè)全新的機(jī)理(dsRNA介導(dǎo)的基因沉默/RNAi)抑制HBV和/或HCV，本發(fā)明中的藥物與其他抗病毒制劑的聯(lián)合療法有望顯著提高治療的有效性，同時(shí)明顯減少藥物抗性的產(chǎn)生，例如，拉米呋啶抗性的產(chǎn)生，該問(wèn)題是長(zhǎng)期使用拉米呋啶中的主要問(wèn)題。目前，干擾素和利巴韋林已獲準(zhǔn)用于HCV的治療，正如用于HBV的治療一樣。預(yù)期本發(fā)明中的組合物可以與它們和其他抗HCV藥物聯(lián)合使用。涉及到這種多因子治療的劑量實(shí)施方案，那些有臨床醫(yī)藥基本技術(shù)的人員可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
理想的制劑配方將包括能增加多核苷酸和重組載體穩(wěn)定性的物質(zhì)，或增加治療性組合物選擇性穿透肝細(xì)胞的能力。本發(fā)明中的治療性組合物可以與藥學(xué)上可接受的載體(如生理鹽水)一起給藥，載體的選擇依據(jù)給藥的方式和途徑和藥學(xué)標(biāo)準(zhǔn)而定。一個(gè)掌握了本領(lǐng)域基本技術(shù)的人員能夠很容易地配制出含有多核苷酸或基因構(gòu)建體的藥用組合物。在某些情況下，使用等滲制劑。一般來(lái)講，等滲添加劑可以包括氯化鈉、葡聚糖、苷露醇、山梨醇和乳糖。在一些情況下，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液這樣的等滲溶液。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在某些實(shí)施方案中，在制劑中加入了血管收縮劑。本發(fā)明中的藥用制劑為無(wú)菌無(wú)熱原的制劑。用于藥學(xué)制劑的合適藥用載體和藥用必需品在Mack Publishing Co.出版的本領(lǐng)域和USP/NF標(biāo)準(zhǔn)參考書，RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(formerlyRemington′s Pharmaceutical Sciences)上有描述。
給藥途經(jīng)包括但不限于，肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、intraoccularly、口服、透皮、吸入或栓劑給藥。優(yōu)選的給藥途經(jīng)包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)和皮下注射。dsRNA或dsRNA表達(dá)構(gòu)建體給藥可通過(guò)，包括但不限于注射器、無(wú)針注射裝置、或“微發(fā)射轟擊基因槍”來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蛇x性地，dsRNA和/或dsRNA表達(dá)構(gòu)建體可通過(guò)各種途徑導(dǎo)入從個(gè)體取出的細(xì)胞中，這種途徑包括，例如，體外轉(zhuǎn)染、電穿孔、微發(fā)射和微發(fā)射轟擊。當(dāng)基因構(gòu)建體進(jìn)入細(xì)胞后，將細(xì)胞重新植入個(gè)體。預(yù)期含有基因構(gòu)建體的其他非免疫細(xì)胞可以被植入個(gè)體即使該宿主細(xì)胞是從另外一個(gè)個(gè)體取出的。
對(duì)于HBV感染的個(gè)體，預(yù)期本發(fā)明的dsRNA組合物可以與刺激機(jī)體針對(duì)病毒的免疫反應(yīng)的治療性疫苗接種措施聯(lián)合使用作為預(yù)治療。本發(fā)明中的dsRNA組合物也可作為預(yù)防藥物周期性地給予那些因?yàn)槁殬I(yè)關(guān)系或其他潛在因素被認(rèn)為暴露于HBV和/或HCV的高危人群，例如，救火、急救和醫(yī)護(hù)人員。這樣的有效預(yù)防實(shí)施方案可以包括，例如，每周、每?jī)芍堋⒚吭?、每?jī)稍隆⒚?月、每4月、每半年或每年給予本發(fā)明中的HBV和/或HCV dsRNA組合物，具體情況可由那些精于臨床醫(yī)藥技術(shù)的人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定。dsRNA載體，如質(zhì)?；虿《据d體有較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)本發(fā)明中的dsRNA的能力，預(yù)計(jì)可達(dá)數(shù)周或數(shù)月的時(shí)間，這一特點(diǎn)被認(rèn)為是此方面和其他方面應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)所在。
dsRNA的劑量 dsRNA直接用于動(dòng)物(例如，短dsRNA抑制毒性，或短或長(zhǎng)dsRNA沉默一個(gè)基因)，典型用藥量為10mg到100mg，1mg到10mg，500μg到1mg，5μg到500μgdsRNA用于一個(gè)體重90-150磅的人/動(dòng)物(次序越后越優(yōu)選)。以編碼dsRNA的載體給藥(例如，短dsRNA抑制毒性，或短或長(zhǎng)dsRNA沉默基因)給動(dòng)物體，典型用藥量為100mg到300mg，10mg到100mg，1mg到10mg，500μg到1mg，或50μg到500μg dsRNA表達(dá)載體或構(gòu)建體用于一個(gè)體重90-150磅的人/動(dòng)物(次序越后越優(yōu)選)。這種劑量可以根據(jù)動(dòng)物的體重來(lái)調(diào)整。在某些實(shí)施方案中，給藥量大約為10mg/kg或2 to 2.5mg/kg。也可使用其他劑量，具體情況可由那些精于臨床醫(yī)藥的技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定。
如給動(dòng)物用藥，典型的用藥量為10ng和50μg之間，50ng和100ng之間，或100ng和5μg之間的dsRNA或編碼dsRNA的DNA。在理想實(shí)施方案中，大約10μg的DNA或5μg的dsRNA用于動(dòng)物。本發(fā)明中的方法無(wú)意將dsRNA或編碼dsRNA的DNA用于細(xì)胞或動(dòng)物時(shí)的給藥、劑量、用藥頻度局限于一個(gè)特殊的模式，本發(fā)明接納所有足以提供抑制基因表達(dá)、預(yù)防或治療疾病的劑量的用藥模式。
如果需要，短dsRNA可以在外源性導(dǎo)入可能引起細(xì)胞毒性的dsRNA(例如，較長(zhǎng)的dsRNA)之前、之中或之后導(dǎo)入，見(jiàn)Pachuk 2003年4月28日提交的USSN 10/425,006″Methods of Silencing GenesWithout Inducing Toxicity″上的討論。
申請(qǐng)者特意將引用的所有參考的完整內(nèi)容包含在本公開(kāi)文本中。此外，當(dāng)以一個(gè)范圍、優(yōu)選范圍或優(yōu)選上限值和優(yōu)選下限值的列表給出量、濃度、其他值或參數(shù)時(shí)，應(yīng)該認(rèn)為是對(duì)所有源自任何一對(duì)范圍上限或優(yōu)選值和任何范圍下限或優(yōu)選值的范圍的特意公開(kāi)，無(wú)論它們是否是分開(kāi)公開(kāi)的。本文給出的范圍數(shù)字值，除非特別指明，應(yīng)該包括其端點(diǎn)值和所有該范圍內(nèi)的整數(shù)和分?jǐn)?shù)。定義范圍時(shí)，無(wú)意將本發(fā)明中的范圍限于的特殊數(shù)值。
實(shí)施例以下實(shí)施例只用于說(shuō)明。所有本公開(kāi)文本中提到的參考文獻(xiàn)通過(guò)整體引用特別結(jié)合到本文中。
實(shí)施例1沉默復(fù)制型細(xì)胞培養(yǎng)模型中的HBV復(fù)制和表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)模型簡(jiǎn)述人肝來(lái)源的細(xì)胞系，如Huh7細(xì)胞系用HBV感染性分子克隆轉(zhuǎn)染，該分子克隆含具末端冗余的能夠轉(zhuǎn)錄所有HBV病毒RNA并產(chǎn)生感染性病毒的病毒基因組[1-3]。用于本研究的復(fù)制子的序列來(lái)自Gen Bank Accession V01460的病毒序列。在被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞并在核內(nèi)定位后，從數(shù)個(gè)病毒啟動(dòng)子開(kāi)始的感染性HBV質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)了反映HBV復(fù)制的級(jí)聯(lián)事件，這種事件包括轉(zhuǎn)錄的病毒mRNA的翻譯、將轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA包裝進(jìn)核心顆粒、前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄、病毒顆粒和HBsAg(乙肝表面抗原)顆粒的組裝和分泌進(jìn)入被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中。該轉(zhuǎn)染模型模擬了HBV在感染的肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的大多數(shù)環(huán)節(jié)，因此是一個(gè)很好的觀察沉默HBV的表達(dá)和復(fù)制的模型。
利用這個(gè)模型，細(xì)胞被感染性HBV克隆和各種eiRNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。然后如以下描述的那樣監(jiān)測(cè)HBV表達(dá)和復(fù)制的降低。有關(guān)本實(shí)驗(yàn)中載體和編碼RNA的詳細(xì)情況在本實(shí)施例的末尾有描述。
實(shí)驗(yàn)1以下是一個(gè)用編碼來(lái)自GenBank檢索號(hào)V01460的序列的eiRNA載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的實(shí)施例。本文所描述的eiRNA載體上的HBV序列，正如本文其他處所鑒別的那樣，是高度保守的，并且呈現(xiàn)siRNA活性(參見(jiàn)，Pachuk，C.提交于2004年二月25日的PCT/US2004/005065，″Methods and Constructs for Evaluation of RNAitargets and Effector Molecules，″)。用于本實(shí)驗(yàn)的特殊eiRNA骨架載體是一個(gè)含有驅(qū)動(dòng)表達(dá)編碼RNA的U6啟動(dòng)子的有專利保護(hù)的載體。每個(gè)載體只編碼一個(gè)短發(fā)夾樣RNA(shRNA)。shRNA的編碼序列后是一個(gè)RNA聚合酶III的終止序列。U6啟動(dòng)子、RNA聚合酶III終止子和編碼shRNA的序列在本實(shí)施例的末尾列出。含有U6啟動(dòng)子和聚合酶III終止信號(hào)的其他類似載體可以在市場(chǎng)上買到，如Promega，Inc.，Madison，Wis.公司的“siLentGene-2 Cloning Systems”。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也可根據(jù)本文提供的信息自己構(gòu)建載體。預(yù)期使用其他表達(dá)和啟動(dòng)子系統(tǒng)，尤其是那些含有RNA聚合酶III啟動(dòng)子而不是U6啟動(dòng)子的載體，如含H1啟動(dòng)子或75K啟動(dòng)子，能夠獲得類似的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)染在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞被接種到6孔板中，接種密度為3×105細(xì)胞/孔。在細(xì)胞接種一天后根據(jù)說(shuō)明書用LipofectamineTM(In Vitrogen，Carlsbad，Cal.)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在本實(shí)驗(yàn)中，用500ng ayw亞型的感染性HBV質(zhì)粒(″pHBV2″)(GenBankAccession#V01460)和500ng、300ng、250ng、120ng、100ng50ng或10ng eiRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)利用一個(gè)惰性DNA質(zhì)粒pGL3-Basic(Promega，Madison Wis.)將轉(zhuǎn)染的DNA總量調(diào)到2.5μg以保持DNA 2.5μg/轉(zhuǎn)染恒定。例如，轉(zhuǎn)染中用500ng HBV DNA和500ng eiRNA構(gòu)建體，則需加入1.5μg pGL3。轉(zhuǎn)染開(kāi)始前，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用Opti-MEME(InVitrogen Life Technologies，Carlsbad，Cal.)洗細(xì)胞。然后在各孔中加入800μl Opti-MEMO，繼之加入轉(zhuǎn)染混合液。轉(zhuǎn)染后的17到19小時(shí)，棄掉轉(zhuǎn)染混合液和Opti-MEMO，每孔替換入2ml培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后的3、6和10天，分別移出細(xì)胞培養(yǎng)基凍存于-70℃。在第3天和第6天用2ml新鮮培養(yǎng)基換液。所有轉(zhuǎn)染都做復(fù)孔。兩套對(duì)照轉(zhuǎn)染也同時(shí)進(jìn)行單一HBV DNA(500ng HBV DNA加2μg pGL3)和HBV DNA和對(duì)照eiRNA構(gòu)建體(500ng HBV DNA，1μg對(duì)照eiRNA構(gòu)建體和1.0μg pGL3 DNA)。
監(jiān)測(cè)細(xì)胞中HBV表達(dá)的喪失轉(zhuǎn)染之后，通過(guò)測(cè)定HBsAg的分泌來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞中HBV表達(dá)和復(fù)制的喪失或降低。測(cè)定轉(zhuǎn)染后3、6和10天轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基(和對(duì)照培養(yǎng)基)來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞。根據(jù)廠商說(shuō)明書用Abbott Labs(Abbott Park，III.)公司生產(chǎn)的AuszymeELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)表面抗原(sAg)。檢測(cè)表面抗原是因?yàn)楸砻婵乖粌H與病毒復(fù)制有關(guān)，而且與啟動(dòng)感染性HBV克隆上表面抗原順?lè)醋雍腕w內(nèi)感染過(guò)程中產(chǎn)生的HBVcccDNA轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶II有關(guān)。因?yàn)樵跓o(wú)HBV復(fù)制時(shí)，表面抗原能夠繼續(xù)合成并產(chǎn)生不良作用，所以，不僅下調(diào)病毒復(fù)制是重要的，而且下調(diào)非復(fù)制依賴的表面抗原合成也很重要。
結(jié)果所有細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了本實(shí)施例末尾描述的HBV特異性eiRNA構(gòu)建體后，與對(duì)照組相比，都出現(xiàn)了表面抗原水平的降低。抑制的水平見(jiàn)根據(jù)表2-8數(shù)據(jù)繪制的圖2-8。注意被鑒別為788-808和807-827的序列在500ng劑量時(shí)只分別降低表面抗原水平的30％和50％。這兩個(gè)序列是唯一的兩個(gè)不以表面抗原mRNA為靶目標(biāo)的序列；它們的靶序列是3.1Kb HBV mRNA，因此它們降低表面抗原水平的作用是間接的。當(dāng)其他HBV RNA被作為靶目標(biāo)時(shí)仍能觀察到表面抗原水平有30％到50％的降低，強(qiáng)烈提示這種eiRNA構(gòu)建體是有效的。
本實(shí)驗(yàn)所用的HBV特異的eiRNA編碼HBV序列的eiRNA載體列于表1中。列出了該序列及其GenBank檢索號(hào)V01460上的圖譜坐標(biāo)(map coordinates)。表1的最右邊是這些序列定位的SEQ ID NO。編碼RNA的序列是5′GGTCGAC(一個(gè)不重要的序列，但來(lái)自所用特殊載體的多接頭序列)緊接著第一正義或反義HBV序列，繼后是環(huán)狀序列(表1中有下劃線者)，再繼后是與第一HBV序列互補(bǔ)的第二HBV序列。注意環(huán)狀結(jié)構(gòu)不必有固定的序列和長(zhǎng)度，我們用過(guò)幾個(gè)不同的環(huán)狀序列，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其對(duì)eiRNA構(gòu)建體的功能有明顯影響。第二HBV序列后緊接著一串T殘基，例如1、2、3或更多T，用作RNA聚合酶III的終止信號(hào)。
表1
*核苷酸坐標(biāo)指Genbank檢索號(hào)V01460
圖9為轉(zhuǎn)錄的RNA結(jié)構(gòu)圖。
SEQ ID NO13為U6啟動(dòng)子的核苷酸序列RNA聚合酶III終止子核苷酸序列5′-TTTTT-3′表和圖HbsAg用以上所述方法測(cè)定并根據(jù)表2-8的數(shù)據(jù)繪制成2-8圖。eiRNA構(gòu)建體用量在eiRNA構(gòu)建體名稱后的括號(hào)內(nèi)，以μg量表示。例如，2791(0.5)意味著0.5μg或500ng 2791-2811eiRNA構(gòu)建體(見(jiàn)表1)用于轉(zhuǎn)染。與對(duì)照相比的抑制百分率也顯示在下表中，為第10天的測(cè)定結(jié)果。注意這個(gè)實(shí)施例的第4套數(shù)據(jù)中1299 500ng劑量組的評(píng)價(jià)只有兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，第3天和第6天，因?yàn)榈?0天未做。這組實(shí)驗(yàn)的抑制百分比顯示的是第6天的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)為原始OD數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)的收集根據(jù)用于檢測(cè)表面抗原的Auszyme ELISA檢測(cè)試劑盒廠家所描述的進(jìn)行。2791-2811組50ng的數(shù)據(jù)和1907-1927組10ng的數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示。與對(duì)照相比，各劑量抑制HBsAg表達(dá)大約為50％。
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
實(shí)驗(yàn)2背景小細(xì)胞培養(yǎng)模型用于評(píng)估加入兩個(gè)eiRNA構(gòu)建體的相加效果。在這一實(shí)驗(yàn)中，2791-2811和2919-2939被評(píng)估。分別在兩個(gè)劑量水平對(duì)它們進(jìn)行了評(píng)價(jià)10ng和25ng，和聯(lián)合應(yīng)用10ng劑量(5ng 2791-2811和5ng 2919-2939)和25ng劑量(12.5ng 2791-2811和12.5ng 2919-2939)。實(shí)驗(yàn)觀察到相加效應(yīng)，例如，25ng2791-2811的一半抑制效果加上25ng 2919-2939的一半抑制效果差不多等于25ng二者聯(lián)合用藥的效果。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)楫?dāng)用一個(gè)25ng單一eiRNA構(gòu)建體不能獲得抑制效果時(shí)，使用兩個(gè)或更多的eiRNA序列對(duì)于避免病毒逃逸突變株的產(chǎn)生是十分重要的。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程轉(zhuǎn)染以3×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度將Huh7細(xì)胞接種于6孔板中，在細(xì)胞接種一天后根據(jù)說(shuō)明書用LipofectamineTM(InVitrogen，Carlsbad，Cal.)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在本實(shí)驗(yàn)中，用500ng ayw亞型的感染性HBV質(zhì)粒(GenBank檢索號(hào)V01460)與25ng或10ng單獨(dú)的兩個(gè)構(gòu)建體或總量為25ng或10ng這兩個(gè)構(gòu)建體聯(lián)合對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)利用一個(gè)惰性的DNA質(zhì)粒pGL3-Basic將轉(zhuǎn)染的DNA總量調(diào)到2.5μg以保持恒定的DNA2.5μg/轉(zhuǎn)染。例如，轉(zhuǎn)染中用500ng HBV DNA和10ng eiRNA構(gòu)建體，則需加入1.99μg pLUC。轉(zhuǎn)染前，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用Opti-MEMO(InVitrogen Life Technologies)洗滌細(xì)胞。在各孔中加入800μl Opti-MEME，然后加入轉(zhuǎn)染混合物。轉(zhuǎn)染后17到19小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染混合物和Opti-MEMS，每孔換上2ml培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后4、8和11天時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基并凍存于-70℃。第4天和第8天用2ml新鮮培養(yǎng)基換液。所有轉(zhuǎn)染均做復(fù)孔。兩套對(duì)照轉(zhuǎn)染也同時(shí)進(jìn)行單一HBV DNA(500ng HBV DNA加2μg pGL3)和HBV DNA與對(duì)照eiRNA構(gòu)建體(500ng HBV DNA，500ng對(duì)照eiRNA構(gòu)建體和1.5μg pGL3 DNA)。
結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表9和圖10中的圖形。2791-2811和2919-2939聯(lián)合使用顯示出至少與2791-2811或2919-2939單用時(shí)的效果相等。預(yù)期兩個(gè)或更多針對(duì)來(lái)自同一HBV基因和/或不同HBV基因的不同HBV序列的dsRNA聯(lián)合使用也應(yīng)有類似的優(yōu)勢(shì)。
表9
實(shí)驗(yàn)3和4HBV在小鼠模型中的沉默概述在小鼠模型中測(cè)試驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)1中的兩個(gè)eiRNA載體沉默HBV復(fù)制的能力。這兩個(gè)載體是2791-2811和1907-1927載體。兩個(gè)載體都顯示能在小鼠模型中以它們?cè)诩?xì)胞模型中類似的程度沉默HBV。其他治療劑在小鼠體內(nèi)沉默HBV復(fù)制子的能力被證明可以用來(lái)預(yù)測(cè)其在人體的效果[4]。
動(dòng)物模型背景黑猩猩是用于人HBV感染研究的唯一動(dòng)物模型。但是，一個(gè)體內(nèi)有HBV表達(dá)和復(fù)制發(fā)生的小鼠模型也可被利用。這種小鼠模型對(duì)于評(píng)估針對(duì)病毒復(fù)制和針對(duì)非RT依賴的抗原表達(dá)的抗HBV藥物都很有價(jià)值。在此模型中，復(fù)制型的HBV從一個(gè)附加體上的HBVDNA瞬時(shí)表達(dá)。將復(fù)制型的HBV DNA通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)法導(dǎo)入到小鼠的肝中而創(chuàng)建此模型[1]。
以下實(shí)驗(yàn)的目的是要在小鼠模型中檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)1中進(jìn)行過(guò)有效性評(píng)價(jià)的兩個(gè)編碼HBV特異性序列的載體的有效性，雖然沒(méi)有期望這種HBV序列相關(guān)的效果在細(xì)胞培養(yǎng)物與小鼠模型中有什么不同。本實(shí)驗(yàn)使用流體動(dòng)力學(xué)法同時(shí)導(dǎo)入復(fù)制型ayw亞型HBV質(zhì)粒(例1，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)1)和HBV特異的eiRNA表達(dá)載體。流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入法對(duì)這種初步研究是很理想的方法，因?yàn)樗軐⒑怂嵊行У貙?dǎo)入肝中[5]。
實(shí)驗(yàn)流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入研究實(shí)驗(yàn)3所有動(dòng)物用流體動(dòng)力學(xué)法導(dǎo)入7.5μg的感染性HBVayw質(zhì)粒(驗(yàn)證性實(shí)施例1所描述)。繼內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞和核內(nèi)定位后，從數(shù)個(gè)病毒啟動(dòng)子的感染性HBV質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)反映HBV復(fù)制的級(jí)聯(lián)事件，這種事件包括翻譯轉(zhuǎn)錄的病毒的mRNA、將轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA包裝進(jìn)核心顆粒、前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄、將病毒顆粒和HBsAg顆粒(乙肝表面抗原)組裝并分泌進(jìn)入被注射的動(dòng)物血清中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同時(shí)注射10μg的2791-2811。第二組對(duì)照動(dòng)物被注射了10μg無(wú)關(guān)eiRNA構(gòu)建體。所有動(dòng)物同時(shí)都注射了GFP報(bào)告質(zhì)粒(Clontech，PaloAlto，Cal.)。GFPmRNA在注射小鼠肝中的表達(dá)作為小鼠模型的轉(zhuǎn)染效率對(duì)照以規(guī)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)引入惰性填充DNA pGL3將每只動(dòng)物的DNA注射量保持在20μg(Promega，Madison，Wis.)。所有DNA依據(jù)Yang等描述的方法進(jìn)行制備和注射[1]。每組5只動(dòng)物。DNA和DNA注射量見(jiàn)表10。
表10
時(shí)間點(diǎn)的選擇以Dr.Chisari的實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的結(jié)果為依據(jù)[1]，它反映了繼流體動(dòng)力學(xué)法導(dǎo)入后，HBVayw質(zhì)粒在小鼠中的復(fù)制動(dòng)態(tài)。測(cè)定注射后的第1、2、3和4天的血清中HbsAg的存在。檢測(cè)按照HBV復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)模型所描述方法進(jìn)行。注射兩天后的肝臟樣本中HBV RNA的存在用Dr.Chisari′s實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的Northern印跡分析法確定[1]，并用常規(guī)技術(shù)以內(nèi)源性GAPDH RNA水平和GFPmRNA水平進(jìn)行規(guī)化；或用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以定量RT-PCR檢測(cè)測(cè)定含表面抗原編碼序列的HBV RNA。RT-PCR檢測(cè)法較Northern印跡分析法定量效果更好并且較Northern印跡分析法有較大的動(dòng)態(tài)窗口(dynamic window)。
在注射了2791-2811的小鼠中，HBV RNA和HBsAg二者都有下調(diào)，參見(jiàn)圖11。定量RT-PCR證明，對(duì)照小鼠的肝臟中有867個(gè)HBV RNA分子存在，而2791-2811處理組中只有57個(gè)分子存在，下調(diào)了15倍(資料未出示)。
表11
表12
流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入研究實(shí)驗(yàn)4本實(shí)驗(yàn)類似實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)3，但被評(píng)估的兩個(gè)eiRNA構(gòu)建體為2791-2811和1907-1927。在本實(shí)驗(yàn)中用本文已經(jīng)描述過(guò)的方法來(lái)測(cè)定第1天和第4天的HBsAg。
表13
實(shí)施例2為RNAi治療研發(fā)的丙型肝炎病毒序列實(shí)驗(yàn)1簡(jiǎn)介丙型肝炎病毒(HCV)是輸血相關(guān)的非甲非乙型肝炎的主要原因，全球約有兩億患者。HCV基因組有很高的序列多變性。已知HCV有6個(gè)主要的基因型包括50個(gè)以上的亞型，其顯著異質(zhì)性還特征性地表現(xiàn)為患者體內(nèi)存在的準(zhǔn)種。通過(guò)重組聚合酶技術(shù)或基于細(xì)胞的亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)的應(yīng)用，對(duì)HCV的復(fù)制的理解已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。通過(guò)應(yīng)用復(fù)制子細(xì)胞系統(tǒng)，HCV特異性的siRNA被證實(shí)能夠抑制HCV蛋白的表達(dá)和RNA的復(fù)制。5′NTR及結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)基因的序列都曾被成功地用作靶目標(biāo)。3′NTR序列的高度保守性使它成為了siRNA類治療的很具吸引力的靶目標(biāo)。然而，對(duì)應(yīng)用3′NTR的可行性還沒(méi)人進(jìn)行過(guò)研究。本文我們報(bào)道幾個(gè)在亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)中能抑制HCV蛋白表達(dá)的siRNA的設(shè)計(jì)和測(cè)試。外源性合成的HCV特異性siRNA按以下描述的方法轉(zhuǎn)染HCV復(fù)制子細(xì)胞系。
細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)基肝細(xì)胞瘤Huh7細(xì)胞中的HCV復(fù)制子在含有10％胎牛血清(Invitrogen)、1％青鏈霉素、1％的非必須氨基酸和0.5mg/mL G418的Dulbecco′s Modified Eagle Media(″DMEM″)(Invitrogen)中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到75％融匯度時(shí)分傳。
Western印跡分析從1×LDS緩沖液(Invitrogen)中收集復(fù)制子細(xì)胞的總細(xì)胞裂解液。在β-巰基乙醇存在下將細(xì)胞裂解液90℃加熱5分鐘，然后在10％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Invitrogen)。繼膜轉(zhuǎn)移后，用含0.5％Tween-20(PBS-Tween)的PBS將膜沖洗一次，再用含5％無(wú)脂牛奶的PBS-Tween封閉一小時(shí)。用PBS-Tween洗膜后，膜與1∶1500倍稀釋的第一α-NS5A抗體(Dr.Chen Liu饋贈(zèng))室溫下孵育一小時(shí)。用PBS-Tween 20洗膜后，與1∶5000倍稀釋的HRP綴合的α-小鼠IgG第二抗體孵育，繼與第二抗體孵育完畢后，再次洗印跡并根據(jù)廠家提供的方法用ECL(Amersham)對(duì)膜進(jìn)行處理。
Norther印跡用Rneasykit(Qiagen)提取細(xì)胞總RNA。Nothern印跡分析根據(jù)Guo等的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)短地講，取5μg總RNA用含有2.2M福爾馬林的1.0％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上用紫外交聯(lián)(Stratagene)固定。然后在含50％去離子化甲酰胺、5×SSC(750mM氯化鈉，750mM檸檬酸鈉)、Denhardt′s溶液、0.02M磷酸鈉(pH 6.8)、0.2％十二烷基磺酸鈉(″SDS″)、100μg/ml碎裂失活的鮭精DNA和100μg/ml酵母RNA的雜交液中用[32P]CTP-標(biāo)記的新霉素RNA在58℃雜交16小時(shí)。在室溫下用2xSSC/0.1％SDS洗膜一次30分鐘，再在68℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗膜兩次共30分鐘。用X光曝光膜。
將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)復(fù)制子細(xì)胞用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen)按使用者手冊(cè)上的方法將siRNA轉(zhuǎn)染入復(fù)制子細(xì)胞，簡(jiǎn)單地講，轉(zhuǎn)染前一天，用含2×104細(xì)胞的0.5mL DMEM培養(yǎng)基接種24孔板。用50μl OptiMEM稀釋指定量的siRNA，然后與稀釋后的Lipofectamine2000試劑(1μl加入50μl Optimem)混合，將該混合物室溫放置20分鐘后，加入單層細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48到72小時(shí)，細(xì)胞用PBS洗滌并用100μlSDS樣品緩沖液裂解。
表14
幾個(gè)含有表14中鑒別的以HCV序列3′UTR為靶目標(biāo)的siRNA；以HCV NS5B基因?yàn)榘心繕?biāo)的siRNA #12(陽(yáng)性對(duì)照)；鑒別的HCV核心抗原siRNA(陽(yáng)性對(duì)照)和鑒別的核纖層蛋白siRNA(陰性對(duì)照)用Silencer siRNA construction kit，目錄#1620(Ambion Inc.，Austin，Tex.)合成。DNA寡核苷酸由IDT(Coralville，lowa)合成。
對(duì)照siRNA1.HCV核心抗原(陽(yáng)性對(duì)照)SEQ ID NO45；
2.表14中的#12，靶向HCV NS5B基因，也為陽(yáng)性對(duì)照；3.核纖層蛋白序列(陰性對(duì)照)SEQ ID NO46。
三個(gè)siRNA用作對(duì)照以細(xì)胞基因核纖層蛋白為靶目標(biāo)的siRNA為陰性對(duì)照；以HCV核心序列為靶目標(biāo)的siRNA為陽(yáng)性對(duì)照；以HCV NS5B基因?yàn)榘心繕?biāo)的siRNA為陽(yáng)性對(duì)照。各siRNA使用兩個(gè)濃度(9和20pmole)，結(jié)果與未轉(zhuǎn)染siRNA組進(jìn)行比較。對(duì)應(yīng)的圖13的Western印跡代表0、9和20pmole鑒別的siRNA。siRNA#22、32、42、62和72可明顯抑制HCV NS5A蛋白的表達(dá)。根據(jù)先前用以核心序列為靶目標(biāo)的陽(yáng)性對(duì)照siRNA的結(jié)果，推測(cè)HCV RNA水平也有下降。另幾種siRNA在所測(cè)濃度時(shí)的作用十分有限，需在較高濃度進(jìn)行評(píng)估。它們包括#12(靶目標(biāo)NS5B)、#102、#52and#82。
實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)2按照“用于RNAi治療研發(fā)的HCV序列”的實(shí)驗(yàn)1中描述的方法進(jìn)行，但用含有表15中的序列(及其互補(bǔ)序列)的siRNAR1-R8進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Western印跡按實(shí)驗(yàn)1中實(shí)施例2的方法進(jìn)行。用作陽(yáng)性對(duì)照的HCV核心siRNA為前述HCV實(shí)驗(yàn)1中的siRNA。除對(duì)照“核心”siRNA用0、3和9pmole進(jìn)行轉(zhuǎn)染外，所有siRNA使用0、9和20pmole三個(gè)轉(zhuǎn)染濃度。正如圖14的Western印跡結(jié)果所示，R1、R2、R3、R5、R7和R8都對(duì)HCV表現(xiàn)出明顯抑制作用。
表15
所有被評(píng)估的siRNA都定位于HCV基因組的3′UTR上，并且在不同HCV基因型和準(zhǔn)種間是保守的。SEQ ID NO27代表HCV3′UTR的101個(gè)核苷酸序列，有時(shí)也被稱為“X”區(qū)域。
實(shí)施例3沉默復(fù)制型細(xì)胞培養(yǎng)模型中HBV的復(fù)制和表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)模型簡(jiǎn)述人肝來(lái)源的細(xì)胞系，如Huh7細(xì)胞系經(jīng)一個(gè)HBV感染性分子克隆轉(zhuǎn)染，該分子克隆含有具有末端冗余的能夠轉(zhuǎn)錄所有HBV病毒RNA并產(chǎn)生病毒顆粒的病毒基因組[1-3]。用于本研究的復(fù)制子病毒序列來(lái)自Gen Bank Accession V01460和J02203的序列。在被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞并在核內(nèi)定位后，從數(shù)個(gè)病毒啟動(dòng)子開(kāi)始的感染性HBV質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)反映HBV復(fù)制的級(jí)聯(lián)事件，這種事件包括翻譯轉(zhuǎn)錄的病毒mRNA、將轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA包裝進(jìn)核心顆粒、前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄、病毒和HBsAg(乙肝表面抗原)的組裝和分泌進(jìn)入被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基。該細(xì)胞模型反映了HBV在被其感染的肝細(xì)胞中復(fù)制的大多數(shù)環(huán)節(jié)，因此是一個(gè)很好的用于觀察沉默HBV的表達(dá)和復(fù)制的模型。
利用這一模型，用HBV的感染性分子克隆和各個(gè)效應(yīng)RNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后按以下所描述的方法監(jiān)測(cè)HBV表達(dá)和復(fù)制的喪失。
以下是一個(gè)用編碼來(lái)自SEQ ID NO1和SEQ ID NO5序列的eiRNA載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的實(shí)施例。該特殊的eiRNA載體是以T7 RNA聚合酶為基礎(chǔ)的載體，(參見(jiàn)，例如，WO 0063364和提交于2002年7月31日的USSN 60/399,998P、提交于2002年10月18日的USSN60/419,532中關(guān)于T7 dsRNA表達(dá)系統(tǒng)的教導(dǎo))并且編碼發(fā)夾狀RNA結(jié)構(gòu)(特別理想的是，例如，提交于2002年7月31日的USSN60/399,998P和提交于2003年7月31日的PCT/US2003/024028中描述的“強(qiáng)制性”發(fā)夾構(gòu)建體，能夠通過(guò)RNA依賴的RNA聚合酶延伸而形成dsRNA發(fā)夾的部分發(fā)夾結(jié)構(gòu)，和提交于2002年10月18日的USSN 60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466中描述的“牛乳”樣發(fā)夾結(jié)構(gòu)(例如多-發(fā)夾長(zhǎng)dsRNA載體和多-短發(fā)夾結(jié)構(gòu))、帶有錯(cuò)誤配對(duì)區(qū)域的發(fā)夾和多表位構(gòu)建體)?？梢灶A(yù)期的是，使用其他如上所描述的表達(dá)和啟動(dòng)子系統(tǒng)，和/或編碼備選的dsRNA結(jié)構(gòu)(即雙螺旋)的載體也會(huì)有類似結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)染將Huh7接種于6孔板，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)到80-90％融匯度。所有轉(zhuǎn)染根據(jù)使用說(shuō)明用LipofectamineTM(Invitrogen)進(jìn)行。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞被50ng感染性HBV質(zhì)粒、1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒(描述見(jiàn)下)、600ng編碼來(lái)自SEQ ID NO1序列的發(fā)夾狀RNA的eiRNA載體(描述見(jiàn)下)和600ng編碼來(lái)自SEQ ID NO5序列的發(fā)夾狀RNA的eiRNA載體(描述見(jiàn)下)轉(zhuǎn)染。對(duì)照細(xì)胞用50ng感染性HBV質(zhì)粒和1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。惰性填充DNApGL3-basic(Promega，Madison WI)被加入轉(zhuǎn)染物中，使總DNA/轉(zhuǎn)染達(dá)2.5μg DNA。
監(jiān)測(cè)細(xì)胞HBV表達(dá)的喪失繼轉(zhuǎn)染之后，通過(guò)測(cè)定HbsAg分泌和含DNA的病毒顆粒的分泌來(lái)監(jiān)測(cè)HBV表達(dá)和復(fù)制的喪失或降低。從給予dsRNA兩天后開(kāi)始對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)試，以后每隔一天測(cè)試一次共三周，以此監(jiān)測(cè)細(xì)胞。購(gòu)自Abbott Labs(Abbott Park，IL)的Auszyme ELISA試劑盒用于檢測(cè)乙肝表面抗原(HBsAg)。檢測(cè)HBsAg不僅因?yàn)槠渑c病毒復(fù)制有關(guān)，而且它與轉(zhuǎn)染的感染性HBV克隆上RNA聚合酶II啟動(dòng)的表面抗原順?lè)醋拥霓D(zhuǎn)錄有關(guān)。因?yàn)镠bsAg的合成在無(wú)HBV復(fù)制的情況下能繼續(xù)進(jìn)行，所以，不僅下調(diào)病毒的復(fù)制是重要的，而且下調(diào)非復(fù)制依賴的HBsAg合成也同樣重要。含有包裹著的HBV基因組DNA的病毒顆粒的分泌也被監(jiān)測(cè)。含有核殼包裹著的DNA的病毒顆粒的喪失提示病毒復(fù)制的停止。分析病毒顆粒的分泌涉及到區(qū)分裸露未成熟的核顆粒和有包膜的感染性病毒粒的技術(shù)[6]。簡(jiǎn)短地說(shuō)，從細(xì)胞培養(yǎng)基得到的沉淀的病毒顆粒用蛋白酶k消化，降解其核心蛋白。滅活蛋白酶K后，在樣品中加入RQ1 DNase(Promega，Madison，WI)以降解從核顆粒中釋放出的DNA。在SDS存在下用蛋白酶K再次消化樣品，以失活Dnase并破裂和降解感染性的有包膜的病毒顆粒，然后DNA用酚/氯仿抽提純化并用乙醇沉淀。經(jīng)電泳后用Southern印跡法檢測(cè)HBV特異性DNA。
相對(duì)只轉(zhuǎn)染了HBV質(zhì)粒和T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染有HBV質(zhì)粒、T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒和eiRNA構(gòu)建體的細(xì)胞培養(yǎng)基中，HBsAg和病毒顆粒的分泌理想地將有70-95％的降低。
實(shí)驗(yàn)中所用的載體T7 RNA聚合酶基因序列T7 RNA聚合酶基因SEQ ID NO47代表克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體如pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)的T7 RNA聚合酶基因。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，克隆是件容易的事情。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)該知道，帶有Kozak序列的前導(dǎo)序列需要被直接克隆到T7 RNA聚合酶基因的上游。
編碼來(lái)自SEO ID NO1的RNA發(fā)夾的eiRNA載體該載體為以上描述的以T7為基礎(chǔ)的載體，其編碼單分子發(fā)夾的插入片段含有定位于GenBank檢索號(hào)為V01460和J02203上的坐標(biāo)(coordinate)3004-2950(大約55bp)位的片段。該發(fā)夾的一個(gè)區(qū)域編碼該序列的正義型，另一個(gè)區(qū)域編碼該序列的反義型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地設(shè)計(jì)和制備出發(fā)夾結(jié)構(gòu)來(lái)。
編碼來(lái)自SEQ ID NO5的RNA發(fā)夾的eiRNA載體該載體為以上描述的基于T7的載體，其編碼單分子發(fā)夾的插入片段含有定位于GenBank檢索號(hào)V01460和J02203上的坐標(biāo)730-786位的片段。發(fā)夾設(shè)計(jì)與所述的編碼來(lái)自SEQ ID NO1序列的發(fā)夾設(shè)計(jì)相同。
實(shí)驗(yàn)1小鼠模型的原理黑猩猩是研究人HBV感染的唯一動(dòng)物模型。然而體內(nèi)有HBV表達(dá)和復(fù)制發(fā)生的小鼠模型也可得到。這種模型對(duì)于評(píng)價(jià)抗HBV治療藥物有著無(wú)法估量的價(jià)值并且可以用于預(yù)測(cè)這種藥物在人體的有效性[4]。這種模型中的第一是轉(zhuǎn)基因鼠模型，其中表達(dá)HBV的基因組或經(jīng)選擇的HBV基因[7，8]。因?yàn)镠BV整合入了小鼠染色體基因組，這種動(dòng)物不僅能夠作為病毒復(fù)制的模型而且能夠作為RT-非依賴的抗原表達(dá)模型。一個(gè)類似的模型為其中具有復(fù)制能力的HBV從一個(gè)HBV DNA游離體上瞬時(shí)表達(dá)，該模型是將具有復(fù)制能力的HBV DNA通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入法導(dǎo)入小鼠肝臟而得[1]。與轉(zhuǎn)基因鼠不同，這種模型對(duì)H3V抗原是無(wú)免疫耐受的并且可以用于免疫介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞的清除的研究。
雖然分別有用于土拔鼠肝炎(WHBV)和鴨肝炎(DHBV)研究的土拔鼠和鴨模型存在，有幾個(gè)原因讓我們決定不用這種模型，1)人HBV不能在這種模型中研究，因?yàn)槲覀冏罱K感興趣的是下調(diào)人HBV的表達(dá)，使用這種模型在某些情況下必須重新設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)人HBV特異的載體和/或RNA。2)小鼠是等基因的，所以在該系統(tǒng)中不會(huì)有基因變化產(chǎn)生的噪音。3)不像人HBV，沒(méi)有可以與其相應(yīng)的動(dòng)物模型進(jìn)行平行研究的確定的WHBV/DHBV細(xì)胞培養(yǎng)模型。
以下描述的實(shí)驗(yàn)用流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入法作為方法將具有復(fù)制能力的ayw亞型的HBV質(zhì)粒和各種效應(yīng)dsRNA(eiRNA)表達(dá)載體共導(dǎo)入。流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入法對(duì)于本實(shí)驗(yàn)是很理想的因?yàn)樗軌驅(qū)⒑怂嵊行У貙?dǎo)入肝臟[5]。dsRNA效應(yīng)質(zhì)粒和具有復(fù)制能力的HBV質(zhì)粒制成同一制劑增加了兩個(gè)質(zhì)粒被同一細(xì)胞吸收的可能性。因?yàn)楸磉_(dá)的效應(yīng)dsRNA在大多數(shù)含有復(fù)制性HBV質(zhì)粒的細(xì)胞中存在，觀察到的結(jié)果可以歸咎于效應(yīng)質(zhì)粒的作用而不是導(dǎo)入效率的差異。本實(shí)驗(yàn)顯示只有特殊的eiRNA在感染的肝中有效。導(dǎo)入方法和制劑不是本實(shí)施例要回答的問(wèn)題。eiRNA載體的配制、給藥和導(dǎo)入在應(yīng)用轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)施例中有研究。
實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)照B10.D2小鼠用流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入法注射含有末端冗余的能夠轉(zhuǎn)錄所有病毒RNA并且產(chǎn)生感染性病毒的HBV感染性克隆(ayw亞型)[1，2，3]。繼內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞并在核內(nèi)定位后，從數(shù)個(gè)病毒啟動(dòng)子開(kāi)始的感染性HBV質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)了反映HBV復(fù)制的級(jí)聯(lián)事件，這種事件包括翻譯轉(zhuǎn)錄的病毒mRNA、將轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA包裝進(jìn)核心顆粒、前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄、病毒和HBsAg(乙肝表面抗原)的組裝和分泌進(jìn)入被轉(zhuǎn)染動(dòng)物的血清中。動(dòng)物被注射4個(gè)劑量的HBV復(fù)制型質(zhì)粒(1μg、3μg、5μg和10μg)。選擇這種劑量是因?yàn)樗鼈兇砹肆黧w動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入后能夠激起報(bào)告基因可測(cè)出的表達(dá)的非飽和劑量。動(dòng)物同時(shí)用效應(yīng)dsRNA表達(dá)載體(eiRNA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使各組動(dòng)物接受10-19μg劑量的特殊效應(yīng)構(gòu)建體，以使總DNA劑量達(dá)20μg。例如，接受3μg劑量的HBV復(fù)制子的小鼠，再注射17μg的eiRNA載體，使注射的總DNA達(dá)20pg。這種劑量的大小因此取決于所用HBV質(zhì)粒的劑量。對(duì)照動(dòng)物注射HBV復(fù)制子但無(wú)eiRNA載體。對(duì)照小鼠轉(zhuǎn)而用惰性填充DNA pGL3-basic(Promega，Madison，WI)共注射，以使制劑中的總DNA量達(dá)到20μg。本研究中的eiRNA載體為基于U6的表達(dá)載體，例如，Ambion，Inc.，Austin，TX，USA。這種載體編碼來(lái)自SEQ ID NO1和SEQ ID NO4.的短發(fā)夾RNA。這種載體編碼的精確序列在以下描述。這種載體共注射的量相同(重量)。預(yù)期用本文其他處所描述的其他的表達(dá)和啟動(dòng)子系統(tǒng)和/或編碼其他結(jié)構(gòu)(即雙螺旋)的載體也會(huì)得到類似結(jié)果。
編碼來(lái)自SEQ ID NO1的基于U6的eiRNA載體的描述編碼含有定位于檢索號(hào)V01460和J02203的坐標(biāo)2905-2929位序列的發(fā)夾的載體(即含有該序列的正義型和反義型，被一個(gè)TTCAAAAGA環(huán)狀結(jié)構(gòu)隔開(kāi)的發(fā)夾)。有關(guān)基于U6的載體的序列可在Lee等文獻(xiàn)中找到[9]。本實(shí)驗(yàn)使用的第二eiRNA載體編碼來(lái)自序列SEQ ID NO4的發(fā)夾并編碼定位于檢索號(hào)V01460和J02203的坐標(biāo)1215-1239位的序列。
注射一天后，取被注射動(dòng)物的肝臟樣品并分析HBV RNA的存在。時(shí)間點(diǎn)的選擇依據(jù)Dr.Chisari的實(shí)驗(yàn)室所發(fā)表的結(jié)果，該結(jié)果詳述了ayw亞型HBV質(zhì)粒繼流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入后在鼠體的復(fù)制動(dòng)力學(xué)并且顯示肝中的RNA表達(dá)高峰出現(xiàn)在流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入一天后[1]。肝臟樣品中的HBV RNA的存在由Northern雜交分析確定。將評(píng)估肝組織中HBV RNA表達(dá)的下調(diào)。另外，將從第4天開(kāi)始收集小鼠血清測(cè)定HBV表面抗原和含DNA的病毒顆粒。測(cè)試將與細(xì)胞復(fù)制子實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例3)和Yang[1]等描述的相同。各載體和對(duì)照組將包括兩組動(dòng)物，每組對(duì)應(yīng)于一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，每組5只動(dòng)物。
結(jié)果相對(duì)對(duì)照動(dòng)物，注射了HBV復(fù)制子和eiRNA構(gòu)建體的小鼠將有HBV特異的RNA和HBV病毒顆粒的下降，個(gè)別動(dòng)物下降的范圍將在約70％到接近100％的范圍。
實(shí)驗(yàn)2轉(zhuǎn)基因鼠研究背景我們將使用Dr.Chisari實(shí)驗(yàn)室[8]開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因小鼠，這種小鼠復(fù)制可觀的HBV DNA并且顯示了它們作為預(yù)測(cè)人體有效性的抗病毒篩選的用途[4]。這種動(dòng)物作為HBV整合介導(dǎo)的抗原表達(dá)模型也很理想，因而不僅可作為病毒復(fù)制的模型，而且可作為非RT-依賴的抗原表達(dá)模型。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)槲覀儾粌H有興趣以病毒復(fù)制為靶目標(biāo)，而且有興趣以整合介導(dǎo)的抗原表達(dá)為靶目標(biāo)。
這種實(shí)驗(yàn)與流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)不同，流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入法效應(yīng)質(zhì)粒是通過(guò)臨床相關(guān)的核酸導(dǎo)入方法用藥的。在這種模型上有效證明效應(yīng)質(zhì)粒被有效地導(dǎo)入了小鼠肝細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8]中的小鼠靜脈注射含有流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入實(shí)施例中描述的eiRNA載體的制劑。它們是基于U6的編碼含有來(lái)自SEQ IDNO1和SEQ ID NO4序列的發(fā)夾eiRNA的載體。
注射用DNA制劑如Satishchandran提交于2003年5月6日的PCT/US03/14288，″Methods for Delivery of Nucleic Acids″中所描述，將DNA與三乳糖(trilactosyl)精胺和膽固醇精胺制成制劑。制備三種制劑，其電荷比均為1.2(正電比負(fù)電)。然而，應(yīng)該注意電荷比為0.8到1.2的制劑都應(yīng)該有效。各質(zhì)粒的DNA起始母液為4mg/ml，兩種質(zhì)粒的母液等量混合使各質(zhì)粒為2mg/ml。這一質(zhì)?；旌衔镉糜谧詈笈渲浦苿?。制劑如PCT/US03/14288中所述(以上)制劑A)35％三乳糖精胺、65％膽固醇酯精胺，制劑B)50％三乳糖精胺、50％膽固醇酯精胺，制劑C)80％三乳糖精胺、20％膽固醇酯精胺。所有配好的制劑含有1mg/ml的各質(zhì)粒。
小鼠靜脈注射100μlDNA制劑。一組小鼠接受制劑A，第二組接受制劑B，第三組接受制劑C。三組對(duì)照鼠相似地注射含有對(duì)照DNA pGL3Basic(Promega，Madison WI)的制劑D，E和F。每天注射一次連續(xù)4天。注射1-3天已有效，但4天注射的方案有更強(qiáng)的效果。
繼用藥后，在第一次注射后的第5天和第9天對(duì)HBV DNA和HBsAg及含DNA的病毒顆粒進(jìn)行定量檢測(cè)。所有分析與流體動(dòng)力學(xué)導(dǎo)入研究中所描述的一樣。
結(jié)果A、B和C制劑組的HBV特異的RNA水平、HBsAg和含DNA的顆粒的病毒相對(duì)對(duì)照來(lái)講將減低。
實(shí)施例4沉默具有復(fù)制能力的細(xì)胞模型中HBV的復(fù)制和表達(dá)。
細(xì)胞培養(yǎng)模型簡(jiǎn)述
人肝來(lái)源的細(xì)胞系如Huh7細(xì)胞用含有末端冗余的能夠轉(zhuǎn)錄所有病毒RNA和產(chǎn)生感染性病毒的病毒基因組的HBV感染性分子克隆轉(zhuǎn)染。本研究所用的復(fù)制子來(lái)自Gen Bank檢索號(hào)AF090840的病毒序列。在內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞并在核內(nèi)定位后，從數(shù)個(gè)病毒啟動(dòng)子開(kāi)始的感染性HBV質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)反映HBV復(fù)制的級(jí)聯(lián)事件，這種事件包括翻譯轉(zhuǎn)錄的病毒mRNA、將轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA包裝進(jìn)核心顆粒、前基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄、病毒和HBsAg(乙肝表面抗原)的組裝和分泌進(jìn)入被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基。該細(xì)胞模型再現(xiàn)了HBV在被其感染的肝細(xì)胞中復(fù)制的大多數(shù)環(huán)節(jié)，因此是一個(gè)很好的用于觀察失活HBV的表達(dá)和復(fù)制的模型。
在本模型中，細(xì)胞用HBV感染性分子克隆和eiRNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染，然后如以下所述的那樣觀察HBV表達(dá)和復(fù)制的降低。
以下是用編碼來(lái)自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2.序列的eiRNA載體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例。用于本實(shí)驗(yàn)的特殊載體為編碼約650bp的RNA雙螺旋的RNA T7聚合酶載體(參見(jiàn)，例如，提交于2000年4月19日的WO 00/63364)。預(yù)期使用本文其他處所描述的其他表達(dá)和啟動(dòng)子系統(tǒng)和/或編碼其他結(jié)構(gòu)(即，雙螺旋)的載體也能得到類似的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)染接種Huh7細(xì)胞到6孔板中，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)融匯度達(dá)到80-90％。所有轉(zhuǎn)染根據(jù)廠家提供的說(shuō)明書用Lipofectamine(InVitrogen)進(jìn)行。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞按以下方式轉(zhuǎn)染A)50ng感染性HBV adw亞型質(zhì)粒，1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒(實(shí)施例3中描述的質(zhì)粒)，和1.5μgHBV特異性eiRNA載體(以下描述)；B)50ng感染性HBV質(zhì)粒，1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒和1.5μg非相關(guān)dsRNA表達(dá)質(zhì)粒；C)125ng感染性HBV質(zhì)粒，1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒和1.4μgHBV特異性eiRNA載體；D)125ng感染性HBV質(zhì)粒，1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒和1.4μg非相關(guān)dsRNA表達(dá)載體。所有轉(zhuǎn)染均做復(fù)孔。在此實(shí)驗(yàn)中，B和D為對(duì)照。轉(zhuǎn)染4天后取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基檢測(cè)其中HbsAg的存在(見(jiàn)下)。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基作為背景對(duì)照也被檢測(cè)。
監(jiān)測(cè)細(xì)胞中HBV表達(dá)的喪失繼轉(zhuǎn)染后，通過(guò)測(cè)定HbsAg的分泌監(jiān)測(cè)細(xì)胞中HBV表達(dá)和復(fù)制的喪失和減低。在使用dsRNA后4天，通過(guò)檢測(cè)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基(和培養(yǎng)基對(duì)照)來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞。購(gòu)自Abbott Labs(Abbott Park，IL)的Auszyme ELISA試劑盒用于檢測(cè)乙肝表面抗原(HBsAg)，測(cè)定表面抗原不僅因?yàn)樗c病毒復(fù)制有關(guān)，而且與RNA聚合酶在轉(zhuǎn)染的感染性克隆上啟動(dòng)的表面抗原順?lè)醋拥霓D(zhuǎn)錄有關(guān)。因?yàn)樵跓o(wú)HBV復(fù)制的情況下表面抗原能繼續(xù)合成，所以不僅下調(diào)病毒復(fù)制是重要的，而且下調(diào)非復(fù)制依賴的表面抗原合成也很重要。
結(jié)果相對(duì)對(duì)照轉(zhuǎn)染，在第4天的時(shí)間點(diǎn)上，用HBV特異性eiRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示HbsAg下降了82-93％。
本實(shí)驗(yàn)所用HBV特異性eiRNA該eiRNA載體編碼定位于GenBank檢索號(hào)#AF090840的坐標(biāo)2027-2674位的dsRNA，所以序列包括來(lái)自SEQ ID NO1和SEQ IDNO2.的序列。更具體的講，該序列包括所有SEQ ID NO2和來(lái)自SEQID NO1的134bp。
實(shí)施例5在細(xì)胞復(fù)制子模型中下調(diào)HCV簡(jiǎn)述本實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)表達(dá)功能性HCV復(fù)制子的細(xì)胞系被構(gòu)建，該細(xì)胞系的構(gòu)建如Lohmann等所詳述[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，Huh7細(xì)胞被用作母細(xì)胞系，但理論上講，任何人肝細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系均適用。該細(xì)胞被HCV特異的eiRNA載體轉(zhuǎn)染。eiRNA轉(zhuǎn)染后的3-7天，HCV特異性RNA的存在用Lohmann等描述的Northern印跡分析來(lái)確定。
實(shí)驗(yàn)方案轉(zhuǎn)染用表達(dá)HCV復(fù)制子的Huh7細(xì)胞接種6孔板使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融匯度達(dá)80-90％。所有轉(zhuǎn)染根據(jù)廠家提供的說(shuō)明書用Lipofectamine TM(InVitrogen)進(jìn)行。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒(實(shí)施例3中所描述的質(zhì)粒)和1.5μg基于T7的編碼含有來(lái)自SEQID NO11序列的發(fā)夾RNA的eiRNA載體(實(shí)施例的末尾描述的載體)轉(zhuǎn)染。對(duì)照細(xì)胞用1μg T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒和1.5μg實(shí)施例3中描述的基于T7的HBV特異的(SEQ ID NO1特異)eiRNA載體轉(zhuǎn)染。未轉(zhuǎn)染表達(dá)復(fù)制子的HuH 7細(xì)胞被用作第二對(duì)照。制備各轉(zhuǎn)染混合物使各混合物的量足夠進(jìn)行10次轉(zhuǎn)染，總量可進(jìn)行20次轉(zhuǎn)染(每個(gè)混合物10次)。在3、4、5、6和7天從各轉(zhuǎn)染組取兩孔細(xì)胞進(jìn)行裂解，并用標(biāo)準(zhǔn)方法提取RNA。如Lohmann等所述，樣品同時(shí)用Northern印跡法分析HCV特異性RNA的存在[10]。
結(jié)果相對(duì)對(duì)照細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了HCV特異性eiRNA載體的細(xì)胞將顯示HCV特異性RNA水平在每個(gè)被分析的時(shí)間點(diǎn)都有下降。
HCV特異性eiRNA載體該eiRNA載體為基于T7且編碼發(fā)夾RNA的載體，發(fā)夾的一邊含有SEQ ID NO48。
該序列后是一個(gè)9Ts的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。發(fā)夾的第二邊含有與發(fā)夾的第一邊互補(bǔ)的序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地設(shè)計(jì)和構(gòu)建發(fā)夾構(gòu)建體。注意預(yù)期由其他啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的和編碼其他類型的RNA結(jié)構(gòu)的其他類型eiRNA載體將有同樣的效果。
實(shí)施例6HBV/HCV共感染的治療簡(jiǎn)述在本實(shí)施例中，復(fù)制HBV和HCV復(fù)制子的細(xì)胞用編碼HBV和HCV特異的eiRNA的eiRNA載體轉(zhuǎn)染。
實(shí)驗(yàn)方案含有HBV和HCV復(fù)制子的細(xì)胞系的構(gòu)建HuH 7首先被改造來(lái)表達(dá)功能性HCV復(fù)制子。細(xì)胞系的構(gòu)建細(xì)見(jiàn)Lohmann等[10]。細(xì)胞系建立后，用例3和以下“細(xì)胞轉(zhuǎn)染”章節(jié)中的感染性HBV復(fù)制子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。在本實(shí)施例中，復(fù)制子來(lái)自Gen Bank檢索號(hào)V01460和J02203的病毒序列。理論上講，可以首先構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)HBV復(fù)制子的細(xì)胞系，再用該細(xì)胞系來(lái)構(gòu)建一個(gè)也表達(dá)HCV復(fù)制子的細(xì)胞系。也可以同時(shí)用HBV和HCV的復(fù)制子共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后篩選并擴(kuò)增出表達(dá)HBV和HCV兩種復(fù)制子的細(xì)胞來(lái)。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染在本實(shí)施例中，HBV和HCV eiRNA由同一載體的不同的順?lè)醋泳幋a。然而，預(yù)期該eiRNA由同一順?lè)醋泳幋a或由不同的載體提供都應(yīng)獲得類似的結(jié)果。在本實(shí)施例中，各順?lè)醋拥霓D(zhuǎn)錄由T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和T7 RNA聚合酶驅(qū)動(dòng)。各啟動(dòng)子后面是發(fā)夾eiRNA，緊隨發(fā)夾eiRNA的是T7終止子(圖1)。本例中的順?lè)醋邮沁B續(xù)的，但也可用不連續(xù)的順?lè)醋?。?yīng)該知道也可用其他表達(dá)系統(tǒng)(包括病毒)來(lái)產(chǎn)生這種RNA，也可用如本文其他處所描述的其他啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)這種RNA的表達(dá)而不會(huì)對(duì)效果有明顯影響。選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)和啟動(dòng)子屬本領(lǐng)域的技術(shù)范圍，人們也可以表達(dá)其他eiRNA結(jié)構(gòu)，例如，本文其他處所描述的和本領(lǐng)域的其他文獻(xiàn)中所描述的其他結(jié)構(gòu)。在本例中，HBV eiRNA載體編碼來(lái)自SEQ ID NO1的序列，HCVeiRNA載體編碼來(lái)自SEQ ID NO11.的序列。有關(guān)載體插入的描述在實(shí)施例的末尾。
用Huh7細(xì)胞接種6孔板使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融匯度達(dá)80-90％。所有轉(zhuǎn)染根據(jù)廠家提供的說(shuō)明書用Lipofectamine(InVitrogen)進(jìn)行。在本實(shí)驗(yàn)中，用50ng感染性HBV質(zhì)粒、1μgT7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒(實(shí)施例3中所描述的質(zhì)粒)、600ng編碼來(lái)自SEQ ID NO1序列的發(fā)夾RNA的eiRNA載體(以下及實(shí)施例3有描述)和600ng編碼來(lái)自SEQID NO11序列的發(fā)夾RNA的eiRNA載體(以下描述)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞用50ng感染性HBV質(zhì)粒和1μgT7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。用惰性填充DNA，pGL3-basic(Promega，Madison WI)將DNA/轉(zhuǎn)染補(bǔ)足到2.5μg。制備時(shí)使每種轉(zhuǎn)染混合物量足以進(jìn)行10次轉(zhuǎn)染，總量為20次轉(zhuǎn)染(每種10次)。
分析繼轉(zhuǎn)染后，通過(guò)測(cè)定HbsAg和含DNA病毒顆粒的分泌來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞HBV表達(dá)和復(fù)制的喪失。用檢測(cè)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞，從使用dsRNA的兩天后開(kāi)始，以后每隔一天檢測(cè)一次直到3個(gè)星期。用從Abbott Labs(Abbott Park，IL)購(gòu)得的Auszyme ELISA試劑盒檢測(cè)乙肝表面抗原(HBsAg)，測(cè)定HbsAg是因?yàn)樗粌H與病毒復(fù)制有關(guān)，而且與RNA聚合酶II啟動(dòng)的被轉(zhuǎn)染的感染性克隆上表面抗原順?lè)醋拥霓D(zhuǎn)錄有關(guān)。由于HbsAg在無(wú)HBV復(fù)制的情況下能夠繼續(xù)合成，所以不僅下調(diào)病毒的復(fù)制是重要的，而且下調(diào)非復(fù)制依賴的HbsAg合成也很重要。含核殼蛋白包裹的HBV基因組DNA的病毒顆粒的分泌也被測(cè)定，含有核殼蛋白包裹的HBV基因組DNA的病毒顆粒的喪失提示HBV復(fù)制的喪失。病毒毒粒的分析涉及到區(qū)別裸露的不成熟的核心顆粒和包裝好的感染性HBV病毒毒粒[6]。簡(jiǎn)單地講，從細(xì)胞培養(yǎng)基中得到的病毒沉淀物用蛋白酶K消化以降解核心蛋白，繼失活蛋白酶k后，樣品與RQ1 DNase(Promega，Madison，WI)共孵育，降解從核心顆粒中釋放出來(lái)的DNA。樣品在有SDS以失活Dnase的條件下再次用蛋白酶K消化，以破碎和降解感染性的有包膜病毒顆粒。然后用酚/氯仿抽提并純化DNA。HBV特異性DNA經(jīng)電泳檢測(cè)后用Southern印跡分析。
在第3、4、5、6、和7天，各轉(zhuǎn)染組(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)的兩孔細(xì)胞被裂解并用標(biāo)準(zhǔn)方法提取RNA。樣品用Lohmann等[10]描述的Northern分析法分析HCV特異性RNA的存在。
結(jié)果轉(zhuǎn)染了HBV-HCV特異性eiRNA載體的細(xì)胞相對(duì)對(duì)照細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在每個(gè)被分析的時(shí)間點(diǎn)上HCV特異的RNA水平將降低，另外，相對(duì)對(duì)照來(lái)講，HbsAg和HBV病毒顆粒也會(huì)降低。
HCV特異的eiRNA序列該eiRNA載體為基于T7并編碼發(fā)夾RNA的載體。該發(fā)夾的一邊含有SEQ ID NO48。
該序列之后緊隨著一個(gè)9Ts的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該發(fā)夾的第二邊含有與發(fā)夾的第一邊互補(bǔ)的序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地設(shè)計(jì)和構(gòu)建反夾結(jié)構(gòu)。注意預(yù)期由其他啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和編碼其他類型的RNA結(jié)構(gòu)的其他類型的eiRNA載體也會(huì)有類似作用。特別理想的是，例如， “強(qiáng)制性”發(fā)夾、能夠通過(guò)RNA依賴的聚合酶延伸形成發(fā)夾的部分發(fā)夾，正如提交于2002年7月31日的USSN 60/399,998P和提交于2003年7月31日的PCT/US2003/024028中所描述，和提交于2002年10月18日的USSN 60/419,532和提交于2003年10月20日的PCT/US2003/033466中描述的“牛乳”樣結(jié)構(gòu)發(fā)夾(例如多-發(fā)夾長(zhǎng)dsRNA載體和多-短發(fā)夾結(jié)構(gòu))、帶有錯(cuò)誤配對(duì)區(qū)域的發(fā)夾和多表位構(gòu)建體，還有其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的dsRNA結(jié)構(gòu)。
HBV特異的eiRNA-SEQ ID NO1該載體為以上描述的基于T7的載體，其插入片段編碼含有定位于GenBank檢索號(hào)460和J02203的坐標(biāo)3004-2950位(約55bp)的單分子發(fā)夾。發(fā)夾的一個(gè)區(qū)域?yàn)樵撔蛄械恼x型，發(fā)夾的另一個(gè)區(qū)域?yàn)樵撔蛄械姆戳x型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能很容易地設(shè)計(jì)和制備發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
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序列表<110>原子核物理公司(Nucleonics，Inc.)C.J.帕楚克(Pachuk，Catherine)C.薩蒂什錢德蘭(Satishchandran，C.)V.R.小祖勞斯基(Zurawski，Vincent)L.明茨(Mintz，Liat)<120>用于基因沉默的HBV和HCV保守序列<130>26788-002<150>60/478,076<151>2003-06-12<160>48<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>138<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<220>
<221>misc_feature<222>(137)..(137)<223>n為a、c、g或t<400>1gaacatggag arcayhdcat caggaytcct aggacccctg ctcgtgttac aggcggkgtk60tttctygttg acaaraatcc tcacaatacc dcagagtcta gactcgtggt ggacttctct 120caattttcta ggggdany 138<210>2<211>26<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<400>2tggatgtgtc trcggcgttt tatcat 26<210>3<211>206<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<220>
<221>misc_feature<222>(63)..(63)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(111)..(111)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(140)..(140)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(174)..(174)<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(177)..(177)<223>n為a、c、g或t<400>3aaggcctttc tvhgtmaaca rtaymtgmmc ctttaccccg ttgcymggca acggychggy60ctntgccaag tgtttgctga cgcaaccccc actgghtggg gcttggybat nggccatcrs 120cgcatgcgtg gaacctttbn gkctcctctg ccgatccata ctgcggaact cctngcngcb 180tgtttygctc gcagcmggtc tggrgc206<210>4<211>119<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<400>4yactgttcaa gcctcaagct gtgccttggg tggctttrgg rcatggacat tgacmcktat60aaagaatttg gagctwctgt ggagttactc tcdtttttgc cttcygactt ytttccttc119<210>5<211>101
<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<400>5cgabgcaggt cccctagaag aagaactccc tcgcctcgca gacgmgrtct caatcgmcgc60gtcgcagaag atctcaatyt cgggaatcty aatgttagta t 101<210>6<211>99<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<400>6abgcaggtcc cctagaagaa gaactccctc gcctcgcaga cgmgrtctca atcgmcgcgt60cgcagaagat ctcaatytcg ggaatctyaa tgttagtat 99<210>7<211>100<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<400>7cabgcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgmgrtctc aatcgmcgcg60tcgcagaaga tctcaatytc gggaatctya atgttagtat 100<210>8<211>100<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<400>8gabgcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgmgrtctc aatcgmcgcg60tcgcagaaga tctcaatytc gggaatctya atgttagtat 100<210>9<211>104<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)
<223>n為a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>n為a、c、g或t<220>
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<221>misc_feature<222>(75)..(75)<223>n為a、c、g或t<400>9ttggybatng gccatcrscg catgcgtgga acctttbngk ctcctctgcc gatccatact60gcggaactcc tngcngcbtg tttygctcgc agcmggtctg grgc104<210>10<211>71<212>DNA<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)<220>
<221>misc_feature<222>(71)..(71)<223>n為a、c、g或t<400>10ctgccaactg gathcthcgc gggacgtcct ttgtytacgt cccgtcrgcg ctgaatcchg60cggacgaccc n 71<210>11<211>490<212>DNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)<220>
<221>misc_feature<222>(86)..(86)<223>n為a、c、g或t
<220>
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<221>misc_feature<222>(488)..(488)<223>n為a、c、g或t<400>11ddatcactcc cctgtgagga actactgtct tcacgcagaa agcgtctagc catggcgtta60gtatgagtgt ygtgcagcyt ccaggncccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg 120aaccggtgag tacaccggaa ttgccrggah gaccgggtcc tttcttggat daacccgctc 180watgccygga vatttgggcg tgcccccgcr agacygctag ccgagtagyg ttgggtygcg 240aaaggccttg tggtactgcc tgatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac 300cgtgcahcat gagcacrmwt cchaaacchc aaagaaaaac caaamgwaac accaaccgyc 360gcccacagga cgthaagttc ccgggyggyg ghcagatcgt tggbggagth tacbtgttgc 420cgcgcagggg cccnmvdttg ggtgtgcgcg cgacnaggaa gacttcbgar cggtcncarc 480chcghggnag 490<210>12<211>29<212>DNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n為a、c、g或t
<400>12atggcntggg atatgatgat gaactggyc 29<210>13<211>265<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>13aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac60aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt 180aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat 240atcttgtgga aaggacgaaa caccg 265<210>14<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)788-808<400>14cgtctgcgag gcgagggagt tagagaactt aactccctcg cctcgcagac g 51<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)807-827<400>15ttcttcttct aggggacctg cagagaactt gcaggtcccc tagaagaaga a 51<210>16<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)1291-1311<400>16aagccaccca aggcacagct tagagaactt aagctgtgcc ttgggtggct t 51<210>17<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)1299-1319<400>17caaggcacag cttggaggct tagagaactt aagcctccaa gctgtgcctt g 51<210>18<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)1737-1757<400>18ggattcagcg ccgacgggac gagagaactt cgtcccgtcg gcgctgaatc c 51<210>19<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)1907-1927<400>19ttccgcagta tggatcggca gagagaactt ctgccgatcc atactgcgga a 51<210>20<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)1912-1932<400>20
cagtatggat cggcagagga gagagaactt ctcctctgcc gatccatact g 51<210>21<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)1943-1963<400>21tccacgcatg cgctgatggc cagagaactt ggccatcagc gcatgcgtgg a 51<210>22<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)1991-2011<400>22tgcgtcagca aacacttggc aagagaactt tgccaagtgt ttgctgacgc a 51<210>23<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)2791-2811<400>23aaaacgccgc agacacatcc aagagaactt tggatgtgtc tgcggcgttt t 51<210>24<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)2791-2811mut<400>24aaaacaccac acacgcatcc aagagaactt tggatgcgtg tgtggtgttt t 51
<210>25<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)2912-2932<400>25ttgagagaag tccaccacga gagagaactt ctcgtggtgg acttctctca a 51<210>26<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>eiRNA編碼序列，定位于Genebank檢索號(hào)#V01460中的HBV-AYW坐標(biāo)2919-2939<400>26aagtccacca cgagtctaga cagagaactt gtctagactc gtggtggact t 51<210>27<211>101<212>DNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)<400>27tttggtggct ccatcttagc cctagtcacg gctagctgtg aaaggtccgt gagccgcttg60actgcagaga gtgctgatac tggcctctct gcagatcaag t 101<210>28<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>28gctaaacact ccaggccaat acctgtctc 29<210>29<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>29tcctttggtg gctccatctt acctgtctc 29<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>30gctccatctt agccctagtc acctgtctc 29<210>31<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>31tcttagccct agtcacggct acctgtctc 29<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>32cctagtcacg gctagctgtg acctgtctc 29<210>33<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)
<400>33ctagtcacgg ctagctgtga acctgtctc 29<210>34<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>34cgtgagccgc ttgactgcag acctgtctc 29<210>35<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>35gctgatactg gcctctctgc acctgtctc 29<210>36<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>36actggcctct ctgcagatca acctgtctc 29<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>37ctggcctctc tgcagatcaa g 21
<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>38tgcagagagt gctgatactg g 21<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>39tgagccgctt gactgcagag a 21<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>40gaaaggtccg tgagccgctt20<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>41tagctgtgaa aggtccgtga g 21<210>42
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>42ttagccctag tcacggctag c 21<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>43tccatcttag ccctagtcac g 21<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA編碼序列，定位于丙型肝炎病毒的X區(qū)<400>44ttggtggctc catcttagcc c 21<210>45<211>21<212>RNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)<400>45aaccucaaag aaaaaccaa c 21<210>46<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>lamin siRNA
<400>46aacuggacuu ccagaagaac a 21<210>47<211>2652<212>DNA<213>噬菌體T7<400>47atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg60ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140gccgctgctg tgtaccgcaa ggacagggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
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<210>48<211>323<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>基于T7聚合酶的eiRNA<400>48atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt60atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa 120ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatga acccgctcaa 180tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 240aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg 300tgcaccatga gcacaaatcc taa 32權(quán)利要求
1.一種抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，該方法包括給予所述細(xì)胞含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括將其中含有來(lái)自不止一種SEQ ID NO1到SEQ ID NO10中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的效應(yīng)分子給予同一細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述給予通過(guò)提供一種或多種含有能夠使所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生雙鏈RNA效應(yīng)分子的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)載體來(lái)完成，該雙鏈RNA效應(yīng)分子含有選自SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列；其中U取代T。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述一種或多種表達(dá)載體進(jìn)一步含有選自T7聚合酶啟動(dòng)子、SP6聚合酶啟動(dòng)子和RNA聚合酶III啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子被操作性地連接到所述至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列上。
5.一種抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，該方法包括給予所述細(xì)胞含有選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
6.權(quán)利要求5的方法，該方法進(jìn)一步包括將其中含有來(lái)自不止一種SEQ ID NO11和SEQ ID NO12中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的效應(yīng)分子給予同一細(xì)胞。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述給予通過(guò)提供一種或多種含有能夠使所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生雙鏈RNA效應(yīng)分子的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)載體來(lái)完成，該雙鏈RNA效應(yīng)分子含有選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列；其中U取代T。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種表達(dá)載體進(jìn)一步含有選自T7聚合酶啟動(dòng)子、SP6聚合酶啟動(dòng)子和RNA聚合酶III啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子被操作性地連接到所述至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列上。
9.一種抑制乙性肝炎病毒的多核苷酸序列和丙型肝炎病毒的多核苷酸序列二者在同一體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方法，所述方法包括給予所述細(xì)胞含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中第一至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T；和給予含有選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中第二至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
10.權(quán)利要求9的方法，該方法進(jìn)一步包括將其中含有來(lái)自兩種以上SEQ ID NO1到SEQ ID NO12中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的效應(yīng)分子給予同一細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述給予通過(guò)提供一種或多種含有能夠使所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生以下雙鏈RNA效應(yīng)分子的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)載體來(lái)完成含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中第一至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T；和含有選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中第二至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述一種或多種表達(dá)載體進(jìn)一步包含選自T7聚合酶啟動(dòng)子、SP6聚合酶啟動(dòng)子和RNA聚合酶III啟動(dòng)子的第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子被操作性地連接到所述第一至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列上；和選自T7聚合酶啟動(dòng)子、SP6聚合酶啟動(dòng)子和RNA聚合酶III啟動(dòng)子的第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子被操作性地連接到所述第二至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列上。
13.權(quán)利要求1、5或9中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人細(xì)胞。
14.一種抑制乙肝病毒的多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的組合物，該組合物包括含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
15.權(quán)利要求14的組合物，進(jìn)一步包含其中含有來(lái)自不止一種SEQ ID NO1到SEQ ID NO10序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的效應(yīng)分子存在于所述組合物中。
16.一種抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的組合物，該組合物包括含有選自SEQ ID NO11和SEQ IDNO12的序列中至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
17.權(quán)利要求16的組合物，進(jìn)一步包含其中含有來(lái)自不止一種SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的效應(yīng)分子存在于所述組合物中。
18.一種抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列和丙型肝炎病毒的多核苷酸序列二者在單個(gè)體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的組合物，該組合物包括含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列中的第一至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T；和含有選自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列中的第二至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
19.權(quán)利要求18的組合物，進(jìn)一步包括其中含有來(lái)自兩種以上SEQ ID NO1到SEQ ID NO12中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的效應(yīng)分子存在于所述組合物中。
20.權(quán)利要求14、16或18中任一項(xiàng)的組合物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人細(xì)胞。
21.一種抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的組合物，該組合物含有選自以下的序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列a)SEQ ID NO1；b)SEQ ID NO2；c)SEQ ID NO3；d)SEQ ID NO4；e)SEQ ID NO5；f)SEQ ID NO6；g)SEQ ID NO7；h)SEQ ID NO8；i)SEQ ID NO9；j)SEQ ID NO10；k)(a)到(j)的互補(bǔ)序列；和l)(a)到(k)的混合物。
22.一種抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的組合物，該組合物含有選自以下序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列a)SEQ ID NO11；b)SEQ ID NO12；c)(a)或(b)的互補(bǔ)序列；d)(a)到(c)的混合物。
23.一種抑制乙型肝炎病毒的多核苷酸序列和丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在同一哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的組合物，該組合物含有選自以下的序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列a)SEQ ID NO1；b)SEQ ID NO2；c)SEQ ID NO3；d)SEQ ID NO4；e)SEQ ID NO5；f)SEQ ID NO6；g)SEQ ID NO7；h)SEQ ID NO8；i)SEQ ID NO9；j)SEQ ID NO10；k)SEQ ID NO11；l)SEQ ID NO12m)(a)到(l)的互補(bǔ)序列；和n)(a)到(m)的混合物；其中所述組合物包含至少一種來(lái)自組(a)到(j)的以及一種來(lái)自組(k)和(l)的序列。
24.權(quán)利要求21、22或23中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少19個(gè)連續(xù)核苷酸序列包含DNA并且哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人細(xì)胞。
25.權(quán)利要求21、22或23中任一項(xiàng)的組合物，其中所述至少19個(gè)連續(xù)核苷酸序列包含RNA并且哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人細(xì)胞；此外其中U取代T。
26.一段多核苷酸序列，該多核苷酸序列包含選自SEQ ID NO14到SEQ ID NO26的序列。
27.一段多核苷酸序列，該多核苷酸序列包含選自SEQ ID NO14到SEQ ID NO26的序列的1-19、1-20、1-21、2-20、2-21或3-21位核苷酸。
28.一段多核苷酸序列，該多核苷酸序列包含選自SEQ ID NO27到SEQ ID NO44的序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)多核苷酸序列。
29.一種抑制丙型肝炎病毒的多核苷酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的組合物，該組合物含有來(lái)自SEQ ID NO27序列中的至少19個(gè)連續(xù)堿基對(duì)核苷酸序列的雙鏈RNA效應(yīng)分子；其中U取代T。
30.一種表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體包含權(quán)利要求14、16、18、21、22、23或29的組合物。
31.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該細(xì)胞包含權(quán)利要求30的表達(dá)構(gòu)建體。
全文摘要
提供了來(lái)自已知乙型肝炎病毒株和已知丙型肝炎病毒株保守共有序列，用于抑制病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。這些序列適用于沉默HBV和HCV的基因，因此提供了抗HBV和HCV病毒感染人的治療有效性。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1836042SQ200480022894
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者C·J·帕楚克, C·薩蒂什錢德蘭, V·R·小祖勞斯基, L·明茨 申請(qǐng)人:原子核物理公司