專利名稱：一種新型促細(xì)胞凋亡素(apo)及其抗體，制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)專業(yè)領(lǐng)域，涉及一種新型促細(xì)胞凋亡素(Apoptoietin，簡稱為APO)的cDNA序列和氨基酸序列，以及該基因的功能信息，還涉及該新型促細(xì)胞凋亡素(APO)的抗體的制備及在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而治療腫瘤以及防止凋亡失控相關(guān)疾病如神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變方面的用途。
背景技術(shù)：
凋亡是程序性、正常的細(xì)胞死亡，是機(jī)體清除多余細(xì)胞的重要手段。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖、分化和衰老起著互補(bǔ)與平衡的作用，在多細(xì)胞動(dòng)物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持過程中至關(guān)重要。作為細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象，凋亡失控的結(jié)果將是嚴(yán)重的凋亡不足時(shí)，易發(fā)生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病而凋亡過量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合癥、重癥肝炎與退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病如老年性癡呆癥、帕金森氏癥等。
本發(fā)明的目的是提供一種新型促細(xì)胞凋亡素(APO)。該發(fā)明可作為臨床上全新的腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑，為癌癥患者提供新的治療途徑。
本發(fā)明以神經(jīng)突起誘向因子β-Netrin為誘餌，篩選4-6月孕齡的人胎腦cDNA文庫，共篩選到10個(gè)克隆與neuronatin的cDNA高度一致。其中的代表克隆JKY2290的cDNA序列為381個(gè)堿基。其氨基酸序列長度為126個(gè)氨基酸。通過BLAST分析，381個(gè)堿基的cDNA序列與人的neuronatin全程同源，但其編碼的126個(gè)氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中未查到同源序列。已知根據(jù)neuronatin cDNA序列預(yù)測(cè)產(chǎn)物有兩種，分別為neuronatin-α和neuronatin-β，將這三種產(chǎn)物比對(duì)后發(fā)現(xiàn)我們所篩到的氨基酸序列為一種全新的neuronatin編碼產(chǎn)物。
本發(fā)明以JKY2290為模板，將APO亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX4T-2中，在大腸桿菌中可通過異丙基-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，加入IPTG和不加入IPTG對(duì)細(xì)菌生長速率的影響是不同的，加入IPTG后誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，可對(duì)細(xì)菌生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。
本發(fā)明以JKY2290為模板，將APO亞克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，轉(zhuǎn)染真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞(COS7)，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，反映APO亞細(xì)胞定位的綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞中的定位發(fā)生明顯變化，最初在整個(gè)細(xì)胞漿中分布，后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并在核內(nèi)聚集。同時(shí)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(染色體聚集，核膜進(jìn)裂)。
本發(fā)明從以上結(jié)果對(duì)此基因的功能研究認(rèn)為，APO能夠?qū)е录?xì)胞的凋亡。該發(fā)明有可能尋找到新的腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，在臨床上腫瘤治療方面發(fā)揮作用。
本發(fā)明通過GOLDKEY軟件分析此氨基酸序列的抗原表位，選擇CVPSPEEHLARSVRGQ編碼肽段合成多肽，并通過碳化二亞胺法與BSA偶聯(lián)后作為免疫用抗原。取BSA偶聯(lián)多肽300μg作為抗原免疫Balb/c小鼠，按常規(guī)細(xì)胞融合方法制備單抗。所制備的抗體能夠特異識(shí)別新型促細(xì)胞凋亡素(APO)編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的抗體可與細(xì)胞內(nèi)的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)中和，用于防止凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)組織，避免不該發(fā)生的細(xì)胞凋亡。因此，可用于凋亡失控相關(guān)疾病如神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的防治與治療。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明所提供的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)具有如下cDNA序列CGGACTCCGAGACCAGCGGATCTCGGCAAACCCTCTTTCTCGACCACCCACCTACCATTCTTGGAACCATGGCGGCAGTGGCGGCGGCCTCGGCTGAACTGCTCATCATCGGCTGGTACATCTTCCGCGTGCTGCTGCAGGTGTTCAGGTACTCCCTGCAGAAGCTGGCATACACGGTGTCGCGGACCGGGCGGCAGGTGTTGGGGGAGCGCAGGCAGCGAGCCCCCAACTGAGGCCCCAGCTCCCAGCCCTGGGCGGCCGTATCATCAGGTGCTCCTGTGCATCTCGGCCAGCACGGGAGCCAGTGCCGCGCAGGAATGTGGG
GTCCCCTGTGTTCCCTCGCCAGAGGAGCACTTGGCAAGGTCAGTGAGGGGCCAGTAG2.本發(fā)明所提供的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)具有如下氨基酸序列RTPRPADLGKPSFSTTHLPFLEPWRQWRRPRLNCSSSAGTSSACCCRCSGTPCRSWHTRCRGPGGRCWGSAGSEPPTEAPAPSPGRPYHQVLLCISASTGASAAQECGVPCVPSPEEHLARSVRGQ3.本發(fā)明所提供的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)具有以下生物學(xué)特性在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白對(duì)細(xì)菌的生長具有明顯的抑制作用，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白能夠?qū)е录?xì)胞的凋亡。
4.本發(fā)明所提供的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)抗體的制備方法1)抗原的制備合成多肽CVPSPEEHLARSVRGQ，用碳化二亞胺法與BSA偶聯(lián)，偶聯(lián)產(chǎn)物作為抗原。
2)抗體的制備將1)中制備的抗原免疫Balb/c小鼠，通過傳統(tǒng)的細(xì)胞融合方法制備單克隆抗體。
3)抗體的純化將2)中所得的單克隆抗體經(jīng)離心、沉淀、脫鹽、得粗提抗體，然后經(jīng)親和純化，即得純化抗體。
4)鑒定抗體的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。
5.本發(fā)明所提供的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)在促腫瘤細(xì)胞凋亡及腫瘤治療中的用途。
6.本發(fā)明所提供的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)抗體用于防止正常細(xì)胞凋亡，從而可用于凋亡相關(guān)疾病如神經(jīng)退行性病變的治療。


圖1新型促細(xì)胞凋亡素(APO)的cDNA序列圖2新型促細(xì)胞凋亡素(APO)的氨基酸序列圖3新型促細(xì)胞凋亡素(APO)cDNA序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫全序列相似性比較結(jié)果圖410個(gè)克隆編碼產(chǎn)物的序列比對(duì)結(jié)果。藍(lán)色代表一致的氨基酸殘基，前部分一致的序列為載體編碼序列圖5IPTG誘導(dǎo)后的生長曲線。新型促細(xì)胞凋亡素(APO)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用。具體地說，生長速率比較結(jié)果為0mM＞0.1mM＞0.5mM IPTG。
圖6不同時(shí)間綠色熒光定位變化。具體地說，用pEGFP-N1空載體和pEGFP-N1/APO載體分別轉(zhuǎn)染真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，不同時(shí)間觀察綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的定位變化?？蛰d體轉(zhuǎn)染后，隨時(shí)間增加定位無變化，熒光在全細(xì)胞內(nèi)均勻分布。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，融合蛋白的綠色熒光在細(xì)胞中的定位發(fā)生明顯變化，最初在整個(gè)細(xì)胞漿中分布，后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并在核內(nèi)聚集。同時(shí)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
圖7DAPI染色確定被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)。具體地說，能看到綠色熒光的細(xì)胞已轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/APO載體。同時(shí)，通過4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色可觀察到細(xì)胞核凝集，核膜進(jìn)裂。而沒有熒光的細(xì)胞仍保持細(xì)胞核的完整性。
圖8Western blot結(jié)果。通過Western blot檢測(cè)抗體的特異性，所用抗原為原核表達(dá)蛋白，分子量為37KD。不同的雜交瘤細(xì)胞株制備的腹水(2B2，2F8)檢測(cè)到同一特異條帶。
圖9小鼠腦石蠟切片免疫組化結(jié)果。用所制備的單克隆抗體能與細(xì)胞內(nèi)的蛋白特異識(shí)別，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色能看到陽性細(xì)胞染色。
具體實(shí)施例方式
1.將腺病毒載體與新型促細(xì)胞凋亡素(APO)在原核細(xì)胞(E.coli)中同源重組，獲得腺病毒載體與新型促細(xì)胞凋亡素(APO)構(gòu)建的基因重組藥物。使用基因重組藥物，可制備成臨床級(jí)基因治療制品，作為臨床上新的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)劑，用于癌癥的治療。
2.本發(fā)明所提供的抗體可制備成抗體藥物，可與細(xì)胞內(nèi)的新型促細(xì)胞凋亡素(APO)中和，用于防止凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)組織，避免錯(cuò)誤的細(xì)胞凋亡。臨床上可用于治療凋亡失控相關(guān)疾病如退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病(老年性癡呆癥、帕金森氏癥等)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明所提供的新型促細(xì)胞凋亡素Apoptoietin(APO)具有如下cDNA序列CGGACTCCGAGACCAGCGGATCTCGGCAAACCCTCTTTCTCGACCACCCACCTACCATTCTTGGAACCATGGCGGCAGTGGCGGCGGCCTCGGCTGAACTGCTCATCATCGGCTGGTACATCTTCCGCGTGCTGCTGCAGGTGTTCAGGTACTCCCTGCAGAAGCTGGCATACACGGTGTCGCGGACCGGGCGGCAGGTGTTGGGGGAGCGCAGGCAGCGAGCCCCCAACTGAGGCCCCAGCTCCCAGCCCTGGGCGGCCGTATCATCAGGTGCTCCTGTGCATCTCGGCCAGCACGGGAGCCAGTGCCGCGCAGGAATGTGGGGTCCCCTGTGTTCCCTCGCCAGAGGAGCACTTGGCAAGGTCAGTGAGGGGCCAGTAG
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型促細(xì)胞凋亡素APO具有如下氨基酸序列RTPRPADLGKPSFSTTHLPFLEPWRQWRRPRLNCSSSAGTSSACCCRCSGTPCRSWHTRCRGPGGRCWGSAGSEPPTEAPAPSPGRPYHQVLLCISASTGASAAQECGVPCVPSPEEHLARSVRGQ
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型促細(xì)胞凋亡素APO具有以下生物學(xué)特性在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白對(duì)細(xì)菌的生長具有明顯的抑制作用，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白能夠?qū)е录?xì)胞的凋亡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗新型促細(xì)胞凋亡素APO抗體的制備方法1)抗原的制備合成多肽CVPSPEEHLARSVRGQ，用碳化二亞胺法與BSA偶聯(lián)，偶聯(lián)產(chǎn)物作為抗原。2)抗體的制備將1)中制備的抗原免疫Balb/c小鼠，通過傳統(tǒng)的細(xì)胞融合方法制備單克隆抗體，同時(shí)免疫家兔制備多克隆抗體。3)抗體的純化將2)中所得的單克隆抗體經(jīng)離心、沉淀、脫鹽、得粗提抗體，然后經(jīng)親和純化，即得純化抗體。4)鑒定抗體的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型促細(xì)胞凋亡素APO在促腫瘤細(xì)胞凋亡及腫瘤治療中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型促細(xì)胞凋亡素APO抗體用于防止正常細(xì)胞凋亡，從而可用于凋亡相關(guān)疾病如神經(jīng)退行性病變的治療。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型促細(xì)胞凋亡素(APO)的cDNA序列、其所編碼的氨基酸序列及其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能及用途，并提供了其抗體的制備方法及用途。其cDNA序列為381個(gè)堿基。其氨基酸序列長度為126個(gè)氨基酸。此cDNA序列在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白對(duì)細(xì)菌的生長具有明顯的抑制作用，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白能夠?qū)е录?xì)胞的凋亡。因此，此cDNA序列編碼的多肽分子在臨床上可作為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而治療腫瘤的誘導(dǎo)劑，在腫瘤分化誘導(dǎo)治療方面發(fā)揮作用。通過分析其氨基酸序列確定抗原表位，合成多肽制備單克隆抗體，蛋白印記技術(shù)顯示此單抗可與該新型促細(xì)胞凋亡素(APO)特異識(shí)別。因此，此單抗可能用于防止正常細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)正常組織，避免錯(cuò)誤的細(xì)胞凋亡。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1673369SQ200410029588
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者張成崗, 余利紅, 王利紅, 高艷, 孫志賢 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所