專利名稱：一種促進神經(jīng)分化和抗細胞凋亡的蛋白質及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學領域。更具體地，本發(fā)明涉及神經(jīng)營養(yǎng)因子--GRAL基因的兩種剪接異構體A、B及其編碼序列和它們的應用。
背景技術：
在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，神經(jīng)元的存活和分化在一定程度上依賴于靶細胞的存在，通過其軸突與對應的靶細胞之間形成突觸聯(lián)系獲得多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的支持，如果沒有突觸后靶細胞的存在，發(fā)育神經(jīng)元的軸突和樹突將萎縮，神經(jīng)元也將死亡。神經(jīng)元和其靶細胞的這種依存關系稱為神經(jīng)營養(yǎng)作用。從20世紀初就開始的長期研究不斷證明了神經(jīng)元對其靶細胞的這種依賴作用。20世紀50年代初美國華盛頓大學的Levi-Montalcini和Hamburger發(fā)現(xiàn)了第一個具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質--神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)。從那時開始，特別是在最近十幾年，相當數(shù)量的神經(jīng)營養(yǎng)因子被發(fā)現(xiàn)，它們分屬于不同的蛋白家族，有著不同的作用機制和功效，而且來源也不限于神經(jīng)突起指向的靶細胞。更重要的是，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子具有一定的特異性，即只對一種或幾種類型的神經(jīng)元群體起保護作用，因此對神經(jīng)系統(tǒng)疾病特別是神經(jīng)退行性疾病的治療有很大的臨床應用潛力。
膠質細胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Lin，L.-F.H.，Doherty，D.H.，Lile，J.D.，Bektesh，S.，Collins，F(xiàn).GDNFa glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.1993Science 2601130-1132)。目前該家族包括4個成員，即GDNF，Neurturin，Persephin和Artemin。它們對胚胎中腦的多巴胺能神經(jīng)元有明顯的促存活作用，增加胞體體積和突起長度，提高神經(jīng)元對多巴胺的重攝取率，并且能促進神經(jīng)毒素損傷后的恢復。在6-羥基多巴胺或者1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)損傷的大鼠模型中，損傷后注射GDNF能顯著減少黑質多巴胺能神經(jīng)元的死亡(Hou，J.G.，Lin，L.F.，Mytilineou，C.，Glial cell line-derived neurotrophicfactor exerts neurotrophic effects on dopaminergic neurons in vitro and promotes their survival andregrowth after damage by 1-methyl-4-phenylpyridinium.1996，J.Neurochem.6674-82)。已知帕金森病的特異損傷腦區(qū)是腹側中腦黑質致密部的多巴胺能神經(jīng)元，不論在培養(yǎng)的胚胎腹側中腦細胞中還是在帕金森氏病動物模型上，GDNF都顯示了對該腦區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的保護作用，但對其它中樞神經(jīng)元則幾乎沒有保護作用，因此這種保護作用具有相對較高的特異性，這些結果提示了GDNF對帕金森病臨床治療中的良好應用前景。目前，在美國GDNF已進入臨床前期試驗階段。此外，GDNF對運動神經(jīng)元的促存活作用也提示它在脊髓側束硬化癥和肌營養(yǎng)不良等神經(jīng)疾病的臨床應用價值(Henderson，C.E.，Phillips，H.S.，Pollock，R.A.，Davies，A.M.，Lemeulle，C.，Armanini，M.，Simpson，L.C.，Moffet，B.，Vandlen，R.A.，Koliatsos，V.E.，Rosenthal，A.，GDNFa potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle，1994Science 2661062-1064)。神經(jīng)營養(yǎng)因子的這些特性和作用進一步激發(fā)了人們研究和開發(fā)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病神經(jīng)營養(yǎng)因子類藥物的興趣。
目前已知神經(jīng)(生長)營養(yǎng)因子(如GDNF)一般通過與相應受體的結合來激活相關的細胞內信號轉導通路，從而發(fā)揮促進細胞存活的功能。現(xiàn)有的研究表明，GDNF家族的信號傳導通路是通過酪氨酸激酶受體Ret來傳導信號的。GDNF家族的神經(jīng)營養(yǎng)因子首先與一種特殊的蛋白GDNF receptorα(GFRα)結合，然后再與Ret結合激活下游通路。GFRα在胞外通過GPI錨定在細胞膜上，當GDNF家族的配體與之結合以后形成的復合物就能與跨膜的Ret結合(Jing，S.，Wen，D.，Yu，Y.，Holst，P.L.，Luo，Y.，F(xiàn)ang，M.，Tamir，R.，Antonio，L.，Hu，Z.，Cupples，R.，Louis，J.C.，Hu，S.，Altrock，B.W.，F(xiàn)ox，G.M.GDNF-induced activation of the Retprotein tyrosine kinase is mediated by GDNFR-alpha，a novel receptor for GDNF.1996，Cell 851113-1124)。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了四種不同GFRα，它們分別與GDNF家族的四個配體結合，即GDNF-GFRα1，neurturin-GFRα2，artemin-GFRα3，persephin-GFRα4。當然，它們也并非絕對的一對一的關系，例如GDNF能與GFRα2結合，neurturin和artemin也可與GFRα1結合(Airaksinen，M.S.，Saarma，M.，The GDNF familysignaling，biological functions and therapeuticvalue.2002，Nature Rev.Neurosci.3383-394)。但目前沒有資料表明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的這四種不同GFRα受體能獨立行使促進神經(jīng)細胞生長的作用。
對各種神經(jīng)退行性疾病現(xiàn)在還沒有很好的治療方法，現(xiàn)在采用的一些治療手段，多為對癥治療或替代療法，如給帕金森病患者服用左旋多巴等，但不能從根本上扭轉黑質多巴胺神經(jīng)元丟失，長期使用還會導致比較顯著的副作用。而神經(jīng)營養(yǎng)因子由于對特定的神經(jīng)元有保護作用，已成為下一代治療神經(jīng)退行性疾病重要候選藥物的一部分。越來越多的神經(jīng)營養(yǎng)因子逐漸進入臨床前試驗，在帕金森病、脊髓側束硬化癥等疾病的治療中顯示了良好的應用前景。
如前所述，神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用依賴于靶細胞受體的存在和狀態(tài)，但在神經(jīng)退行性疾病的狀況下，已遭損害或部分損害的神經(jīng)細胞(即靶細胞，如多巴胺能神經(jīng)元)狀態(tài)低下，它們所表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體也不可避免地在數(shù)量上和對配體的反應性(如結合能力等)等方面受到負面影響，因此，神經(jīng)營養(yǎng)因子本身的有效性可能會顯著下降，而通過適當?shù)姆椒?如基因治療)使這些靶細胞表達具有自激活特性的跨膜蛋白基因(或使其表達水平提高)，自主而持續(xù)地激活與細胞分化、抗凋亡相關的細胞內信號轉導通路，將有助于擺脫對外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的依賴，從而達到持久的神經(jīng)保護的目的，這將會為發(fā)展神經(jīng)退行性疾病的治療方法提供全新的思路和途徑。
因此，本領域迫切需要開發(fā)新的神經(jīng)營養(yǎng)因子及其編碼序列。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供促進靶細胞和/或神經(jīng)細胞存活的多核苷酸和蛋白。
本發(fā)明的另一目的是用這些蛋白和多核苷酸篩選調節(jié)這些蛋白或多核苷酸表達或功能的化合物。
本發(fā)明進一步的目的是用這些化合物調節(jié)或與所述的蛋白及多核苷酸相互作用，以治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其是神經(jīng)退行性疾病。
本發(fā)明的進一步目的是提供治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其是神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的GRAL蛋白，所述GRAL蛋白含有選自下述的氨基酸序列(a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4氨基酸序列；(b)蛋白(a)的保守性變異蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物；(c)將SEQ ID NO2或SEQ ID NO4氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有自激活特性的由(a)衍生的蛋白；(d)具有促進神經(jīng)細胞分化和/或存活的功能，與蛋白(a)的序列具有50％，70％，80％，90％或95％同源性的氨基酸序列。
優(yōu)選的，所述GRAL蛋白具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1、2或3所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
較佳的，所述多核苷酸編碼含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白。
更佳的，所述多核苷酸的序列選自下組(a)含有SEQ ID NO1中239-1420位的序列；(b)含有SEQ ID NO1中1-2123位的序列；(c)含有SEQ ID NO3中239-955位的序列；(d)含有SEQ ID NO3中1-1872位的序列。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有上述多核苷酸。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種，所述宿主細胞含有上述多核苷酸。較佳的，所述哺乳動物細胞。更佳的，所述宿主細胞為小鼠、大鼠或人的細胞。
本發(fā)明的第五方面，提供了一種具有GRAL蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達GRAL蛋白的條件下，培養(yǎng)上述宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有GRAL蛋白活性的多肽。
本發(fā)明的第六方面，提供了一種能與上述GRAL蛋白特異性結合的抗體。
本發(fā)明的第七方面，提供了一種組合物，所述組合物含有安全有效量的上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸，以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的第八方面，提供了一種保健品，所述保健品含有上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸。
本發(fā)明的第九方面，提供了一種篩選促進或抑制神經(jīng)細胞分化和/或存活的化合物的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將GRAL基因的cDNA裝入表達載體，轉染哺乳動物細胞株，制備表達GRAL蛋白的細胞株(b)向步驟(a)中的表達GRAL蛋白的細胞株培養(yǎng)液中加入測試化合物，檢測GRAL蛋白表達量的變化；促進GRAL蛋白表達量增加的化合物就是促進神經(jīng)細胞分化和/或存活的化合物，抑制GRAL蛋白表達量增加的化合物就是抑制神經(jīng)細胞分化和/或存活的化合物。
本發(fā)明的第十方面，提供了一種檢測試劑盒，所述試劑盒包括上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸。所述檢測試劑盒用于檢測神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)退行性疾病。
本發(fā)明的第十一方面，提供了上述組合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應用。
本發(fā)明的第十二方面，提供了上述GRAL蛋白、或上述多核苷酸在抗細胞凋亡中的應用。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1小鼠GRAL的cDNA及氨基酸序列AGRAL剪接異構體A的cDNA序列；BGRAL剪接異構體A的氨基酸序列；CGRAL剪接異構體B的cDNA序列；DGRAL剪接異構體B的氨基酸序列。
圖2小鼠GRAL基因與已知小鼠GDNF receptorα受體的氨基酸序列比較m1～m4小鼠GDNF receptorα1～α4。
ma&mb小鼠GRAL基因剪接異構體A&B。
黑色方框表示在所有基因中都保守的氨基酸殘基，灰色方框表示在其中5個基因中保守的氨基酸殘基。GRAL基因與已知的小鼠GDNFα1，α2，α3，α4在氨基酸水平的同源性分別為37％，39％，40％和35％。
圖3用RT-PCR方法檢測GRAL基因在成年小鼠各器官和組織中的分布AGRAL基因主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，但在主要的外周器官和組織中缺如。
BGRAL基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的豐度也不同。β-肌動蛋白為內參照，表明各受試組織的模板量近似均等。
圖4小鼠GRAL基因定位在細胞膜上A帶FLAG抗原表位的GRAL基因表達質粒(FLAG-GRAL)被轉染于中國倉鼠卵巢細胞(CHO)后，用抗FLAG抗體作免疫熒光染色，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡掃描后，可觀察到熒光信號(即Flag-GRAL基因表達產物主要集中在細胞膜上)；B利用上述同樣方法，將FLAG-GRAL基因轉染PC12細胞，以抗FLAG抗體作免疫熒光染色。熒光信號也同樣集中在細胞膜上；CFLAG-GRAL轉染CHO細胞后用抗FLAG抗體作免疫印跡，在約45kDa處顯示該基因產物的條帶。泳道1轉染空載體作為對照。泳道2轉染FLAG-GRAL。
圖5穩(wěn)定轉染小鼠GRAL基因的PC12細胞表現(xiàn)出自發(fā)分化現(xiàn)象A轉染空載體的PC12細胞。
B、C、D穩(wěn)定表達GRAL基因的PC12細胞10號克隆、11號克隆、18號克隆。圖中箭頭示意部分較長的突起。
E顯示轉染空載體的PC12細胞和10號、11號、18號細胞克隆中，擁有不少于一倍胞體長的突起的細胞占總細胞數(shù)的比例。
圖6PC12細胞轉染GRAL基因兩周后的形態(tài)學變化A轉染了GRAL基因的PC12細胞。
B轉染空載體即pcDNA3.1的PC12細胞。
C以擁有一倍胞體長的突起為分化指標，以上兩種細胞分化比例的統(tǒng)計圖示。
圖7加入GDNF家族配體后，穩(wěn)定轉染GRAL基因的PC12細胞分化比例無明顯改變縱坐標為擁有一倍胞體長的細胞在總細胞中的百分比。C表示未加任何配體刺激，GDNF、NTN(neurturin)、PSP(persephin)、ART(artemin)為四種已知的GDNF家族配體，加入的配體濃度均為100納克/毫升。
圖8過表達GRAL基因增強細胞抗凋亡的作用穩(wěn)定轉染GRAL基因的PC12細胞(18號克隆)比對照PC12細胞更能抵抗血清饑餓。從培養(yǎng)基中撤除胎牛血清兩天或四天后，分別用臺盼藍染色法和熒光素二乙酸酯染色法對PC12細胞進行染色，計數(shù)存活細胞占總細胞數(shù)的百分比。
具體實施例方式
發(fā)明人克隆了一個與GFRα有一定同源性的新基因，發(fā)明人命名為glial cell line-derivedneurotrophic factor receptor α-like gene(簡稱GRAL基因)，其氨基酸序列與膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子α受體有一定相似性。該基因有兩種剪接形式，剪接異構體A(GRAL A，為全長基因，SEQNO1)編碼一種跨膜蛋白(GRALA蛋白或GRAL蛋白，SEQNO2，本發(fā)明中通常用GRAL基因表示它的編碼序列)，而剪接異構體B(GRAL B，SEQ NO3)則編碼一種分泌蛋白(GRAL B蛋白，SEQ NO4)。
如本文所用，術語“GRAL蛋白”和“GRAL多肽”可互換使用，指在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達的、氨基酸序列與人、大鼠或小鼠的GRAL氨基酸序列有50％以上，或者60％以上，較佳地70％-80％以上，更佳地90％，最佳地95％以上同源性的多肽。此外，GRAL的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物也可用于本發(fā)明。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的GRAL蛋白或多肽”是指GRAL多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化GRAL蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的條帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人GRAL蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然小鼠GRAL蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“GRAL多肽”指具有小鼠GRAL蛋白活性的SEQ ID NO2或SEQ ID NO4序列的多肽。該術語還包括具有與GRAL蛋白相同功能的、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-60個，較佳地1-50個，更佳地1-30個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括GRAL蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與GRAL基因雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗GRAL多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含GRAL多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了GRAL多肽的可溶性片段(如具有SEQ NO4序列的GRAL B具有較高的可溶性)。通常，該片段具有GRAL多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供GRAL蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然GRAL多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
一類特殊的GRAL類似物是，在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中GRAL多肽的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列，通過雜交或擴增的方法而獲得，進而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“GRAL蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列相比，有至多50個，或40個，或30個，較佳地至多20個，更佳地至多10個，最佳地至多5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQID NO2或SEQ ID NO4的蛋白質，但與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性，最佳的90％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼GRAL蛋白的多聚核苷酸。
GRAL核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的小鼠GRAL的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或GRAL蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的GRAL多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼GRAL多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
具體而言，本發(fā)明的GRAL蛋白可通過將相應的編碼序列引入宿主細胞(直接引入或通過引入含GRAL編碼序列的載體)，并在合適的條件下培養(yǎng)轉化的宿主細胞以表達GRAL蛋白，然后分離和純化出GRAL蛋白。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
具體而言，本發(fā)明的GRAL蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)促進神經(jīng)和/或靶細胞存活，和用于篩選促進GRAL蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組GRAL蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能促進或刺激GRAL蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對GRAL DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于GRAL基因產物或片段。較佳地，指那些能與GRAL基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的GRAL基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達GRAL蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用GRAL基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與GRAL基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗GRAL蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的GRAL蛋白。
多克隆抗體的生產可用GRAL蛋白或多肽免疫動物，如家兔，羊等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與GRAL蛋白發(fā)生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。在篩選時，可以將GRAL蛋白加入生物分析測定中，通過測定化合物影響GRAL蛋白和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。此外，還可將測試化合物與GRAL蛋白一起施用于實驗動物，與對照相比存在不同的神經(jīng)和/或靶細胞的存活數(shù)就表明，該化合物是GRAL蛋白的激動劑或拮抗劑。
此外，還可將GRAL基因的cDNA裝入表達載體，轉染哺乳動物細胞株，制備高表達GRAL蛋白的細胞株并以此細胞株中的GRAL蛋白為靶位點，篩選對GRAL蛋白有激活或抑制作用的藥物。并向所述的表達GRAL蛋白的細胞株培養(yǎng)液中加入測試化合物，檢測GRAL蛋白表達量的變化。促進GRAL蛋白表達的就是促進神經(jīng)細胞和/或靶細胞存活的化合物。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、靜脈內、皮下、口服、或局部給藥。
正常的GRAL多肽可直接用于疾病治療，例如，在療治神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)退行性疾病等場合，用于促進神經(jīng)再生，保護靶細胞。在使用本發(fā)明GRAL基因時，也可以促進神經(jīng)再生，保護靶細胞。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明GRAL蛋白、其編碼核酸、和/或反義核酸，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.01微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的GRAL蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.01微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.01微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
GRAL蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g可用于治療由于GRAL蛋白的無表達或異常/無活性的GRAL蛋白的表達所致的神經(jīng)退變。構建攜帶GRAL基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組GRAL基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測GRAL蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的GRAL蛋白水平，可以用作解釋GRAL蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷GRAL蛋白起作用的疾病。
一種檢測樣品中是否存在GRAL蛋白的方法是利用GRAL蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與GRAL蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在GRAL蛋白。
GRAL蛋白的多聚核苷酸可用于GRAL蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，GRAL蛋白的多聚核苷酸可用于檢測GRAL蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下GRAL蛋白的異常表達。如GRAL DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷GRAL蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用GRAL蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測GRAL基因的轉錄產物。
檢測GRAL基因的突變也可用于診斷GRAL蛋白相關的疾病。GRAL蛋白突變的形式包括與正常野生型GRAL DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的GRAL蛋白不僅可用于治療，也可用于促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用。因此，本發(fā)明還提供了一種保健品，它含有哺乳動物的GRAL蛋白或其編碼序列。本發(fā)明保健品，可通過保健品領域常規(guī)的方法，通過將哺乳動物的GRAL蛋白或其編碼序列，與合適的稀釋劑、食品等混合在一起而制備。優(yōu)選的保健品是片劑、顆粒劑、口服劑形式。
GRAL基因在外周器官如心、肝、脾、肺中缺如，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達。在沒有GDNF家族的四個配體存在的情況下，過表達GRAL的PC12細胞(一種常用的來源于大鼠嗜鉻細胞瘤的細胞株)，與對照相比表現(xiàn)出一定程度的自分化現(xiàn)象，并且還更能抵抗血清饑餓。這些實驗結果提示，發(fā)明人克隆到的GRAL基因的編碼產物具有一定的促進神經(jīng)細胞分化和存活的神經(jīng)營養(yǎng)作用。剪接異構體B經(jīng)軟件分析，具有較高的可溶性，GRAL B蛋白與GRAL A蛋白具有很高的同源性，因此GRAL B蛋白也有類似的神經(jīng)營養(yǎng)作用。因此，本基因的克隆和功能的闡述為人們研制治療神經(jīng)退行性疾病重要候選藥物增加了新的選擇。
神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用依賴于靶細胞受體的存在和狀態(tài)，但在神經(jīng)退行性疾病的狀況下，已遭損害或部分損害的神經(jīng)細胞(即靶細胞，如多巴胺能神經(jīng)元)狀態(tài)底下，它們所表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體也不可避免地在數(shù)量和對配體的反應性(如結合能力等)等方面受到負面影響，因此，神經(jīng)營養(yǎng)因子本身的有效性可能會顯著下降，而通過適當?shù)姆椒?如基因治療)使這些靶細胞表達具有自激活特性的跨膜蛋白基因(或使其表達水平提高)，自主而持續(xù)地激活與細胞分化、抗凋亡相關的細胞內信號轉導通路，將有助于擺脫對外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的依賴，從而達到持久的神經(jīng)保護的目的，這將會為發(fā)展神經(jīng)退行性疾病的治療方法提供全新的思路和途徑。發(fā)明人新近克隆的GRAL基因正具有這一特性，因而具有開發(fā)為新的促神經(jīng)分化和抗凋亡藥物的前景。
多序列比對結果表明，該基因與已知的GDNF receptorα有一定的同源性(見圖2)。結果顯示，GRAL基因與已知的小鼠GDNFα1，α2，α3，α4在氨基酸水平的同源性分別為37％，39％，40％和35％。對該基因在多器官和組織的分布檢測表明，該基因的兩個剪接異構體主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(大腦和脊髓)中表達，并且在海馬、丘腦、黑質等部位表達水平較高(見圖3)。免疫熒光細胞化學實驗證明，GRAL基因的剪接異構體A定位在細胞膜上(見圖4)。穩(wěn)定轉染了GRAL的PC12細胞，在不加外來因子刺激的情況下，表現(xiàn)出一定的分化狀態(tài)，有接近百分之六十的細胞長出了達一倍胞體長的神經(jīng)突起，而沒有轉染的PC12細胞和轉染空載體的PC12細胞則基本保持在未分化狀態(tài)(見圖5)。由于穩(wěn)定轉染GRAL基因的PC12細胞是由單克隆衍生而來的，為了鑒別發(fā)明人所看到的分化現(xiàn)象是由轉染GRAL基因造成的，還是由于克隆之間初始分化狀態(tài)不同造成的，發(fā)明人篩選了非單克隆來源的PC12穩(wěn)定表達株，即用G418篩選兩周后即停止進一步篩選的細胞株。這種細胞也有部分表現(xiàn)出分化現(xiàn)象，雖然分化比例比單克隆來源的穩(wěn)定表達株低，但與對照相比還是有明顯差異(見圖6)，這說明PC12細胞的分化確實是由于轉染GRAL基因造成的。發(fā)明人又將已知的四種GDNF家族的配體作用于穩(wěn)定轉染GRAL基因的PC12細胞，發(fā)現(xiàn)分化比例和神經(jīng)突起的長度都沒有明顯改變，這說明已知的四種GDNF家族的配體并不能激活發(fā)明人轉染的GRAL基因(圖7)。因此，本發(fā)明在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物和促進神經(jīng)存活和分化方面與已知的神經(jīng)營養(yǎng)因子，如GDNF相比，具有極大的優(yōu)越性；另外，本發(fā)明的蛋白和多核苷酸還可用于抗細胞凋亡。
除了促神經(jīng)分化作用以外，我們還觀察到穩(wěn)定轉染的PC12細胞比對照更能抵抗血清饑餓。撤除血清兩天以后，穩(wěn)定轉染GRAL的PC12細胞與轉染空載體的PC12細胞相比，有更多的細胞存活(見圖8)。這些結果提示，GRAL基因編碼的蛋白具有類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，在體外能促進PC12細胞的分化和存活，而且其營養(yǎng)作用并不依賴于已知的GDNF家族配體，因此是一種潛在的以跨膜形式存在的神經(jīng)營養(yǎng)因子。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
部分實驗材料抗Flag抗體，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，熒光素二乙酸酯等，均購自美國Sigma公司(Sigma，St.Louis，MO)；GDNF，neurturin，persephin，artemin均購自英國PeproTech公司(London，UK)；TOTALLY RNA純化試劑盒(Ambion，Austin，TX，USA)，DMEM/F12(GIBCO，Invitrogen，USA)；胎牛血清(GIBCO，Invitrogen，USA)；小鼠腦mRNA和SMART RACE試劑盒購自Clontech公司(Clontech，CA，USA)，實施例1 小鼠GRAL基因的克隆用已知的小鼠GDNF receptor α的保守序列利用BLAST程序對小鼠基因組草圖數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)進行搜索，在小鼠6號染色體上找到了一個同源片段。以該同源片段序列為基礎，分別設計了5’端引物(P1)和3’端引物(P2)。小鼠腦mRNA經(jīng)過反轉錄成cDNA。以反轉錄所得cDNA為模板，采用擴增未知cDNA末端的方法RACE(RapidAmplification of cDNA Ends)，利用SMART RACE試劑盒，我們克隆到了小鼠全長基因。序列分析表明，該基因是一個全新的基因，其序列與已知的小鼠GDNF receptorα有一定的同源性(與四種GDNF receptorα的同源性介于35％到40％之間)，但是并不符合GDNF receptorα的全部序列特征。根據(jù)其序列特點，結合下面的功能實驗，我們將該基因命名為膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子α受體樣基因(glial cell line-derived neurotrophic factor receptor α-like gene，GRAL)。小鼠GRAL基因有兩個剪接異構體，其序列見圖1。
5’端引物(P1，SEQ NO5)為5’-CAT GGC TTG CTG TGA AGA GTT TCT TTG G-3’；3’端引物(P2，SEQ NO6)為5’-CAC TGC CAA GCA GCC ATA CGG TTC-3’。
實施例2 小鼠GRAL蛋白的表達和Western blot分析首先將全長小鼠GRAL基因(SEQ NO1)插入載體pcDNA3.1(Invitrogen)，轉化入大腸桿菌DH5α(GIBCO BRL)后大量抽提質粒，然后將質粒轉染入細胞，在細胞中表達得到小鼠GRAL-Flag的融合蛋白，兩天后收集細胞。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，加入裂解緩沖液(1xPBS，1％Nonidet P-40，0.5％ sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制劑cocktail)，用細胞刮將細胞刮下，冰上放置30分鐘，然后用細注射器抽吸裂解液，冰上放置30分鐘。4℃10,000g離心10分鐘。取上清。加入上樣緩沖液，95℃水浴5分鐘。經(jīng)SDS-PAGE電泳，然后電轉至硝酸纖維素膜，用TBST(1xTBS，0.05％Tween 20)漂洗，然后用含有5％脫脂奶粉的TBST孵育45分鐘，再在小鼠抗Flag抗體(IgG)中孵育45分鐘，TBST漂洗后再在辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗小鼠IgG中孵育45分鐘，漂洗后按照SuperSignalWest Pico ECLsystem操作曝光，顯影。Western blot分析表明，轉染pcDNA3.1-GRAL的CHO細胞裂解液有小鼠GRAL-Flag蛋白的表達，該產物分子量約為45kDa，與推算的理論值(44kDa)相符(圖4)。
實施例3 免疫熒光標記經(jīng)Flag-GRAL基因轉染后的細胞用常規(guī)方法固定，用PBST(PBS含0.01％tritonX-100)漂洗后在4％羊血清中孵育30分鐘，再用含1％羊血清的Flag抗體在4℃孵育48小時，再用PBST漂洗，然后與熒光素標記的二抗孵育，漂洗。用熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，照相(圖4)。實驗結果顯示，F(xiàn)lag-GRAL主要定位在細胞膜上，與基因結構分析的結果相符。

實施例4 半定量RT-PCR將成年小鼠處死并迅速分離所需各組織，在冰上勻漿并用Trizol試劑抽提總RNA。取1微克總RNA合成單鏈cDNA，反應體系為20微升，其中含有50mM隨機引物，50mM Tris-HCL，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，50mM DTT，0.75U RNasin，0.2mM dNTP，200U MMLV反轉錄酶。反應在37℃進行了一小時，然后于95℃加熱5分鐘終止反應。特異于GRAL的引物能擴增出1270和1018堿基長的DNA片段，分別對應于剪接異構體A和B。正向引物(P2，SEQ NO6)為5’-CACTGCCAAGCAGCCATACGGTTC-3’，反向引物(P3，SEQ NO7)為5’-TGGAGTAACCATTGACTTTTCTCAAACCAA-3’。
以水作模板的陰性PCR沒有擴出條帶，說明反應過程中沒有交叉污染。
PCR反應在Mastercycler Gradient PCR儀(德國Eppendorf)里進行，反應體系為20微升，含有1-3微升模板，25pmol引物，1.25U Taq聚合酶，和1xPCR反應緩沖液(0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2)。在PCR反應之前每個模板的GAPDH被調節(jié)成均一濃度。取20微升PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，然后用柯達數(shù)碼相機拍照。所有PCR產物用自動PCR測序儀測序。結果表明，GRAL基因的兩個剪接異構體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)表達，而在多種外周器官如心、肝、脾、肺、腎、胎盤、骨骼肌、小腸中缺如；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GRAL基因在海馬、黑質、丘腦、脊髓中豐度相對較高，而在皮層、紋狀體、小腦、嗅球中豐度較低(見圖3)。
實施例5 GRAL基因對PC12細胞分化作用的觀察利用脂質體轉染法將Flag-GRAL-pcDNA3.1轉入體外培養(yǎng)的PC12細胞，通過G418(200-800微克/毫升)的篩選去除那些未被轉染的細胞，從而獲得穩(wěn)定表達該基因的PC12細胞克隆。這樣的細胞克隆有三個，分別是10號，11號和18號。在不加外來因子刺激的情況下，它們均表現(xiàn)出一定的分化狀態(tài)，即有接近百分之六十的細胞長出了達一倍胞體長的神經(jīng)突起，而沒有轉染的PC12細胞和轉染空載體的PC12細胞則基本保持在未分化狀態(tài)(圖5)。在光學顯微鏡下，對擁有一倍胞體長神經(jīng)突起的細胞進行計數(shù)，計算它們在總細胞數(shù)中所占比例(圖5)。在部分實驗中，還篩選了非單克隆來源的PC12穩(wěn)定表達株，細胞計數(shù)的方法相同。
實施例6 GRAL基因對PC12細胞抗凋亡作用的觀察利用從體外培養(yǎng)實施例5中獲得的PC12細胞克隆18號進行該基因抗細胞凋亡的實驗。將培養(yǎng)基中所含的胎牛血清撤除以誘導細胞凋亡，兩天后將這些細胞用臺盼蘭或熒光素二乙酸酯染色，然后在光學顯微鏡下計數(shù)活細胞(即未被臺盼蘭染色的細胞或被熒光素二乙酸酯染色的細胞，這兩種方法相互獨立)，計算它們各自在總細胞數(shù)中所占比例(圖8)。我們觀察到穩(wěn)定轉染的PC12細胞比對照更能抵抗血清饑餓。撤除血清兩天以后，穩(wěn)定轉染GRAL的PC12細胞與轉染空載體的PC12細胞相比，有更多的細胞存活(見圖8)，這一效應在血清撤除后4天更明顯。這表明，GRAL基因能明顯增強PC12細胞的抗凋亡能力。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>一種促進神經(jīng)分化和抗細胞凋亡的蛋白質及其編碼基因<130>031118<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2123<212>DNA<213>小鼠(mouse)<220>
<221>CDS<222>(239)..(1420)<223>
<400>1actctcctga aaggataata tcctgggttc gcaagctgag gagaacaatt gaatttgaat 60acaattagga aagttcacag ctcaaaacaa actggtgagg aacagctgac accagaagct120gactctaatt ggctggctct taggaagcaa aacctttaca cagaaacttc agttgggatg180ttggttggtg tcagctcatc cgcctttctc ccagggagac catcttgagt tgtccaac 238atg cta gtg ttc att ttc ctg gct gtt acg tta agc tca gaa aat gaa 286Met Leu Val Phe Ile Phe Leu Ala Val Thr Leu Ser Ser Glu Asn Glu1 5 10 15tcc tct tcc cca aca aat gat tgt gca cat tta ata cag aaa tgc ttg 334Ser Ser Ser Pro Thr Asn Asp Cys Ala His Leu Ile Gln Lys Cys Leu20 25 30att gat gca aat ggc tgt gag cag tca tgg aga tca atg gaa gac acc 382Ile Asp Ala Asn Gly Cys Glu Gln Ser Trp Arg Ser Met Glu Asp Thr35 40 45tgc ctt act cca ggt gac tcc tgc aag ata aat aat tca cta cat tgt 430Cys Leu Thr Pro Gly Asp Ser Cys Lys Ile Asn Asn Ser Leu His Cys50 55 60aac ctg agt atc cag gct ttg gtg gaa aaa aat ttc caa ttt aaa gag 478Asn Leu Ser Ile Gln Ala Leu Val Glu Lys Asn Phe Gln Phe Lys Glu65 70 75 80tgt ctt tgt atg gat gac ctc cac tgt aca gta aac aaa ctt ttt gga 526Cys Leu Cys Met Asp Asp Leu His Cys Thr Val Asn Lys Leu Phe Gly85 90 95aaa aag tgc acc aat aag aca gat aac atg gaa aag gac aat aaa gat 574Lys Lys Cys Thr Asn Lys Thr Asp Asn Met Glu Lys Asp Asn Lys Asp100 105 110
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權利要求
1.一種分離的GRAL蛋白，其特征在于，含有選自下述的氨基酸序列(a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4氨基酸序列；(b)蛋白(a)的保守性變異蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物；(c)將SEQ ID NO2或SEQ ID NO4氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進神經(jīng)細胞分化和/或存活功能的由(a)衍生的蛋白；(d)具有促進神經(jīng)細胞分化和/或存活的功能，與蛋白(a)的序列具有50％，70％，80％，90％或95％同源性的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1或2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組(a)含有SEQ ID NO1中239-1420位的序列；(b)含有SEQ ID NO1中1-2123位的序列；(c)含有SEQ ID NO3中239-955位的序列；(d)含有SEQ ID NO3中1-1872位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3、4或5所述的多核苷酸。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的多核苷酸。
8.一種具有GRAL蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達GRAL蛋白的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有GRAL蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求1或2所述的GRAL蛋白特異性結合的抗體。
10.一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的GRAL蛋白、或權利要求3所述的多核苷酸，以及藥學上可接受的載體。
11.一種保健品，其特征在于，它含有權利要求1所述的GRAL蛋白、或權利要求3所述的多核苷酸。
12.一種篩選促進或抑制神經(jīng)細胞分化和/或存活的化合物的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將GRAL基因的cDNA裝入表達載體，轉染哺乳動物細胞株，制備表達GRAL蛋白的細胞株(b)向步驟(a)中的表達GRAL蛋白的細胞株培養(yǎng)液中加入測試化合物，檢測GRAL蛋白表達量的變化；促進GRAL蛋白表達量增加的化合物就是促進神經(jīng)細胞分化和/或存活的化合物，抑制GRAL蛋白表達量增加的化合物就是抑制神經(jīng)細胞分化和/或存活的化合物。
13.一種檢測試劑盒，其特征在于，它包括權利要求1所述的GRAL蛋白、或權利要求3所述的多核苷酸。
14.權利要求10所述組合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應用。
15.權利要求1所述的GRAL蛋白、或權利要求3所述的多核苷酸在抗細胞凋亡中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的促神經(jīng)分化和抗細胞凋亡的蛋白質—GRAL蛋白以及編碼GRAL蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還公開了GRAL蛋白及其多核苷酸的制法和用途。本發(fā)明還公開了此GRAL蛋白用于治療神經(jīng)退行性疾病的方法。本發(fā)明還提供了含GRAL蛋白的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK1544465SQ20031010879
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權日2003年11月21日
發(fā)明者周嘉偉, 李志華, 王冰薇 申請人:中國科學院上海生命科學研究院