專(zhuān)利名稱(chēng)：長(zhǎng)春花生物堿及其鹽的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及長(zhǎng)春花生物堿及其鹽的應(yīng)用，更具體涉及增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力的藥劑、糖尿病治療藥、降血糖劑、誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞分化的方法、增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力的方法、制造胰島素生成能力增強(qiáng)的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的方法、來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法、胰島素的制造方法、被誘導(dǎo)分化的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞以及胰島素生成和/或分泌能力增強(qiáng)了的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
背景技術(shù)：
糖尿病是由于血液中的胰島素不足或功能不全而使血液中的糖濃度增加，引起神經(jīng)障礙、視覺(jué)障礙、腎功能障礙等并發(fā)癥的疾病。僅在日本就有700萬(wàn)糖尿病患者。糖尿病有1型和2型，1型是由產(chǎn)生胰島素的胰β細(xì)胞因自身免疫疾病被破壞、極度胰島素不足而引起的。另一方面，2型糖尿病的原因是肌肉、脂肪、肝臟等靶組織的胰島素抗性的出現(xiàn)和胰β細(xì)胞功能下降引起的血液中胰島素量的下降。所以，可以說(shuō)1型和2型的糖尿病都是由胰β細(xì)胞的功能不全引起的疾病。
作為已有技術(shù)，為了使血糖值下降，對(duì)于1型的病例幾乎都使用了胰島素注射。這時(shí)，1天約4次的注射無(wú)疑對(duì)患者來(lái)說(shuō)是痛苦的。對(duì)于2型的治療，比如使用減低胰島素抗性的PPARγ抑制劑，但效果不充分，存在發(fā)胖的副作用。另外，還使用促進(jìn)胰島素從β細(xì)胞分泌的磺酰脲等，但效果不充分。
相對(duì)于使用藥劑治療糖尿病，近年來(lái)，作為再生治療期待著全新的采用細(xì)胞或組織移植的治療方法。如果給1型糖尿病患者移植具有分泌大量胰島素的能力的細(xì)胞，就可以長(zhǎng)時(shí)間不用進(jìn)行1天4次的胰島素注射。另一方面，對(duì)于2型糖尿病，即使靶組織存在胰島素抗性，只要胰島素正常地產(chǎn)生，血糖值就不會(huì)上升，因此胰島素分泌細(xì)胞的移植是有效的。人們期待移植產(chǎn)生的效果比現(xiàn)在所使用的磺酰脲等使胰島素從β細(xì)胞分泌的藥劑好得多。
從獲取的難度和免疫學(xué)特性來(lái)看，豬胰島細(xì)胞是被期待用于糖尿病再生治療的細(xì)胞，但至今在任何細(xì)胞系都沒(méi)有收集大量細(xì)胞并足以分化誘導(dǎo)為胰島素生成·分泌細(xì)胞的技術(shù)。
胰臟的β細(xì)胞在胎兒時(shí)期基本形成后，非常緩慢地增殖·分化(Herrera，P.L.等，Development 1272317-2322(2000))，但實(shí)驗(yàn)也證明在胰臟受到損傷時(shí)其分化和增殖變得活躍，通過(guò)在切除90％胰臟的成年小鼠和用四氧嘧啶破壞β細(xì)胞而引發(fā)糖耐量異常的小鼠中產(chǎn)生胰臟的導(dǎo)管細(xì)胞向β細(xì)胞的分化增殖及殘存的β細(xì)胞的增殖，知道了成人的胰臟中也存在干細(xì)胞，具有再生能力(Bonner-Wier，S.等，Diabetes 421715-1720(2000))。因此，進(jìn)行了從導(dǎo)管取出干細(xì)胞使其分化成胰島素生成細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)(Ramiya，V.K.等，Nature Med.6278-282(2000)和Bonner-Wier，S.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 977999-8004(2000))。可是，胰臟的干細(xì)胞的標(biāo)記不清楚，然而最近報(bào)道了在神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)記巢蛋白(nestin)是胰干細(xì)胞的標(biāo)記，并且確認(rèn)在成人的胰臟導(dǎo)管內(nèi)也存在(Hunziker，E.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.271116-119(2000))。進(jìn)一步體外培養(yǎng)，成功分化成包括胰島素生成細(xì)胞的表型細(xì)胞(Zulewski，H.等，Diabetes 50521-533(2001))，也成功地從ES細(xì)胞分化成胰島樣的組織(Lumelysky，N.等，Science 2921389-1394(2001))，期待作為胰臟的再生醫(yī)療的臨床的應(yīng)用。
這樣，可以成為胰β細(xì)胞的材料的細(xì)胞的研究進(jìn)展的同時(shí)，也期待誘導(dǎo)胰臟β細(xì)胞的分化的生理活性物質(zhì)能夠應(yīng)用于再生醫(yī)療領(lǐng)域。至今為止已知的誘導(dǎo)向β細(xì)胞分化的物質(zhì)有屬于TGF-β超家族的活化素A(activin A)(Demeterco，C.J.等，Clin.Endo.853892-3897(2000))和屬于EGF家族的β-動(dòng)物纖維素(betacellulin)(BTC)(Ishiyama，N.等，Diabetologia41623-628(1998)及Yamamoto，K.等，Diabetes 492021-2027(2000))、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGFhepatocyte growth factor)(Ocana，A.G.等，Biol.Chem.2751226-1232(2000))、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Assady，S.等，Diabetes 501691-1697(2001))等。這些因?yàn)槭堑鞍踪|(zhì)，所以不適合口服，通過(guò)注射引入則因免疫的問(wèn)題和不穩(wěn)定性而難以實(shí)現(xiàn)。另一方面，報(bào)道了在低分子化合物中，煙酰胺作為聚ADP核糖合成酶的抑制劑起作用，促進(jìn)胰β細(xì)胞的再生(Watanabe，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913589-3592(1994)及Sjohorm，A.等，Endocrinology 1351559-1565(1994))，同時(shí)促進(jìn)促使胰β細(xì)胞增殖和分化的Reg蛋白(Akiyama，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9845-53(2001))的表達(dá)(Watanabe，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA913589-3592(1994))。此外，報(bào)道了丁酸鈉(sodium butyrate)和地塞米松(Korsgren，O.等，Upsala J.Med.Sci.9839-52(1993))使豬胎胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICC)分化成胰島素生成細(xì)胞，但由于特異性低，所以實(shí)用性差。
另一方面，已知從馬來(lái)西亞和泰國(guó)的夾竹桃科植物的葉中分離的生物堿科諾菲林(conophylline)(Umezawa，K.等，Anticancer Res.142413-2418(1994))和科諾菲利定(conophyllidine)(Kam，T.S.等，J.Nat.Prod.561865-1871(1993))的結(jié)構(gòu)如

圖1所示。已知科諾菲林在動(dòng)物中表現(xiàn)出抗癌活性(Umezawa，K.等，Drugs Exptl.Clin.Res.2235-40(1996))。
此外，已知科諾菲林誘導(dǎo)胰腺泡癌細(xì)胞AR42J-B13生成胰島素(第45屆日本糖尿病學(xué)會(huì)年度學(xué)術(shù)會(huì)議(東京，2002年5月18日)會(huì)議摘要01-21)。但是，該癌細(xì)胞沒(méi)有向培養(yǎng)基中分泌胰島素。
本發(fā)明的目的在于提供可以誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞生成和/或分泌胰島素的藥劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人為了達(dá)成以上目的進(jìn)行了認(rèn)真努力的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春花生物堿在體外顯著地誘導(dǎo)正常的胰細(xì)胞向胰島素生成·分泌細(xì)胞的分化，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的重要內(nèi)容如下。
1.含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分的、增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力的藥劑。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。所述藥劑較好是還含有煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
2.含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺作為有效成分的、增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素分泌能力的藥劑。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。所述藥劑較好是還含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
3.含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分的、與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。所述與胰島素缺乏相關(guān)的疾病是選自糖尿病、動(dòng)脈硬化和這些疾病引起的并發(fā)癥的任一種疾病。所述與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥較好是還含有煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
4.含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分的降血糖劑。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。所述降血糖劑較好是還含有煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
5.含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分的、來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素生成細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。所述分化誘導(dǎo)劑較好是還含有煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
6.含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺作為有效成分的、來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。所述分化誘導(dǎo)劑較好是還含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
7.由長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽構(gòu)成的、來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。
8.誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞分化的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽。通過(guò)這樣在長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞分化成胰島素生成細(xì)胞和胰島素分泌細(xì)胞。來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)較好是使用煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。此外，所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。
9.增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。為了增加所述的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力，較好是添加煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
10.增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素分泌能力的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。為了增加所述的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力，較好是添加煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
11.包括在長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的、制造胰島素生成和/或分泌能力增加的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的方法。通過(guò)這樣在長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，可以制造胰島素生成能力增加的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞(胰島素生成細(xì)胞)和胰島素分泌能力增加的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞(胰島素分泌細(xì)胞)。來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)較好是使用煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。此外，所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。
12.包括在長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞、從培養(yǎng)物(培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)液)分離·純化胰島素的胰島素的制造方法。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。
13.包括在長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞、從培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)液分離·純化胰島素的胰島素的制造方法。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。
14.通過(guò)上述8中所述的方法誘導(dǎo)分化的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞(胰島素生成細(xì)胞或胰島素分泌細(xì)胞)。
15.通過(guò)上述9中所述的方法胰島素生成能力增加了的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
16.通過(guò)上述10中所述的方法胰島素分泌能力增加了的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
17.與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療方法，其特征在于，使用含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。此外，所述與胰島素缺乏相關(guān)的疾病是選自糖尿病、動(dòng)脈硬化和這些疾病引起的并發(fā)癥的任一種疾病。所述與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥較好是還含有煙酰胺、或者煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
18.與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療方法，其特征在于，在長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，使用培養(yǎng)的所述來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞?？梢栽陂L(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，使用培養(yǎng)的所述來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。所述的長(zhǎng)春花生物堿較好是使用科諾菲林。此外，所述與胰島素缺乏相關(guān)的疾病是選自糖尿病、動(dòng)脈硬化和這些疾病引起的并發(fā)癥的任一種疾病。
本說(shuō)明書(shū)中，“長(zhǎng)春花生物堿”是指從夾竹桃科植物長(zhǎng)春花(Vinca rosea)分離得到的長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿，以及廣義上含有以下的結(jié)構(gòu)式
所表示的骨架的生物堿。生物堿是指植物產(chǎn)生的環(huán)中含有氮原子的環(huán)狀化合物。長(zhǎng)春花生物堿的具體例子可以例舉圖1所示的長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、科諾菲林、科諾菲利定、科諾佛林(conofoline)、科諾菲利寧(conophyllinine)、塔貝爾哈寧(taberhanine)、帕奇希分(pachysiphine)等，但并不局限于此。
“來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞”是指來(lái)源于生物個(gè)體的胰臟的、無(wú)腫瘤形成能力的細(xì)胞，其中包括從生物個(gè)體的胰臟采集的細(xì)胞、培養(yǎng)該細(xì)胞得到的細(xì)胞(即培養(yǎng)細(xì)胞)。培養(yǎng)細(xì)胞包括原代培養(yǎng)細(xì)胞和繼代培養(yǎng)細(xì)胞。
“增加細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力”是包括不具有胰島素生成和/或分泌能力的細(xì)胞變成具有胰島素生成和/或分泌能力的細(xì)胞、具有胰島素生成和/或分泌能力的細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力提高的概念。
“分化成β細(xì)胞”是指β前體細(xì)胞開(kāi)始生成和分泌胰島素。
如上所述，已知科諾菲林作為長(zhǎng)春花生物堿的一種，誘導(dǎo)胰腺泡癌細(xì)胞AR42J-B13生成胰島素。AR42J細(xì)胞生成胰島素，但是無(wú)法分泌到細(xì)胞外。在只知道這樣弱的作用的條件下，將細(xì)胞換成來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)，無(wú)法預(yù)期長(zhǎng)春花生物堿誘導(dǎo)胰島素生成、甚至將胰島素分泌到細(xì)胞外。
此外，在AR42J細(xì)胞中可使其制造胰島素的激活蛋白在豬胰細(xì)胞中沒(méi)有表現(xiàn)出效果。使ES細(xì)胞制造胰島素需要包括白細(xì)胞激活因子(LAF，leukocyte activatingfactor)的多個(gè)因子和階段。對(duì)于每種細(xì)胞使其制造胰島素的分化的條件并不相同。因此，即使是本領(lǐng)域的技術(shù)人員也無(wú)法預(yù)期長(zhǎng)春花生物堿使來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞胰島素的生成增加、并向細(xì)胞外分泌胰島素。
另外，由于AR42J細(xì)胞是癌細(xì)胞，所以即使使其胰島素的生成能力增加，從安全性的角度來(lái)看，也無(wú)法利用于再生醫(yī)療。采用本發(fā)明，通過(guò)確立使來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成·分泌能力增加的技術(shù)，可以大量制備可用于再生醫(yī)療的細(xì)胞。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1表示屬于長(zhǎng)春花生物堿的若干化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
圖2表示用未添加(1)、只添加煙酰胺(10mM)(2)、添加煙酰胺(10mM)和HGF(10ng/ml)(4)、只添加科諾菲林(0.1μg/ml)(5)、添加科諾菲林(0.1μg/ml)和HGF(10ng/ml)(7)、添加科諾菲林(0.1μg/ml)和煙酰胺(10mM)及HGF(10ng/ml)(8)的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周得到的幼豬胰細(xì)胞以免疫染色法染色的結(jié)果。圖中，N表示煙酰胺，CNP表示科諾菲林。
圖3表示用未添加(○)、添加煙酰胺和HGF(△)、只添加科諾菲林(●)、添加科諾菲林和煙酰胺及HGF(▲)的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周得到的幼豬胰細(xì)胞生成的胰島素的量以ELISA測(cè)定的結(jié)果。圖中，N表示煙酰胺，CNP表示科諾菲林。
圖4是科諾菲林對(duì)于投與鏈佐星的大鼠血糖值的效果示意圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下，例舉實(shí)施例的同時(shí)，對(duì)基于上述認(rèn)知而完成的本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施方式和實(shí)施例中沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，使用記載于以下標(biāo)準(zhǔn)操作程序集中的方法，或者對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)或修改后的方法J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual(3rd edition)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork(2001)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons Ltd.等。此外，在使用市場(chǎng)上銷(xiāo)售的試劑盒和測(cè)定裝置的情況下，沒(méi)有特別的說(shuō)明時(shí)，則使用它們所附的操作程序。
本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)和其思路通過(guò)本說(shuō)明書(shū)的記載，從業(yè)者可以了解，從本說(shuō)明書(shū)的記載，只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員就可以容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下記載的發(fā)明的實(shí)施方式和具體的實(shí)施例等是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，是為了示例或說(shuō)明而例舉的，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施方式。在本說(shuō)明書(shū)中所揭示的本發(fā)明的意圖及范圍內(nèi)，基于本說(shuō)明書(shū)的記載，可以進(jìn)行各種改進(jìn)和修改，這一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是可以了解的。
以下，對(duì)本發(fā)明的一種實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
1.長(zhǎng)春花生物堿及其鹽的制造屬于長(zhǎng)春花生物堿的若干化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。
長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿可以通過(guò)Neuss N，Gorman M，Hargrove W，et al &Manning RE(1964)J.Am.Chem.Soc.861440-1442所記載的方法從長(zhǎng)春花(Vinca rosea Linn)分離純化。
科諾菲林可以從夾竹桃科植物小葉狗牙花(Ervatamia microphylla)的葉中，如后述制造例1進(jìn)行分離純化(Umezawa，K.等，Anticancer Res.142413-2418(1994)的改進(jìn)方法)。從約4kg小葉狗牙花的葉可以得到約500mg科諾菲林的結(jié)晶。
科諾菲利定與科諾菲林相同，可以從小葉狗牙花的葉通過(guò)相同的方法制造(Kam，T.S.等，J.Nat.Prod.561865-1871(1993))。
科諾佛林和帕奇希分可以通過(guò)Kam TS，Anuradha S.Alkaloids fromTabernaemontana divaricata.Phytochemistry(1995)40313-6所記載的方法制造。
科諾菲利寧和塔貝爾哈寧可以通過(guò)Kam TS，Pang HS，Lim TM，Biologicallyactive indole and bisindole alkaloids from Tabernaemontana divaricata.Org.Biomol.Chem.(2003)21；1(8)1292-7所記載的方法制造。
長(zhǎng)春花生物堿的鹽可以例舉鹽酸鹽、硫酸鹽，這些鹽是藥理學(xué)上允許的鹽。這些鹽可以用公知的方法制造。
2.使用長(zhǎng)春花生物堿及其鹽誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成首先，準(zhǔn)備來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞較好是來(lái)自哺乳動(dòng)物，哺乳動(dòng)物可以例舉人、猿等靈長(zhǎng)類(lèi)，豬、牛、狗、大鼠等非靈長(zhǎng)類(lèi)。細(xì)胞可以來(lái)自健康的個(gè)體，也可以來(lái)自需要治療的患者?；颊卟痪窒抻谌?，還可以是不健康的非人的動(dòng)物。來(lái)自于健康個(gè)體的非腫瘤細(xì)胞的情況下，個(gè)體較好是胎兒或新生兒(例如，豬的情況下，為出生后3天以內(nèi)的幼豬)。非腫瘤細(xì)胞可以是外分泌細(xì)胞，也可以是內(nèi)分泌細(xì)胞，但較好是內(nèi)分泌細(xì)胞。此外，內(nèi)分泌細(xì)胞中β細(xì)胞和β前體細(xì)胞更好。
從健康的哺乳動(dòng)物個(gè)體的胰臟分離非腫瘤細(xì)胞例如可以如下進(jìn)行。從哺乳動(dòng)物體內(nèi)取出胰臟，剝離結(jié)締組織。將胰臟切碎，加入緩沖液攪拌。攪拌后，去上清液，加入膠原酶(Liberase)攪拌。然后，重復(fù)離心、去上清液、加PBS的操作。用PBS懸浮并收集細(xì)胞，使該細(xì)胞液加在細(xì)胞分離液(Histopaque)上并離心。胰內(nèi)分泌細(xì)胞在細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞分離液的分界面形成白色帶狀層，收集該層。然后，離心并去上清液，加入培養(yǎng)基懸浮后移入培養(yǎng)容器培養(yǎng)。然后，攪拌適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，形成扁球體(spheroid)(細(xì)胞的松散聚集體)后培養(yǎng)。將從培養(yǎng)容器懸浮的細(xì)胞用于之后的操作。
將從培養(yǎng)容器懸浮的細(xì)胞放入離心管中靜置，扁球體沉到底部后去上清液，加入培養(yǎng)基輕輕振蕩，再靜置使扁球體沉到底部。重復(fù)該操作2～3次后，離心去上清液。將殘留的細(xì)胞在添加了長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽的培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)較好為靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)基較好是使用RPMI培養(yǎng)基等。更好是在長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽中再添加煙酰胺、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。較好是每隔4～7天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～35天。在培養(yǎng)期間較好是以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔觀察細(xì)胞的形態(tài)。此外，更換培養(yǎng)基時(shí)，較好是回收培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)液中所含的胰島素量進(jìn)行測(cè)定。
上述的細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法在準(zhǔn)備來(lái)自患者的胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)也可以適用。但是，獲取來(lái)自患者的胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)，從患者的胰臟采集組織碎片，從該組織碎片上以上述方法分離非腫瘤細(xì)胞。
通過(guò)如上所述，在長(zhǎng)春花生物堿或其鹽的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，可以誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞分化。較好是可以將來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞分化誘導(dǎo)成胰島素生成·分泌細(xì)胞(例如β細(xì)胞)?；蛘撸部梢栽黾诱Ｒ扰K細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力。此外，通過(guò)在長(zhǎng)春花生物堿或其鹽的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)物(培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)液)可以通過(guò)公知的方法分離·純化胰島素。
通過(guò)在長(zhǎng)春花生物堿或其鹽的存在下培養(yǎng)而胰島素生成和/或分泌能力增加了的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，在以每1ml培養(yǎng)基2.5×105個(gè)的濃度培養(yǎng)7～35天的情況下，1ml培養(yǎng)基中可以生成10ng以上、較好為25ng以上、更好為55ng以上的胰島素。
如上所述，從獲取的難度和免疫學(xué)特性等來(lái)看，豬胰細(xì)胞是被期待用于糖尿病再生治療的細(xì)胞，但至今在任何細(xì)胞系還沒(méi)有收集大量細(xì)胞足以分化誘導(dǎo)為胰島素生成·分泌細(xì)胞的技術(shù)。
采用本發(fā)明的技術(shù)，可以將大量的細(xì)胞充分地分化誘導(dǎo)成胰島素生成·分泌細(xì)胞。因此，可以將通過(guò)本發(fā)明的方法得到的胰島素生成·分泌細(xì)胞應(yīng)用于對(duì)糖尿病的再生醫(yī)療。
通過(guò)本發(fā)明的方法得到的胰島素生成·分泌細(xì)胞較好是懸浮于溶液中、或者包埋在載體基質(zhì)中后，給受試者使用。懸浮胰島素生成·分泌細(xì)胞的溶液較好是藥理學(xué)上允許的載體及稀釋劑，可以例舉例如食鹽水、緩沖水溶液等。在溶液中較好是添加對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、柳硫汞(thiromesal)等保存劑，L抗壞血酸等穩(wěn)定劑等。在溶液中懸浮胰島素生成·分泌細(xì)胞后較好是進(jìn)行滅菌處理。包埋胰島素生成·分泌細(xì)胞的載體基質(zhì)較好是對(duì)服用者合適且分解成對(duì)使用者無(wú)害的產(chǎn)物的基質(zhì)?；|(zhì)的原料較好是采用天然高分子物質(zhì)、合成高分子物質(zhì)等。天然高分子物質(zhì)可以例舉膠原、明膠等。合成高分子物質(zhì)可以例舉聚乙醇酸、聚乳酸等?；|(zhì)可以采用薄膜狀、片狀、粒狀、膏狀等形態(tài)，但并不局限于此。
3.使用長(zhǎng)春花生物堿的藥劑·醫(yī)藥品長(zhǎng)春花生物堿及其藥理學(xué)上允許的鹽可以增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力。此外，長(zhǎng)春花生物堿及其藥理學(xué)上允許的鹽可以使血糖值下降。因此，這些化合物可以作為醫(yī)藥品(例如糖尿病的治療藥)給人和其他動(dòng)物使用，也可以用作實(shí)驗(yàn)用的試劑。這些化合物可以單獨(dú)使用，也可以和其他藥劑(例如其他的糖尿病治療藥)組合使用。給個(gè)體使用長(zhǎng)春花生物堿時(shí)，利用內(nèi)源性的煙酰胺和/或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，使效果增強(qiáng)，但也可以在投與長(zhǎng)春花生物堿時(shí)同時(shí)投與煙酰胺和/或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
給人使用長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽時(shí)，較好是以例如每天約0.1～10mg/kg(體重)的劑量，1次或分?jǐn)?shù)次口服，但其劑量和服用次數(shù)可以根據(jù)癥狀、年齡、給藥方法等適當(dāng)改變。
長(zhǎng)春花生物堿及其藥理學(xué)上允許的鹽可以制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等制劑口服，也可以制成注射劑、栓劑等經(jīng)腹腔內(nèi)或靜脈注射非口服地投與。長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽(有效成分)的含量可以在1～90重量％之間變動(dòng)。例如，在采用片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑等形態(tài)的情況下，較好是含有5～80重量％的有效成分。糖漿劑等液劑的情況下，較好是含有1～30重量％的有效成分。另外，非口服投與的注射劑的情況下，較好是含有1～10重量％的有效成分。
長(zhǎng)春花生物堿及其藥理學(xué)上允許的鹽的制劑化使用賦形劑(乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇等糖類(lèi)，馬鈴薯、小麥、玉米等淀粉，碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈉等無(wú)機(jī)物，結(jié)晶纖維素等)、粘合劑(淀粉糊、阿拉伯樹(shù)膠、明膠、藻酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、羧甲纖維素等)、潤(rùn)滑劑(硬脂酸鎂、滑石、氫化植物油、聚乙二醇、硅酮油)、崩解劑(淀粉、瓊脂、明膠粉末、結(jié)晶纖維素、CMC·Na、CMC·Ca、碳酸鈣、碳酸氫鈉、藻酸鈉等)、調(diào)味除臭劑(乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、芳香性精油類(lèi)等)、溶劑(注射用水、滅菌精制水、芝麻油、豆油、玉米油、橄欖油、棉籽油等)、穩(wěn)定劑(氮?dú)?、二氧化碳等惰性氣體，EDTA、巰基乙酸等螯合劑，亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、L-抗壞血酸、雕白粉等還原物質(zhì)等)、保存劑(對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、芐醇、苯酚、苯扎氯銨等)、表面活性劑(氫化蓖麻籽油、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20等)、緩沖劑(檸檬酸、醋酸、磷酸的鈉鹽，硼酸等)、稀釋劑等制劑添加劑，以公知的方法進(jìn)行。
長(zhǎng)春花生物堿及其藥理學(xué)上允許的鹽可以用于預(yù)防和/或治療與胰島素缺乏相關(guān)的疾病(例如糖尿病、動(dòng)脈硬化)。此外，也可以應(yīng)用于胰細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌的研究。另外，還可以用作降血糖劑和其他高血糖狀態(tài)長(zhǎng)期持續(xù)而引起的眼部的視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)障礙、壞疽、動(dòng)脈硬化等并發(fā)癥的治療藥。
以下，通過(guò)制造例和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。這些制造例和實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例中使用的材料和來(lái)源如下。
新生幼豬高山養(yǎng)豬場(chǎng)Roswel Park Memorial Institute(RPMI)培養(yǎng)液Invitrogen煙酰胺Sigma Chemical Science(Sigma)胎牛血清(FBS)Sigma生理磷酸緩沖液(PBS)膠原酶(Histopaque)Sigma肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)Sigma Chemical ScienceDMEM日水制藥株式會(huì)社HEPESSigma卡那霉素Sigma谷氨酰胺Sigma青霉素GSigma
胰蛋白酶WakoEDTA關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社免疫熒光用PBS-BSA(牛血清清蛋白)Sigmaα-胰島素抗體Biogenesisα-豚鼠-花青苷3抗體Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.(West Grove，PA)活化素AR&D Systems，Inc.(Minneapolis，MO)Hoechst 33258Polysciences，Inc.
<實(shí)施例1> 科諾菲林的制備從夾竹桃科植物小葉狗牙花的葉(采集于泰國(guó)的坤敬(Khon Khen)市)中如下分離純化科諾菲林。
從約4kg小葉狗牙花的葉用100L三氯甲烷進(jìn)行活性物質(zhì)的提取，得到約130g油狀物質(zhì)。將該油狀物質(zhì)用硅膠柱色譜純化(一共進(jìn)行5次，使用約500g硅膠的柱色譜純化)，以三氯甲烷-甲醇40∶1、20∶1的體系依次洗脫。然后，將K-ras-NRK細(xì)胞的形態(tài)變化作為活性的指標(biāo)，回收出現(xiàn)該生物活性的部分，將得到的粗純化物(約40g)以正己烷-乙酸乙酯1∶2、0∶1的體系進(jìn)行硅膠柱色譜純化(使用約500g硅膠(從Merck公司購(gòu)得))，得到約1.5g活性部分。接著，將活性部分以正己烷-乙酸乙酯-三氯甲烷9∶3∶1、6∶3∶1的體系進(jìn)行硅膠柱色譜純化(使用約150g硅膠)，回收、濃縮活性部分，得到約500mg結(jié)晶。得到的科諾菲林在質(zhì)譜和NMR圖譜中與文獻(xiàn)值(Umezawa，K.等，Anticancer Res.142413-2418(1994))一致。使用的溶劑從關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社購(gòu)入。
<實(shí)施例2> 1.方法從(高山)養(yǎng)豬場(chǎng)購(gòu)入出生后72小時(shí)以內(nèi)的新生幼豬。移入手術(shù)室后，立即進(jìn)行全身麻醉并取出完整的胰(腹側(cè)、背側(cè)胰)。除去取出的胰臟周?chē)慕Y(jié)締組織和附著的血液后，移入10ml燒杯，用眼科剪刀切細(xì)。將切細(xì)了的胰組織片移入100ml三角燒瓶，加入50～60ml磷酸緩沖液(PBS)，用低轉(zhuǎn)速攪拌器以110rpm攪拌3分鐘后，靜置，去上清液。接著，加入40ml含有濃度2.5mg/ml的Liberase PI(Roche)的磷酸緩沖液，用低轉(zhuǎn)速攪拌器以110rpm攪拌8分鐘后，靜置并收集細(xì)胞懸浮的上清液。重復(fù)該操作5次，將收集的細(xì)胞懸浮液以1200rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞。將通過(guò)離心沉淀收集的細(xì)胞用25～50ml PBS懸浮，在10ml細(xì)胞分離液Histopaque 1077(Sigma)上將25ml細(xì)胞懸浮液輕輕地鋪成一層，以1800rpm離心10分鐘。胰(內(nèi)分泌)細(xì)胞在細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞分離液的分界面形成帶狀層(細(xì)胞的分離·純化法)。
將集中于分界面的細(xì)胞用巴氏移液管(Pasteur pipette)采集，懸浮于添加10mM煙酰胺和10％加熱滅活FBS的RPMI 1640中，以1200rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再懸浮于同樣的培養(yǎng)液中，在75ml的培養(yǎng)燒瓶中靜置培養(yǎng)1晝夜(5％CO2恒溫箱，37℃)。
培養(yǎng)條件去除漂浮于燒瓶的細(xì)胞，將粘附在燒瓶底部的細(xì)胞用EDTA-胰蛋白酶剝離·采集。將細(xì)胞懸浮于各培養(yǎng)液(組1～8)，將細(xì)胞(1.25×103細(xì)胞/ml)以2ml為單位，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)(5％CO2恒溫箱，37℃)。
培養(yǎng)液 組1RPMI 1640加10％FBS(對(duì)照)2對(duì)照+10mM煙酰胺3對(duì)照+10ng/ml HGF4對(duì)照+0.1μg/ml科諾菲林52+362+473+482+3+4每4天更換培養(yǎng)液，進(jìn)行3周的觀察。期間，每周觀察一次細(xì)胞的形態(tài)，通過(guò)使用過(guò)氧化物酶的酶免疫法確認(rèn)胰β細(xì)胞是否出現(xiàn)(實(shí)驗(yàn)例I)。將3-氨基-9-乙基咔唑(AEC；0.75mg/ml)作底物，進(jìn)行染色。此外，4天一次更換時(shí)回收培養(yǎng)液，對(duì)分泌到培養(yǎng)液中的胰島素量用ELISA法進(jìn)行測(cè)定(實(shí)驗(yàn)例II)。
2.結(jié)果實(shí)驗(yàn)例I的結(jié)果如圖2所示。據(jù)報(bào)道，煙酰胺(Akiyama，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9848-53(2001))和HGF(Ocana，A.G.等，J.Biol.Chem.2751226-1232(2000))在特定的實(shí)驗(yàn)體系中促進(jìn)向胰島素生成細(xì)胞的分化，但效果較弱。如圖2所示，在未添加組(1)、只添加煙酰胺(10mM)(2)、添加煙酰胺和HGF(10ng/ml)(4)、只添加科諾菲林(0.1μg/ml)(5)、添加科諾菲林和HGF(7)的組中，三周后，只出現(xiàn)了極少的被染紅的胰島素生成細(xì)胞。但是，在煙酰胺、HGF和科諾菲林這3者混合(8)的組中顯示出紅色的胰島素生成細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。煙酰胺和科諾菲林的混合物(6)與上述3者的混合物(8)相比，胰島素生成細(xì)胞的數(shù)量少，但與其他的組相比顯著增加(未圖示)。
實(shí)驗(yàn)例II的結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，8～20天的培養(yǎng)中，若在煙酰胺中加入HGF或科諾菲林，則可以在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)少許胰島素。另外，若組合煙酰胺、HGF和科諾菲林，與其他的組合或者單獨(dú)添加相比，分泌的胰島素的量顯著增加。
總結(jié)雖然沒(méi)有在幼豬的胰細(xì)胞中誘導(dǎo)向胰島素生成細(xì)胞分化的技術(shù)，但知道了用科諾菲林、煙酰胺與HGF的組合，產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的比例大幅提高，在胰島素分泌方面也有大量增加。幼豬胰臟可以大量提供，從而能夠大量準(zhǔn)備充分分泌胰島素的可以移植的細(xì)胞。我們認(rèn)為，通過(guò)該技術(shù)再生醫(yī)療作為糖尿病在將來(lái)所期待的治療變得可能。
此外，還確認(rèn)了科諾菲利定與科諾菲林同樣，誘導(dǎo)胰腺泡癌細(xì)胞AR42J的與胰島素生成相關(guān)的形態(tài)變化。因此，可以認(rèn)為科諾菲利定也與科諾菲林同樣具有增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力的作用。
<實(shí)施例3> 科諾菲林誘導(dǎo)大鼠胰腺泡癌細(xì)胞AR42J-B13細(xì)胞分化成胰島素生成細(xì)胞的效果1.方法細(xì)胞的培養(yǎng)將DMEM在20mM HEPES-NaOH的存在下調(diào)整至pH7.4后，過(guò)濾滅菌，與20ml加入100mg/l卡那霉素、0.6g/l谷氨酰胺、100單位/ml青霉素G、5mM NaHCO3、10％ FBS的培養(yǎng)液一起，將胰腺泡癌細(xì)胞AR42J的HGF敏感性高的亞克隆AR42J-B13細(xì)胞(群馬大學(xué)醫(yī)學(xué)部生體調(diào)節(jié)細(xì)胞專(zhuān)業(yè)的小島至博士提供)在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為了防止細(xì)胞密集引起的性狀轉(zhuǎn)化、且為了保持細(xì)胞的分化能力，每2～3天將細(xì)胞進(jìn)行傳代，保持2.5～5％鋪滿。傳代時(shí)，將培養(yǎng)液除去后用PBS-(無(wú)Ca2+，Mg2+PBS；8g/l NaCl、0.2g/l KCl、0.916g/lNa2HPO4、0.2g/l KH2PO4)洗滌細(xì)胞2次后，用2ml胰蛋白酶-EDTA溶液剝離細(xì)胞，加8ml培養(yǎng)液使胰蛋白酶失活。然后，通過(guò)將細(xì)胞用離心機(jī)以1000rpm離心5分鐘使其沉降，除去胰蛋白酶，加入新的10ml培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移細(xì)胞使其鋪滿2.5～5％。冷凍在7.5％二甲亞砜(DMSO)的條件下進(jìn)行。
在24孔板中將以4×105細(xì)胞/ml調(diào)制的細(xì)胞按每孔500μl進(jìn)行接種，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)，第二天，單獨(dú)加入0.1～0.3μg/ml科諾菲林或加入O.1μg/ml科諾菲林和100pM HGF，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入1.5ml的Eppendorf管中，將細(xì)胞用200μl PBS-洗滌一次后，重新加入200μl PBS-，觀察存活的細(xì)胞形態(tài)，用連接顯微鏡的照相機(jī)以150倍的倍數(shù)拍攝照片。然后，用胰蛋白酶剝離細(xì)胞，該溶液全部移入前述的Eppendorf管中，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞外排出試驗(yàn)。另外，細(xì)胞的形態(tài)觀察中，將照片放大至250％，將細(xì)胞的全長(zhǎng)達(dá)細(xì)胞直徑的1.5倍以上作為形態(tài)變化，算出形態(tài)變化率。
免疫熒光法首先，在8孔塑料板中將以2×105細(xì)胞/ml調(diào)制的細(xì)胞按每孔500μl進(jìn)行接種，加入0.1μg/ml科諾菲林或加入O.1μg/ml科諾菲林和100pM HGF后，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72小時(shí)使其分化，去除培養(yǎng)基，用免疫熒光用PBS-(8g/l NaCl、O.45g/l NaH2PO4·2H2O、1.28g/l Na2HPO4洗滌一次，用3％甲醛在4℃下過(guò)夜(或者在室溫下30分鐘)固定細(xì)胞。接著，用免疫熒光用PBS-洗滌2次，每孔加入1ml 1％BSA(免疫熒光用PBS-的溶液)，在室溫下靜置1小時(shí)進(jìn)行封閉，為了用50mM甘氨酸(免疫熒光用PBS-的溶液)猝滅，靜置5分鐘，洗滌3次。接著，除去塑料孔中的溶液，每孔中鋪上50μl用稀釋到10倍的封閉液稀釋至100倍的α-胰島素抗體，在室溫下放置1小時(shí)，但不要讓細(xì)胞干燥。這時(shí)，準(zhǔn)備一個(gè)用2nM活化素A和100pM HGF使之分化的細(xì)胞的孔，為了比較次級(jí)抗體的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的影響，不加入初級(jí)抗體進(jìn)行保存。接著，將載玻片移入容器中，在振蕩器上振蕩的同時(shí)用免疫熒光用PBS-洗滌3次，每次5分鐘。接著，向用稀釋到10倍的封閉液稀釋至100倍的α-豚鼠-花青苷3抗體加入Hoechst 33258，稀釋100倍，與初級(jí)抗體同樣鋪在面上，再將載玻片用鋁箔放入遮光的容器內(nèi)，在室溫下遮光放置1小時(shí)，用TNT緩沖液(0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween 20；pH 7.5)在振蕩器上于遮光條件下洗滌3次，每次10分鐘。在所述載玻片上鋪上50％甘油的PBS-溶液，以蓋玻片覆蓋，用顯微鏡拍攝照片。
2.結(jié)果單獨(dú)使用科諾菲林和與HGF一起使用時(shí)，在0.1～0.3μg/ml的濃度范圍內(nèi)與濃度相關(guān)地，誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞樣的突起伸長(zhǎng)，另外在與HGF一起使用時(shí)細(xì)胞死亡稍稍增加，形態(tài)變化率上升。
免疫熒光法的結(jié)果中，在72小時(shí)后，單獨(dú)的100pM HGF沒(méi)有在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)顯示胰島素的紅色染色，在0.1μg/ml科諾菲林和100pM HGF同時(shí)使用時(shí)，在除核之外的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)紅色的胰島素的染色，在細(xì)胞質(zhì)中還發(fā)現(xiàn)像是被封閉在顆粒中的粒狀。在與分泌相關(guān)的細(xì)胞膜周?chē)鷽](méi)有發(fā)現(xiàn)胰島素染色。另一方面，在同時(shí)使用2nM活化素A和100pM HGF時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)顆粒狀的胰島素紅色染色，但是它的分布稍有不同，沿著分別位于2極的突起的軸有發(fā)現(xiàn)，也發(fā)現(xiàn)蓄積在突起的前端。
此外，試著對(duì)分化的細(xì)胞的胰島素分泌通過(guò)ELISA定量法，結(jié)果在可檢測(cè)水平之外。
總結(jié)由上可知，科諾菲林可以誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞的形態(tài)變化，誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞生成胰島素，但是無(wú)法使胰島素分泌到細(xì)胞外。
<實(shí)施例4>
科諾菲林的體內(nèi)降血糖效果通過(guò)實(shí)施例2，已知在體外，科諾菲林具有誘導(dǎo)胰細(xì)胞生成和分泌胰島素的作用。于是，為了確認(rèn)通過(guò)投與科諾菲林，是否在體內(nèi)也誘導(dǎo)胰島素的生成，考察了在體內(nèi)投與科諾菲林后血糖值的變化。
分別向10只出生后一天的Wistar大鼠(從靜岡市SLC公司購(gòu)入)以85μg/g體重在腹腔內(nèi)投與經(jīng)破壞胰β細(xì)胞引起胰島素生成下降、從而誘發(fā)糖尿病的鏈佐星(從和光純藥購(gòu)入，溶解于0.05mM檸檬酸緩沖液(pH4.5))。將投與鏈佐星的那天定義為0天。從第二天(1天)開(kāi)始，7天內(nèi)向5只大鼠以5μg/g體重每天皮下注射科諾菲林溶液(乙醇)，隨時(shí)連日測(cè)定血糖值。向?qū)φ战M的5只大鼠投與同樣量的溶劑(對(duì)照)。其結(jié)果，如圖4所示，在所有的大鼠中都發(fā)現(xiàn)投與鏈佐星后血糖值顯著增加，但在投與科諾菲林的大鼠(●)中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照(○)相比血糖值明顯降低，表現(xiàn)出科諾菲林的降血糖作用(與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01)。由上可知，科諾菲林在體內(nèi)也誘導(dǎo)胰島素的生成。
此外，與體外的結(jié)果比較的情況下，從只用科諾菲林觀察到了作用效果來(lái)看，推測(cè)向體內(nèi)投與科諾菲林時(shí)，利用了內(nèi)源性的煙酰胺和/或肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性通過(guò)本發(fā)明，提供了可以誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞生成和/或分泌胰島素的藥劑。
通過(guò)本發(fā)明的藥劑，可以誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的分化。
此外，通過(guò)本發(fā)明的藥劑，可以增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成和/或分泌能力。
權(quán)利要求
1.增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力的藥劑，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力的藥劑，其特征還在于，還含有煙酰胺。
3.如權(quán)利要求1所述的增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力的藥劑，其特征還在于，還含有煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
4.增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素分泌能力的藥劑，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺作為有效成分。
5.增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素分泌能力的藥劑，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)作為有效成分。
6.與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分。
7.如權(quán)利要求6所述的與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥，其特征還在于，所述與胰島素缺乏相關(guān)的疾病是選自糖尿病、動(dòng)脈硬化和這些疾病引起的并發(fā)癥的任一種疾病。
8.如權(quán)利要求6所述的與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥，其特征還在于，還含有煙酰胺。
9.如權(quán)利要求6所述的與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥，其特征還在于，還含有煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
10.降血糖劑，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分。
11.如權(quán)利要求10所述的降血糖劑，其特征還在于，還含有煙酰胺。
12.如權(quán)利要求10所述的降血糖劑，其特征還在于，還含有煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
13.誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素生成細(xì)胞分化的分化誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分。
14.如權(quán)利要求13所述的分化誘導(dǎo)劑，其特征還在于，還含有煙酰胺。
15.如權(quán)利要求13所述的分化誘導(dǎo)劑，其特征還在于，還含有煙酰胺和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
16.誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的分化誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺作為有效成分。
17.誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的分化誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)作為有效成分。
18.促進(jìn)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的分化誘導(dǎo)促進(jìn)劑，其特征在于，由科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽構(gòu)成。
19.誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素生成細(xì)胞分化的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽。
20.誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺。
21.誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
22.增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素生成能力的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽。
23.增加來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞的胰島素分泌能力的方法，其特征在于，培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞時(shí)添加科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽。
24.胰島素生成細(xì)胞的制造方法，其特征在于，包括在科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
25.胰島素分泌細(xì)胞的制造方法，其特征在于，包括在科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
26.胰島素分泌細(xì)胞的制造方法，其特征在于，包括在科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
27.胰島素的制造方法，其特征在于，包括在科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞、從培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)液中分離·純化胰島素。
28.胰島素的制造方法，其特征在于，包括在科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞、從培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)液中分離·純化胰島素。
29.胰島素生成細(xì)胞，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求19所述的方法誘導(dǎo)分化過(guò)。
30.胰島素分泌細(xì)胞，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求20或21所述的方法誘導(dǎo)分化過(guò)。
31.來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求22所述的方法增加了胰島素生成能力。
32.來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求23所述的方法增加了胰島素分泌能力。
33.與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療方法，其特征在于，使用科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽。
34.與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療方法，其特征在于，在科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽以及煙酰胺的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，使用所培養(yǎng)的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
35.與胰島素缺乏相關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療方法，其特征在于，在科諾菲林或其藥理學(xué)上允許的鹽、煙酰胺以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的存在下培養(yǎng)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞，使用所培養(yǎng)的來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
含有長(zhǎng)春花生物堿或其藥理學(xué)上允許的鹽作為有效成分的藥劑可以誘導(dǎo)來(lái)源于胰臟的非腫瘤細(xì)胞生成和/或分泌胰島素。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1802380SQ200480016059
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2004年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者梅澤一夫, 大河原久子, 小島至, 小谷野喬 申請(qǐng)人:學(xué)校法人慶應(yīng)義塾