專利名稱：：治療腸梗阻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療胃腸道疾病。
背景技術(shù)：
：一氧化碳(CO)氣體在高濃度時(shí)是有毒的。然而，現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到它是一種重要的信號(hào)分子(Verma等，Science259381-384，1993)。已有提示表明一氧化碳作為腦內(nèi)的神經(jīng)元信使分子(Id.)和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子起作用(Pozzoli等.，Endocrinology7352314-2317，1994)。和一氧化氮(NO)一樣，一氧化碳是平滑肌的松弛劑(Utz等，BiochemPharmacol.47195-201，1991；Christodoulides等，Circulation972306-9，1995)并且抑制血小板的聚集(Mansouri等，ThrombHaemost.48286-8，1982)。在一些模型中，吸入低水平的一氧化碳顯示具有抗炎效果。腸梗阻(ileus)是一種特征為缺乏腸運(yùn)動(dòng)性的疾病，并且是腸阻塞(obstruction)的一種更常見的形式(見，例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。通常，腸梗阻見于整個(gè)腸道(例如大腸和小腸)，但有時(shí)只涉及腸道的一個(gè)或多個(gè)節(jié)段。腹部手術(shù)過(guò)程中的腸操作經(jīng)常導(dǎo)致腸梗阻。已經(jīng)提出了多種治療腸梗阻的藥物方法(見例如，美國(guó)專利5,362,756(非多托嗪(fedotozine))；5,929,035(神經(jīng)肽)；6,214,843(pyrazolopyridine)；和5,958,407(例如拮抗型蛋白酶活化的受體-2))。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)給藥CO可減輕腸梗阻。相應(yīng)地，一方面本發(fā)明涉及治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有或可能患腸梗阻的患者，以及給藥該患者包含有效量或濃度的一氧化碳的藥物組合物。腸梗阻可以是胃腸道任何部分的腸梗阻，例如胃，小腸和/或結(jié)腸。腸梗阻可以由任何導(dǎo)致腸梗阻的因素引起，例如腹部手術(shù)如移植手術(shù)(例如小腸移植(SITx))或除移植手術(shù)以外的腹部手術(shù)(即涉及剖腹術(shù)和不涉及剖腹術(shù)的腹部手術(shù)，例如腹腔鏡手術(shù))，矯形手術(shù)(例如髖部手術(shù))；分娩；腸缺血；腹膜后血腫，腹腔內(nèi)膿毒癥；腹膜內(nèi)炎癥，例如急性闌尾炎，膽囊炎(choecystitis)，胰腺炎；脊柱骨折；輸尿管絞痛；胸部損傷；基底肺炎(basalpneumonia)；肋骨骨折；心肌梗死；代謝障礙；或者這些疾病的任何組合。藥物組合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何將氣體，液體和/或固體給藥患者的方法給藥患者，例如通過(guò)吸入，吹入，輸注，注射，和/或攝取。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物通過(guò)吸入給藥患者。在另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物通過(guò)口服給藥患者。在另一實(shí)施方案中，將所述藥物組合物直接給藥患者的腹腔。所述方法還可包括給藥所述患者除CO以外的以下治療中的至少一種在患者體內(nèi)誘導(dǎo)HO-1或鐵蛋白；在患者體內(nèi)表達(dá)重組HO-1或鐵蛋白；以及將包含HO-1，膽紅素，膽綠素，鐵蛋白，去鐵敏(desferoxamine)，鐵葡聚糖，或去鐵鐵蛋白的藥物組合物給藥該患者。本發(fā)明另一方面涉及治療患者的手術(shù)后腸梗阻的方法。所述方法包括鑒定患有術(shù)后腸梗阻的患者，并將包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥該患者。所述腸梗阻可以是胃腸道的任何一部分，例如，胃，小腸，和/或大腸(例如結(jié)腸)的腸梗阻。所述藥物組合物可通過(guò)本文所述的任何途徑給藥患者，例如通過(guò)吸入(氣體組合物)；口服；和/或直接給藥至患者的腹腔。本發(fā)明還涉及治療患者的腸梗阻的方法，所述患者患有或可能患不是由腹部手術(shù)造成的腸梗阻，例如由本文所述的除腹部手術(shù)以外的任何因素造成的腸梗阻。該方法包括鑒定患有或可能患不是由腹部手術(shù)造成的腸梗阻的患者，以及給藥該患者包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物。本發(fā)明另一方面涉及治療患者的腸梗阻的方法，其包括以下步驟提供包含含有一氧化碳?xì)怏w的加壓氣體的容器，鑒定患有或可能患腸梗阻的患者，將加壓氣體從所述容器中釋放出來(lái)以形成包含一氧化碳?xì)怏w的環(huán)境，以及將所述患者暴露于該環(huán)境，所述環(huán)境中一氧化碳的量足以治療患者的腸梗阻。本發(fā)明另一方面涉及對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)的方法。所述方法包括鑒定需要手術(shù)的患者，并且在進(jìn)行手術(shù)之前，期間和/或以后使患者吸入足以治療患者腸梗阻的量的一氧化碳?xì)怏w。所述手術(shù)可以是任何導(dǎo)致和/或使患者可能患腸梗阻的手術(shù)。例如，所述手術(shù)可涉及對(duì)例如胃和/或腸，例如小腸或大腸(例如結(jié)腸)的胃腸道的操作(例如，接觸(直接或間接))，還可以是涉及剖腹術(shù)或不涉及剖腹術(shù)(例如涉及腹腔鏡的手術(shù))的手術(shù)。在特定的實(shí)施方案中，所述手術(shù)可以是移植手術(shù)或非移植手術(shù)，例如涉及腹部的任何器官或組織的手術(shù)，例如泌尿生殖系統(tǒng)(例如腎，輸尿管，和/或膀胱；和生殖器官(例如子宮，卵巢，和/或輸卵管))；消化系統(tǒng)(例如，胃，小腸，大腸(例如結(jié)腸)，闌尾，膀胱，肝，脾，和/或胰腺)；淋巴系統(tǒng)；呼吸系統(tǒng)(例如肺)；膈；治療腹腔內(nèi)任何器官或組織的癌癥的手術(shù)；子宮內(nèi)膜手術(shù)；和矯形手術(shù)，例如髖部手術(shù)。另一方面，本發(fā)明提供了包含醫(yī)用級(jí)壓縮CO氣體的容器。所述容器帶有表明該氣體可用來(lái)治療腸梗阻的標(biāo)簽，例如患者(例如人類患者)體內(nèi)的手術(shù)造成的腸梗阻(例如涉及腸操作的手術(shù))。CO氣體可以與氮?dú)饣旌?，與一氧化氮和氮?dú)饣旌?，或者與含氧的氣體混合。CO氣體在混合物中的濃度可以是至少約0.025％，例如至少約0.05％，0.10％，0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。本發(fā)明另一方面提供了治療患者的腸梗阻的方法，該方法包括鑒定患有或可能患腸梗阻的患者，以及給予所述患者以下治療中的任何一種和CO治療的聯(lián)合治療誘導(dǎo)患者體內(nèi)的HO-1或鐵蛋白；在患者體內(nèi)表達(dá)重組HO-1或鐵蛋白；以及將包含HO-1，膽紅素，膽綠素，鐵蛋白或去鐵鐵蛋白的藥物組合物給藥所述患者。還涉及CO以及以上列出的任何一種藥劑在制備治療或預(yù)防腸梗阻的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及CO在制備治療或預(yù)防本文所述的疾病例如腸梗阻的藥物中的用途。所述藥物也可用在治療患者的腸梗阻和/或治療移植手術(shù)中的供體，器官，和/或受體的方法中。所述藥物可以是本文所述的任何形式，例如液體或氣體CO組合物。除非另有限定，本文的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有的含義和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員通常所理解的一樣。適宜的方法和材料在下文中描述，但與其類似或?qū)Φ鹊姆椒ê筒牧弦部捎糜诒景l(fā)明的實(shí)踐和檢測(cè)中。所有公開出版物，專利申請(qǐng)，專利，和其它本文提到的參考文件的全文內(nèi)容都包含在本文中作為參考。如果有沖突，以本說(shuō)明書，包括其中的定義在內(nèi)為準(zhǔn)。所述材料，方法和實(shí)施例只作為舉例，而不是意圖作為限制。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在附圖和以下說(shuō)明中詳述。本發(fā)明的其它特征，目的，和優(yōu)點(diǎn)從說(shuō)明書和附圖，以及權(quán)利要求書中明顯可見。圖1是線圖，顯示了小腸移植(SITx)以及CO處理對(duì)自發(fā)的和氨甲酰甲膽堿刺激的小腸環(huán)肌的收縮性的影響?！綄?duì)照；◇＝對(duì)照+CO；X＝SITx；■＝SITx+CO。圖2A是柱圖，其顯示CO對(duì)對(duì)照動(dòng)物(未接受SITx的動(dòng)物)的腸轉(zhuǎn)運(yùn)(intestinaltransit)的影響。實(shí)心柱＝對(duì)照；條紋柱＝對(duì)照+CO(250ppm)；stom＝胃；sb＝小腸。圖2B是柱圖，顯示CO對(duì)經(jīng)過(guò)SITx的動(dòng)物的腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)心柱＝對(duì)照；條紋柱＝對(duì)照+CO(250ppm)；stom＝胃；sb＝小腸；和col＝結(jié)腸。圖2C是柱圖，顯示了CO顯著改善經(jīng)過(guò)SITx的大鼠中的腸轉(zhuǎn)運(yùn)。該圖總結(jié)了算出的轉(zhuǎn)運(yùn)幾何中心的大小(calculatedtransitgeometriccentermeasurement)。對(duì)照＝暴露于空氣的對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；SITx＝接受SITx并暴露于空氣的動(dòng)物；SITx+CO＝接受SITx并暴露于CO的動(dòng)物。圖3是柱圖，顯示SITx之后，CO對(duì)白細(xì)胞募集到腸肌層的影響。對(duì)照＝暴露于空氣的對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；SbTx＝接受SITx并暴露于空氣的動(dòng)物；SbTx+CO＝接受SITx并暴露于CO的動(dòng)物。圖4A是線圖，顯示SITx之后的各時(shí)間點(diǎn)粘膜和肌層中IL-6mRNA的表達(dá)，所述表達(dá)是通過(guò)RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的。■＝肌肉；○＝粘膜。圖4B是線圖，顯示SITx之后的各時(shí)間點(diǎn)粘膜和肌層中IL-1βmRNA的表達(dá)，所述表達(dá)是通過(guò)RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的。■＝肌肉；○＝粘膜。圖5是一組柱圖，顯示CO對(duì)再灌注后四小時(shí)的腸移植物肌外層中一氧化氮合酶(iNOS)，IL-6，IL-1β和IL-10的表達(dá)的作用，其是通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR分析測(cè)定的。正常＝暴露于空氣的對(duì)照動(dòng)物；正常+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；SITx＝接受SITx并暴露于空氣的動(dòng)物；SITx+CO＝接受SITx并暴露于CO的動(dòng)物。圖6是一組柱圖，顯示再灌注后一小時(shí)(SITx+CO(1hr)和四小時(shí)(SITx+CO(4hr))，CO對(duì)經(jīng)受SITx的動(dòng)物的血清中IL-6和硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度的影響。正常＝暴露于空氣的對(duì)照動(dòng)物；正常+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；SITx(1hr)和SITx(4hr)＝分別是再灌注后一小時(shí)和四小時(shí)測(cè)定的、經(jīng)受SITx的動(dòng)物。圖7A是柱圖，顯示使用實(shí)時(shí)兩步RT-PCR分析測(cè)定的腸操作(IM)對(duì)肌層提取物中的HO-1表達(dá)的影響。在剖腹術(shù)后3小時(shí)(IM3h)，6小時(shí)(IM6h)，12小時(shí)(IM12h)，和24小時(shí)(IM24h)分析樣品。術(shù)后3-6小時(shí)出現(xiàn)了峰值HO-1表達(dá)。數(shù)據(jù)代表相對(duì)于對(duì)照±SEM的平均倍數(shù)增長(zhǎng)，n＝6。*P＝0.001；**P＝0.0001。圖7B是肌層整體封裝(musculariswholemount)的圖，顯示IM以后浸潤(rùn)肌層的多形核白細(xì)胞中的HO-1樣免疫反應(yīng)性。圖7C是肌層整體封裝的圖，顯示IM以后浸潤(rùn)肌層的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中的HO-1樣免疫反應(yīng)性。圖7D是肌層整體封裝的圖，顯示IM以后浸潤(rùn)肌層的含顆粒細(xì)胞中的HO-1樣免疫反應(yīng)性。圖像下半部分的模糊的免疫熒光位點(diǎn)是焦點(diǎn)平面以下的細(xì)胞。圖7E是肌層整體封裝的圖，顯示對(duì)照動(dòng)物的肌層中HO-1樣免疫反應(yīng)性的缺乏。圖8A是柱圖，顯示吸入的CO(暴露24小時(shí))對(duì)沒有接受IM的小鼠的腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。stom＝胃；sb＝小腸；和col＝結(jié)腸。實(shí)心柱＝?jīng)]有暴露于CO的動(dòng)物；條紋柱＝暴露于CO的動(dòng)物。大多數(shù)熒光信號(hào)位于盲腸和近段結(jié)腸中。圖8B是柱圖，顯示吸入的CO(暴露24小時(shí))對(duì)接受IM的小鼠的腸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。stom＝胃；sb＝小腸；和col＝結(jié)腸。實(shí)心柱＝?jīng)]有暴露于CO的動(dòng)物；條紋柱＝暴露于CO的動(dòng)物。IM以后，轉(zhuǎn)運(yùn)被明顯延遲。吸入CO導(dǎo)致標(biāo)記的葡聚糖的更遠(yuǎn)側(cè)的分布(IM-CO)。圖8C是柱圖，顯示幾何中心(GeometricCenter)(GC)計(jì)算的結(jié)果。數(shù)字越高對(duì)應(yīng)標(biāo)記葡聚糖的更遠(yuǎn)側(cè)的分布。對(duì)照＝對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；IM＝接受IM的動(dòng)物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動(dòng)物。與對(duì)照相比，*IM組中的GC顯著降低，P＜0.0001；n＝6。+吸入CO(IM+CO)導(dǎo)致與IM相比，GC明顯升高，P＝0.001；n＝6。圖9A是代表性的圖形(trace)，顯示CO對(duì)自發(fā)收縮活動(dòng)的影響。對(duì)照未接受手術(shù)的小鼠的節(jié)律性收縮。對(duì)照+CO對(duì)照小鼠吸入一氧化碳(CO)24小時(shí)，對(duì)自發(fā)收縮性沒有影響。IM對(duì)小腸進(jìn)行手術(shù)操作后，節(jié)律性收縮性消失。IM+CO接受操作的動(dòng)物經(jīng)CO處理后，節(jié)律性恢復(fù)。圖9B是線圖(劑量-反應(yīng)曲線)，顯示CO對(duì)沒有接受IM的動(dòng)物的環(huán)形平滑肌帶(strip)的強(qiáng)直性收縮的強(qiáng)度的影響。所述收縮是通過(guò)將所述肌帶暴露于濃度漸增的氨甲酰甲膽堿(0.1-300μmol/L)誘導(dǎo)的。對(duì)照動(dòng)物吸入CO對(duì)氨甲酰甲膽堿誘導(dǎo)的收縮活性沒有影響。■＝對(duì)照；▲＝對(duì)照+CO。圖9C是線圖(劑量-反應(yīng)曲線)，顯示CO對(duì)接受IM的動(dòng)物的環(huán)肌帶(strip)的強(qiáng)直性收縮的強(qiáng)度的影響。所述收縮是通過(guò)將所述肌帶暴露于濃度漸增的氨甲酰甲膽堿(0.1-300μmol/L)誘導(dǎo)的。環(huán)肌對(duì)氨甲酰甲膽堿反應(yīng)而收縮的能力在IM后明顯被削弱。CO的吸入將收縮活性恢復(fù)到對(duì)照水平(IM+CO)?！觯絀M；▲＝IM+CO。圖10是柱圖，顯示CO的吸入對(duì)浸潤(rùn)對(duì)照小鼠和腸操作(IM)之后的小鼠的腸肌層的髓過(guò)氧化物酶(MPO)陽(yáng)性白細(xì)胞的數(shù)目的影響。對(duì)照＝對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；IM＝接受IM的動(dòng)物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*P＜0.0001；n＝4。圖11A是柱圖，顯示手術(shù)麻醉和IM對(duì)IL-6mRNA表達(dá)的時(shí)間過(guò)程的影響，用實(shí)時(shí)兩步RT-PCR進(jìn)行分析的結(jié)果。在3小時(shí)(IM3h)，6小時(shí)(IM6h)，12小時(shí)(IM12h)，和24小時(shí)(IM24h)分析樣品。表達(dá)在術(shù)后3和6小時(shí)達(dá)到峰值。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P＜0.0001。圖11B是柱圖，顯示CO吸入對(duì)術(shù)后3小時(shí)(IM+CO3hr)和6小時(shí)(IM+CO6hr)的IL-6mRNA的表達(dá)的影響。IM3hr和IM6hr＝3小時(shí)和6小時(shí)的IM對(duì)照動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。圖11C是柱圖，顯示CO吸入對(duì)IL-6蛋白從術(shù)后24小時(shí)采集的肌層提取物中的釋放的影響。IL-6蛋白的釋放被CO吸入明顯降低。對(duì)照＝對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；IM＝接受IM的動(dòng)物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P＜0.0001，且相對(duì)于IM+P＝0.001；n＝6。圖12A是柱圖，顯示手術(shù)麻醉和IM對(duì)IL-1βmRNA表達(dá)的時(shí)間過(guò)程的影響，用實(shí)時(shí)兩步RT-PCR進(jìn)行分析的結(jié)果。在3小時(shí)(IM3h)，6小時(shí)(IM6h)，12小時(shí)(IM12h)，和24小時(shí)(IM24h)分析樣品。表達(dá)在術(shù)后6小時(shí)達(dá)到峰值。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。圖12B是柱圖，顯示CO吸入對(duì)術(shù)后3小時(shí)(IM+CO3hr)和6小時(shí)(IM+CO6hr)的IL-1βmRNA的表達(dá)的影響。CO顯著抑制峰值IL-1βmRNA表達(dá)。IM3hr和IM6hr＝3小時(shí)和6小時(shí)的IM對(duì)照動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*P＝0.001對(duì)IM小時(shí)，n＝6。圖12C是柱圖，顯示CO吸入對(duì)IL-1β蛋白從術(shù)后24小時(shí)采集的肌層提取物中的釋放的影響。IL-1β蛋白釋放由于CO吸入明顯降低。對(duì)照＝對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；IM＝接受IM的動(dòng)物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。ND＝未檢測(cè)到。*相對(duì)于對(duì)照P＝0.0001，相對(duì)于IM+P＝0.001；n＝6。圖13A是柱圖，顯示手術(shù)麻醉和IM對(duì)iNOSmRNA表達(dá)的時(shí)間過(guò)程的影響，用實(shí)時(shí)兩步RT-PCR進(jìn)行分析的結(jié)果。在3小時(shí)(IM3h)，6小時(shí)(IM6h)，12小時(shí)(IM12h)，和24小時(shí)(IM24h)分析樣品。術(shù)后6小時(shí)出現(xiàn)峰值表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。圖13B是柱圖，顯示CO吸入對(duì)術(shù)后3小時(shí)(IM+CO3hr)和6小時(shí)(IM+CO6hr)的iNOSmRNA的表達(dá)的影響。IM3hr和IM6hr＝3小時(shí)和6小時(shí)的IM對(duì)照動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。+P＝0.001對(duì)IM6小時(shí)，n＝6。圖13C是柱圖，顯示CO吸入對(duì)總亞硝酸鹽從術(shù)后24小時(shí)采集的肌層提取物中的釋放的影響?？倎喯跛猁}的釋放被認(rèn)為是iNOS活性的標(biāo)志。吸入CO明顯抑制手術(shù)誘導(dǎo)的亞硝酸鹽從被操作肌層中的釋放的增加。亞硝酸鹽的類似降低也可通過(guò)在存在選擇性iNOS抑制物L(fēng)-Nil(30μM；IM+L-Nil)的條件下，通過(guò)保溫肌層提取物實(shí)現(xiàn)。對(duì)照＝對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；IM＝接受IM的動(dòng)物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動(dòng)物。*相對(duì)于對(duì)照P＝0.0001，相對(duì)于IM+P＝0.001；n＝6。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。圖14A是柱圖，顯示手術(shù)麻醉和IM對(duì)COX-2mRNA表達(dá)的時(shí)間過(guò)程的影響，用實(shí)時(shí)兩步RT-PCR進(jìn)行分析的結(jié)果。在3小時(shí)(IM3h)，6小時(shí)(IM6h)，12小時(shí)(IM12h)，和24小時(shí)(IM24h)分析樣品。術(shù)后3-12小時(shí)出現(xiàn)峰值表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P＝0.001和**P＜0.0001，n＝6。圖14B是柱圖，顯示CO吸入對(duì)術(shù)后3小時(shí)(IM+CO3hr)和6小時(shí)(IM+CO6hr)的COX-2mRNA的表達(dá)的影響。IM3hr和IM6hr＝3小時(shí)和6小時(shí)的IM對(duì)照動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。圖14C是柱圖，顯示對(duì)照動(dòng)物吸入CO顯著增加處理后3小時(shí)(CO3hr)的COX-2mRNA的表達(dá)。CO6hr＝處理后6小時(shí)的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*P＝0.01。圖14D是柱圖，顯示CO吸入對(duì)PGE2蛋白從術(shù)后24小時(shí)采集的肌層提取物中的釋放的影響。PGE2蛋白的釋放被認(rèn)為是COX-2活性的標(biāo)志。吸入CO明顯增加蛋白從對(duì)照肌層中的釋放，但對(duì)手術(shù)誘導(dǎo)的PGE2從操作的肌層中的釋放增加沒有影響。對(duì)照＝對(duì)照動(dòng)物；對(duì)照+CO＝暴露于CO的對(duì)照動(dòng)物；IM＝接受IM的動(dòng)物；IM+CO＝接受IM并暴露于CO的動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P＝0.01且**P＝0.0001；n＝6。圖15A是柱圖，顯示手術(shù)麻醉和IM對(duì)IL-10mRNA表達(dá)的時(shí)間過(guò)程的影響，用實(shí)時(shí)兩步RT-PCR進(jìn)行分析的結(jié)果。在3(IM3h)，6(IM6h)，12(IM12h)，和24(IM24h)小時(shí)分析樣品。術(shù)后3-6小時(shí)出現(xiàn)峰值表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P≤0.001，n＝6。圖15B是柱圖，顯示CO吸入對(duì)術(shù)后3小時(shí)(IM+CO3hr)和6小時(shí)(IM+CO6hr)的IL-10mRNA的表達(dá)的影響。吸入CO增加手術(shù)后3小時(shí)的IL-10信息(message)，但不增加手術(shù)后6小時(shí)的IL-10信息。IM3hr和IM6hr＝3小時(shí)和6小時(shí)的IM對(duì)照動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。+p＝0.001相對(duì)于IM3小時(shí)；n＝6。圖15C是柱圖，顯示對(duì)照動(dòng)物吸入CO明顯增加處理后3小時(shí)(CO3hr)和6小時(shí)(CO6h)的IL-10mRNA的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。*相對(duì)于對(duì)照P≤0.001，n＝6。圖16A是柱圖，顯示在手術(shù)(IM)后3小時(shí)和6小時(shí)，對(duì)手術(shù)麻醉和IM對(duì)HO-1mRNA表達(dá)的時(shí)間過(guò)程的影響進(jìn)行實(shí)時(shí)兩步RT-PCR分析的結(jié)果。吸入CO明顯增加術(shù)后3小時(shí)(IM+CO3hr)的HO-1mRNA的表達(dá)，但不增加術(shù)后6(IM+CO6hr)小時(shí)的HO-1mRNA的表達(dá)。IM3hr和IM6hr＝3小時(shí)和6小時(shí)的IM對(duì)照動(dòng)物。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。+p＜0.001對(duì)IM3hr；n＝6。圖16B是柱圖，顯示對(duì)照動(dòng)物吸入CO對(duì)處理后3小時(shí)(CO3hr)和6小時(shí)(CO6h)的HO-1mRNA的表達(dá)的影響。對(duì)照動(dòng)物吸入CO增加處理后6小時(shí)的HO-1mRNA的表達(dá)。*相對(duì)于對(duì)照P＜0.05，n＝6。發(fā)明詳述本文術(shù)語(yǔ)“一氧化碳”(或“CO”)描述了氣態(tài)的，加壓成液態(tài)的，或者溶解于水溶液中的分子一氧化碳。本文術(shù)語(yǔ)“一氧化碳組合物″或“包含一氧化碳的藥物組合物”用于描述可給藥患者和/或器官例如小腸的、含有一氧化碳的氣體或液體組合物。熟練醫(yī)師知道在具體應(yīng)用中，優(yōu)選何種形式的藥物組合物，例如氣體，液體，或氣體和液體的形式。本文術(shù)語(yǔ)“有效量”和“有效地治療”指一段時(shí)間內(nèi)(包括急性或慢性給藥以及定期的或連續(xù)的給藥)給藥一定量或濃度的一氧化碳，所述量或濃度在其給藥用來(lái)產(chǎn)生目的效果或生理結(jié)果的背景下是有效的。本發(fā)明所用有效量的一氧化碳包括例如防止或減輕諸如小腸移植等手術(shù)后的腸梗阻的量。在氣體的情況下，有效量的CO通常在約0.0000001％到約0.3％重量之間，例如0.0001％到約0.25％重量，優(yōu)選CO重量至少約0.001％，例如至少約0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％。在CO溶液的情況下，有效量通常在約0.0001到約0.0044gCO/100g溶液，例如至少約0.0001，0.0002，0.0004，0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020.0.0021，0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或0.0042gCO/100g水溶液。優(yōu)選的范圍包括，例如約0.0010到約0.0030gCO/100g液體，約0.0015到約0.0026gCO/100g液體，或者約0.0018到約0.0024gCO/100g液體。熟練的醫(yī)師應(yīng)理解根據(jù)應(yīng)用的情況可使用這些范圍外的量。本文術(shù)語(yǔ)“患者”描述根據(jù)本發(fā)明提供的方法對(duì)其進(jìn)行治療的動(dòng)物，人或非人。本發(fā)明明確涉及獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于哺乳動(dòng)物，例如人，其它靈長(zhǎng)類，豬，嚙齒類例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，倉(cāng)鼠，牛，馬，貓，狗，綿羊和山羊。本文術(shù)語(yǔ)“治療”是指延緩病情的發(fā)生，抑制，預(yù)防或緩解疾病的影響，所述疾病例如腸梗阻。術(shù)語(yǔ)“供體”或“供體患者”用于文中指患者(人或非人)，從該患者可以獲得器官或組織用于移植到受體患者。術(shù)語(yǔ)“受體”或“受體患者”指器官或組織被轉(zhuǎn)移至其中的患者(人或非人)。本文術(shù)語(yǔ)“腸梗阻”通常指胃腸道的部分或完全麻痹或運(yùn)動(dòng)障礙。腸梗阻可以出現(xiàn)在整個(gè)胃腸道，或者可以只涉及胃腸道的一個(gè)或幾個(gè)部分，例如，胃，小腸或結(jié)腸。熟練的醫(yī)師將理解腸梗阻可以由很多因素造成，包括，例如手術(shù)(例如任何涉及剖腹術(shù)的手術(shù))，例如小腸移植(SITx)；或者任何涉及腹腔鏡的手術(shù))；腸缺血；腹膜后血腫；腹腔內(nèi)膿毒癥；腹膜內(nèi)炎癥；急性闌尾炎；膽囊炎；胰腺炎；輸尿管絞痛；胸部損傷；基底肺炎；心肌梗死；代謝障礙，例如導(dǎo)致鉀的水平降低的代謝障礙；藥物，例如長(zhǎng)期使用鴉片制劑；和外傷，例如脊柱和肋骨骨折(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。該術(shù)語(yǔ)還包括產(chǎn)后腸梗阻，其是產(chǎn)后期婦女的常見疾病，例如陰道分娩(“自然分娩”)或手術(shù)輔助的分娩以后。本文術(shù)語(yǔ)“手術(shù)后腸梗阻”指任何手術(shù)例如腹部手術(shù)以后患者經(jīng)歷的腸梗阻。術(shù)語(yǔ)“非手術(shù)介入”指不涉及手術(shù)的醫(yī)學(xué)治療。術(shù)語(yǔ)“不涉及手術(shù)的病情導(dǎo)致的腸梗阻”指由除手術(shù)以外的因素例如本文所述的因素導(dǎo)致的腸梗阻。認(rèn)為可能出現(xiàn)腸梗阻的個(gè)體尤其可從本發(fā)明受益，主要是因?yàn)樵诔霈F(xiàn)任何腸梗阻的證據(jù)以前，就可以開始預(yù)防性治療。“可能患”的個(gè)體包括，例如需要腹部手術(shù)(醫(yī)學(xué)上必要的或可選的)的患者，和/或患有前一段落所述的任何病情或損傷的個(gè)體。熟練的醫(yī)師應(yīng)理解通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，可確定患者可能患腸梗阻，例如通過(guò)醫(yī)師的診斷。本文所用術(shù)語(yǔ)“移植”是總稱，用于描述將器官或組織(例如小腸)轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“移植”在本領(lǐng)域定義為將活體組織或細(xì)胞從供體轉(zhuǎn)移到受體，并保持被轉(zhuǎn)移的組織或細(xì)胞在受體中的功能完整性(見例如TheMerkManual，Berkow，F(xiàn)letcherandBeers，Eds.，MerckResearchLaboratories，Rahway，N.J.，1992)。該術(shù)語(yǔ)包括本領(lǐng)域已知的所有種類的移植。移植通過(guò)部位以及供體和受體之間的遺傳關(guān)聯(lián)分類。該術(shù)語(yǔ)包括例如自體移植(autotransplantation)(將病人身體的一個(gè)位置的細(xì)胞或組織取出并轉(zhuǎn)移到同一病人身體的相同或另一位置)，同種異體移植(allotransplantation)(相同物種成員間的移植)，和異種移植(xenotransplantation)(不同物種成員間的移植)。制備氣體組合物CO組合物可以是氣體一氧化碳組合物?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的壓縮氣體(compressedgas)或加壓氣體(pressurizedgas)，可自任何商業(yè)來(lái)源獲得，并可位于任何類型的適合保存壓縮氣體的容器(vessel)中。例如，壓縮或加壓氣體可以自任何提供醫(yī)用壓縮氣體例如氧氣的來(lái)源獲得。本文術(shù)語(yǔ)“醫(yī)用級(jí)”氣體，指適合給藥本文所定義的患者的氣體。提供用于本發(fā)明的方法的加壓氣體包括一氧化碳時(shí)，可使得所需的最終組合物中的所有氣體(例如，CO，He，NO，CO2，O2，N2)在同一容器內(nèi)，除NO和O2不能保存在一起的情況?？蛇x的，本發(fā)明的方法可使用多個(gè)含有單一氣體的容器進(jìn)行。例如，可提供含或不含其它氣體的含一氧化碳的單個(gè)容器，其含有的氣體可選地與室內(nèi)空氣或其它容器中含有的氣體混合，所述其它容器例如含有氧氣，氮?dú)?，二氧化碳，壓縮空氣，或任何其它適合的氣體或其混合物的容器。根據(jù)本發(fā)明給藥患者的氣體組合物通常含有0％-約79％重量的氮?dú)猓s21％-約100％重量的氧氣和約0.0000001％-約0.3％重量(相當(dāng)于約1ppb或0.001ppm-約3,000ppm)的CO。優(yōu)選氣體組合物中氮?dú)饬渴羌s79％重量，氧氣量是約21％重量且CO量是約0.0001％-約0.25％重量。CO的量?jī)?yōu)選是至少約0.001％，例如，至少約0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％重量。CO的優(yōu)選范圍包括約0.005％-約0.24％，約0.01％-約0.22％，約0.015％-約0.20％，和約0.025％-約0.1％重量。注意到根據(jù)應(yīng)用情況，具有大于0.3％(例如1％或更高)的CO濃度的氣體CO組合物可短期使用(例如一次或數(shù)次呼吸)?？捎脷怏wCO組合物產(chǎn)生包含CO氣體的環(huán)境(atmosphere)。包含適當(dāng)水平的CO氣體的環(huán)境可通過(guò)例如以下方式產(chǎn)生提供含有包含CO氣體的加壓空氣的容器，并將所述加壓氣體從容器中釋放到室或空間內(nèi)，在該室或空間內(nèi)形成包括CO氣體的環(huán)境?？蛇x地，所述氣體可被釋放到使氣體在呼吸面罩或呼吸管內(nèi)達(dá)到最高濃度的一種儀器中，從而在呼吸面罩或呼吸管中創(chuàng)造出包含CO氣體的環(huán)境，使得患者成為該室內(nèi)唯一暴露于明顯水平的CO的人。環(huán)境中CO的水平可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)或監(jiān)測(cè)。這種方法包括電化學(xué)檢測(cè)，氣相色譜，放射性同位素計(jì)數(shù)，紅外吸收，比色法，和基于選擇性膜的電化學(xué)方法(見例如Sunderman等，Clin.Chem.282026-2032，1982；Ingi等，Neuron16835-842，1996)。亞百萬(wàn)分?jǐn)?shù)級(jí)(sub-partspermillion)CO水平可通過(guò)例如，氣相色譜和放射性同位素計(jì)數(shù)檢測(cè)。此外，本領(lǐng)域已知亞-ppm范圍內(nèi)的CO水平可通過(guò)中紅外氣體傳感器(midinfraredgassensor)在生物組織中檢測(cè)(見例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol280H482-H488，2001)。CO傳感器和氣體檢測(cè)儀可自多種商業(yè)來(lái)源獲得。制備液體組合物包含CO的藥物組合物也可以是液體組合物。液體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何使氣體溶于液體的方法制成CO組合物。例如，所述液體可以置于所謂的“CO2溫育箱”中并暴露于持續(xù)的CO氣流，優(yōu)選由二氧化碳平衡，直到液體中CO達(dá)到所需的濃度。另一實(shí)施例中，CO氣體可直接″吹入(bubbled)″液體中，直到液體中CO達(dá)到所需的濃度。溶解于給定水溶液中的CO量隨溫度的降低而增加。在另一實(shí)施例中，適宜的液體可流經(jīng)允許氣體進(jìn)行擴(kuò)散的管道系統(tǒng)(tubing)，該管道系統(tǒng)在包含CO的環(huán)境(例如利用如體外膜氧合器(extracorporealmembraneoxygenator)的儀器)中運(yùn)行。CO擴(kuò)散進(jìn)入液體產(chǎn)生液體CO組合物。很可能地，這種用于引入活動(dòng)物體內(nèi)的液體組合物，當(dāng)其被引入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，溫度是或約37℃。液體可以是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的任何適合給藥患者，或保存和/或洗滌和/或灌注目的器官的液體(參見，例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。通常，所述液體是水溶液。適合的溶液的實(shí)例包括磷酸鹽緩沖的鹽水溶液(PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，檸檬酸鹽溶液，和威斯康星大學(xué)(UniversityofWisconsin)(UW)溶液(OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，液體是林格氏液(Ringer′ssolution)，例如，乳酸鹽林格氏溶液，或任何可輸注入患者體內(nèi)的其它液體。在另一實(shí)施方案中，液體包括血液，例如全血。任何適合的液體可通過(guò)氣體擴(kuò)散器飽和到給定的CO濃度。可選地，可用經(jīng)質(zhì)量控制含有給定水平的CO的預(yù)制溶液。可通過(guò)使用帶有與CO分析儀連接的透氣但不透液的膜的儀器對(duì)劑量進(jìn)行精確控制?？蓪⑷芤猴柡偷剿栌行舛炔⒈３衷谶@些水平。用CO組合物治療患者可用本領(lǐng)域已知的任何將氣體和/或液體給藥患者的方法使用一氧化碳組合物治療患者。一氧化碳組合物可給藥診斷為，或者確定可能患腸梗阻的患者，例如手術(shù)患者，包括接受了SITx的患者。本發(fā)明還涉及將液體或氣體一氧化碳系統(tǒng)地給藥患者(例如通過(guò)吸入和/或攝取)，以及將所述組合物局部地給藥患者的胃腸道(例如通過(guò)攝取，吹入，和/或?qū)敫骨?。系統(tǒng)地遞送氣體CO氣體CO組合物可系統(tǒng)地遞送給患者，例如手術(shù)患者或者小腸移植供體和/或受體。氣體CO組合物通常通過(guò)嘴或鼻道吸入肺內(nèi)給藥，在肺內(nèi)CO直接顯示其作用或者很容易地被吸收到患者的血流內(nèi)。治療性氣體組合物中所用活性化合物(CO)的濃度有賴于CO的吸收，分布，滅活和排出(通常通過(guò)呼吸)速率以及本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的其它因素。還應(yīng)理解，對(duì)于任何具體受試者而言，具體的劑量方案應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要和實(shí)施或監(jiān)督組合物給藥的人員的職業(yè)判斷隨時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，而且前述的濃度范圍只是示例性的，而不是為限制所要求的組合物的范圍或?qū)嵺`。本發(fā)明還涉及CO的急性，亞急性和慢性給藥，所述給藥方式有賴于例如患者腸梗阻的嚴(yán)重性或持續(xù)性。CO可在足以治療病情并顯示預(yù)期藥理學(xué)或生物學(xué)效應(yīng)的一段時(shí)間內(nèi)(包括不定時(shí)地給藥)遞送給患者。以下是一些可用于對(duì)患者給藥氣體CO組合物的方法和器械的實(shí)例。呼吸機(jī)(ventilator)可購(gòu)買醫(yī)用級(jí)CO(可有多種濃度)，所述CO與空氣或其它含有氧氣的氣體混合于加壓氣體標(biāo)準(zhǔn)罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述氣體為非反應(yīng)活性(non-reactive)的，而本發(fā)明方法所需濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于可燃范圍(空氣中10％)。在醫(yī)院中，推定要將氣體遞送到床邊，在那里使之與氧氣或室內(nèi)空氣在混合器(blender)內(nèi)混合，達(dá)到所需的ppm濃度?；颊咄ㄟ^(guò)呼吸機(jī)吸入氣體混合物，呼吸機(jī)的流率根據(jù)患者的舒適程度和需要設(shè)定。通過(guò)肺圖(即呼吸速率，潮氣量等)可確定該流率。可將防止患者不必要地接受超過(guò)所需量的一氧化碳的自動(dòng)防故障機(jī)制(fail-safemechamism)設(shè)計(jì)在遞送系統(tǒng)中?；颊叩腃O水平可通過(guò)研究以下指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)(1)靜脈血中可測(cè)的碳氧血紅蛋白(COHb)，和，(2)從呼吸機(jī)側(cè)部收集的呼出CO?？筛鶕?jù)患者的健康狀況和標(biāo)志物調(diào)節(jié)CO暴露。如果有必要，還可通過(guò)吸入100％的氧氣洗出CO。CO是不被代謝的，因此除很小一部分被轉(zhuǎn)化成CO2，無(wú)論吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治療性遞送CO而不導(dǎo)致隨后的低氧狀況。面罩和幕(Tent)含有CO的氣體混合物如上述方法制備，從而允許患者通過(guò)面罩或幕被動(dòng)吸入。吸入濃度可改變，并通過(guò)簡(jiǎn)單地?fù)Q成吸入100％的O2進(jìn)行洗滌。可用自動(dòng)防故障機(jī)制在面罩或幕或在其附近監(jiān)測(cè)CO水平，所述自動(dòng)防故障機(jī)制可防止吸入過(guò)高濃度的CO。便攜式吸入器(Portableinhaler)加壓CO可被包裝入便攜式吸入器并吸入經(jīng)過(guò)計(jì)量的劑量，例如使得不住院的受體接受間歇性治療?？蓪⒉煌瑵舛鹊腃O包裝到容器中。該儀器可簡(jiǎn)單到只是帶有開-關(guān)閥和管子的含有稀釋CO的小儲(chǔ)罐(例如低于5kg)，從所述管子中，患者可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案或需要吸入CO。靜脈內(nèi)人工肺(IntravenouSArtificialLung)設(shè)計(jì)為遞送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中氣體交換的導(dǎo)管器械)可用于CO遞送。該導(dǎo)管植入后，定位于一根大靜脈中并可系統(tǒng)性遞送所需濃度的CO或?qū)⑵溥f送到局部位點(diǎn)。所述遞送可以是短時(shí)間內(nèi)遞送高濃度CO到手術(shù)位點(diǎn)例如鄰近小腸的局部遞送(所述高濃度在血流中迅速稀釋)，或者相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)暴露于較低濃度的CO(見例如，Hattler等，Artif.Organs18(11)806-812(1994)；和Golob等，ASAIOJ.，47(5)432-437(2001))。正常氣壓小室(Normobaricchamber)在某些情況下，需要將患者整體暴露于CO。患者須位于充滿CO的密閉艙中，其中CO的水平不會(huì)對(duì)患者造成危險(xiǎn)，或者該水平造成可接受的危險(xiǎn)但不會(huì)使旁觀者處于被暴露的危險(xiǎn)。完成暴露后，用空氣(例如，21％O2，79％N2)充滿該艙，并使用CO分析儀分析樣品，以保證在允許患者離開暴露系統(tǒng)前沒有任何CO存留。系統(tǒng)性遞送液體CO組合物本發(fā)明還涉及，可產(chǎn)生用于系統(tǒng)地遞送給患者的液體CO組合物，例如輸注到患者體內(nèi)。例如，液體CO組合物，如CO飽和的林格氏溶液，可以在外科手術(shù)之前，期間和/或以后輸注給患者?？蛇x或此外，被CO部分或完全飽和的全(或部分)血可輸注入患者。本發(fā)明還涉及能夠遞送可用的CO氣體或液體劑型的試劑(例如CO釋放性膠，乳膏，軟膏劑或膜片)。使用一氧化碳對(duì)胃腸道進(jìn)行局部治療可選或此外，一氧化碳組合物還可直接給藥胃腸道，例如整個(gè)胃腸道的內(nèi)部和/或外部，或者其任何部分。氣體組合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的將氣體吹入患者的方法，直接給藥患者的胃腸道，所述患者例如手術(shù)患者或者小腸移植供者或受者。例如，在內(nèi)窺鏡和腹腔鏡操作中，氣體如二氧化碳通常被分別吸入患者的胃腸道和腹腔從而輔助檢查(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。熟練醫(yī)師將理解類似的方法可以用于將一氧化碳組合物直接給藥患者的胃腸道。認(rèn)為本發(fā)明可用來(lái)輔助預(yù)防腹腔鏡和內(nèi)窺鏡檢查例如結(jié)腸鏡和食管胃十二指腸鏡檢查導(dǎo)致的腸梗阻。液體CO組合物也可局部給藥患者的胃腸道。液體CO組合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何將液體給藥患者的方法給藥。和氣體組合物一樣，液體CO組合物可直接給藥患者胃腸道的內(nèi)部和/或外部。例如，液體形式可經(jīng)口服給藥，例如通過(guò)使病人攝取液體一氧化碳組合物的膠囊化或非膠囊化劑型。另一實(shí)例中，液體，例如含有溶解的CO的鹽水溶液，可以分別在內(nèi)窺鏡和腹腔鏡手術(shù)中注入患者的胃腸道和腹腔。SITx時(shí)，原位暴露可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，例如從供者體內(nèi)取出器官之前，使用液體一氧化碳組合物在原位沖洗該器官(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。活體外小腸移植器官的保存(preservation)一氧化碳組合物可用來(lái)治療接受胃腸道的任何部分的移植，例如小腸移植(SITx)的患者。在移植手術(shù)的情況下，一氧化碳組合物可用來(lái)在器官采集，保存，和移植過(guò)程的任何步驟處理供體，受體和/或器官本身。胃腸器官可以從供體采集，根據(jù)本發(fā)明使用一氧化碳組合物在活體外(exvivo)處理該器官，并將其移植到受體內(nèi)?？蛇x地或此外，該器官可以在原位處理，即還在供體內(nèi)時(shí)處理?？蛇x地，一氧化碳組合物可以在手術(shù)之前，期間，和/或以后，例如使用受體的血液灌注該器官以后給藥該受體。所述一氧化碳組合物可以在從供體采集器官以前或采集過(guò)程中給藥供體。小腸(或其一部分)在活體外暴露給一氧化碳可以通過(guò)將小腸暴露于含有一氧化碳?xì)怏w的環(huán)境，和/或暴露于液體一氧化碳組合物，例如其中溶有一氧化碳的灌注液，保存液或洗滌液實(shí)現(xiàn)。將小腸暴露于氣體一氧化碳組合物可在任何適合產(chǎn)生包含適當(dāng)水平的CO氣體的環(huán)境的小室(chamber)或區(qū)域中進(jìn)行。這樣的小室包括，例如孵箱，和用于將器官保存在保存液中的小室。適宜的小室是其內(nèi)部環(huán)境只有加入該小室的氣體的小室，使得一氧化碳的濃度可建立并保持給定的濃度和純度，例如密封小室。例如，CO2溫育箱可用來(lái)將器官暴露于一氧化碳組合物，其中的一氧化碳?xì)怏w從含有該氣體的容器中以連續(xù)氣流的方式供給。將器官在活體外暴露于液體一氧化碳組合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行。例如所述暴露可在任何小室或空間中在活體外進(jìn)行，只要該小室或空間具有足以使該器官完全或部分浸沒在一氧化碳組合物中的容積。另一實(shí)例中，也可以通過(guò)將所述器官置于任何適宜的容器中而暴露給一氧化碳組合物，并使液體一氧化碳組合物“洗過(guò)”所述器官，使得所述器官暴露于一氧化碳組合物的連續(xù)流。另一實(shí)施例中，所述器官可用一氧化碳組合物灌注。術(shù)語(yǔ)“灌注”是本領(lǐng)域已知的術(shù)語(yǔ)，并且和液體例如一氧化碳組合物流經(jīng)該器官的血管相關(guān)。就胃腸道而言，該術(shù)語(yǔ)包括使用一氧化碳組合物沖洗腸腔。在活體外和原位灌注器官的方法是本領(lǐng)域已知的?？赏ㄟ^(guò)例如連續(xù)低溫自動(dòng)灌注(continuoushypothermicmachineperfusion)在活體外使用一氧化碳組合物灌注該器官(見OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。可選地，在原位或活體外灌注中，使用一氧化碳組合物灌注所述器官之前，可以用洗滌液，例如不含一氧化碳的UW溶液灌注該器官，以從該器官中去除供體的血液。進(jìn)行該過(guò)程可以避免供體血紅蛋白競(jìng)爭(zhēng)一氧化碳。此外，洗滌液還可以是一氧化碳組合物。在另一實(shí)例中，所述器官可以被置于，例如浸沒在不包含一氧化碳的介質(zhì)或溶液中，并將其置于小室內(nèi)，使得所述介質(zhì)或溶液可通過(guò)暴露于本文所述的含有一氧化碳的環(huán)境而制成一氧化碳組合物。另一實(shí)例中，所述器官可以浸沒在不含有一氧化碳的液體中，而一氧化碳可以被“吹入”該液體中。小腸可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的任何方法從供體中采集并移植(見例如，OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知移植和/或采集器官用于移植的方法隨具體情況而不同，例如供體/受體的年齡。本發(fā)明所述的將器官暴露于液體一氧化碳組合物的上述方法之一或全部，例如洗滌，浸沒，或灌注，可被用于給定的手術(shù)，例如單SITx手術(shù)。血紅素加氧酶-1和其它化合物的應(yīng)用本文還涉及隨同一氧化碳的給藥而誘導(dǎo)或表達(dá)血紅素加氧酶-1(HO-1)。在SITx的情況下，HO-1可隨一氧化碳的給藥而在器官內(nèi)，器官供體體內(nèi)，受體或所有三者中誘導(dǎo)。例如，HO-1可以在供體內(nèi)(例如去除該器官以前或該過(guò)程中)，在所述離體器官中，和/或在受體內(nèi)在移植前，移植過(guò)程中，或移植后誘導(dǎo)。在其它(即非移植相關(guān)的)很可能造成腸梗阻的介入治療的情況下，HO-1在介入治療前不久，期間或之后不久被誘導(dǎo)。本文術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)”指使用細(xì)胞本身編碼蛋白的基因例如，HO-1的內(nèi)源性(例如非重組的)基因，造成分離的細(xì)胞或組織，器官或動(dòng)物的細(xì)胞中上述蛋白的生成增加。HO-1可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法在患者體內(nèi)誘導(dǎo)。例如HO-1的產(chǎn)生可通過(guò)氯高鐵血紅素(hemin)，鐵原卟啉，或鈷原卟啉誘導(dǎo)。各種非血紅素(non-heme)制劑包括重金屬，細(xì)胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，內(nèi)毒素和熱休克也強(qiáng)烈誘導(dǎo)HO-l表達(dá)(Otterbein等，Am.J.Physiol.LungCellMol.Physiol.279L1029-L1037，2000；Choi等，Am.J.Respir.CellMol.Biol.159-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharma一氧化碳1.Toxi一氧化碳1.37517-554，1997；和Tenhunen等，J.Lab.Clin.Med.75410-421，1970)。多種導(dǎo)致氧化物應(yīng)激的制劑和條件可高度誘導(dǎo)HO-1，所述制劑和條件包括過(guò)氧化氫，谷胱甘肽耗竭物，UV輻射和氧過(guò)多(Choi等，Am.J.Respir.CellMol.Biol.159-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharma一氧化碳1.Toxi一氧化碳1.37517-554，1997；andKeyse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8699-103，1989)?！鞍琀O-1誘導(dǎo)物的藥物組合物”指包括任何能夠在患者體內(nèi)誘導(dǎo)HO-1的試劑的藥物組合物，例如任何上述的試劑，例如氯高鐵血紅素，鐵原卟啉，和/或鈷原卟啉。通過(guò)基因轉(zhuǎn)移可增加細(xì)胞中HO-1的表達(dá)。本文術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指通過(guò)外源給藥基因(例如重組基因)造成分離的細(xì)胞或組織，器官或動(dòng)物的細(xì)胞中的蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或鐵蛋白。HO-1或鐵蛋白優(yōu)選是與受體的同一物種的(例如人，小鼠，大鼠等)，從而最小化任何免疫反應(yīng)?？赏ㄟ^(guò)組成型啟動(dòng)子(例如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子)或組織特異的啟動(dòng)子(例如用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的乳清蛋白啟動(dòng)子或用于肝細(xì)胞的白蛋白啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)表達(dá)。編碼HO-1或鐵蛋白的適宜基因治療載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒(AAV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，小鼠極小病毒，乙型肝炎病毒，流感病毒，單純皰疹病毒-1型，和慢病毒)可通過(guò)口服，吸入或注入，在誘導(dǎo)腸梗阻的手術(shù)以前，期間和/或以后的任何時(shí)間(例如誘發(fā)腸梗阻的操作前24小時(shí)或即刻)給藥至腸壁，腸腔，或腹腔。類似的，編碼HO-1或去鐵鐵蛋白的質(zhì)?？勺鳛槔缏懵兜腄NA的形式，位于脂質(zhì)體中的形式，或位于微顆粒中的形式給藥。此外，外源性HO-1蛋白可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法直接給藥患者。外源性HO-1可直接給藥，作為上述在患者體內(nèi)誘導(dǎo)或表達(dá)HO-1的方法的補(bǔ)充或替換，。所述HO-1蛋白可在脂質(zhì)體內(nèi)，和/或作為融合蛋白例如TAT融合蛋白(見例如，Becker-Hapak等，Methods24247-256，2001)的形式給藥患者?？蛇x或此外，HO-1的任何代謝產(chǎn)物例如膽紅素，膽綠素，鐵，和/或鐵蛋白可與一氧化碳聯(lián)合給藥，以防止或治療腸梗阻。此外，本發(fā)明涉及將除鐵蛋白以外的鐵結(jié)合分子，例如去鐵敏(desferoxamine，DFO)，鐵右旋糖苷(irondextran)，和/或去鐵鐵蛋白，給藥患者。本發(fā)明還涉及可抑制催化任何這些產(chǎn)物降解的酶(例如膽綠素還原酶)以創(chuàng)造/增強(qiáng)所需的效果。上述任何物質(zhì)均可給藥，例如經(jīng)口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，或直接給藥腸內(nèi)或腸外。本發(fā)明的方法中也可以使用在給藥化合物后，將CO釋放到機(jī)體的化合物(例如釋放CO釋放的化合物，如光可激活的的釋放CO的化合物)，例如二錳十羰基，三羰基二氯釕(II)二聚體，和二氯甲烷(例如，在400-600mg/kg之間的劑量，例如，約500mg/kg)，也可以使用碳氧血紅蛋白以及供給CO的血紅蛋白替代物?？梢砸匀魏畏绞浇o藥患者上述任何物質(zhì)，例如通過(guò)口服，靜脈內(nèi)，或動(dòng)脈內(nèi)給藥。上述任何化合物可局部和/或系統(tǒng)地給藥患者，并且可以聯(lián)合給藥。本發(fā)明還涉及通過(guò)將CO給藥患者治療腸梗阻與對(duì)患者的腸道進(jìn)行功能性刺激聯(lián)合，所述對(duì)腸道的刺激例如通過(guò)給藥患者糞便軟化劑，輕瀉劑，和/或潤(rùn)滑劑；和/或通過(guò)靜脈內(nèi)水合作用(intravenoushydration)和/或鼻胃減壓(nasogastricdecompression)。CO可以和任何其它已知的治療腸梗阻的方法或化合物聯(lián)合給藥。以下實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的一部分，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為從任何方面限制本發(fā)明。實(shí)施例1一氧化碳對(duì)移植誘導(dǎo)的腸梗阻的保護(hù)作用動(dòng)物近親交配的雄性LEW(RT1)大鼠體重200-300克，購(gòu)自HarlanSpragueDawley，Inc.(Indianapolis，IN)，并保存在UniversityofPittsburgh的層流動(dòng)物設(shè)備。使用標(biāo)準(zhǔn)飲食隨意地喂養(yǎng)動(dòng)物。小腸移植為確定CO是否抗御小腸移植相關(guān)的腸梗阻，在同基因Lewis大鼠中進(jìn)行同位SITx。具有腔靜脈引流的SITx是使用前述方法進(jìn)行的。整個(gè)供體小腸從Treitz韌帶到回盲瓣在血管蒂上分離，所述血管蒂由門靜脈和帶有主動(dòng)脈的一個(gè)節(jié)段的腸系膜上動(dòng)脈組成。使用5m1冷的林格氏(Ringer’s)乳酸溶液通過(guò)該主動(dòng)脈節(jié)段灌注該移植物，并用含有0.5％新霉素-硫酸鹽(Sigma，St.Louis，MO)的20ml冷鹽水溶液灌注腸腔。使用10-0NovafilTM縫線進(jìn)行移植物主動(dòng)脈和受體的腎下主動(dòng)脈之間，以及移植物門靜脈和受體腔靜脈之間的端-側(cè)吻合。冷缺血時(shí)間(coldischemictime)為1小時(shí)。整個(gè)受體的腸被去除，并通過(guò)近端和遠(yuǎn)端端-端腸吻合恢復(fù)整個(gè)連續(xù)性。術(shù)后3天給予受體動(dòng)物20mg/天預(yù)防性的頭孢羥唑酯鈉。手術(shù)后3小時(shí)給予移植受體喂水，在術(shù)后24小時(shí)喂食。實(shí)驗(yàn)分組四組動(dòng)物在本研究中被檢查，其中兩組接受了SITx。第一組由未接受手術(shù)的正常大鼠組成。第二組動(dòng)物暴露于CO且沒有接受手術(shù)。第三組中，進(jìn)行了同基因SITx，并將受體置于室溫。第四組由SITx受體組成，其在手術(shù)前被置于CO小室中1小時(shí)，隨后在手術(shù)以后立刻暴露于CO直到處死。在第三組和第四組中，正常LEW大鼠作為供體。CO暴露所述動(dòng)物暴露于250ppm濃度的CO。簡(jiǎn)言之，空氣中1％的CO和空氣(21％氧氣)在不銹鋼混合柱(cylinder)中混合，然后以12L/min的流速導(dǎo)入3.70ft3玻璃暴露小室中。使用CO分析儀(Interscan，Chatsworth，CA)，連續(xù)測(cè)定小室中CO的水平。CO濃度一直保持在250ppm。在暴露的過(guò)程中給所述動(dòng)物提供食物和水。功能研究CO治療對(duì)于被移植的移植物的腸運(yùn)動(dòng)障礙的作用在體內(nèi)和體外評(píng)價(jià)。手術(shù)后24小時(shí)或48小時(shí)采集組織，這個(gè)時(shí)間顯示是移植誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙出現(xiàn)高峰的時(shí)間點(diǎn)。在體內(nèi)，環(huán)肌機(jī)械活性如前述測(cè)定(Eskandari等.，Am.J.Physiol.273(3Pt1)G727-34(1997))。大鼠被麻醉并在術(shù)后24小時(shí)通過(guò)放血被殺死。中空腸的一個(gè)節(jié)段被釘在SygaardTM覆蓋的解剖盤上，所述解剖盤含有預(yù)先氧處理的Krebs-Ringer-重碳酸鹽緩沖液(KRB；137.4mMNa+，5.9mMK+，2.5mMCa2+，1.2mMMg2+，134mMCl-，15.5mMHCO3-，1.2mMH2PO4-，和11.5mM葡萄糖)，所述緩沖液使用97％O2/3％CO2平衡。沿腸系膜邊緣打開小腸，并使用細(xì)剪(fineforceps)去除粘膜。沿與環(huán)肌層平行的方向剪下全層肌肉帶(1×6mm)。肌肉帶置于連續(xù)澆蓋了預(yù)先氧處理的KRB并保持在37℃的小室(standardhorizontalmechanicalorganchamber)中。每個(gè)肌肉帶的一個(gè)末端和固定的柱(post)結(jié)扎在一起，另一端和等大的力量傳感器(WPI，Sarasota，F(xiàn)L)連接。使肌肉帶平衡1小時(shí)，隨后其逐漸伸長(zhǎng)直到最大自發(fā)收縮出現(xiàn)(L0)。第二次平衡30分鐘以后，收縮性-反應(yīng)曲線通過(guò)將組織暴露于濃度漸增的毒蕈堿激動(dòng)劑氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)10分鐘產(chǎn)生，然后洗滌10分鐘。收縮活性通過(guò)總和曲線下的面積而計(jì)算，通過(guò)將肌肉帶的重量和長(zhǎng)度轉(zhuǎn)化成組織的平方毫米(1.03mg/mm2)而標(biāo)準(zhǔn)化，然后報(bào)道為g/s/mm2。術(shù)后48小時(shí)，在對(duì)照和操作的動(dòng)物中，通過(guò)評(píng)估熒光標(biāo)記的葡聚糖(MolecularProbes)的腸分布測(cè)定腸轉(zhuǎn)運(yùn)(intestinaltransit)。通過(guò)吸入異氟醚使動(dòng)物稍鎮(zhèn)定，并口服標(biāo)記的葡聚糖(200μl，濃度為6mg/ml，溶解在鹽水中)。給藥后兩小時(shí)，將該動(dòng)物處死，并收集從胃到遠(yuǎn)端結(jié)腸的整個(gè)腸道。打開胃，小腸(分成等長(zhǎng)的10個(gè)節(jié)段)，盲腸，和結(jié)腸(3個(gè)節(jié)段，近段，中段和遠(yuǎn)段)的內(nèi)容(contents)，置于2ml的鹽水中，并強(qiáng)力渦旋以釋放各節(jié)段中存在的葡聚糖。沉淀腸組織和乳糜后，等分量的上清在讀板儀上讀數(shù)兩次(CytoFluorII；激發(fā)波長(zhǎng)530nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm)，來(lái)定量每個(gè)腸節(jié)段的熒光信號(hào)。隨后，繪制熒光信號(hào)的中值柱形圖，以顯示實(shí)驗(yàn)組之間標(biāo)記的葡聚糖的分布的改變。通過(guò)計(jì)算幾何中心(GC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析測(cè)定腸轉(zhuǎn)運(yùn)。形態(tài)學(xué)研究小腸移植物在10％的緩沖福爾馬林中固定，并在石蠟中包埋。制作4μm的切片并使用蘇木精和伊紅染色。髓過(guò)氧化物酶組織化學(xué)肌肉全層包埋物是從術(shù)后24小時(shí)采集的中段小腸制備的。腸段浸在SylgaardTM覆蓋的玻璃盤的KRB中，并沿腸系膜邊緣在不拉伸的情況下固定。該節(jié)段的長(zhǎng)度和寬度使用游標(biāo)卡尺測(cè)定。隨后沿腸系膜邊緣打開結(jié)腸，并拉伸到長(zhǎng)度的150％和寬度的250％。使用精細(xì)鑷(fineforceps)去除粘膜和粘膜下層，余下的組織在100％的變性乙醇中固定30分鐘。使用PBS洗滌數(shù)次后，使用Hanker-Yates試劑來(lái)檢測(cè)顯示髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性的多形核嗜中性粒細(xì)胞(PMN’s)(Sheibani等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)367-70(1981))。使用Gel/MountTM(BiomediaCorp.，F(xiàn)osterCity，CA)在載玻片上制作組織的標(biāo)本，加上蓋玻片并通過(guò)光學(xué)顯微鏡(NikonFXA，F(xiàn)ryer，Huntley，IL)以200×的放大率進(jìn)行檢查。浸潤(rùn)肌外層的MPO陽(yáng)性PMN的數(shù)目通過(guò)腸系膜和腸系膜游離緣(anti-mesentericborder)之間集中的五到六個(gè)相鄰視野的平均計(jì)數(shù)確定。分子生物研究RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)(RPA)為研究細(xì)胞因子mRNA在粘膜和肌層中表達(dá)的序列(sequential)分析，根據(jù)生產(chǎn)說(shuō)明使用RiboquantTM試劑盒(Pharmingen)進(jìn)行RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)。放射標(biāo)記的反義RNA多探針是使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒和大鼠細(xì)胞因子多重探針模板組(multi-probetemplateset)(rCK-1)合成的，該多探針包括細(xì)胞因子(白介素(IL)-1a，IL-1β3，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，TNF-a，TNF-β和IFN-γ)以及管家基因(L32和GAPDH)。32P標(biāo)記的探針(8.0×105cpm)和樣品RNA(5μg)在56℃雜交12-16小時(shí)，而且包括反義RNA探針在內(nèi)的單鏈RNA通過(guò)使用RPA試劑盒(Pharmingen)消化。被保護(hù)的探針加樣在40％的聚丙烯酰胺凝膠上。使用PhosphorImagerTM系統(tǒng)(MolecularDynamics，Krefeld，Germany)進(jìn)行放射自顯影。使用NIHImage進(jìn)行mRNA帶的放射活性的定量，根據(jù)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，并表達(dá)為細(xì)胞因子/GAPDH的比值(n＝3-4)。SYBRgreen實(shí)時(shí)RT-PCR吸入CO對(duì)移植誘導(dǎo)的促炎基因和抗炎基因的表達(dá)的影響通過(guò)RT-PCR在肌肉提取物中測(cè)定。從正常腸和移植后4小時(shí)的移植物中采集肌外層，并在液氮中急速冷凍。該時(shí)間點(diǎn)落在最大炎癥介導(dǎo)物表達(dá)的的范圍內(nèi)，即腹部切開后3-6小時(shí)之間。使用前述的硫氰酸胍酚-氯仿提取法(Eskandari等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)367-370(1997))進(jìn)行總RNA提取。RNA碎片(pellet)重懸于RNA-安全的(secure)重懸液(AmbionInc.，Austin，TX)中，然后通過(guò)使用DNaseI(DNA-Free試劑盒，AmbionInc.，Austin，TX)處理去除可能存在的污染的DNA。每個(gè)樣品的等分量(5μg)的總RNA通過(guò)分光光度法(波長(zhǎng)250nm)定量，且以40ng/μl的濃度進(jìn)行等分。峰值mRNA表達(dá)通過(guò)SYBRGreen兩步，實(shí)時(shí)RT-PCR定量?jī)纱?。GAPDH被用作內(nèi)源參照物。使用隨機(jī)六聚物(PEappliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)和SuperScriptIITM(LifeTechnologies，Rockville，MD)，對(duì)等分量的RNA進(jìn)行第一鏈(first-strand)互補(bǔ)DNA(cDNA)合成。引物序列根據(jù)文獻(xiàn)獲得或者根據(jù)公開的序列設(shè)計(jì)(表1)。使用SYBRGreenPCR核心反應(yīng)試劑(CoreReagents)(PEAppliedBiosystems)制備PCR反應(yīng)混合物。每種樣品都使用產(chǎn)品說(shuō)明推薦的條件估測(cè)兩次。所述反應(yīng)在50℃保溫2分鐘，以活化尿嘧啶N’-糖基化酶，隨后在95℃保溫12分鐘，以活化AmplitaqGoldTM聚合酶，然后在ABIPRISM7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(PEAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)上，以95℃，15秒和60℃，1分鐘進(jìn)行循環(huán)，共40次。實(shí)時(shí)PCR的數(shù)據(jù)被繪制成ΔRn熒光信號(hào)對(duì)循環(huán)數(shù)的圖。給logΔRn循環(huán)圖的中段-線性部分(mid-linearportion)設(shè)定任意的閾值。閾值循環(huán)(CT)被限定為ΔRn與該閾值交叉時(shí)的循環(huán)數(shù)。mRNA表達(dá)的定量可根據(jù)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，并使用比較CT法(Schmittgen等.，J.Biochem.Biophys.Methods46(1-2)69-8(2000))相對(duì)于對(duì)照進(jìn)行計(jì)算。為了排除對(duì)污染基因組DNA的PCR擴(kuò)增，RT陰性對(duì)照(含有未被逆轉(zhuǎn)錄的RNA的樣品)包括在每次的PCR反應(yīng)中。對(duì)每次反應(yīng)進(jìn)行熔解曲線分析，以保證對(duì)特定產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。此外，還對(duì)所述引物進(jìn)行凝膠電泳以確定不存在非特異條帶，以及確定擴(kuò)增子大小正確。檢測(cè)靶cDNA的PCR擴(kuò)增的效率以測(cè)定稀釋的共線性(colinearity)。對(duì)cDNA的連續(xù)3倍稀釋，平行三份重復(fù)進(jìn)行。通過(guò)用CT值對(duì)相對(duì)輸入拷貝數(shù)作圖產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.2±0.3，校正系數(shù)為0.99被認(rèn)為是可接受的，其相應(yīng)的效率是100±10％。表1引物總結(jié)HO-1的Northern印跡如上述進(jìn)行Northern印跡(Camhi等.，Am.J.Respir.CellMol.Biol.13387-398(1995))。簡(jiǎn)言之，如上述從組織中提取10μg總RNA，并在1％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后通過(guò)毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。隨后在65℃，將所述尼龍膜在雜交緩沖液中(1％牛血清白蛋白(BSA)，7％SDS，0.5MPO4緩沖液，pH7.0，和1mMEDTA)預(yù)雜交2小時(shí)，然后使用32P標(biāo)記的大鼠HO-1cDNA，32P標(biāo)記的大鼠L-鐵蛋白，或32P標(biāo)記的大鼠H-鐵蛋白寡核苷酸探針在65℃雜交24小時(shí)。隨后在65℃在緩沖液A(0.5％BSA，5％SDS，40mMPO4緩沖液，pH7.0，和1mMEDTA)中洗滌兩次，每次15分鐘，然后在65℃在緩沖液B(1％SDS，40mMPO4緩沖液，pH7.0和1mMEDTA)中洗滌三次，每次15分鐘。HO-1cDNA探針全長(zhǎng)大鼠cDNA(pHO1)由Tohoku大學(xué)(Sendai，Japan)的S.Shibahara博士提供。pHO1被克隆到pBluescript載體中，并用HindIII進(jìn)行消化以將0.9kbHO-1cDNA插入物從pBluescript載體中分離出來(lái)。為了控制不同樣品中RNA量的差異或加樣誤差，印跡和相應(yīng)于18SrRNA的寡核苷酸探針雜交。與18SrRNA互補(bǔ)的24個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸(5’-ACGGTATCTGATCGTCTTCGAACC-3′；SEQIDNO17)是通過(guò)使用DNA合成儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)合成的。使用購(gòu)自BoehringerMannheim(Mannheim，Germany)的隨機(jī)引物試劑盒用[32P]CTP標(biāo)記HO-1cDNA。所有寡核苷酸探針都用末端去氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(BethesdaResearchLaboratories，Gaithersburg，MD)在3’端用[32P]ATP進(jìn)行標(biāo)記。將放射自顯影信號(hào)和得自同一印跡的18SrRNA進(jìn)行比較。血清細(xì)胞因子水平的確定灌注后1，4和24小時(shí)順序取得血清樣品，并保存在-80℃直到進(jìn)行評(píng)估。血清細(xì)胞因子(包括IL-6，IL-10，和TNFα)的濃度是通過(guò)使用酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)試劑盒(R&D，Cambridge，MA)如產(chǎn)品說(shuō)明所述測(cè)定的。血清亞硝酸鹽/硝酸鹽水平的測(cè)定為了監(jiān)測(cè)NO代謝的穩(wěn)定終產(chǎn)物，使用可購(gòu)得的檢驗(yàn)試劑盒(R&D，Cambridge，MI)測(cè)定1，4和24小時(shí)的血清亞硝酸鹽/硝酸鹽水平，并根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行定量。在該試驗(yàn)系統(tǒng)中，使用硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，且樣品中亞硝酸鹽的濃度隨后使用Griess反應(yīng)測(cè)定。肌肉細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)后24小時(shí)，對(duì)照大鼠和移植后大鼠的小腸被取出(在無(wú)菌條件下)。結(jié)腸保留在原位。將小腸轉(zhuǎn)移到含有Hank’s平衡鹽溶液(Sigma，St.Louis，MO)和200U/ml的青霉素G和200μg/ml的鏈霉素(HBSS)的無(wú)菌碎裂機(jī)(breaker)中。如上述分離肌層，并在無(wú)菌紗布上點(diǎn)樣。測(cè)定樣品的濕重，等分組織，每份150-200毫克。在HBSS中洗滌該組織兩次。如上述將各等分試樣轉(zhuǎn)移到35毫米的有孔培養(yǎng)板中，該板含有3ml含有青霉素/鏈霉素的無(wú)血清DMEM，并在5％的CO2孵箱中在37℃保溫24小時(shí)。保溫一段時(shí)間后，在液氮中冷凍1ml的上清等分試樣，并保存在-80℃。細(xì)胞因子蛋白水平通過(guò)ELISA測(cè)定，并根據(jù)組織濕重標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明使用可購(gòu)得的ELISA試劑盒。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表示為平均值加或減平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。在適合的條件下，使用s檢驗(yàn)(student’stest)或方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。概率水平p≤0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。CO抑制與SITx相關(guān)的腸功能障礙的發(fā)生在體外器官浴(organbath)試驗(yàn)中研究SITx和使用CO治療對(duì)于自發(fā)和氨甲酰甲膽堿刺激的小腸環(huán)肌收縮的作用。再灌注移植后的腸移植物后24小時(shí)采集組織。對(duì)照小腸的肌肉帶(strip)出現(xiàn)有規(guī)律的收縮(數(shù)據(jù)未顯示)。使用CO處理24小時(shí)對(duì)未接受手術(shù)的對(duì)照大鼠的自發(fā)收縮沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。SITx以后，自發(fā)收縮活性消失(數(shù)據(jù)未顯示)。CO治療恢復(fù)了移植后大鼠的自發(fā)收縮活性(數(shù)據(jù)未顯示)。將氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)加入水浴澆注液中引發(fā)了濃度依賴的強(qiáng)直性收縮。圖1顯示了對(duì)氨甲酰甲膽堿劑量遞增產(chǎn)生反應(yīng)的整合后的收縮反應(yīng)對(duì)獲得的組織面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在對(duì)照動(dòng)物中，收縮力在10-300μM的氨甲酰甲膽堿的范圍內(nèi)是濃度依賴的，其峰值力量為對(duì)100μM的氨甲酰甲膽堿起反應(yīng)而產(chǎn)生的3.5±0.7g/mm2/s。使用CO處理對(duì)未接受手術(shù)的動(dòng)物的收縮力沒有影響(峰值收縮力量3.2±0.5g/mm2/s)。與對(duì)照相比，SITx導(dǎo)致整個(gè)劑量反應(yīng)曲線的收縮力量降低，并在氨甲酰甲膽堿的濃度大于10μM時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在氨甲酰甲膽堿的濃度為100μM時(shí)，峰值收縮力量降低了49％，為1.7±0.4g/mm2/s。使用CO處理防止了SITx對(duì)整個(gè)劑量-反應(yīng)曲線的抑制作用，使峰值收縮力量恢復(fù)到對(duì)照的水平(3.6±0.7g/mm2/s)。術(shù)后48小時(shí)，通過(guò)評(píng)估口服的，熒光素標(biāo)記的葡聚糖的腸分布測(cè)定對(duì)照動(dòng)物和移植后動(dòng)物的腸轉(zhuǎn)運(yùn)。圖2A-2B是轉(zhuǎn)運(yùn)柱圖，顯示口服2小時(shí)后，不可吸收的FITC標(biāo)記的葡聚糖沿胃腸道(從胃到結(jié)腸)的分布。經(jīng)口喂養(yǎng)2小時(shí)后，來(lái)自未接受手術(shù)的對(duì)照大鼠和使用CO處理的對(duì)照大鼠的每個(gè)腸節(jié)段中熒光的中值柱圖在圖2中繪制。在這兩組中，大多數(shù)熒光標(biāo)記位于小腸節(jié)段9和10，以及盲腸中。這和移植后的大鼠中觀察到的分布模式相反(圖2B)，其中的熒光標(biāo)記主要見于胃，一些標(biāo)記進(jìn)入了近端小腸。在使用CO處理的移植動(dòng)物中，標(biāo)記的分布更遠(yuǎn)，總體來(lái)說(shuō)主要在小腸節(jié)段6，7和8中。幾何中心計(jì)算結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析在表2C中總結(jié)，顯示了吸入CO顯著提高接受了小腸移植的大鼠的腸轉(zhuǎn)運(yùn)。白細(xì)胞募集小腸肌層中的細(xì)胞炎性事件通常出現(xiàn)在SITx后24小時(shí)。通過(guò)Hanker-Yates組織化學(xué)測(cè)定的髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，用來(lái)定量來(lái)自對(duì)照動(dòng)物和移植動(dòng)物，經(jīng)過(guò)和沒有經(jīng)過(guò)CO處理的組織中的白細(xì)胞浸潤(rùn)。在未經(jīng)手術(shù)的對(duì)照大鼠和CO處理的對(duì)照大鼠中，MPO陽(yáng)性細(xì)胞很少見(數(shù)據(jù)未顯示)。SITx導(dǎo)致白細(xì)胞明顯被募集到腸肌層(數(shù)據(jù)未顯示)。每200×視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)在圖3中總結(jié)，其顯示了CO處理降低了MPO陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)目；然而，所述降低沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＝0.08，n＝6)。粘膜和肌層中細(xì)胞因子的序列分析RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示，SITx導(dǎo)致IL-6和IL-1βmRNA的明顯上調(diào)，其峰值在移植后的移植物中持續(xù)3-6小時(shí)(圖4A和4B)。相應(yīng)地，再灌注后4小時(shí)分析炎癥介質(zhì)mRNA水平。分子炎性反應(yīng)圖5是一組柱圖，其顯示了再灌注四小時(shí)后，腸移植物的肌外層中CO對(duì)一氧化氮合酶(iNOS)，IL-6，IL-1β，和IL-10的表達(dá)的影響。實(shí)時(shí)PCR分析顯示腸移植物的肌外層中，促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)明顯增加，(IL-6(3400倍))和IL-1β(38倍))。TNFα也明顯上調(diào)，但程度較低(3倍)。ICAM-1的基因表達(dá)增加了14倍，其中ICAM-1是在循環(huán)炎性細(xì)胞的募集中起重要作用的粘附分子。在使用CO處理的受體大鼠中，平均相對(duì)IL-6和IL-1β的表達(dá)降低(分別降低40％和50％)，而TNFα和ICAM-1的表達(dá)不變。由于移植組間的大的標(biāo)準(zhǔn)偏差，CO處理的大鼠中IL-6mRNA的表達(dá)的降低不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＝0.046，n＝6)，而IL-1β的表達(dá)明顯降低(p＝0.084，n＝6)。移植后移植物的肌層中，可誘導(dǎo)形式的環(huán)加氧酶(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的基因表達(dá)也明顯上調(diào)(分別為5倍和48倍)。這兩種酶的平均相對(duì)mRNA表達(dá)在CO處理的大鼠中降低大約50％。iNOS表達(dá)的降低仍不十分顯著(p＝0.060，n＝6)，而COX-2的表達(dá)的降低非常顯著(p＝0.26，n＝6)。單獨(dú)吸入CO對(duì)于任何一種所研究的介質(zhì)的表達(dá)沒有影響。圖6是一組柱圖，顯示了再灌注后1和4小時(shí)，接受腸移植物的動(dòng)物中，CO對(duì)血清IL-6和硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度的影響。為了產(chǎn)生這些數(shù)據(jù)，在移植后的各時(shí)間點(diǎn)采集血清樣品，并保存在-80℃直到對(duì)其進(jìn)行評(píng)估時(shí)。血清IL-6濃度使用大鼠酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)試劑盒(R&D，Cambridge，MA)。血清亞硝酸鹽/硝酸鹽水平，NO代謝的穩(wěn)定終末產(chǎn)物，使用可購(gòu)得的檢驗(yàn)試劑盒(Cayman，AnnArbor，MI)測(cè)定。在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，使用硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，并隨后使用Griess反應(yīng)測(cè)定樣品的亞硝酸鹽濃度。接受SITx并使用空氣處理的動(dòng)物中的血清IL-6和亞硝酸鹽/硝酸鹽水平隨時(shí)間增加。接受SITx并使用CO處理的動(dòng)物(SITx+CO)顯示血清IL-6以及亞硝酸鹽/硝酸鹽的水平明顯降低。顯示CO防止移植誘導(dǎo)的腸功能障礙的數(shù)據(jù)列在下表1中。SITx后早期(＜48小時(shí))，腸移植物的腸轉(zhuǎn)運(yùn)明顯延緩，肌肉收縮力明顯降低，且出現(xiàn)大量炎性浸潤(rùn)。這些改變?cè)谟肅O處理的受體中下降。與沒有用CO處理的SITx動(dòng)物相比，用CO處理的SITx動(dòng)物中的血清IL-6濃度(再灌注后4小時(shí))明顯降低。CO通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-1，防止腸移植炎癥和與SITx相關(guān)的I/R損傷。表2CO抑制與SITx相關(guān)的腸功能障礙實(shí)施例2CO抑制與小腸的手術(shù)操作相關(guān)的腸梗阻的發(fā)生動(dòng)物C57B16野生型雄性小鼠(20-25g)得自Harlan(Indianapolis，IN)。小鼠圈養(yǎng)在無(wú)病原體的裝置中，保持12小時(shí)的晝/夜循環(huán)，并隨意地用可購(gòu)得的嚙齒動(dòng)物食物和自來(lái)水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組和操作步驟年齡相當(dāng)?shù)男∈蟊环殖伤膫€(gè)實(shí)驗(yàn)組自然對(duì)照組(對(duì)照)；使用CO處理的對(duì)照組(對(duì)照+CO)；接受小腸手術(shù)操作(IM)的小鼠；和接受手術(shù)操作并使用CO處理的小鼠(IM+CO)。手術(shù)操作通過(guò)吸入異氟醚麻醉小鼠，并從腹中線剖開腹部。將小腸從腹腔拉出，并使用濕潤(rùn)的無(wú)菌棉敷料沿其全長(zhǎng)輕壓。這一過(guò)程是為了刺激腸的“蠕動(dòng)”，通常在臨床腹腔手術(shù)中進(jìn)行。將腸重新放回腹腔，并使用雙層連續(xù)縫合關(guān)閉切口。手術(shù)的時(shí)間為大約15分鐘，且所述動(dòng)物在麻醉解除后20分鐘內(nèi)在其籠子周圍自由移動(dòng)。CO吸入治療圈養(yǎng)籠子里的小鼠被置于持續(xù)通空氣或者含有CO(250ppm)的空氣的樹脂玻璃小室中。提供取樣口以持續(xù)監(jiān)測(cè)小室內(nèi)的一氧化碳濃度。動(dòng)物可隨意在任何時(shí)間吃食和喝水。剖腹術(shù)前1小時(shí)將小鼠暴露于CO或空氣，轉(zhuǎn)移出小室進(jìn)行手術(shù)操作，然后返回小室24小時(shí)。沒有接受手術(shù)的小鼠從小室中轉(zhuǎn)移出相似長(zhǎng)度的時(shí)間，然后返回小室中24小時(shí)。形態(tài)學(xué)研究MPO組織化學(xué)肌肉全層包埋物是從術(shù)后24小時(shí)采集的中段小腸制備的。腸段浸在SylgaardTM覆蓋的玻璃盤的KRB中，并沿腸系膜邊緣在不拉伸的情況下固定。該節(jié)段的長(zhǎng)度和寬度使用游標(biāo)卡尺測(cè)定。隨后沿腸系膜邊緣打開結(jié)腸，并拉伸到長(zhǎng)度的150％和寬度的250％。使用精細(xì)鑷(fineforceps)去除粘膜和粘膜下層，余下的組織在100％的變性乙醇中固定30分鐘。使用PBS洗滌數(shù)次后，使用Hanker-Yates試劑來(lái)處理組織以檢測(cè)顯示髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性的多形核嗜中性粒細(xì)胞(PMN’s)(Sheibani等.，Am.J.Clin.Pathol.75(3)367-70(1981))。使用Gel/MountTM(BiomediaCorp.，F(xiàn)osterCity，CA)在載玻片上制作組織的標(biāo)本，加上蓋玻片并通過(guò)光學(xué)顯微鏡(NikonFXA，F(xiàn)ryer，Huntley，IL)以200×的放大倍數(shù)進(jìn)行檢查。計(jì)數(shù)腸系膜邊緣和腸系膜游離部邊緣之間集中的五到六個(gè)相鄰視野中的MPO陽(yáng)性PMN的數(shù)目。HO-1免疫組化如上述制備的肌肉全層包埋物在Zamboni’s固定劑中固定1小時(shí)，使用DMSO清洗。使用PBS洗滌數(shù)次后，使用含有10％的正常驢血清和0.1％的Triton-X的PBS處理所述組織。隨后肌肉全層包埋物和兔抗大鼠HO-1抗體(1∶500，Stressgen，Vancouver，Canada)一同溫育過(guò)夜，經(jīng)洗滌后和驢抗兔IgG-Cy3偶聯(lián)物(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.，WestGrove，PA)一同保溫2小時(shí)。如上述使用Gel/MountTM包埋組織，并通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)(NikonMicrophot-FXA，Huntley，IL)。功能研究小鼠被麻醉，并在使用CO或室內(nèi)空氣24小時(shí)小室處理的最后，通過(guò)放血處死小鼠。體外環(huán)肌的機(jī)械活性如上Eskandari等(Am.J.Physiol.273G727-G734(1997))所述測(cè)定。簡(jiǎn)言之，中段小腸的一個(gè)節(jié)段被釘在SygaardTM覆蓋的解剖盤上，所述解剖盤含有預(yù)先氧處理(preoxygenate)的Krebs-Ringer-重碳酸鹽緩沖液(KRB；137.4mMNa+，5.9mMK+，2.5mMCa2+，1.2mMMg2+，134mMCl-，15.5mMHCO3-，1.2mMH2PO4-，和11.5mM葡萄糖)，并通入97％O2/3％CO2使pH為7.4。沿腸系膜邊緣打開小腸，并使用精密剪(fineforceps)去除粘膜。沿與環(huán)肌層平行的方向剪下的全層肌肉帶(1×6mm)置于標(biāo)準(zhǔn)水平機(jī)械器官小室(standardhorizontalmechanicalorganchamber)中，并連續(xù)傾注保持在37℃的預(yù)先氧處理的KRB。每個(gè)肌肉帶的一個(gè)末端和固定的柱(post)結(jié)扎在一起，另一端和等大的力量傳感器(WPI，Sarasota，F(xiàn)L)連接。使肌肉帶平衡1小時(shí)，隨后其逐漸伸長(zhǎng)到L0(出現(xiàn)最大自發(fā)收縮的長(zhǎng)度)?；€出現(xiàn)30分鐘后，收縮性-反應(yīng)曲線通過(guò)將組織暴露于濃度漸增的毒蕈堿激動(dòng)劑氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)10分鐘產(chǎn)生，然后洗滌10分鐘。收縮活性通過(guò)總和曲線下的面積計(jì)算。通過(guò)將肌肉帶的重量和長(zhǎng)度轉(zhuǎn)化成組織的平方毫米(1.03mg/mm2)而使應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)化，然后報(bào)告為g/s/mm2。術(shù)后24小時(shí)，在對(duì)照和操作的動(dòng)物中，通過(guò)評(píng)估不可吸收的熒光標(biāo)記的葡聚糖(分子量70,000)的腸分布測(cè)定腸轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)吸入異氟醚使動(dòng)物稍鎮(zhèn)定，并口服標(biāo)記的葡聚糖(100μl，25mg/mlCO儲(chǔ)存液)。給藥后九十分鐘，將該動(dòng)物處死，并收集從胃到遠(yuǎn)端結(jié)腸的整個(gè)腸道。胃，小腸(分成等長(zhǎng)的10個(gè)節(jié)段)，盲腸，和結(jié)腸(3個(gè)節(jié)段等長(zhǎng))在1ml的鹽水中切碎，并強(qiáng)力混合以釋放各節(jié)段中存在的葡聚糖。沉淀腸組織和乳糜后，等分量的澄清上清在讀板儀上讀數(shù)兩次(CytoFluorII；激發(fā)波長(zhǎng)530nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm)，來(lái)定量每個(gè)腸節(jié)段的熒光信號(hào)。通過(guò)計(jì)算幾何中心(GC＝∑(每個(gè)節(jié)段的總熒光信號(hào)百分比×節(jié)段數(shù)))測(cè)定信號(hào)在胃腸道中的分布，以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組之間的定量統(tǒng)計(jì)比較。SYBRgreen實(shí)時(shí)RT-PCR促炎基因和抗炎基因的表達(dá)通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定。小腸肌外層在術(shù)后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集(3，6，12，和24小時(shí))，并在液氮中急速冷凍。使用Eskandari等(Id)所述的硫氰酸胍酚-氯仿提取法進(jìn)行總RNA提取。RNA沉淀物重懸于RNA-安全(secure)的重懸液(AmbionInc.，Austin，TX)，然后通過(guò)使用DNaseI(DNA-FreeKit，AmbionInc.，Austin，TX)處理去除可能存在的污染DNA。每個(gè)樣品的等分量(5μg)的總RNA通過(guò)分光光度法(波長(zhǎng)250nm)定量。峰值mRNA表達(dá)通過(guò)SYBRGreen兩步，實(shí)時(shí)RT-PCR定量?jī)纱?。?肌動(dòng)蛋白被用作內(nèi)源參照物。使用隨機(jī)六聚物(PEappliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)和SuperScriptIITM(LifeTechnologies，Rockville，MD)，對(duì)等分量的RNA(40ng)進(jìn)行第一鏈(first-strand)互補(bǔ)DNA(cDNA)合成。引物序列根據(jù)文獻(xiàn)獲得或者根據(jù)公開的序列設(shè)計(jì)(表3)。使用SYBRGreenPCR核心反應(yīng)試劑(CoreReagents)(PEAppliedBiosystems)制備PCR反應(yīng)混合物。每種樣品都使用產(chǎn)品說(shuō)明推薦的條件估測(cè)兩次。實(shí)時(shí)PCR的數(shù)據(jù)被繪制成ΔRn熒光信號(hào)對(duì)循環(huán)數(shù)的圖。給logΔRn圖中段-線性部分設(shè)定任意的閾值。閾值循環(huán)(CT)被限定為ΔRn與閾值交叉時(shí)的循環(huán)數(shù)。mRNA表達(dá)的定量可根據(jù)β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，并使用比較CT法(Schmittgen等.，J.Biochem.Biophys.Methods46(1-2)69-8(2000))相對(duì)于對(duì)照進(jìn)行計(jì)算。表3引物總結(jié)為了排除對(duì)污染基因組DNA的PCR擴(kuò)增，RT陰性對(duì)照(含有未被逆轉(zhuǎn)錄的RNA的樣品)包括在每次的PCR反應(yīng)中。對(duì)每次反應(yīng)進(jìn)行熔解曲線分析，以保證對(duì)特定產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。此外，還對(duì)所述引物進(jìn)行凝膠電泳以確定不存在非特異帶，以及確定擴(kuò)增子大小正確。檢測(cè)靶cDNA的PCR擴(kuò)增的效率以測(cè)定連續(xù)稀釋物的共線性(colinearity)。對(duì)cDNA的逐級(jí)3倍稀釋重復(fù)三次。通過(guò)用CT值對(duì)相對(duì)輸入拷貝數(shù)作圖產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以驗(yàn)證引物。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.2±0.3，校正系數(shù)為0.99被認(rèn)為是可接受的，其相應(yīng)的效率是100±10％。從腸肌層釋放的介質(zhì)的分析蛋白和一氧化氮測(cè)定術(shù)后4或24小時(shí)，對(duì)照小鼠和接受腸操作的小鼠的小腸在無(wú)菌條件下被取出。結(jié)腸保留在原位。將小腸轉(zhuǎn)移到含有Hank’s液平衡的鹽水溶液(Sigma，St.Louis，MO)和200U/ml的青霉素G和200μg/ml的鏈霉素(HBSS)的碎裂機(jī)中，沖洗腸腔，并將組織轉(zhuǎn)移到含HBSS的第二個(gè)碎裂機(jī)中。如上述采集肌層，用于實(shí)時(shí)RT-PCR。整個(gè)采集過(guò)程中，組織保持在在3-5℃的無(wú)菌條件下。將分離的肌層在無(wú)菌紗布上點(diǎn)樣，測(cè)定樣品的濕重以獲得40-60毫克的等分試樣。在HBSS中洗滌該組織兩次。如上述將各等分試樣轉(zhuǎn)移到35毫米孔的培養(yǎng)板中，該板含有3ml含有青霉素/鏈霉素的無(wú)血清DMEM，并在5％的CO2孵箱中在37℃保溫24小時(shí)。加入培養(yǎng)基的藥物試劑在使用前過(guò)濾滅菌。保溫一段時(shí)間后，在液氮中冷凍等分量的培養(yǎng)基，并保存在-80℃。使用可購(gòu)得的ELISA試劑盒(R&D，Cambridge，MA)，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明測(cè)定分泌到培養(yǎng)基中的IL-6，IL-1β，PGE2和IL-10蛋白的水平。釋放到培養(yǎng)基中的一氧化氮(NO)通過(guò)測(cè)定NO代謝的穩(wěn)定終末產(chǎn)物估計(jì)。硝酸鹽/亞硝酸鹽水平使用可購(gòu)得的檢驗(yàn)試劑盒(Cayman，AnnArbor，MI)在術(shù)后24小時(shí)測(cè)定，并根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明定量。在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，使用顆?；逆k將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，并隨后使用Griess反應(yīng)測(cè)定樣品的總亞硝酸鹽濃度。所有測(cè)定都根據(jù)組織濕重標(biāo)準(zhǔn)化。吸入的CO抑制術(shù)后腸梗阻的發(fā)生總體觀察所有動(dòng)物都很快從手術(shù)中恢復(fù)。沒有與手術(shù)或者CO暴露方案相關(guān)的死亡或發(fā)病。盡管小鼠出現(xiàn)了腸梗阻，術(shù)后喂養(yǎng)和日常行為正常，并且麻醉恢復(fù)后，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就恢復(fù)了經(jīng)口攝取食物和水。HO-1的表達(dá)圖7A-7E是柱圖和照片，顯示了鼠小腸的手術(shù)操作后，腸肌層中血紅素加氧酶(HO)-1的表達(dá)。為研究?jī)?nèi)源性HO-1產(chǎn)物的潛在抗炎保護(hù)作用，通過(guò)SYBRgreen實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定HO-1mRNA表達(dá)的改變。圖7A顯示了未接受手術(shù)的對(duì)照小鼠和操作小鼠在剖腹術(shù)后3，6，12和24小時(shí)采集的腸肌層中，HO-1mRNA的表達(dá)模式。剖腹術(shù)后3小時(shí)，HO-1mRNA的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照明顯增加了35倍，其峰值表達(dá)出現(xiàn)在術(shù)后6小時(shí)，為45倍。盡管表達(dá)水平在6小時(shí)以后有所降低，直到術(shù)后24小時(shí)測(cè)定的終時(shí)間點(diǎn)，表達(dá)仍保持升高(22倍)。也研究了HO-1mRNA的增加是否導(dǎo)致手術(shù)操作后的腸肌層中蛋白的表達(dá)。HO-1的免疫組化對(duì)從沒有接受手術(shù)的小鼠采集的肌肉全層和從接受小腸操作術(shù)后24小時(shí)的小鼠采集的中段空腸肌肉全層包埋物進(jìn)行。在操作的動(dòng)物中，在大量浸潤(rùn)的多形核白細(xì)胞中觀察到HO-1免疫活性(圖7B)，并在與巨噬細(xì)胞形態(tài)相似的細(xì)胞中觀察到HO-1免疫活性(圖7C)。有時(shí)，發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)胞漿顆粒的細(xì)胞(粒細(xì)胞)也顯示強(qiáng)的HO-1免疫反應(yīng)性(圖7D)。弱HO-1免疫活性也見于分散在肌肉層中的不典型細(xì)胞群中。在未接受操作的對(duì)照小鼠的肌肉全層中沒有檢測(cè)到HO-1免疫反應(yīng)性(圖7E)。HO-1的免疫染色的特異性通過(guò)最初抗體的缺失確定(未顯示)。功能研究通過(guò)評(píng)估口服熒光素標(biāo)記的葡聚糖的胃腸分布，測(cè)定術(shù)后24小時(shí)對(duì)照和操作動(dòng)物中的腸轉(zhuǎn)運(yùn)。圖8A-8C是柱圖，顯示了口服給藥1.5小時(shí)后，從不可吸收的熒光素標(biāo)記的葡聚糖的分布測(cè)定的轉(zhuǎn)運(yùn)研究的結(jié)果。自然對(duì)照小鼠和CO處理的小鼠的每個(gè)腸節(jié)段中存在的熒光的中值柱圖繪制在圖8A中。在自然動(dòng)物中，標(biāo)記的葡聚糖在攝取葡聚糖90分鐘后，主要分布在末端小腸，盲腸，和遠(yuǎn)端結(jié)腸中。單獨(dú)吸入CO的治療(250ppm)導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)的輕微的不明顯的改變，其中所述標(biāo)記主要分布在盲腸和結(jié)腸中。圖8B對(duì)比了接受了腸操作，進(jìn)行或未進(jìn)行CO處理的小鼠中的熒光信號(hào)的分布。小腸操作后，所述熒光信號(hào)被限制在胃和小腸的近端3個(gè)節(jié)段。動(dòng)物用CO處理時(shí)，所述標(biāo)記在整個(gè)胃腸道較遠(yuǎn)端分布。幾何中心(GC)的計(jì)算結(jié)果總結(jié)在圖8C中用于統(tǒng)計(jì)比較。GC的值越高，熒光信號(hào)的分布越靠遠(yuǎn)端，并對(duì)應(yīng)于更快的轉(zhuǎn)運(yùn)。該圖中的值顯示CO加速未操作的小鼠中的腸轉(zhuǎn)運(yùn)，但GC值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。此外，如前所示GC顯示腸操作后轉(zhuǎn)運(yùn)顯著減慢，但這種轉(zhuǎn)運(yùn)的延長(zhǎng)在使用CO吸入處理的小鼠中明顯改善。小腸手術(shù)操作后24小時(shí)，在體外器官浴試驗(yàn)中研究了CO對(duì)自發(fā)的和氨甲酰甲膽堿刺激的小腸環(huán)肌收縮的影響，在該時(shí)間點(diǎn)腸梗阻顯示已形成。圖9A-9C顯示了這種小腸環(huán)形平滑肌帶的機(jī)械活性。圖9A是一組代表性的圖形，顯示了小腸環(huán)肌的自發(fā)收縮。來(lái)自自然小鼠小腸的肌肉帶出現(xiàn)有規(guī)律的收縮(圖9A；對(duì)照)，且使用CO處理沒有作用(圖9A；對(duì)照+CO)。IM以后，自發(fā)收縮活性被明顯抑制(圖9A；IM)。然而，在使用CO處理的IM小鼠中，節(jié)律性明顯改善(圖9A；IM+CO)。將毒蕈堿激動(dòng)劑氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)加入澆注液激發(fā)了濃度依賴的強(qiáng)制性收縮。將收縮曲線下的面積進(jìn)行總和，并根據(jù)肌肉帶表面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以獲得環(huán)肌收縮力的測(cè)定值。圖9B和9C是線圖，顯示了標(biāo)準(zhǔn)化的收縮力。在對(duì)照小鼠中，峰值收縮力(3.5±0.7g/s/mm2)是對(duì)100μM的氨甲酰甲膽堿反應(yīng)產(chǎn)生的(圖9B)。單獨(dú)的CO對(duì)對(duì)照收縮力(3.2±0.7g/s/mm2)沒有作用。手術(shù)操作導(dǎo)致與對(duì)照相比，整個(gè)劑量-反應(yīng)曲線的收縮力量的降低，當(dāng)氨甲酰甲膽堿的濃度大于10μM時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖9C)。這些小鼠中，100μM的氨甲酰甲膽堿產(chǎn)生的峰值收縮力降低了49％(1.7±0.4g/s/mm2)。吸入CO(250ppm)完全防止了手術(shù)操作的抑制效應(yīng)(3.6±0.7g/s/mm2)。MPO組織化學(xué)小腸的手術(shù)操作通常導(dǎo)致大量肌層內(nèi)的細(xì)胞炎性反應(yīng)。使用Hanker-Yates組織化學(xué)檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(MPO+)的活性，用來(lái)定量對(duì)照的和操作的，進(jìn)行和未進(jìn)行CO處理的動(dòng)物的組織中的白細(xì)胞浸潤(rùn)。圖10是柱圖，總結(jié)了該研究所用的四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，浸潤(rùn)腸肌層的MPO+陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)據(jù)。在200×的放大倍數(shù)下進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。在沒有進(jìn)行手術(shù)的對(duì)照動(dòng)物中，MPO+細(xì)胞非常少。手術(shù)麻醉和腸操作導(dǎo)致在24小時(shí)浸潤(rùn)肌層的MPO+細(xì)胞的數(shù)目增加了250倍。有趣的是，CO吸入治療對(duì)各組中白細(xì)胞浸潤(rùn)的程度沒有影響。促炎細(xì)胞因子表達(dá)圖11A-11C是柱圖，顯示了吸入CO對(duì)IL-6的表達(dá)的影響。該圖顯示了小腸操作后IL-6基因表達(dá)的時(shí)間過(guò)程，以及吸入的CO對(duì)于IL-6基因和蛋白表達(dá)的影響。使用實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行的時(shí)間過(guò)程分析顯示了手術(shù)后3和6小時(shí)，IL-6mRNA相對(duì)于自然對(duì)照小鼠增加了300倍(圖11A)。12小時(shí)后，表達(dá)迅速降低，在24小時(shí)降低到了相對(duì)于對(duì)照組的50倍的增加。吸入CO對(duì)3和6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)的操作誘導(dǎo)的基因表達(dá)沒有影響(圖11B)。在細(xì)胞培養(yǎng)基中保溫后，測(cè)定從分離的肌層中釋放的IL-6蛋白(圖11C)。IL-6蛋白在腸操作后24小時(shí)大量升高，并且與PCR數(shù)據(jù)相比，CO處理的小鼠中，蛋白釋放明顯降低了70％。還研究了促炎細(xì)胞因子IL-1β。IL-1β基因表達(dá)的時(shí)間過(guò)程如圖12A-12B所示。IL-1β的測(cè)定被天然對(duì)照小鼠和使用CO處理的對(duì)照小鼠中的肌外層中的mRNA水平低于序列分析儀的檢測(cè)能力這一觀察復(fù)雜化。因此，術(shù)后6小時(shí)采集的來(lái)自操作的小鼠的樣品被連續(xù)稀釋，并且將循環(huán)閾值(CT)的值根據(jù)沒有稀釋的樣品中測(cè)定的β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。隨后使用IL-1β的最低濃度計(jì)算對(duì)照ΔCT值，在該濃度CT降低到線性范圍以內(nèi)。隨后計(jì)算余下的實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)相對(duì)于所述對(duì)照組的改變，且因此在對(duì)其實(shí)際倍數(shù)增加的估計(jì)上是保守的。從這些計(jì)算發(fā)現(xiàn)，對(duì)手術(shù)麻醉和腸操作反應(yīng)的IL-1βmRNA的表達(dá)在手術(shù)后3小時(shí)，相對(duì)于對(duì)照增加了38倍。最大表達(dá)的出現(xiàn)稍晚于較早報(bào)道的IL-6較早的表達(dá)，在術(shù)后6小時(shí)和12小時(shí)達(dá)到170倍和150倍，并在24小時(shí)再次降低到40倍(圖12A)。在使用CO處理的動(dòng)物中，IL-1β在6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)降低了60％(圖12B)。從術(shù)后24小時(shí)采集的肌外層中釋放的IL-1β蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)基中再保溫24小時(shí)后測(cè)定(圖12C)。與RT-PCR相關(guān)，沒有IL-1β蛋白可在任一對(duì)照組中檢測(cè)出，而100mg提取的組織所產(chǎn)生的蛋白的濃度在腸操作后升高。該反應(yīng)在使用CO吸入處理的小鼠中明顯降低了60％。環(huán)加氧酶-2和可誘導(dǎo)的一氧化氮合酶表達(dá)活化的固有(resident)巨噬細(xì)胞和浸潤(rùn)白細(xì)胞合成并釋放來(lái)自環(huán)加氧酶可誘導(dǎo)的同種型的前列腺素，COX-2，以及來(lái)自一氧化氮合酶(iNOS)的可誘導(dǎo)形式的一氧化氮(NO)，上述物質(zhì)對(duì)小腸平滑肌收縮器有直接且有效的抑制作用。操作后iNOS表達(dá)的時(shí)間圖顯示在圖13A-13C中。時(shí)間過(guò)程分析顯示，基因表達(dá)在小腸操作后3和6小時(shí)明顯增加(圖13B)。6小時(shí)處的峰值表達(dá)在CO處理的動(dòng)物中降低了60％(圖14B)。天然小鼠暴露于CO對(duì)iNOS的表達(dá)沒有影響(倍數(shù)增加對(duì)照，1.06±0.18；CO3小時(shí)，1.04±0.19；CO6小時(shí)；1.26±0.19)。測(cè)定從術(shù)后24小時(shí)采集的肌層提取物中釋放到培養(yǎng)基的總亞硝酸鹽，作為對(duì)NO產(chǎn)生的估計(jì)(圖13C)。如PCR數(shù)據(jù)所預(yù)測(cè)的，亞硝酸鹽的測(cè)定值在腸操作后明顯增加，并且用CO處理小鼠使該增加降低了75％。該反應(yīng)類似的減弱通過(guò)將肌層提取物在存在選擇的iNOS抑制物，L-Nil(50μM)，的條件下保溫實(shí)現(xiàn)，表明iNOS是手術(shù)誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生增加的來(lái)源。圖14A-14D是柱圖，顯示了吸入CO對(duì)COX-2表達(dá)的影響。該圖顯示了IM誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)的時(shí)間圖。時(shí)間過(guò)程分析顯示COX-2基因表達(dá)在術(shù)后3-6小時(shí)增加了8-10倍，并且在24小時(shí)內(nèi)保持升高(圖14A)。CO處理對(duì)3或6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)無(wú)影響(圖14B)。術(shù)后3小時(shí)，未手術(shù)的對(duì)照小鼠CO吸入本身導(dǎo)致相對(duì)小的(2.5倍)COX-2信號(hào)的誘導(dǎo)(圖14C)。PGE2從術(shù)后24小時(shí)采集的肌層提取物中的釋放作為COX-2活性的標(biāo)志物被測(cè)定(圖14D)。與PCR的數(shù)據(jù)一致，單獨(dú)吸入CO和小腸操作都導(dǎo)致PGE2的釋放明顯增加。尤其是對(duì)PGE2而言，用CO處理操作的小鼠對(duì)IM誘導(dǎo)的這種前列腺類物質(zhì)釋放沒有影響?？寡谆虮磉_(dá)IL-10是一種多效細(xì)胞因子，在胃腸道中具有重要的保護(hù)和抗炎效應(yīng)。圖15A-15C顯示CO吸入對(duì)IL-10表達(dá)的影響。該圖顯示了IL-10表達(dá)隨時(shí)間變化的圖形。術(shù)后3和6小時(shí)，對(duì)腸操作反應(yīng)的基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照增加了12倍。隨后表達(dá)降低，但在24小時(shí)內(nèi)與對(duì)照表達(dá)相比，仍保持升高大約4倍(圖5A)。在3小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，在CO處理的操作動(dòng)物中，IL-10基因表達(dá)比對(duì)照增加到43倍，比單獨(dú)的操作引起的反應(yīng)高300％(圖15B)。在對(duì)照小鼠中，單獨(dú)的CO吸入足以誘導(dǎo)IL-10表達(dá)的明顯增加(圖15C)。吸入的CO對(duì)HO-1基因表達(dá)的作用也被評(píng)估。圖6A-16B顯示了CO吸入對(duì)HO-1表達(dá)的影響。圖16A對(duì)比了術(shù)后3小時(shí)和6小時(shí)，IM誘導(dǎo)的基因表達(dá)(見圖7D)，以及CO處理的操作小鼠中IM誘導(dǎo)基因的表達(dá)。吸入CO也使術(shù)后3小時(shí)的HO-1基因表達(dá)比單獨(dú)操作增加到300％的水平(圖16B)。在這種情況下，未接受手術(shù)的對(duì)照小鼠只吸入CO誘導(dǎo)了盡管明顯但小的HO-1基因表達(dá)的增加，但只是在6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。本實(shí)施例提供了吸入低濃度的CO(250ppm)顯著降低術(shù)后腸梗阻的特征性腸運(yùn)動(dòng)障礙的體內(nèi)和體外證據(jù)。該數(shù)據(jù)顯示了CO能在基因和蛋白的表達(dá)水平起作用，從而選擇性調(diào)節(jié)促炎和抗炎途徑的具體元件，使得腸功能明顯改善。術(shù)后腸梗阻是腹部手術(shù)目前實(shí)際上不能避免的后果，并且可從短期的張力缺乏到可持續(xù)數(shù)天的嚴(yán)重的麻痹性腸梗阻。麻痹性腸梗阻的特征是腸淤滯，細(xì)菌過(guò)量生長(zhǎng)，和體液電解質(zhì)紊亂，導(dǎo)致很高的發(fā)病率并通常導(dǎo)致死亡。將小鼠通過(guò)吸入暴露于CO改善了操作誘導(dǎo)的自發(fā)環(huán)形平滑肌收縮力的抑制，恢復(fù)了該肌肉對(duì)膽堿能激動(dòng)劑產(chǎn)生反應(yīng)而收縮的能力，并明顯降低了腸轉(zhuǎn)運(yùn)的損害。獲得總體收縮功能的改善而不明顯降低炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，表明CO對(duì)炎性級(jí)聯(lián)元件而不是與白細(xì)胞募集相關(guān)的那些元件起作用。為了評(píng)估CO對(duì)炎性級(jí)聯(lián)的影響，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR評(píng)估促炎和抗炎介質(zhì)基因的表達(dá)。增加的促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-1水平在人和動(dòng)物的急性和慢性腸炎癥，包括術(shù)后腸梗阻中持續(xù)表達(dá)。IL-6活化各種細(xì)胞類型以誘導(dǎo)化學(xué)引誘物和粘附分子的合成，并由此在發(fā)動(dòng)白細(xì)胞募集和外滲到腸肌層中起核心作用。在該實(shí)施例中，吸入CO不改變術(shù)后3和6小時(shí)測(cè)定的早期手術(shù)誘導(dǎo)的IL-6基因表達(dá)的增加，這一發(fā)現(xiàn)和CO缺乏對(duì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度的影響一致。然而，在CO處理的小鼠中，術(shù)后24小時(shí)測(cè)定的IL-6蛋白從分離的腸肌層中的釋放降低了60％，從5000pg/ml到2000pg/ml，表明CO對(duì)IL-6表達(dá)具有轉(zhuǎn)錄后效應(yīng)。該持續(xù)的蛋白釋放水平與自然對(duì)照(150pg/ml)相比，仍然是顯著升高的，使得很難估計(jì)這對(duì)IL-6促炎信號(hào)有怎樣的影響。然而最近的研究顯示，IL-6可能還具有重要的抗炎性質(zhì)，表明IL-6的持續(xù)表達(dá)對(duì)于誘導(dǎo)特定保護(hù)性途徑是必要的。這些可能包括抑制TNFα，IL-1β和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2的能力，以及增加IL-1受體拮抗劑和TNF-可溶的受體在體外的水平。因此，IL-6介導(dǎo)的促炎途徑的抑制，以及在炎癥級(jí)聯(lián)的后期IL-6介導(dǎo)的抗炎途徑的啟動(dòng)，可能導(dǎo)致術(shù)后24小時(shí)所見的腸收縮力的改善。IL-1β在術(shù)后腸梗阻中起的作用還沒有很好的定論，但內(nèi)源性IL-1β顯示抑制大鼠腸平滑肌對(duì)膽堿能激動(dòng)劑以及對(duì)電刺激的收縮反應(yīng)，表明其通過(guò)改變神經(jīng)元通路顯示其抑制效果。此外，IL-1活性的免疫中和作用極大地降低了結(jié)腸炎鼠模型中疾病的嚴(yán)重性，表明這種細(xì)胞因子在腸炎癥中也起重要的啟動(dòng)作用。在CO處理的操作小鼠中，IL-1β基因表達(dá)顯著降低，術(shù)后6小時(shí)手術(shù)誘導(dǎo)的基因表達(dá)降低了75％，且術(shù)后24小時(shí)測(cè)定的蛋白表達(dá)也相應(yīng)降低。因此，預(yù)期IL-1β的促炎活性，以及其可能的對(duì)神經(jīng)肌肉器的抑制作用將被明顯減弱?？偟膩?lái)看，這些發(fā)現(xiàn)表明CO吸入的保護(hù)作用至少部分通過(guò)靶向IL-6和IL-1β介導(dǎo)的促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的選擇性元件的機(jī)制而出現(xiàn)，所述級(jí)聯(lián)反應(yīng)不依賴于白細(xì)胞募集，或者在白細(xì)胞募集被完全啟動(dòng)以后出現(xiàn)。盡管浸潤(rùn)白細(xì)胞的數(shù)目在CO處理的小鼠中沒有改變，細(xì)胞因子的數(shù)據(jù)表明，存在細(xì)胞因子的CO依賴性功能抑制，其中所述細(xì)胞因子通常由白細(xì)胞產(chǎn)生。因此，研究了對(duì)白細(xì)胞來(lái)源的運(yùn)動(dòng)活躍的平滑肌介質(zhì)NO和PGE2的調(diào)節(jié)，所述介質(zhì)可作為CO抑制的其它靶點(diǎn)。已顯示COX-2產(chǎn)生的前列腺類物質(zhì)和iNOS產(chǎn)生的一氧化氮對(duì)腸平滑肌收縮力具有有效的抑制作用，而且對(duì)COX-2酶的抑制或來(lái)源于白細(xì)胞的iNOS基因的選擇性敲除明顯增加了對(duì)術(shù)后腸梗阻發(fā)生的抵抗性。在本實(shí)施例中，對(duì)iNOS和COX-2基因表達(dá)的研究顯示，這兩者在腸操作后顯著升高。手術(shù)誘導(dǎo)的iNOS基因表達(dá)和NO產(chǎn)生中的增加在CO處理的動(dòng)物中大約降低了75％，表明CO在基因轉(zhuǎn)錄的水平起作用以調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)。在體外還顯示，NOS的活性，以及NOS的內(nèi)皮同種型和神經(jīng)元同種型，可直接被CO抑制，可能是通過(guò)CO與存在于NOS蛋白上的血紅素基團(tuán)的結(jié)合產(chǎn)生的。總的來(lái)看，降低的基因表達(dá)和/或酶活性造成的NO釋放降低預(yù)期明顯地造成CO吸入誘導(dǎo)的腸功能的改善。與iNOS相反，CO吸入對(duì)手術(shù)誘導(dǎo)的COX-2mRNA表達(dá)或PGE2釋放沒有影響，如保溫的肌層(術(shù)后24小時(shí)采集)的培養(yǎng)基中測(cè)定的那樣。有趣的是，天然小鼠吸入CO導(dǎo)致術(shù)后3小時(shí)COX-2mRNA的表達(dá)升高2.5倍，且24小時(shí)后PGE2的釋放相應(yīng)地增加。CO誘導(dǎo)的COX-2以前沒有報(bào)道，這一增加的活性的功能后果是未知的。CO處理的對(duì)照小鼠沒有顯示功能損害或者促炎介質(zhì)的升高，表明在這種情況下，COX-2的誘導(dǎo)在促炎能力中不起作用。CO吸入的顯著效果之一是對(duì)與抗炎途徑相關(guān)的基因IL-10和HO-1的表達(dá)。盡管這兩種基因都在腸操作后誘導(dǎo)，在CO處理的操作動(dòng)物中，表達(dá)增加了300％。在術(shù)后3小時(shí)而不是6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)觀察到這一增加，表明CO暴露導(dǎo)致這些基因的早期誘導(dǎo)，這一概念由顯示天然動(dòng)物單獨(dú)吸入CO明顯誘導(dǎo)IL-10和HO-1的結(jié)果支持。這些介質(zhì)在術(shù)后腸梗阻中的作用以前沒有被描述。然而，IL-10是多效的細(xì)胞因子，對(duì)淋巴樣細(xì)胞和髓樣細(xì)胞具有廣泛的生物效應(yīng)譜。其已知的功能之一就是抑制促炎介質(zhì)的產(chǎn)生；包括腫瘤壞死因子α(TNFα)，IL-6，IL-1，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，以及活化的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮。近來(lái)，發(fā)現(xiàn)IL-10通過(guò)拮抗L-精氨酸的細(xì)胞吸收以及iNOS本身的催化活性抑制LPS激活的鼠巨噬細(xì)胞的NO產(chǎn)生，從而極大地促使NO對(duì)腸平滑肌的抑制作用的減弱。此外，還逐步發(fā)現(xiàn)，對(duì)HO-1介導(dǎo)的途徑的誘導(dǎo)，在多種急性和慢性炎性條件下具有重要的抗炎作用的細(xì)胞保護(hù)作用。目前有證據(jù)表明，這兩種介質(zhì)的表達(dá)是相關(guān)的。公開的發(fā)現(xiàn)表明，暴露于CO提高IL-10基因的表達(dá)和從LPS-刺激的巨噬細(xì)胞中的蛋白釋放。近期，內(nèi)源性IL-10被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞中的IL-10，且HO-1的誘導(dǎo)是IL-10對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的TNFα的產(chǎn)生的抑制效應(yīng)所需的。HO-1的早期誘導(dǎo)導(dǎo)致增加的內(nèi)源性CO產(chǎn)出，預(yù)期可促成外源性使用氣體的效果。此外，HO-1活性具有細(xì)胞保護(hù)和抗氧化性質(zhì)，所述性質(zhì)是由膽綠素和膽紅素的氧化還原循環(huán)過(guò)程中的自由基清除造成的。因此，增加的IL-10產(chǎn)生和增強(qiáng)的HO-1活性將協(xié)同起作用，通過(guò)下調(diào)促炎介質(zhì)表達(dá)，增強(qiáng)CO的組織利用度，和提供對(duì)自由基應(yīng)激的保護(hù)，在炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生早期抑制該反應(yīng)?？傊?，本文的數(shù)據(jù)表明，CO吸入的保護(hù)作用通過(guò)靶向促炎和抗炎途徑中的選擇性元件發(fā)生。CO在基因和蛋白的水平起作用，導(dǎo)致IL-10和HO-1的誘導(dǎo)，IL-1β的下調(diào)，和iNOS的抑制。這些效應(yīng)在一起造成對(duì)小腸肌層內(nèi)手術(shù)誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致術(shù)后功能的改善。實(shí)施例3CO抑制小鼠和豬的小腸手術(shù)操作相關(guān)的腸梗阻的發(fā)生通過(guò)對(duì)小腸的輕柔操作在小鼠中誘導(dǎo)腸梗阻。作切口暴露小鼠的腹腔，小腸操作是通過(guò)輕柔地戳和刺小腸進(jìn)行的(見例如Schwarz等.，Gastroenterology121(6)1354-1357(2001))。切口隨后被關(guān)閉，且24小時(shí)后進(jìn)行分析。小鼠在腸操作前一小時(shí)通過(guò)吸入暴露于CO(250ppm和500ppm)，并且在整個(gè)24小時(shí)的恢復(fù)期也通過(guò)吸入暴露于CO(250ppm和500ppm)。通過(guò)測(cè)定環(huán)形肌帶對(duì)氨甲酰甲膽堿(0.3-300μM)反應(yīng)的收縮在體外測(cè)定腸收縮力，并通過(guò)從口服熒光素標(biāo)記的葡聚糖的分布測(cè)定腸轉(zhuǎn)運(yùn)以及如上述實(shí)施例1所述計(jì)算幾何中心。HO-1和IL-10mRNA從肌外層提取物的表達(dá)是通過(guò)SYBRgreen實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定的，如實(shí)施例1所述。平滑肌收縮的有效抑制物一氧化氮(NO)的釋放，通過(guò)測(cè)定血清總亞硝酸鹽估測(cè)，也在上述實(shí)施例1中描述。與對(duì)照相比(2.2±0.5g/s/mm2)，對(duì)氨甲酰甲膽堿(100μM)反應(yīng)產(chǎn)生的峰值收縮力被IM明顯降低(1.1±0.2g/s/mm2)。IM誘導(dǎo)的收縮抑制在IM+CO小鼠中被阻止(1.9±0.5g/s/mm2)。小腸轉(zhuǎn)運(yùn)在CO處理的小鼠中也得到改善(幾何中心；對(duì)照＝11.0±0.5，IM＝2.7±0.2，IM+CO＝6.3±0.8)。RT-PCR數(shù)據(jù)顯示，IM后，相對(duì)于對(duì)照IM誘導(dǎo)在6小時(shí)時(shí)的峰值HO-1表達(dá)(45倍)，和IL-6(300倍)以及IL-10(13倍)在3小時(shí)的表達(dá)明顯增加。在IM-CO小鼠中，HO-1表達(dá)峰值出現(xiàn)較早，即IM后3小時(shí)，相對(duì)于對(duì)照其表達(dá)水平較高(150倍)。IL-10在3小時(shí)的表達(dá)在IM-CO小鼠中也較高(35倍)。血清亞硝酸鹽在IM后增加(18.3±3.6μM)對(duì)對(duì)照(2.4±1.0μM)，并在IM-CO后降低(6.0±1.6μM)。因此，CO在體外和體內(nèi)都減輕手術(shù)誘導(dǎo)的腸運(yùn)動(dòng)障礙，其機(jī)制可能涉及抗炎細(xì)胞因子IL-10的誘導(dǎo)和降低的NO產(chǎn)生。HO-1的早期誘導(dǎo)(其表達(dá)比單獨(dú)IM增加了300％)將增加CO的可利用度，增強(qiáng)其抗炎效果。類似的實(shí)驗(yàn)可在豬模型中進(jìn)行。通過(guò)輕微操作小腸(IM)誘導(dǎo)腸梗阻。IM前將豬暴露于CO(250ppm)或空氣(對(duì)照)3小時(shí)。通過(guò)觀察置于小腸內(nèi)的鋼性球形物(steelballbearing)的腸轉(zhuǎn)運(yùn)，評(píng)估體內(nèi)的胃腸道功能。發(fā)現(xiàn)CO可改善腸操作后的腸轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)施例4剖腹術(shù)前使用低濃度的CO(250-75ppm)預(yù)治療3小時(shí)，防止術(shù)后腸梗阻本實(shí)施例顯示了短期釋放的低濃度CO可防止術(shù)后腸梗阻的發(fā)生。腸梗阻通過(guò)對(duì)小腸的輕微操作(IM)誘導(dǎo)。剖腹術(shù)前，將大鼠暴露于空氣中的濃度遞減的CO(250，125，75，30ppm)1小時(shí)或3小時(shí)(n＝6)。將結(jié)果與使用先前已建立的方案獲得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，所述方案即剖腹術(shù)前暴露于250ppm的CO1小時(shí)，術(shù)后暴露24小時(shí)。通過(guò)從口服喂養(yǎng)的熒光素標(biāo)記的葡聚糖在整個(gè)胃腸道的分布測(cè)定腸轉(zhuǎn)運(yùn)，評(píng)估體內(nèi)的胃腸功能。測(cè)定標(biāo)記的葡聚糖的中值分布，用于通過(guò)計(jì)算幾何中心(GC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。經(jīng)過(guò)手術(shù)操作的大鼠和沒有經(jīng)過(guò)手術(shù)的對(duì)照相比，其幾何中心明顯降低(GC分別為對(duì)照＝9.8±0.4，IM＝5.8±0.4)，表明腸轉(zhuǎn)運(yùn)明顯減慢。盡管將未接受手術(shù)的大鼠暴露于250ppm24小時(shí)導(dǎo)致腸轉(zhuǎn)運(yùn)輕微延緩(GC8.8±0.4)，1小時(shí)的預(yù)治療后，使用250ppm的CO進(jìn)行24小時(shí)的處理，導(dǎo)致接受手術(shù)操作的大鼠的腸轉(zhuǎn)運(yùn)明顯改善(GC8.2±0.4)。僅在術(shù)前使用250ppm對(duì)操作的大鼠進(jìn)行1小時(shí)的預(yù)處理，在預(yù)防手術(shù)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制中的效果較差(GC7.2±0.3)，而預(yù)處理3小時(shí)產(chǎn)生的效果和24小時(shí)的預(yù)處理的效果等同(GC8.6±0.3)。通過(guò)使用如125和75ppm這樣低的濃度進(jìn)行預(yù)處理獲得相似的改善(GC分別為8.6±0.4和8.8±0.1)。當(dāng)CO濃度進(jìn)一步降低到30ppm，這種保護(hù)效應(yīng)降低(GC7.0±0.2)。本實(shí)施例顯示了獲得對(duì)術(shù)后腸梗阻的完全保護(hù)效應(yīng)無(wú)需延長(zhǎng)地暴露于CO。將低濃度的CO在術(shù)前期摻入麻醉氣體中，可提供侵入性最小的技術(shù)，其可協(xié)助降低易感患者的腸梗阻，從而加速術(shù)后恢復(fù)并將縮短住院期。實(shí)施例5治療腸梗阻的方案以下實(shí)施例顯示了在手術(shù)前，其間，和/或以后治療患者的方案，所述手術(shù)例如移植(例如SITx)或非移植手術(shù)(例如可導(dǎo)致腸梗阻的手術(shù))。所述實(shí)施例包括治療腸梗阻的方案，例如由移植和非移植手術(shù)造成的腸梗阻，以及使用CO處理移植手術(shù)中的供體，其胃腸道或其胃腸道的一部分例如小腸，和受體的其它方案。以下方法中的任何一種或多種都可用于給定的手術(shù)方法中?；颊叩奶幚韺?duì)患者進(jìn)行手術(shù)以前，其間和/或以后，或者患者被診斷為腸梗阻(例如由手術(shù)造成或由不涉及手術(shù)的情況造成的腸梗阻)后，可將一氧化碳系統(tǒng)地或局部地給予患者。患者可吸入的CO的濃度可以從10ppm到1000ppm，例如，約100ppm到約800ppm，約150ppm-約600ppm，或約200ppm-約500ppm。優(yōu)選的濃度包括，例如，約30ppm，50ppm，75ppm，100ppm，125ppm，200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或約1000ppm。例如，可將一氧化碳間斷或連續(xù)給藥患者，在手術(shù)進(jìn)行前0-20天開始，例如，至少在手術(shù)前約30分鐘開始，例如，手術(shù)前約1，2，3，5，7，或10小時(shí)，或約1，2，4，6，8，10，12，14，18，或20天，或大于20天開始。可選或此外，可將一氧化碳在手術(shù)期間給予患者，例如通過(guò)局部和/或通過(guò)吸入來(lái)給藥。可選或此外，可將一氧化碳在術(shù)后給藥患者，例如手術(shù)完成后立刻，并在手術(shù)完成后持續(xù)約1，2，3，5，7，或10小時(shí)，或約1，2，5，8，10，20，30，50，或60天，或不定期，直到正常腸運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。移植方法供體的處理收獲器官或其部分前，可使用吸入的一氧化碳(250ppm)處理供體一小時(shí)。處理的給藥的劑量可從10ppm-1000ppm，時(shí)間從一小時(shí)到六小時(shí)，或者從開始可能處理腦死亡(尸體)供體到器官被取出的時(shí)間的整個(gè)階段。對(duì)于人類供體，宣布腦死亡后應(yīng)盡早進(jìn)行處理。在一些應(yīng)用中，需要在腦死亡前進(jìn)行處理。對(duì)于非人動(dòng)物(例如豬)用作異種移植供體的情況，如需要可用相對(duì)高水平的吸入的一氧化碳處理活動(dòng)物，只要由此產(chǎn)生的碳氧血紅蛋白不損害待移植器官的生存力和功能。例如，可使用大于500ppm(例如，1000ppm或更高，甚至達(dá)10,000ppm，特別是短時(shí)間使用)的濃度。器官的原位處理從供體收獲器官前，可以在該器官仍在供體體內(nèi)時(shí)將該器官內(nèi)充滿溶液，例如緩沖液或介質(zhì)。目的是使用用一氧化碳飽和的溶液沖洗該器官，并保持在一氧化碳的環(huán)境中，使得一氧化碳的含量保持飽和。沖洗可進(jìn)行至少10分鐘，例如1小時(shí)，幾小時(shí)或更長(zhǎng)。較理想的是，該溶液將可能的最高濃度的一氧化碳遞送到器官的細(xì)胞。器官的活體外(exvivo)處理器官如小腸從供體取出后到移植給受體以前，可保存在包含一氧化碳的介質(zhì)中。這可通過(guò)將器官或組織保存在含有一氧化碳的介質(zhì)中進(jìn)行，或者通過(guò)灌注這種介質(zhì)進(jìn)行。由于這種情況出現(xiàn)在活體外而不是動(dòng)物體內(nèi)，可使用非常高濃度的一氧化碳?xì)怏w(例如，10,000ppm)使該介質(zhì)被一氧化碳飽和。受體的處理可用一氧化碳處理受體?？稍谝浦彩中g(shù)當(dāng)天手術(shù)開始前至少30分鐘開始處理?？蛇x地，可以于再灌注受體器官前30分鐘開始?？沙掷m(xù)至少30分鐘，例如一小時(shí)?？蓪?0ppm到3000ppm的一氧化碳劑量遞送不同時(shí)間，例如數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)，并可在移植當(dāng)天和移植后數(shù)天給藥。例如，受體可在三次連續(xù)10秒的呼吸中吸入例如3000ppm濃度的一氧化碳?？蛇x地，也可以采用規(guī)律呼吸而不是深呼吸(breathholding)的方式間斷或連續(xù)地遞送較低濃度的氣體，遞送較長(zhǎng)時(shí)間。碳氧血紅蛋白濃度可指導(dǎo)對(duì)患者適當(dāng)?shù)亟o藥一氧化碳。通常，受體的處理不應(yīng)導(dǎo)致碳氧血紅蛋白水平升高到被認(rèn)為可能給需要移植的患者造成危險(xiǎn)的程度。應(yīng)理解，雖然發(fā)明詳述描述了本發(fā)明，前述說(shuō)明意圖列舉但不是限制所附權(quán)利要求限定的范圍。其它方面，優(yōu)點(diǎn)，和改動(dòng)也在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有腸梗阻的患者；和將包含治療患者的腸梗阻的有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥該患者。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述腸梗阻是小腸的腸梗阻。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述腸梗阻是結(jié)腸的腸梗阻。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述腸梗阻是胃的腸梗阻。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述腸梗阻是手術(shù)后腸梗阻。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述腸梗阻是產(chǎn)后腸梗阻。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥物組合物通過(guò)吸入給藥患者。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥物組合物是液體形式的，并且通過(guò)口服給藥患者。9.權(quán)利要求1的方法，其中將所述藥物組合物直接給藥至患者的腹腔。10.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有由于各種腹部手術(shù)導(dǎo)致的腸梗阻或者有患該腸梗阻危險(xiǎn)的患者，所述腹部手術(shù)選自泌尿生殖系統(tǒng)的手術(shù)；消化系統(tǒng)的手術(shù)；淋巴系統(tǒng)的手術(shù)；呼吸系統(tǒng)的手術(shù)；膈的手術(shù)；治療癌癥的手術(shù)；子宮內(nèi)膜手術(shù)；或矯形手術(shù)；和將包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥所述患者。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述腸梗阻是小腸的腸梗阻。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述的腸梗阻是結(jié)腸的腸梗阻。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述藥物組合物通過(guò)吸入給藥患者。14.權(quán)利要求10的方法，其中所述藥物組合物是液體形式的，并且通過(guò)口服給藥患者。15.權(quán)利要求10的方法，其中將所述藥物組合物直接給藥至患者的腹腔。16.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括鑒定患有或者可能患不是由手術(shù)造成的腸梗阻的患者；和將包含治療患者腸梗阻有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥所述患者。17.治療患者的腸梗阻的方法，所述方法包括(a)提供含有包含一氧化碳?xì)怏w的加壓氣體的容器；(b)鑒定患有腸梗阻的患者；(c)從所述容器中釋放加壓氣體，以形成含有一氧化碳?xì)怏w的環(huán)境；和(d)將所述患者暴露于該環(huán)境，其中環(huán)境中一氧化碳的量足以治療患者的腸梗阻。18.含有壓縮的醫(yī)用級(jí)一氧化碳?xì)怏w的容器，所述容器帶有表明該氣體可用來(lái)治療患者的腸梗阻的標(biāo)簽。19.權(quán)利要求18的容器，其中所述一氧化碳?xì)怏w和含氧的氣體混合。20.權(quán)利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳?xì)怏w的濃度至少約0.025％。21權(quán)利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳?xì)怏w的濃度至少約0.05％。22權(quán)利要求19的容器，其中混合物中的一氧化碳?xì)怏w的濃度至少約0.10％。23.權(quán)利要求19的容器，其中的混合物中的一氧化碳?xì)怏w的濃度至少約1.0％。24.權(quán)利要求19的容器，其中的混合物中的一氧化碳?xì)怏w的濃度至少約2.0％。全文摘要本發(fā)明涉及治療患者的腸梗阻的方法，包括將包含一氧化碳的藥物組合物給藥患者。文檔編號(hào)A61K9/72GK1658889SQ03812662公開日2005年8月24日申請(qǐng)日期2003年2月21日優(yōu)先權(quán)日2002年4月15日發(fā)明者利奧·E·奧特拜因,奧古斯丁·M·K·喬伊,貝弗利·A·穆爾,安東尼·J·鮑爾申請(qǐng)人:聯(lián)邦高等教育系統(tǒng)匹茲堡大學(xué),耶魯大學(xué)