專利名稱：抑制豬流感(siv)和可傳播的腸胃炎冠狀病毒(tgev)的含有來自釀酒酵母is2的可溶性葡 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合物，其含有從釀酒酵母IS2中分離的可溶性葡聚糖低聚物，其可抑制豬流感(SIV)和可傳播的腸胃炎冠狀病毒(TGEV)。
背景技術(shù)：
流感已成為人類發(fā)病率和老年人及嬰幼兒死亡率的的主要原因。流感病毒為正粘病毒科的成員，其由四類即流感病毒A、B、C和托高土病毒屬(Thogotovirus)組成。流感的臨床表現(xiàn)包括高燒、寒戰(zhàn)、咳嗽、喉嚨痛、流涕或鼻塞、頭痛、肌肉疼痛并且經(jīng)常是特別疲勞。大多數(shù)感染流感病毒的病人在一或兩星期內(nèi)完全恢復(fù)。然而，許多人患有進(jìn)一步發(fā)展的嚴(yán)重并發(fā)癥，并死于該并發(fā)癥。迄今，全世界有幾種復(fù)發(fā)的大范圍流行病，例如，1957年的亞洲流感(H2N2)，1968年的香港流感(H3N2)，1977年的俄國(guó)流感(H1N1)以及近期于2003年爆發(fā)的無法抵抗的香港SARS(重癥急性呼吸綜合癥)流感，其使得所有的亞洲人都害怕死亡(de Jong JC.，等，Nature，389，pp554，1997；SubbaraoK.，等，Science，279，pp393-396，1998；Claas EC.，等，Lancet，351，pp472-477，1998；Yuen KY.，等，Lancet，351，pp467-471，1998)。已知流感來自于四類流感混合病毒，即A、B、C4型病毒和冠狀病毒。盡管所有的病毒都表現(xiàn)出相似的臨床特征，對(duì)抗一種病毒的疫苗對(duì)其它類型的流感病毒不具有免疫性。
作為一種預(yù)防方法，推薦流感病毒疫苗，并且已知它表現(xiàn)出70-80％的預(yù)防活性(Influenza，Plenum Medical Book Company，p291，1987)。然而，由于疫苗賦予了短期的免疫性并且采用注射提供，存在幾個(gè)問題，如難以給藥到兒童以及流感的初級(jí)預(yù)防。
由傳染性病毒或微生物引起的豬尤其是吃奶的和斷奶的小豬痢疾導(dǎo)致養(yǎng)豬場(chǎng)很大的經(jīng)濟(jì)損失。腸病毒就其腸內(nèi)取向和復(fù)制而言具有獨(dú)特性(Saif L.J.，等，Disease of swine 8th，Iowa State University Press，Ames.，USA，1990)。大多數(shù)腸病毒具有熱不穩(wěn)定性，其引發(fā)病毒性痢疾在冬天流行。
已知冠狀病毒，SARS的一種病原學(xué)病毒，作為一種突變型從動(dòng)物轉(zhuǎn)移到人，并且是引起豬痢疾、豬喪失食欲的一種主要病毒，其導(dǎo)致抑制豬的生長(zhǎng)。而且，它不能采用常規(guī)的抗生素治療，并且至今仍未研究出基本的治療方案。
可傳播的腸胃炎(TGE)，冠狀病毒的一個(gè)成員，在經(jīng)濟(jì)學(xué)上是一種重要的疾病，這是因?yàn)樗歉邆魅拘缘?，并且特征在于嘔吐、嚴(yán)重的痢疾和小豬在出生前幾周內(nèi)的高死亡率。已報(bào)道在全世界包括韓國(guó)發(fā)現(xiàn)了該病毒。
β-葡聚糖可以從各種來源如酵母、微生物、蘑菇、谷物和藻類中分離。至今，已經(jīng)進(jìn)行了研究并作為多種類型的產(chǎn)品應(yīng)用。特別是，已經(jīng)研究了得自酵母細(xì)胞壁的β-葡聚糖，并且有了很好的認(rèn)識(shí)。
酵母，一種微生物，在FDA中被分入GRAS(通常認(rèn)為是安全的)，已經(jīng)被用在包括食品領(lǐng)域的各種領(lǐng)域，而且酵母的內(nèi)細(xì)胞膜包括作為主要組分的β1、3-和1、6-葡聚糖以及少量殼質(zhì)和甘露蛋白，然而，其外細(xì)胞膜包括甘露蛋白，一種連接到甘露聚糖的蛋白質(zhì)。
β-葡聚糖，酵母細(xì)胞壁的一種主要組分，已經(jīng)被報(bào)道通過巨噬細(xì)胞的活化和增殖而增加Ag特異性免疫應(yīng)答，提高對(duì)病原體如真菌、細(xì)菌、病毒等的抵抗性，抑制在損傷中觀測(cè)到的免疫低下以及增加對(duì)宿主中癌或癌轉(zhuǎn)移的抵抗性(Abel，G.and Czop，J.K.，Int.J.Immunophamacol.，14，pp1363-1373，1992；Babineau，等，220(5)，pp601-609，1994；Benach J.L.，等，Infection and Immunity，35(3)，pp947-951，1982；DiRenzo，L.，等，Eur.J.Immunol.，21，pp1755-1758，1991；Fukase，S.，等，Cancer Res.，47，pp4842-4847，1987；Janusz，M.J.，等，J.Immun.，142，pp959-965，1989；Olsen，E，J.，等，J.Immun.，64，pp3548-3554，1996，Sakurai，T.，等，Int.J.Immunopharmacol.，14，pp821-830，1992；Czop，J.K.，等，Prog.Clin.Biol.Res.，297，pp287-296，1989)。
由于酵母的β-葡聚糖為一種不溶于水的多聚糖，迄今，已經(jīng)研發(fā)了如下的許多制備方法，用于獲得具有高溶解性的β-葡聚糖。
US專利No.5,576,015公開了制備β-葡聚糖的方法，該β-葡聚糖具有精細(xì)微粒形狀以增加其吸收率；US專利No.4,877,777公開了將化學(xué)配方引入葡聚糖以增加其溶解度的方法；US專利No.5,037,972和US專利No.6,143,883公開了制備可溶性葡聚糖微粒的方法，其通過用有機(jī)溶劑提取葡聚糖并隨后用可降解β-1，3-D-葡萄糖鏈的β-葡聚糖酶或纖維素酶進(jìn)行處理，該鏈為葡聚糖的一種基本結(jié)構(gòu)。
然而，在以上引用的任何文獻(xiàn)中都未報(bào)道或公開從酵母的變異菌株IS2(KCTC 0959BP)中分離的特異性可溶性葡聚糖低聚物以及該葡聚糖寡聚物用于流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒疾病的療效，其所公開的內(nèi)容作為參考并入本文。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從研究中努力發(fā)現(xiàn)了來自特異性酵母變異菌株的具有藥學(xué)潛能的β-葡聚糖，并最終通過證實(shí)提取自酵母變異IS2的細(xì)胞壁的分子量小于50,000 D的可溶性葡聚糖低聚物對(duì)流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒表現(xiàn)出潛在的抑制活性而完成了本發(fā)明。
通過以下對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說明，本發(fā)明的這些和其它目的將會(huì)變得顯而易見。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物，其用于治療和預(yù)防人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物在制備治療劑中的應(yīng)用，該治療劑可治療和預(yù)防人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含得自酵母變異菌株(KTCT0959BP)細(xì)胞壁的可溶性葡聚糖低聚物的藥物組合物，其通過用酶處理不溶性的β-葡聚糖而獲得，可用于治療和預(yù)防人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物用于制備治療劑的用途，該治療劑治療和預(yù)防人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病。
上述流感病毒包括流感病毒A、B、C4和豬流感病毒。
上述由于感染流感病毒而引起的疾病包括如SARS的流感、普通感冒、咽喉炎、支氣管炎、肺炎等。
上述由于感染可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病包括普通感冒、嚴(yán)重的急性呼吸疾病、豬流行性痢疾(PED)、可傳播的胃腸炎(TGE)等。
而且，上述哺乳動(dòng)物包括家畜，如狗、貓、牛、豬等。
本發(fā)明的另一目的是提供用于制備可溶性葡聚糖低聚物的方法，包括以下步驟(a)在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母(釀酒酵母)變異IS2(KCTC0959BP)用于接種；(b)將以上的酵母培養(yǎng)物溶液接種到肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)并離心以獲得酵母；(c)向其中加入NaOH以便從酵母細(xì)胞壁中提取β-葡聚糖；(d)將提取的β-葡聚糖與水解酶進(jìn)行反應(yīng)，并隨后進(jìn)行過濾以獲得可溶性的葡聚糖低聚物；以及(e)最后，用凍干法進(jìn)行干燥以獲得本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物。
本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物可根據(jù)以下的優(yōu)選實(shí)施例制備。
對(duì)于本發(fā)明，上述可溶性的葡聚糖低聚物可通過以下步驟制備(a)第一步，培養(yǎng)酵母IS2(KCTC 0959BP)的步驟包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母IS2(KCTC 0959BP)，該液體培養(yǎng)基包括0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母提取物、0.1-10w/v％胨；(b)第二步，從酵母培養(yǎng)基中獲得酵母的步驟包括將第一步制備的數(shù)量介于0.1-10％(v/v)的酵母培養(yǎng)基接種到初級(jí)液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包括0.5-10w/v％葡萄糖、0.1-5w/v％酵母提取物、0.01-2w/v％硫酸銨、0.001-1w/v％磷酸鉀和0.001-1w/v％硫酸鎂，pH介于5.0-6.0，在速度介于100-400rpm時(shí)培養(yǎng)12-48小時(shí)，通入的氣體量介于0.3-3vvm，在培養(yǎng)基中的溫度介于20-40℃，并隨后進(jìn)行離心以獲得酵母；
(c)第三步，從酵母細(xì)胞壁提取濕β-葡聚糖的步驟包括將1-10％氫氧化鈉溶液加入到酵母中，分散，當(dāng)溫度介于70-100℃時(shí)反應(yīng)30分鐘-5小時(shí)，而后進(jìn)行離心以獲得酵母的干細(xì)胞物質(zhì)(DCW)，其中，該過程可重復(fù)幾次以進(jìn)行富集，采用強(qiáng)酸如鹽酸和硫酸將該物質(zhì)的pH滴定至介于4.0-5.0，再次分散于氫氧化鈉溶液中，在75℃下進(jìn)一步反應(yīng)1小時(shí)，進(jìn)行離心以分為氫氧化鈉溶液和固體組分；并且最后，清洗并純化該固體組分以獲得濕的β-葡聚糖；(d)第四步，獲得葡聚糖低聚物的液相的步驟包括向其中加入相當(dāng)于葡聚糖(v/v％)1-10倍量的蒸餾水和相當(dāng)于葡聚糖(v/w％)1/20-1/5量的β-葡聚糖水解酶，在溫度介于30-80℃時(shí)反應(yīng)6-24小時(shí)，淬滅反應(yīng)后通過離心回收上清液，采用超濾膜過濾上清液以獲得本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物溶液，其分子量小于50,000；(e)第五步，獲得最終的可溶性葡聚糖低聚物干粉的步驟包括將第四步制備的低聚物在低于-70℃下單獨(dú)放置12小時(shí)-48小時(shí)，并隨后凍干以獲得本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物粉末。
采用上述步驟制備的可溶性葡聚糖低聚物包括分子量小于50,000的葡聚糖低聚物，優(yōu)選介于1,000-10,000。
本發(fā)明的另一目的是提供一種藥物組合物，其包含得自酵母變異菌株(KTCT 0959BP)細(xì)胞壁的通過上述步驟獲得的可溶性葡聚糖低聚物，作為一種有效量的活性組分，與其藥學(xué)上可接受的載體一起，用于治療和預(yù)防由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的哺乳動(dòng)物的疾病。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于制備上述可溶性葡聚糖低聚物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供采用上述制備方法制備的得自酵母變異IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，并且本發(fā)明的另一目的是提供一種藥物組合物，其包含得自酵母變異菌株(KTCT 0959BP)細(xì)胞壁的采用上述方法獲得的可溶性葡聚糖低聚物，作為一種有效量的活性組分，與其藥學(xué)可接受的載體一起，用于治療和預(yù)防由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒疾病而引起的哺乳動(dòng)物的疾病。
本發(fā)明的組合物可以給藥到人或家畜，如狗、貓、牛和豬，并可以以普通的給藥方法如與飼料混合而使用。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物用于制備治療劑的用途，以治療和預(yù)防人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒疾病的方法，包括將有效量的包含得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物的組合物與其藥學(xué)上可接受的載體一起，給藥到所述哺乳動(dòng)物。
根據(jù)使用方法，本發(fā)明的組合物還可以包括常規(guī)的載體、佐劑或稀釋劑。優(yōu)選根據(jù)用途和使用方法將所述載體作為適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)使用，但不進(jìn)行限制。適當(dāng)?shù)南♂寗┝杏赗emington’s Pharmaceutical Science(Mack Publishing co，Easton PA)的書面文本中。
本文中，以下制備方法和賦形劑僅僅是示范性的，并非用于限制本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以作為一種藥物組合物提供，其含有藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或稀釋劑，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠樹、藻酸鹽、凝膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯基砒絡(luò)烷酮、水、甲基羥基安息香酸鹽、丙基羥基安息香酸鹽、云母、硬脂酸鎂和礦物油。所述制劑還可以包括填料、抗凝聚劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、增香劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可以被制作成當(dāng)通過采用本領(lǐng)域公知的任何步驟將它們給藥到患者后便提供快速、持續(xù)或延遲釋放活性組分。
例如，本發(fā)明的組合物可以溶解在經(jīng)常被用于生產(chǎn)注射劑的油、丙二醇或其它溶劑中。載體的適當(dāng)實(shí)施例包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、異丙基肉豆蔻酸鹽等，但不局限于它們。對(duì)于局部給藥，本發(fā)明的提取物可以被制成藥膏和乳霜形式。
含有天然藥物組合物的藥學(xué)制劑可以被制成任何形式，如口服形式(粉末、片劑、膠囊、軟膠囊、水溶性藥物、糖漿、西也劑藥丸、粉末、香囊、顆粒)或局部制劑(乳霜、藥膏、洗液、凝膠、香膏、小塊、軟膏、噴射液、氣溶膠等)、栓劑或無菌注射劑(溶液、懸浮液、乳劑)。
本發(fā)明的藥學(xué)劑量形式的組合物可以以其藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用，并且也可以單獨(dú)或以適當(dāng)?shù)木喓闲问绞褂?，以及與其它藥學(xué)上的活性組分一起使用。
本發(fā)明的組合物的預(yù)期劑量隨患者的狀況和體重、嚴(yán)重性、藥物形式、給藥途徑和周期而改變，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。然而，為了獲得預(yù)期的效果，通常推薦以0.01-10g/kg優(yōu)選0.1-1g/kg體重/天的量給藥本發(fā)明的組合物。可以以每天單劑量或多劑量的形式給藥該劑量。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過各種途徑給藥到受檢動(dòng)物如哺乳動(dòng)物(大鼠、小鼠、家畜或人)。所有的給藥方式都是預(yù)期的，例如，可以是口頭地、直腸地或通過靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、皮內(nèi)的、胸內(nèi)的、硬膜外的或腦內(nèi)室的注射而給藥。
本發(fā)明的另一目的是提供一種包括組合物的保健食品，該組合物實(shí)質(zhì)上包含得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，與飲食上可接受的添加劑一起，用于預(yù)防和改善由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒疾病而引起的哺乳動(dòng)物的疾病。
根據(jù)組合物的總重量，用于預(yù)防和減輕由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒疾病而引起的哺乳動(dòng)物疾病的保健食品可以包含約0.01-80w/w％優(yōu)選1-50w/w％的上述得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物。
本發(fā)明提供了一種保健飲料組合物，用于預(yù)防和減輕人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病，其包括得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物。
本發(fā)明的上述低聚物組合物可以加入到食物和飲料中，用于預(yù)防和減輕人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒疾病而引起的疾病。
為了研制保健食品，包含本發(fā)明的上述低聚物組合物的可添加食物實(shí)例例如為各種食物、飲料、面包、餅干、果醬、糖果、口香糖、茶、乳酪、維他命復(fù)合物、健康改進(jìn)食物等，并且可以作為粉末、顆粒、片劑、咀嚼片、膠囊或飲料等使用。
本發(fā)明的組合物無毒性和副作用，因此，可以安全使用。
本文的上述組合物可以加入到食物、添加劑或飲料中，其中，對(duì)于保健食品組合物，上述低聚物在食物或飲料中的量一般可以介于食物總重量的約0.01-80w/w％，并且在100ml健康飲料組合物中為0.02-30g，優(yōu)選0.3-5g。
倘若本發(fā)明的健康飲料組合物以指示的比例含有作為一種主要組分的上述低聚物，則對(duì)其它液體組分無特殊限制，其中，其它組分可以為各種除臭劑或天然的碳水化合物等，如常見的飲料。上述天然碳水化合物的實(shí)例為單糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麥芽糖、蔗糖等；常見的糖，如糊精、環(huán)糊精；以及糖醇，如木糖醇和赤藻糖醇等。作為不同于上述的其它除臭劑，天然除臭劑如taumatin、甜菊提取物如levaudioside A、甘草甜味料等，以及合成的除臭劑，如糖精、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartam)等，可以良好地使用。在100ml本飲料組合物中，上述天然碳水化合物的量通常介于約1-20g，優(yōu)選5-12g。
不同于上述組合物的其它組分為各種營(yíng)養(yǎng)物、維他命、礦物質(zhì)或電解質(zhì)、合成的增香劑、在干酪巧克力等情況下的著色劑和精煉劑、果膠酸及其鹽、褐藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠體粘合劑、pH控制劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、丙三醇、乙醇、在碳酸飲料中使用的碳化劑等。不同于上述的其它組分可以為用于制備天然果汁、果汁飲料和蔬菜飲料的果汁。
本發(fā)明的組合物可作為混合劑用于乳酸菌制飲料或軟膏等。
上述組分可以單獨(dú)或組合使用。
本發(fā)明提供了一種保健食品，除本發(fā)明的組合物外，其還包括約0.01-30w/w％的維他命、低聚糖和食物組分。
組分的比率不很重要，但通常介于約0.01-30w/w％/100w/w％本組合物。其中，包含上述提取物的可添加食物的實(shí)例為各種食物、飲料、口香糖、維他命復(fù)合物、增進(jìn)健康食物等。
本發(fā)明的組合物還可以包括一種或多于一種的有機(jī)酸，如檸檬酸、反丁烯二酸、脂肪酸、乳酸、蘋果酸；磷酸鹽，如磷酸鹽、磷酸鈉、磷酸鉀、酸性焦磷酸鹽、聚磷酸鹽；天然的抗氧化劑，如多酚、兒茶酚、α-生育酚、迷迭香提取物、維他命C、甘草根提取物、殼聚糖、丹寧酸、植酸等。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對(duì)本發(fā)明的組合物、用途和制備方法進(jìn)行各種修改和變形，不偏離本發(fā)明的主題和范圍。
附圖簡(jiǎn)述結(jié)合附圖，根據(jù)下述的詳細(xì)說明，將會(huì)更加清楚地理解本發(fā)明的以上和其它目的、特征和其它優(yōu)勢(shì)，其中

圖1顯示出可溶性的葡聚糖低聚物對(duì)在肺泡巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生NO(一氧化氮)的影響。
下文中，通過以下實(shí)施例更加特異性地說明本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明絕不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式以下實(shí)施例和試驗(yàn)性的實(shí)施例用于進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，不限制其范圍。
實(shí)施例1.酵母變異IS2的培養(yǎng)和采集將含有10g/L葡萄糖、6g/L酵母提取物、3g/L硫酸銨((NH4)2SO4)、1.5g/L磷酸鉀(K2PO4)和0.5g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)的液體培養(yǎng)基用作初級(jí)培養(yǎng)基。
將液體YPD培養(yǎng)基(含有葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L和胨20g/L)用于接種，并且將含有400g/L葡萄糖、30g/L酵母提取物、40g/L硫酸銨((NH4)2SO4)、15g/L磷酸鉀(K2PO4)和5.7g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)的培養(yǎng)基用作生長(zhǎng)介質(zhì)。
將生長(zhǎng)培養(yǎng)基高壓滅菌后，于其中播種100ml培養(yǎng)的酵母變異IS2(KCTC 0959BP)，在轉(zhuǎn)速為300rpm、1vvm的通風(fēng)氣體、30℃和pH 5.5下培養(yǎng)，并且最終通過批量0培養(yǎng)系統(tǒng)獲得50-55g/L的酵母干細(xì)胞物質(zhì)(DCW)。
實(shí)施例2.來自酵母變異IS2的β葡聚糖提取物將在以上實(shí)施例1中制備的80g酵母DCW懸浮在1,000ml 4％氫氧化鈉(NaOH)溶液中，并隨后在95℃下培育1小時(shí)。培育的懸浮液在速度為2,000rpm下離心15分鐘，以便分成NaOH溶液部分和固體部分。
將分離的固體部分再次懸浮在2,000ml3％氫氧化鈉溶液中，在75℃下培育3小時(shí)，并隨后在2,000rpm的速度下離心15分鐘，以便再次分成NaOH溶液和固體部分。
用HCl將富集的固體部分調(diào)至pH 4.5，分散到最終體積為2，000ml，并在75℃下再培育1小時(shí)。將培育的懸浮液在2,000rpm的速度下培養(yǎng)15分鐘，以便分離成NaOH溶液部分和固體部分。
用蒸餾水將固體部分沖洗3次，以便從酵母變異體的細(xì)胞壁中獲得160g濕β葡聚糖。
實(shí)施例3.從酵母變異IS2的β-葡聚糖中制備可溶性葡聚糖低聚物將從實(shí)施例2中制備的160g濕β葡聚糖放入1,000ml燒瓶中，并向其中加入480ml蒸餾水和相當(dāng)于1/10葡聚糖(v/w)量的β-葡聚糖酶，并在40℃下培育15小時(shí)。
反應(yīng)停止后，將反應(yīng)混合物在7,000rpm下離心15分鐘以收集上清液。將收集的上清液過濾并通過采用超濾膜(Filtron Co.，MWCO10K)去除未反應(yīng)的酶以獲得含有MW小于10,000道爾頓的含葡聚糖低聚物的溶液。繼溶液于-74℃下單獨(dú)放置過夜后，將該溶液凍干以產(chǎn)生5.8g粉末狀的可溶性葡聚糖低聚物。
試驗(yàn)性實(shí)施例1.可溶性的葡聚糖低聚物對(duì)在肺泡巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生NO(一氧化氮)的影響為測(cè)定可溶性葡聚糖低聚物對(duì)在肺泡巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生NO的影響，進(jìn)行了以下步驟。
1-1.細(xì)胞培養(yǎng)物利用磷酸緩沖鹽(PBS，2.56g/L NaH2PO4·H2O，22.5g/LNa2HPO4·7H2O，87.9g/L NaCl，pH 7.2)從年齡介于1-3星期的母豬肺中分離肺泡巨噬細(xì)胞，并采用DMEM培養(yǎng)基將被分離的肺泡巨噬細(xì)胞懸浮在10％FBS和2x抗細(xì)菌-抗真菌溶液中，在75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中以漂浮。從漂浮液中提取RNA并采用文獻(xiàn)中公開的方法進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))以證實(shí)巨噬細(xì)胞是否被七類豬病毒感染，即豬細(xì)小病毒、2型豬圓環(huán)病毒、1型豬圓環(huán)病毒、豬生殖和呼吸綜合癥病毒、日本腦炎病毒、encephalomyelocarditis病毒和假性狂犬病病毒(Jabrane等，Can.Vet.J.，35，pp86-92，1994)。檢查肺泡巨噬細(xì)胞的感染12小時(shí)后，利用PBS溶液在接種肺泡巨噬細(xì)胞前輕微地清洗微量板兩次，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液從瓶表面脫離肺泡巨噬細(xì)胞。最后，將脫離的肺泡巨噬細(xì)胞接種入24孔平板至平板中每一孔的濃度為1×106-107/ml。
1-2.誘導(dǎo)NO產(chǎn)生將實(shí)施例3制備的可溶性葡聚糖低聚物溶解在DMEM培養(yǎng)基中至濃度為10mg/ml，以兩倍稀釋的方式從0.625mg/ml稀釋到5mg/ml/孔。36小時(shí)后，另外加入以兩倍稀釋的方式從100ug/ml稀釋到25ug/ml/孔微量板的LPS(脂多糖，Sigma，USA)溶液并培養(yǎng)36小時(shí)。培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)基的上清液以測(cè)定它們的NO(一氧化氮)產(chǎn)生。將僅用LPS處理的組和未處理組均用作陰性組。采用常規(guī)的分析試劑盒測(cè)定NO產(chǎn)生(硝酸鹽/亞硝酸鹽比色分析試劑盒，Cayman Chemical Co.，USA)。
結(jié)果，采用得自酵母變異菌株IS2的可溶性葡聚糖低聚物處理的試驗(yàn)組顯示出相對(duì)于陰性對(duì)照組而言，NO產(chǎn)生增加較多，并且證實(shí)了通過可溶性葡聚糖低聚物的NO產(chǎn)生以劑量相關(guān)方式增加(見圖1)。
試驗(yàn)性實(shí)施例2.可溶性葡聚糖低聚物對(duì)豬流感病毒的抗病毒活性為了測(cè)定可溶性葡聚糖低聚物對(duì)豬流感病毒的抗病毒活性，將在試驗(yàn)性實(shí)施例1中采用本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物處理及未處理的兩種培養(yǎng)基上清液用豬病毒處理并接種到肺泡巨噬細(xì)胞。通過觀察如下的病毒細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)測(cè)定二者的抗病毒作用。
2-1.病毒和細(xì)胞制備從感染流感病毒的豬肺中分離豬流感病毒，并且測(cè)出豬的TCID50(組織培養(yǎng)物感染劑量50)值為5×107.5/ml。
從在試驗(yàn)性實(shí)施例1-2中獲得的肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液中制備本試驗(yàn)中使用的NO。在試驗(yàn)中，使用了得自狗腎的MDCK(Mardin-Darby Canine Kidney，ATCC，USA)細(xì)胞。
2-2.間接測(cè)定抗病毒作用通過培養(yǎng)而制備細(xì)胞使其在96孔平板上增殖為單層。5mg/ml的葡聚糖處理組和葡聚糖/LPS共處理組均分別用作NO處理組，并且DMEM培養(yǎng)基處理組和葡聚糖/LPS無處理治療組均用作陰性對(duì)照組。以不同的濃度即103、102和10TCID50/孔平板接種豬流感病毒。在接種24和36小時(shí)后，利用反相顯微鏡測(cè)定病毒的細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)。將連續(xù)三個(gè)孔的平均值用于每組，并將結(jié)果分為4個(gè)等級(jí)，即最強(qiáng)CPE(+++)、中等CPE(++)、輕微CPE(+)和無CPE(-)，并與文獻(xiàn)中公開的方法進(jìn)行對(duì)比(Belaid等，J.Med.Virol.，66(2)，pp229-34，2002)。
結(jié)果，在所有的試驗(yàn)組中，葡聚糖/LPS共處理組顯示出最高的抗病毒作用。特別是，證實(shí)了與對(duì)照組相比，在36小時(shí)后，葡聚糖/LPS處理組抑制病毒的CPE為70％和約30％。而且，在用濃度為102和101TCID50的少量流感病毒處理的組中，抑制作用直到接種36小時(shí)后保持100％(見表1)。
表1


2-3.直接測(cè)定抗病毒作用為了測(cè)定可溶性葡聚糖低聚物的抗病毒活性，將在實(shí)施例3中制備的每個(gè)5mg/ml的低聚物接種到96孔平板，同時(shí)每個(gè)孔平板上有上述試驗(yàn)性實(shí)施例2-1中的MDCK細(xì)胞上的豬病毒，濃度為103、102和101TCID50。將僅用葡聚糖處理的組用作陰性對(duì)照組。在接種24和36小時(shí)后，采用反相顯微鏡測(cè)定病毒的細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)。將連續(xù)三個(gè)孔的平均值用于每組，并且將結(jié)果分為4個(gè)等級(jí)，即最強(qiáng)CPE(+++)、中等CPE(++)、輕微CPE(+)和無CPE(-)，并與文獻(xiàn)(Belaid等，J.Med.Virol.，66(2)，pp229-34，2002)中公開的方法進(jìn)行對(duì)比。此外，將在實(shí)施例3中制備的5mg/ml低聚物的混合液以及豬流感病毒接種到單層細(xì)胞上，以證實(shí)葡聚糖低聚物的直接抗病毒作用。
結(jié)果，相對(duì)于對(duì)照組而言，接種后直到24小時(shí)，僅用葡聚糖處理的組顯示出潛在的100％抗病毒作用，與病毒的數(shù)量無關(guān)。用少量病毒(102和101TCID50)處理的兩組和用大量病毒(103TCID50)處理的組在接種后直到36小時(shí)顯示出100％和70％的抗病毒活性(見表2)。
表2


試驗(yàn)性實(shí)施例3.可溶性葡聚糖低聚物對(duì)TGEV(可傳播的腸胃炎冠狀病毒)的抗病毒作用為了測(cè)定可溶性葡聚糖低聚物對(duì)TGEV(可傳播的腸胃炎冠狀病毒)的抗病毒作用，進(jìn)行了如下過程。
3-1.病毒和細(xì)胞制備可傳播的腸胃炎冠狀病毒(TGEV)(一種冠狀病毒)的Miller株從Seoul National University處獲得，文獻(xiàn)(Kim B.and Chae C.，J.Comp.Path.，126，pp30-37，2002)，并且在試驗(yàn)前測(cè)定TGEV的TCID50值為1×106/ml。
本試驗(yàn)中，從豬睪丸中分離豬睪丸細(xì)胞(ATCC，USA)。
3-2.間接測(cè)定抗病毒作用為測(cè)定本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物的間接抗病毒作用，將在實(shí)施例1-2中制備的肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液與冠狀病毒混合，并且將混合物接種到96孔平板上的單層。類似于在實(shí)施例2-2公開的方法進(jìn)行其它步驟。
結(jié)果，在所有組中，從用葡聚糖和LPS處理的肺泡巨噬細(xì)胞制備的培養(yǎng)物上清液顯示出最高的抗病毒活性。在病毒大量時(shí)(103TCID50)，相對(duì)于對(duì)照組而言，用葡聚糖和LPS處理的組的CPE值顯示出潛在的抗病毒作用，在接種后24小時(shí)為約70％，并且相對(duì)于對(duì)照組而言，在接種后36小時(shí)為約30％(見表3)。
表3


3-3.直接測(cè)定抗病毒作用為測(cè)定本發(fā)明的可溶性葡聚糖低聚物的直接抗病毒作用，將在實(shí)施例3中制備的每個(gè)5mg/ml的低聚物與豬病毒混合，并且將混合物接種到96孔平板上。相似于實(shí)施例2-3中公開的方法進(jìn)行其它的步驟。
結(jié)果，在所有組中，僅用可溶性葡聚糖低聚物處理的組顯示出最高的抗病毒活性。僅用可溶性葡聚糖低聚物處理的組的CPE值顯示出潛在的抗病毒作用，與對(duì)照組相比，在病毒最大量時(shí)(103TCID50)接種24小時(shí)為約70％，在病毒大量時(shí)(103，103TCID50)為約30％，并且在病毒少量時(shí)(101TCID50)接種36小時(shí)為約70％(見表4)。
表4


試驗(yàn)性實(shí)施例4.毒性測(cè)試4-1.方法利用實(shí)施例3的低聚物對(duì)ICR小鼠(平均體重25±5g)和Sprague-Dawley大鼠(235±10g，Jung-Ang Lab Animal Inc.)進(jìn)行了急性中毒測(cè)試。分別對(duì)由10只小鼠或大鼠組成的四個(gè)組口頭給藥4mg/kg、40mg/kg、400mg/kg和4,000mg/kg的測(cè)試樣品或溶劑(0.2ml，i.p.)并觀察兩星期。
4-2.結(jié)果在任意組或任一性別中，對(duì)死亡率、臨床征兆、體重改變以及總體發(fā)現(xiàn)無治療相關(guān)的效果。這些結(jié)果暗示出本發(fā)明制備的提取物為有潛力的，并且安全。
以下將描述制備方法和賦形劑的種類，但本發(fā)明不局限于它們。典型的制備實(shí)施例描述如下。
制備粉末實(shí)施例的干粉50mg乳糖100mg云母10mg
通過將上述組分混合并填充密封包裝而制備粉末制品。
制備片劑實(shí)施例3的干粉50mg玉米淀粉 100mg乳糖 100mg硬脂酸鎂 2mg通過將上述組分混合并成片而制備片劑制品。
制備膠囊實(shí)施例3的干粉50mg玉米淀粉 100mg乳糖 100mg硬脂酸鎂 2mg通過將上述組分混合并采用常規(guī)的明膠制備方法填充明膠膠囊而制備膠囊制劑。
制備注射劑實(shí)施例3的干粉50mg注射用蒸餾水 最適量PH控制劑 最適量通過溶解活性組分、將pH控制到約7.5并隨后將所有組分填充在2ml ample中以及采用常規(guī)的注射品制備方法進(jìn)行消毒而制備注射制劑。
制備液體實(shí)施例3的干粉0.1～80g糖 5～10g檸檬酸 0.05～0.3％焦糖 0.005～0.02％維他命C 0.1～1％
蒸餾水79～94％CO2氣體 0.5～0.82％通過溶解活性組分、填充所有組分以及通過采用常規(guī)的液體制備方法進(jìn)行消毒而制備液體制劑。
制備保健食品實(shí)施例3的干粉 1000mg維他命混合物 最適量維他命A醋酸鹽 70mg維他命E 1.0mg維他命B10.13mg維他命B20.15mg維他命B6 0.5mg維他命B12 0.2mg維他命C 10mg生物素10mg煙酸胺1.7mg葉酸 50mg泛酸鈣0.5mg礦物混合物最適量硫酸亞鐵 1.75mg氧化鋅0.82mg碳酸鎂25.3mg單磷酸鉀 15mg磷酸二鈣 55mg檸檬酸鉀 90mg碳酸鈣100mg氯化鎂24.8mg上述維他命和礦物混合物可以以多種方式改變。這些改變不視為偏離本發(fā)明的主題和范圍。
制備健康飲料實(shí)施例3的干粉 1000mg檸檬酸1000mg低聚糖100g杏濃縮物 2g?；撬?g蒸餾水900ml通過將活性組分溶解、混合、于85℃下攪拌1小時(shí)、過濾并隨后將所有組分填充1000ml ample中以及采用常規(guī)的健康飲料制備方法進(jìn)行消毒來制備健康的飲料制品。
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了如此地描述，很明顯可以以很多方式改變本發(fā)明。這種改變不視為偏離本發(fā)明的主題和范圍，并且希望所有這些對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)是顯而易見的變形包含在以下權(quán)利要求書的范圍以內(nèi)。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，分子量介于1,000-10,000的可溶性葡聚糖低聚物，其通過利用市場(chǎng)上可購(gòu)買的β-葡聚糖水解酶處理從酵母變異IS2的細(xì)胞壁分離的不溶性β-葡聚糖而制得，該可溶性葡聚糖低聚物對(duì)流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒顯示出潛在的抑制性，因此，它可以作為治療劑或保健食品使用，用于治療和預(yù)防被流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒感染的疾病。
權(quán)利要求
1.可溶性葡聚糖低聚物在制備治療劑方面的用途，所述可溶性葡聚糖低聚物得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)，所述治療劑可用于治療和預(yù)防人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中，所述流感病毒為流感病毒A、B、C4或豬流感病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中，所述被流感病毒感染的疾病為流感、普通感冒、咽喉炎、支氣管炎或肺炎。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中，所述被可傳播的腸胃炎冠狀病毒感染的疾病為普通感冒、嚴(yán)重的急性呼吸疾病、豬流行性痢疾(PED)或可傳播的胃腸炎(TGE)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中，所述哺乳動(dòng)物為人和家畜。
6.一種藥物組合物，其包含利用酶處理不溶性的β-葡聚糖而從酵母變異菌株(KTCT 0959BP)細(xì)胞壁獲得的可溶性葡聚糖低聚物，所述組合物可用于治療和預(yù)防人和哺乳動(dòng)物中由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的疾病。
7.一種保健食品，其包括作為一種活性組分的得自酵母變異菌株IS2(KCTC 0959BP)的可溶性葡聚糖低聚物，以及飲食上可接受的添加劑，所述保健食品可用于預(yù)防和改善由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的哺乳動(dòng)物疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子量介于1,000－10,000的可溶性葡聚糖低聚物，其通過利用市場(chǎng)上可購(gòu)買的β－葡聚糖水解酶處理酵母變異IS2的分離細(xì)胞壁的不溶性β－葡聚糖而制得。所述可溶性葡聚糖低聚物對(duì)流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒的活性表現(xiàn)出潛在的抑制功效，因此，它可以作為治療劑或保健食品用于治療和預(yù)防由于感染流感病毒和可傳播的腸胃炎冠狀病毒而引起的哺乳動(dòng)物疾病。
文檔編號(hào)A61K31/716GK1809366SQ200480017555
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月23日
發(fā)明者文元國(guó), 金東右, 樸正勛, 鄭鳳鉉 申請(qǐng)人:天然F&P公司