專利名稱：從水母中分離的具有抗氧化活性的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物，具體講是兩類具有抗氧化活性的水母蛋白，可作為抗衰老藥物的藥源，同時(shí)也為天然食品添加劑的研制提供新途徑。
背景技術(shù)：
活性氧自由基對(duì)機(jī)體具有巨大的損傷作用，如會(huì)引起蛋白質(zhì)損傷、酶失活、膜質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致衰老、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等許多疾病的發(fā)生。人工合成的二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基甲氧基(BHA)、丙二醇(PG)等具有較好的清除活性氧自由基的作用，常用作食品添加劑，但近年研究表明，BHT、BHA、PG具有致癌作用。因此篩選對(duì)人體安全、高效的活性氧清除劑有著重要的意義。
水母蛋白結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，具有多種生物活性，如酶活性、影響離子運(yùn)轉(zhuǎn)等，但對(duì)于抗氧化活性還未見(jiàn)報(bào)道。我國(guó)水母資源豐富，從海南島、廣東、山東，一直到遼寧沿海均有分布，水母大量存在時(shí)，它將干擾人們?cè)诤Ｉ系膸缀跛谢顒?dòng)，如游泳，養(yǎng)漁業(yè)，更重要的是它傷及人的身體，如果被它刺到，能產(chǎn)生多種癥狀，包括疼痛、皮膚蟄痕、水腫、神經(jīng)抑制、心跳停止、麻痹、甚至死亡。但對(duì)水母資源的利用，現(xiàn)階段只是經(jīng)簡(jiǎn)單加工后，作為食品，附加值不高。所以有必要對(duì)水母蛋白進(jìn)行研究，使水母這種低值生物資源獲得高值化利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用豐富的水母資源，從水母中分離出具有抗氧化活性的蛋白及分析水母蛋白的應(yīng)用，使水母這種低值生物資源獲得高值化利用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為分離得到了兩類具有抗氧化活性的水母蛋白，第一類的分子量大于800K，第二類的分子量小于30K。(根據(jù)葡聚糖凝膠的排阻分子量來(lái)初步確定水母蛋白的分子量)
這兩類水母蛋白的分離工藝步驟為1)將稱量的水母均勻絞碎后，細(xì)胞破碎，加入0.5-5倍的重量/體積比的磷酸緩沖溶液中，放入2-6℃下，浸泡0.5-2h；2)在4℃下，轉(zhuǎn)速10000-20000rpm(相對(duì)離心力9160-25480g)，離心10-30min，取上清液；殘?jiān)?.5-3倍的重量/體積比的磷酸緩沖溶液(5-20mM，PH4-8)二次浸取，在4℃下，浸泡0.5-2h；再在4℃下，轉(zhuǎn)速10000-20000rpm(相對(duì)離心力9160-25480g)，離心10-30min；合并兩次離心的上清液；3)用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定合并的上清液中水母蛋白的濃度；4)用凝膠過(guò)濾層析法，將2)中的合并的上清液分離，得到兩類水母蛋白；第一類蛋白的分子量大于800K，等電點(diǎn)PI在3-9，于百分飽和度30-60％的硫酸銨溶液中沉淀；第二類蛋白的分子量小于30K，等電點(diǎn)PI在4-8，于百分飽和度0-30％的硫酸銨溶液中沉淀；所獲得的兩類蛋白的氨基酸質(zhì)量百分組成如下表1兩類蛋白的氨基酸組成(％)氨基酸種類 第一類蛋白第二類蛋白天門冬氨酸(Asp) 7.61 8.43蘇氨酸(THR) 4.12 3.89絲氨酸(SER) 2.52 2.62色氨酸(TRP) 3.23 3.43谷氨酸(GLU) 13.29 13.15甘氨酸(GLY) 13.09 12.18丙氨酸(ALA) 5.35 4.86胱氨酸(CYS) 11.00 11.18纈氨酸(VAL) 5.23 4.99蛋氨酸(MET) 3.85 3.89異亮氨酸(ILE)3.06 3.11亮氨酸(LEU) 3.85 3.82酪氨酸(TYR) 2.06 2.07苯丙氨酸(PHE)4.19 4.12
賴氨酸(LYS) 4.19 4.20組氨酸(HIS) 0.50 0.65精氨酸(ARG) 6.02 6.09脯氨酸(PRO) 5.78 6.09總氨基酸 98.94 98.77所述水母為新鮮水母或置于-80～-20℃的低溫下保存的新鮮水母；磷酸緩沖溶液的濃度5-20mM，PH4-8。
這兩種蛋白能夠抑制超氧陰離子自由基(O2·-)、羥自由基(·OH)的產(chǎn)生，防止紅細(xì)胞因過(guò)氧化氫氧化溶血和肝脂質(zhì)過(guò)氧化。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)抗氧化活性高。本發(fā)明水母蛋白抗氧化活性高，可作為抗衰老藥物的藥源，同時(shí)也為天然食品添加劑的研制提供新途徑。
2)無(wú)毒害。本發(fā)明水母蛋白屬于天然抗氧化劑，對(duì)人、畜無(wú)毒害。
3)生產(chǎn)成本低。本發(fā)明水母蛋白利用了水母這種豐富的海洋生物資源，為水母這種低值資源獲得高值化發(fā)展提供了新的途徑。


圖1A～C為葡聚糖凝膠分離水母蛋白洗脫體積和吸光度關(guān)系曲線；其中，圖1A葡聚糖凝膠SephadexG-100分離水母蛋白；圖1B葡聚糖凝膠SephadexG-200分離第一類水母蛋白；圖1C葡聚糖凝膠SephadexG-50分離第二類水母蛋白；圖2A～B為兩類蛋白的紅外光譜圖；圖2A第一類蛋白的紅外譜圖；圖2B第二類蛋白的紅外譜圖；圖3水母蛋白的硫酸銨(分級(jí))沉淀曲線；第一類蛋白分布于百分飽和度30％-60％的硫酸銨沉淀中；第二類蛋白分布于百分飽和度0-30％的硫酸銨沉淀中。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于下列實(shí)施例中。
一、水母蛋白分離的實(shí)施例實(shí)施例1(1)將一定量的水母用超聲波破碎儀破碎，加入0.5倍的重量/體積比的5mM，pH4的磷酸緩沖溶液(PB)中，放入2℃下，浸泡0.5h；
(2)在4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心30min，取上清液；殘?jiān)?.5倍的重量/體積比的5mM，pH4的磷酸緩沖溶液(PB)二次浸取，在4℃下，浸泡0.5h；再在4℃下，轉(zhuǎn)速10000rpm，離心30min；合并兩次離心的上清液；(3)用考馬斯亮蘭染色法(該法選自《蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)》，陶慰孫等編，高等教育出版社)，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)水母蛋白在595nm處的吸光度(A595)，根據(jù)朗伯比爾定律，進(jìn)而算出上清液中水母蛋白的濃度(Cmg/ml)。
(4)用凝膠過(guò)濾層析法(該法選自《蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)》，陶慰孫等編，高等教育出版社)，選用凝膠SephadexG-100，將(3)中的合并的上清液分離，得到兩類水母蛋白，洗脫液為50mM，PH6的磷酸緩沖溶液。第一類蛋白的分子量大于800K(用SephadexG-200對(duì)其分離，洗脫體積與空體積相當(dāng)，SephadexG-200的排阻分子量為800K)，第二類蛋白的分子量小于30K(用SephadexG-50對(duì)其分離，洗脫體積大于空體積，SephadexG-50的排阻分子量為30K)。
實(shí)施例2(1)將一定量的水母用超聲波破碎儀破碎，加入2.0倍的重量/體積比的10mM，pH6的磷酸緩沖溶液(PB)中，放入4℃下，浸泡1h；(2)在4℃下，轉(zhuǎn)速15000rpm，離心20min，取上清液；殘?jiān)?.5倍的重量/體積比的10mM，pH6的磷酸緩沖溶液(PB)二次浸取，在4℃下，浸泡1h；再在4℃下，轉(zhuǎn)速15000rpm，離心20min；合并兩次離心的上清液；(3)用考馬斯亮蘭染色法(該法選自《蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)》，陶慰孫等編，高等教育出版社)，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)水母蛋白在595nm處的吸光度(A595)，根據(jù)朗伯比爾定律，進(jìn)而算出上清液中水母蛋白的濃度(Cmg/ml)。
(4)用凝膠過(guò)濾層析法(該法選自《蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)》，陶慰孫等編，高等教育出版社)，選用凝膠SephadexG-100，將(3)中的合并的上清液分離，得到兩類水母蛋白，洗脫液為50mM，PH6的磷酸緩沖溶液。第一類蛋白的分子量大于800K(用SephadexG-200對(duì)其分離，洗脫體積與空體積相當(dāng)，SephadexG-200的排阻分子量為800K)，第二類蛋白的分子量小于30K(用SephadexG-50對(duì)其分離，洗脫體積大于空體積，SephadexG-50的排阻分子量為30K)。
實(shí)施例3(1)將一定量的水母用超聲波破碎儀破碎，加入5.0倍的重量/體積比的20mM，pH8的磷酸緩沖溶液(PB)中，放入4℃下，浸泡2h；(2)在4℃下，轉(zhuǎn)速20000rpm，離心10min，取上清液；殘?jiān)?.5倍的重量/體積比的20mM，pH8的磷酸緩沖溶液(PB)二次浸取，在4℃下，浸泡1h；再在4℃下，轉(zhuǎn)速20000rpm，離心10min；合并兩次離心的上清液；(3)用考馬斯亮蘭染色法(該法選自《蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)》，陶慰孫等編，高等教育出版社)，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)水母蛋白在595nm處的吸光度(A595)，根據(jù)朗伯比爾定律，進(jìn)而算出上清液中水母蛋白的濃度(Cmg/ml)。
(4)用凝膠過(guò)濾層析法(該法選自《蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)》，陶慰孫等編，高等教育出版社)，選用凝膠SephadexG-100，將(3)中的合并的上清液分離，得到兩類水母蛋白，洗脫液為50mM，PH6的磷酸緩沖溶液。第一類蛋白的分子量大于800K(用SephadexG-200對(duì)其分離，洗脫體積與空體積相當(dāng)，SephadexG-200的排阻分子量為800K)，第二類蛋白的分子量小于30K(用SephadexG-50對(duì)其分離，洗脫體積大于空體積，SephadexG-50的排阻分子量為30K)。
表2葡聚糖凝膠SephadexG-100分離水母蛋白


如圖1A～C所示，葡聚糖凝膠分離水母蛋白洗脫體積和吸光度關(guān)系曲線。其中，圖1A為葡聚糖凝膠SephadexG-100分離水母蛋白；圖1B為葡聚糖凝膠SephadexG-200分離第一類水母蛋白；圖1C為葡聚糖凝膠SephadexG-50分離第二類水母蛋白。
二、水母蛋白抗氧化活性的實(shí)施例1.水母蛋白對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用采用吩嗪硫酸甲酯-NADH體系產(chǎn)生自由基。反應(yīng)體系為3.0ml的Tris-HCl緩沖液(16mmol/L，pH8.0)，其中含有78μmol/L還原型輔酶I(NADH)，50μmol/L硝基四氮唑藍(lán)(NBT)，10μmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)，以及不同濃度的水母蛋白溶液。超氧陰離子自由基和NBT的顯色反應(yīng)采用分光光度法在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。在空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用Tris-HCl緩沖液替換NADH。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果以清除率表示清除率％＝(A-A1)/(A-A0)×100％；實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照表3所示，其中，A空白對(duì)照值，A1加入樣品后的吸光值，A0參比；表3水母蛋白對(duì)超氧自由基的清除作用

結(jié)果分析兩類蛋白對(duì)超氧陰離子具有很強(qiáng)的清除作用，清除作用對(duì)濃度具有依賴性，即隨著濃度的提高，清除作用增強(qiáng)，EC50分別為6.12μg/ml，0.88μg/ml，遠(yuǎn)低于BHA，BHT，維生素E，它們的EC50分別為31μg/ml，61μg/ml，88μg/ml(MünirOktay，

Gülin and .


Determination of in vitro antioxidantactivity of fennel(Foeniculum vulgare)seed extracts，Lebensmittel-Wissenschaftund-Technologie，Volume 36，Issue 2，March 2003，Pages 263-271)。
2.水母蛋白對(duì)羥自由基的清除作用·OH是由EDTANa2-Fe(II)-H2O2體系產(chǎn)生，由于·OH可特異地使番紅花紅色褪色，根據(jù)褪色程度用比色法來(lái)衡量·OH的含量。反應(yīng)體系中含有pH7.4的磷酸緩沖液1.5ml，番紅花(260μg/ml)0.2ml，3％的H2O20.8ml，EDTANa2-Fe(II)0.7ml，一定量不同濃度的水母蛋白溶液，混合均勻后于37℃水浴保溫30min，然后于520nm處測(cè)吸光度A值。空白組以蒸餾水代替樣品液，對(duì)照組以蒸餾水代替樣品液和EDTANa2-Fe(II)，反應(yīng)總體積為4.0ml。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果以清除率表示清除率％＝(A樣品-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100％；實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照表4所示；表4水母蛋白對(duì)羥自由基的清除作用

結(jié)果分析兩類蛋白對(duì)羥自由基具有清除作用，第二類蛋白的清除作用很強(qiáng)，濃度為9.99μg/ml時(shí)，清除率達(dá)到94.49％。清除作用對(duì)濃度具有依賴性，即隨著濃度的提高，清除作用增強(qiáng)。兩類蛋白對(duì)羥自由基的EC50分別為45.42μg/ml，1.52μg/ml，遠(yuǎn)低于甘露醇和維生素E，它們的EC50分別為4536μg/ml，1907μg/ml。
3.水母蛋白對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血實(shí)驗(yàn)健康Wistar大鼠眼眶取血，制成抗凝血，1000×g離心10min，移棄血漿和白細(xì)胞，向沉淀的紅細(xì)胞中加入等滲的生理鹽水，混勻，1000×g離心10min，棄上清液，如此反復(fù)2次洗滌紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞制成0.5％的懸浮液。取紅細(xì)胞懸浮液1ml，加不同濃度的水母蛋白溶液，最后加100mmol/l的H2O2，混勻，37℃溫浴60min，用生理鹽水稀釋5倍，1000×g離心10min，上清液于415nm處測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照表5所示；表5水母蛋白對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血作用

結(jié)果分析兩類蛋白對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血具有很強(qiáng)的抑制作用，第一類蛋白的濃度為6.74μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到81.21％，第二類蛋白的濃度為0.47μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到84.35％，抑制率對(duì)濃度的依賴性不是很強(qiáng)，隨著濃度的提高，抑制率變化不是很明顯。
4.水母蛋白對(duì)大鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的作用健康Wistar大鼠，頸椎脫臼致死，迅速分離肝組織，用冰冷的Tris-HCl緩沖液(20mmol/l)制成20％的勻漿，9810×g離心20min，沉淀再洗一次并離心，合并上清液。在0.2mol/l Tris-HCl緩沖液中(pH7.4)加含肝勻漿液0.2ml，F(xiàn)eSO410μmol/l，抗壞血酸0.12mmol/l及不同濃度的水母蛋白溶液，在37℃溫浴60min，保溫結(jié)束后加入20％三氯乙酸(TCA)1.0ml終止反應(yīng)。混勻，再加入0.67％硫代巴比妥酸(TBA)1.5ml，沸水浴加熱15min。離心去除蛋白質(zhì)沉淀后，于532nm測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照表6所示。
表6水母蛋白對(duì)大鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化作用

結(jié)果分析兩類蛋白對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化具有明顯的抑制作用，EC50分別為18.74μg/ml，5.74μg/ml，兩類蛋白對(duì)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化均表現(xiàn)出濃度依賴性。
權(quán)利要求
1.從水母中分離的具有抗氧化活性的蛋白，其特征在于其分離步驟為，1)將稱量的水母均勻絞碎后，細(xì)胞破碎，加入0.5-5倍的重量/體積比的磷酸緩沖溶液中，放入2-6℃下，浸泡0.5-2h；2)在4℃下，轉(zhuǎn)速10000-20000rpm，離心10-30min，取上清液；殘?jiān)?.5-3倍的重量/體積比的磷酸緩沖溶液二次浸取，在4℃下，浸泡0.5-2h；再在4℃下，轉(zhuǎn)速10000-20000rpm，離心10-30min；合并兩次離心的上清液；3)用凝膠過(guò)濾層析法，將2)中的合并的上清液分離，得到兩類水母蛋白；第一類蛋白的分子量大于800K，等電點(diǎn)PI在3-9，于百分飽和度30-60％的硫酸銨溶液中沉淀；蛋白質(zhì)量百分組成天門冬氨酸7.61％，蘇氨酸4.12％，絲氨酸2.52％，色氨酸3.23％，谷氨酸13.29％，甘氨酸13.09％，丙氨酸5.35％，胱氨酸11.00％，纈氨酸5.23％，蛋氨酸3.85％，異亮氨酸3.06％，亮氨酸3.85％，酪氨酸2.06，苯丙氨酸4.19％，賴氨酸4.19％，組氨酸0.50％，精氨酸6.02％，脯氨酸5.78％，總氨基酸98.94％；第二類蛋白的分子量小于30K，等電點(diǎn)PI在4-8，于百分飽和度0-30％的硫酸銨溶液中沉淀；蛋白質(zhì)量百分組成天門冬氨酸8.43％，蘇氨酸3.89％，絲氨酸2.62％，色氨酸3.43％，谷氨酸13.15％，甘氨酸12.18％，丙氨酸4.86％，胱氨酸11.18％，纈氨酸4.99％，蛋氨酸3.89％，異亮氨酸3.11％，亮氨酸3.82％，酪氨酸2.07％，苯丙氨酸4.12％，賴氨酸4.20％，組氨酸0.65％，精氨酸6.09％，脯氨酸6.09％，總氨基酸98.77％。
2.按照權(quán)利要求1所述的從水母中分離的具有抗氧化活性的蛋白，其特征在于所述水母為新鮮水母或置于-80～-20℃的低溫下保存的新鮮水母。
3.按照權(quán)利要求1所述的從水母中分離的具有抗氧化活性的蛋白，其特征在于磷酸緩沖溶液的濃度5-20mM，PH4-8。
4.一種權(quán)利要求1所述的蛋白的應(yīng)用，其特征在于這兩種蛋白能夠抑制超氧陰離子自由基(O2-)、羥自由基(OH)的產(chǎn)生，防止紅細(xì)胞因過(guò)氧化氫氧化溶血和肝脂質(zhì)過(guò)氧化。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物，具體講是兩類具有抗氧化活性的水母蛋白，其分離步驟為，水母絞碎細(xì)胞破碎后，加入磷酸緩沖溶液中，2－6℃浸泡0.5－2h；轉(zhuǎn)速10000－20000rpm，離心10－30min，取上清液；磷酸緩沖溶液二次浸取，轉(zhuǎn)速10000－20000rpm，離心10－30min；合并兩次離心的上清液；用凝膠過(guò)濾層析法，將合并的上清液分離，得到兩類水母蛋白；它們能夠抑制超氧陰離子自由基(O
文檔編號(hào)A61P43/00GK1752101SQ20041005048
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者李鵬程, 于華華, 劉希光, 邢榮娥, 劉松, 郭占勇, 王丕波, 李翠萍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所