專(zhuān)利名稱(chēng)：逆轉(zhuǎn)錄病毒免疫療法的策略的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種治療哺乳動(dòng)物被試者中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。更具體而言，本發(fā)明提供一種治療導(dǎo)致人類(lèi)被試者中免疫缺陷-相關(guān)疾病的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。
背景技術(shù)：
人免疫缺陷病毒(HIV)可誘導(dǎo)持續(xù)和進(jìn)展性的感染，在絕大多數(shù)情況下，導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的發(fā)生?，F(xiàn)有至少有2種不同類(lèi)型的HIVHIV-1和HIV-2。在人類(lèi)中，HIV感染最終導(dǎo)致免疫機(jī)能不全、機(jī)會(huì)性感染、神經(jīng)機(jī)能障礙、腫瘤生長(zhǎng)、及最后的死亡。
HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒家族的成員。逆轉(zhuǎn)錄病毒是較小的有包膜病毒，含有單鏈RNA基因組，并經(jīng)由DNA中間體插入到通過(guò)病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的宿主DNA中而復(fù)制。其它逆轉(zhuǎn)錄病毒包括，例如，致癌病毒，如人T-細(xì)胞白血病病毒(HTLV-I、-II、-III)、貓白血病病毒、和鼠C型逆轉(zhuǎn)錄病毒。
HIV病毒顆粒包括病毒核心，部分由被稱(chēng)作p24和p18的衣殼蛋白組成，以及病毒RNA基因組和早期復(fù)制事件所需的那些酶。十四?；痝ag蛋白圍繞病毒核心形成外層病毒殼，其依次被來(lái)源于感染細(xì)胞膜的脂膜包膜圍繞。HIV包膜表面糖蛋白被合成為一個(gè)單一的160千道爾頓的前體蛋白，其在病毒向兩個(gè)糖蛋白gp41和gp120中芽殖的過(guò)程中被細(xì)胞蛋白酶裂解。gp41是一種跨膜糖蛋白，gp120是一種胞外糖蛋白，其保持與gp41非共價(jià)關(guān)聯(lián)，可能是三聚或多聚的形式。
HIV感染屬于流行病，且HIV-相關(guān)疾病代表了一種主要的世界健康問(wèn)題。雖然已經(jīng)付出巨大的努力來(lái)設(shè)計(jì)有效的療法，但是目前還沒(méi)有抗AIDS的可治愈的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物或療法存在。在研制這種藥物的嘗試中，HIV生命周期的若干階段已經(jīng)被認(rèn)為是治療性干預(yù)的目標(biāo)(Mitsuya等，1991)。
人們已經(jīng)關(guān)注研制用于治療HIV感染的疫苗。HIV-1包膜蛋白(gp160、gp120、gp41)已經(jīng)顯示是AIDS患者中存在的抗-HIV抗體的主要抗原(Barin等，1985)。因此，迄今這些蛋白似乎是作為抗-HIV疫苗研究的抗原起作用的最有希望的候選物。很多小組已經(jīng)開(kāi)始使用gp160、gp120、和/或gp41的各個(gè)部分作為宿主免疫系統(tǒng)的免疫原性靶(US 5,141,867；WO 92/22654；WO 91/09872；WO 90/07119；US 6,090,392)。盡管作了這些努力，但是還沒(méi)有研制出用于治療HIV感染的有效疫苗策略。
本發(fā)明提供一種用于治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的替代免疫療法。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)注意到在應(yīng)答感染哺乳動(dòng)物的逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)產(chǎn)生至少兩個(gè)免疫細(xì)胞群體。具體而言，感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)能夠通過(guò)一組細(xì)胞，此處通常稱(chēng)作“效應(yīng)細(xì)胞”增強(qiáng)抗所述病毒的免疫應(yīng)答，然而，第二細(xì)胞群體也同時(shí)產(chǎn)生，它們可調(diào)節(jié)“效應(yīng)細(xì)胞”，此處通常稱(chēng)作“調(diào)節(jié)細(xì)胞”，限制哺乳動(dòng)物有效控制或消除逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的能力。
然而不希望受到理論的限制，提出了人含有很多與在它們基因組內(nèi)斷裂成穩(wěn)定的可遺傳元件的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列同源或近似同源的序列。因此，由這些序列編碼的蛋白可在免疫應(yīng)答的發(fā)展過(guò)程中“自我”識(shí)別。隨后的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染還可部分“自我”識(shí)別，限制免疫系統(tǒng)增強(qiáng)成功的免疫應(yīng)答的能力。這個(gè)提議，至少部分，可解釋為什么直到現(xiàn)在還很難研制出抗HIV的有效疫苗。
這種假設(shè)的支持已經(jīng)由Rakowicz-Szulczynska及其同事(1998和2000)提出，它們證明了與乳腺癌有關(guān)的某些抗原與由HIV-1編碼的蛋白在分子學(xué)和免疫學(xué)方面相似。相似的觀察結(jié)果已經(jīng)相對(duì)于其它癌癥作出。此外，Coll等(1995)已經(jīng)報(bào)道了結(jié)合患有自身免疫疾病，如Sjogren’s綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中的HIV-1的抗體。此外，對(duì)具有人免疫缺陷病毒基因組序列的人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的BLAST檢索表明兩個(gè)基因組之間的很多區(qū)明顯相同。人們已經(jīng)注意到在調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)展前，相對(duì)數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞在應(yīng)答抗原時(shí)擴(kuò)展。本發(fā)明提供了一種防止“調(diào)節(jié)細(xì)胞”產(chǎn)生、限制“調(diào)節(jié)細(xì)胞”功能，或破壞“調(diào)節(jié)細(xì)胞”，同時(shí)維持“效應(yīng)細(xì)胞”的可能。
此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗“調(diào)節(jié)細(xì)胞”的試劑可在治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染中給藥時(shí)，急性期炎癥指標(biāo)的水平可被用作指示劑。
因此，第一方面本發(fā)明提供一種治療哺乳動(dòng)物被試者中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法，該方法包括給予被試者一種組合物，該組合物可增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量、和/或激活效應(yīng)細(xì)胞，隨后給予被試者一種可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，其中該試劑的給藥時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
有很多方式都可增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量、和/或活性。在某些情況中，這可能會(huì)由于無(wú)意中感染逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，被含病毒的注射器的針尖刺到而發(fā)生。眾所周知，健康的工作人員和研究人員都可能有在針刺損傷過(guò)程中感染病毒的危險(xiǎn)。同樣，公眾也可能經(jīng)由廢棄的注射器，特別是在海灘上，和擁有這種注射器的罪犯而處于這種危險(xiǎn)之中。因此，在懷疑與逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是HIV接觸之后，哺乳動(dòng)物被試者可利用本發(fā)明的方法。
本發(fā)明的方法還可用于治療已經(jīng)感染逆轉(zhuǎn)錄病毒一段時(shí)間的哺乳動(dòng)物被試者。雖然這種被試者的免疫系統(tǒng)已經(jīng)接觸了逆轉(zhuǎn)錄病毒，但其它逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原的加入會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答，具有隨后消除這些新的效應(yīng)物的調(diào)節(jié)子的機(jī)會(huì)。
感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的被試者可使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物，如HAART療法進(jìn)行治療，從而將病毒負(fù)荷維持在較低水平。這種被試者還可用所述組合物給藥，從而引發(fā)新的效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，然而隨后給予所述試劑可消除調(diào)節(jié)細(xì)胞。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，監(jiān)測(cè)急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)以確定何時(shí)給予所述試劑。正如本領(lǐng)域已知的，某些急性期炎癥指標(biāo)最初在免疫應(yīng)答過(guò)程中增加(此后稱(chēng)作急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo))，而另外一些最初在免疫應(yīng)答過(guò)程中降低(此后稱(chēng)作急性期炎癥陰性指標(biāo))。
優(yōu)選，所述急性期炎癥指標(biāo)是急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)，且所述試劑大約是在標(biāo)記水平最初增加之后、急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)水平開(kāi)始降低時(shí)給予的。在這種情況下，效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生和/或活性是通過(guò)急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)水平的增加所表示的。調(diào)節(jié)細(xì)胞克隆擴(kuò)展之后，效應(yīng)細(xì)胞的活性被下調(diào)，從而導(dǎo)致急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)水平降低。
優(yōu)選，所述急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)是c-反應(yīng)性蛋白。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑大約是在c-反應(yīng)性蛋白水平已經(jīng)達(dá)到峰值并開(kāi)始降低時(shí)給予的。
人們還發(fā)現(xiàn)急性期炎癥指標(biāo)可作為病毒負(fù)荷的指示劑，這是因?yàn)橛行У拿庖邞?yīng)答可導(dǎo)致病毒負(fù)荷降低，從而導(dǎo)致急性期炎癥指標(biāo)水平降低。因?yàn)榧毙云谘装Y指標(biāo)水平可很容易地在少量的血液樣品中測(cè)量，因此它可被用作何時(shí)開(kāi)始監(jiān)測(cè)病毒負(fù)荷的指示劑。
因此，在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑大約是給予所述組合物之后，病毒顆粒的數(shù)量開(kāi)始穩(wěn)定或增加時(shí)給予的，其中在給予所述組合物后，急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)水平開(kāi)始降低時(shí)，開(kāi)始測(cè)試被試者中的病毒顆粒水平。應(yīng)注意的是，所述試劑的給藥時(shí)間還可符合在最初的峰值之后，病毒顆粒的數(shù)量降低(見(jiàn)

圖18)。
優(yōu)選，急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)是c-反應(yīng)性蛋白。
在第一方面的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，感染哺乳動(dòng)物被試者中效應(yīng)細(xì)胞的再次刺激可通過(guò)含有逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽的組合物獲得。優(yōu)選，所述抗原多肽是通過(guò)給予一種含有逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽和藥學(xué)上可接受載體的疫苗而提供給被試者的。更優(yōu)選，所述疫苗還含有佐劑。
在另一實(shí)施方案中，所述抗原多肽是通過(guò)給予一種編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽的DNA疫苗而提供給被試者的。
在另一實(shí)施方案中，所述抗原多肽是通過(guò)食用表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽的轉(zhuǎn)基因植物而提供給被試者的。
取消抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法通?？梢鹂垢腥颈辉囌咧性俅纬霈F(xiàn)的病毒的效應(yīng)細(xì)胞的快速再擴(kuò)展。因此，可在適宜的時(shí)間給予所述試劑，從而消除調(diào)節(jié)細(xì)胞，而無(wú)需給予此處所定義的組合物。
因此，第二方面，本發(fā)明提供一種治療哺乳動(dòng)物被試者中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法，該方法包括使被試者接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法，隨后給予被試者能夠抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，其中所述試劑是在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法已經(jīng)結(jié)束后給予的，且逆轉(zhuǎn)錄病毒數(shù)量的最終擴(kuò)展導(dǎo)致抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增加、和/或激活，且其中該試劑的給藥時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
優(yōu)選，所述急性期炎癥指標(biāo)是急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)。優(yōu)選，所述急性期炎癥指標(biāo)是c-反應(yīng)性蛋白。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑是在c-反應(yīng)性蛋白水平已經(jīng)達(dá)到峰值并開(kāi)始降低時(shí)給予的。
優(yōu)選，所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法是HAART。
在取消抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法后，病毒負(fù)荷增加(例如，見(jiàn)Daar等，1998和圖18)。如此導(dǎo)致抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞擴(kuò)展和/或激活，其開(kāi)始使病毒負(fù)荷穩(wěn)定。大約在逆轉(zhuǎn)錄病毒數(shù)量已經(jīng)達(dá)到峰值、或在該峰值之后開(kāi)始降低時(shí)，應(yīng)當(dāng)給予該試劑。如上所述，急性期炎癥指標(biāo)水平可以成為病毒負(fù)荷的指示劑。
因此，在第二方面的又一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑大約是在病毒顆粒數(shù)已經(jīng)達(dá)到峰值、或在該峰值之后開(kāi)始降低時(shí)給予的，應(yīng)答抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法的結(jié)束，其中在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法結(jié)束后，急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)水平開(kāi)始增加時(shí)，測(cè)試被試者中的病毒顆粒水平。
另一方面，本發(fā)明提供可增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量、和/或激活效應(yīng)細(xì)胞的組合物用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中隨后給予被試者可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，且其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
另一方面，本發(fā)明提供可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中先前已經(jīng)給予被試者可增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量、和/或激活效應(yīng)細(xì)胞的組合物，且其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
另一方面，本發(fā)明提供抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中隨后給予被試者可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，且其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
另一方面，本發(fā)明提供可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中先前已經(jīng)給予該被試者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，且其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
優(yōu)選，用于消除調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑選自抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞活性下調(diào)的抗體、放療和抗-增殖藥物。優(yōu)選，抗-增殖藥物選自長(zhǎng)春花堿和脫水長(zhǎng)春花堿。
優(yōu)選抗體的例子包括，但不限制于，抗-CD4+、抗-CTLA-4(細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4)、和抗-CD28。
優(yōu)選，逆轉(zhuǎn)錄病毒選自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。
正如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到的那樣，本發(fā)明的方法可被重復(fù)從而提供更完全的治療。
優(yōu)選，哺乳動(dòng)物被試者是人。
另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，它含有i)一種用于增加抗哺乳動(dòng)物被試者中逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量、和/或激活效應(yīng)細(xì)胞的組合物；ii)可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑；和iii)用于測(cè)定急性期炎癥指標(biāo)水平的工具。
另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，它含有i)至少一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物；ii)可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑；和iii)用于測(cè)定急性期炎癥指標(biāo)水平的工具。
在上面描述的各方面，“調(diào)節(jié)細(xì)胞”群的消除可使“效應(yīng)細(xì)胞”群減少或消除逆轉(zhuǎn)錄病毒負(fù)荷，因?yàn)樾?yīng)物的任何下調(diào)(由于自我耐受機(jī)理)已被除去。
很明顯，本發(fā)明其中一個(gè)方面的優(yōu)選特征和性質(zhì)可應(yīng)用于本發(fā)明其它方面。
在本說(shuō)明書(shū)中，詞語(yǔ)“包含”或變換，如“包括”或“含有”可被理解為包括規(guī)定的元件、整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的集合，但不排除任何其它的元件、整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的集合。
此后，將通過(guò)下列非限制性附圖和實(shí)施例描述本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述圖1感染LP-BM5的B6小鼠中MAIDS的時(shí)間過(guò)程。
圖2在感染后10周時(shí)，單一劑量的長(zhǎng)春花堿(6mg/kg，i.p.)對(duì)MAIDS進(jìn)展的作用。
圖3感染后10周，用長(zhǎng)春花堿治療過(guò)的小鼠脾臟的組織學(xué)。
圖4進(jìn)行長(zhǎng)春花堿治療后，在感染后20周時(shí)，可免受MAIDS感染。n＝5。
圖5進(jìn)行保護(hù)性長(zhǎng)春花堿治療后，用MAIDS病毒再次侵襲。n＝5。
圖6第14天時(shí)，長(zhǎng)春花堿對(duì)感染MAIDS(MAIDS+)的小鼠和對(duì)照小鼠(MAIDS-)中脾細(xì)胞百分比的作用。n＝3。
圖7脾轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)方案。
圖8脾細(xì)胞從感染MAIDS的供體小鼠轉(zhuǎn)移。n＝7。
圖9體內(nèi)損耗實(shí)驗(yàn)方案。
圖10感染后第14天，CD4+或CD8+細(xì)胞的體內(nèi)損耗。n＝5。
圖11在實(shí)施例第4部分中描述的過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)方案的流程圖。
圖12使用未感染的供體細(xì)胞進(jìn)行的CD4+CD25+/-過(guò)繼轉(zhuǎn)移的結(jié)果。脾重量是在MAIDS感染后10用時(shí)獲得的(n＝5只小鼠/組)。
圖13感染MAIDS小鼠的血清中的IL-4。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)代表9只小鼠的平均值+/-SEM。
圖14感染MAIDS小鼠的血清中的IL-10。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)代表9只小鼠的平均值+/-SEM。
圖15通過(guò)脾臟總WBC中胞內(nèi)流動(dòng)測(cè)定的IL-4和IL-10水平。數(shù)據(jù)是以每組3只小鼠的平均值+/-SEM表示的。
圖16通過(guò)感染MAIDS小鼠的脾WBC的ELISpot測(cè)定的IL-4產(chǎn)生。數(shù)據(jù)是以每組3只小鼠的平均值+/-SEM表示的。
圖17通過(guò)感染MAIDS小鼠的脾WBC的ELISpot測(cè)定的IL-10產(chǎn)生。數(shù)據(jù)是以每組3只小鼠的平均值+/-SEM表示的。
圖18應(yīng)答取消人類(lèi)患者進(jìn)行的HAART治療時(shí)，HIV RNA、c-反應(yīng)性蛋白和T細(xì)胞的水平。
發(fā)明詳述
定義這里所用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒負(fù)荷的降低。最優(yōu)選，逆轉(zhuǎn)錄病毒負(fù)荷被完全消除。
“調(diào)節(jié)細(xì)胞”包括，但不是必需限制于，CD4+T細(xì)胞的亞群。這種細(xì)胞在本領(lǐng)域中還可被稱(chēng)作“抑制細(xì)胞”。調(diào)節(jié)細(xì)胞或者可以直接作用于效應(yīng)細(xì)胞，或者可以通過(guò)其它機(jī)理維持它們對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的作用。
CD4+細(xì)胞表達(dá)本領(lǐng)域已知的標(biāo)記CD4。通常，這里所用的術(shù)語(yǔ)“CD4+T細(xì)胞”不指代也表達(dá)CD8的細(xì)胞。然而，該術(shù)語(yǔ)可包括也表達(dá)其它抗原標(biāo)記，如CD25的T細(xì)胞。
“效應(yīng)細(xì)胞”包括，但不是必需限制于，被稱(chēng)作CD8+細(xì)胞的T細(xì)胞群。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“消除”或“消除”當(dāng)涉及“調(diào)節(jié)細(xì)胞”與所述試劑接觸時(shí)，是指調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量、和/或活性被該試劑下調(diào)。最優(yōu)選，調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量、和/或活性被該試劑完全消除。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所用的重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)屬于標(biāo)準(zhǔn)操作，對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員而言是熟知的。這類(lèi)技術(shù)通過(guò)下列來(lái)源的文獻(xiàn)來(lái)描述和解釋?zhuān)鏙.Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(編者)，EssentialMolecular BiologyA Practical Approach，卷1和2，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(編者)，DNA CloningAPractical Approach，卷1-4，IRL Press(1995和1996)，和F.M.Ausubel等人(編者)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括到目前為止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(編者)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，，和J.E.Coligan等人(編者)Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons(包括到目前為止的所有更新)，它們引入此處作為參考。
可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生 限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑所述試劑可以是選擇性或非選擇性導(dǎo)致調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生被破壞或抑制的任何因子或治療。例如，CD4+特異性抗體可用于特異性針對(duì)CD4+T細(xì)胞。然而，在某些情況下，可使用非選擇性試劑，如抗增殖藥物或放療，兩者都可破壞分裂的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“抗增殖藥物”是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語(yǔ)，指代可破壞分裂的細(xì)胞或抑制它們經(jīng)過(guò)進(jìn)一步增殖的任何化合物?？乖鲋乘幬锇ǎ幌拗朴?，氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、六甲基三聚氰胺、噻替派、白消安、卡莫司汀、羅氮芥、司莫司汀、鏈脲霉素、達(dá)卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖孢苷、巰基嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、噴托他丁、長(zhǎng)春花堿、脫水長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、替尼泊苷、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、博萊霉素、普卡霉素、絲裂霉素、L-天門(mén)冬酰胺酶、順鉑、米托蒽醌、羥基脲、丙卡巴肼、米托坦、氨魯米特、潑尼松、羥基孕酮己酸鹽、甲羥孕酮醋酸鹽、甲地孕酮醋酸鹽、己烯雌酚、乙炔雌二醇、他莫昔芬、睪酮丙酸鹽、放射性同位素、蓖麻毒蛋白A鏈、紫杉醇、白喉毒素和假單胞菌外毒素A。
所述試劑可以本領(lǐng)域所用的標(biāo)準(zhǔn)劑量給藥。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑可以作為單一的大輸液給藥。在另一實(shí)施方案中，所述試劑可在一段時(shí)間、例如24小時(shí)內(nèi)通過(guò)輸注給藥。
被試者接受試劑的時(shí)間正如上面所描述的，本發(fā)明依賴(lài)于在調(diào)節(jié)細(xì)胞之前，效應(yīng)細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量在應(yīng)答抗原時(shí)發(fā)生擴(kuò)展的觀察結(jié)果。因此，這里所用的術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)細(xì)胞的活性沒(méi)有顯著降低”是指該試劑的給藥時(shí)間是所述試劑對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用較之對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的作用，成比例地更大。顯然，優(yōu)選所述試劑是在對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用與對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的作用的比值達(dá)到最大時(shí)給藥。
據(jù)報(bào)道，在進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后病毒負(fù)荷開(kāi)始降低后，例如，在感染HIV的被試者中，病毒負(fù)荷增加，且隨后在取消治療后，存在對(duì)病毒負(fù)荷增加的免疫應(yīng)答刺激(Oritz等，1999；Kilby等，2000；Lifson等，2000)。因此，使被試者接受抗病毒療法后，再取消該療法可用于增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量、和/或激活效應(yīng)細(xì)胞，使可靶向的調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)展。
給予所述試劑的適宜時(shí)間的例子可參考Daar等人(1998)來(lái)確定。該文獻(xiàn)提供了取消高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(也稱(chēng)作HAART)的患者的病毒負(fù)荷，及CD8+和CD4+T細(xì)胞的水平。病毒負(fù)荷開(kāi)始升高后，當(dāng)CD8+T細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大數(shù)量時(shí)，病毒負(fù)荷出現(xiàn)降低，并因此發(fā)揮作用(見(jiàn)Daar等人，1998的圖1)。在該時(shí)間點(diǎn)(幾天)后，CD8+T細(xì)胞立刻開(kāi)始減少，病毒負(fù)荷在下降后開(kāi)始穩(wěn)定。
同樣，圖18顯示在結(jié)束HAART之后，患者中的病毒負(fù)荷開(kāi)始增加，接著由于效應(yīng)細(xì)胞的活性，HIV RNA降低，然后由于效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)，HIV RNA水平再次增加。
峰值可被用作推論點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)隨后調(diào)節(jié)細(xì)胞的克隆擴(kuò)展和調(diào)節(jié)細(xì)胞消除的介入點(diǎn)。所述試劑應(yīng)當(dāng)在絕大多數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞處于克隆擴(kuò)展(有絲分裂)時(shí)應(yīng)用，其通常相當(dāng)于病毒負(fù)荷最初增加之后已經(jīng)穩(wěn)定時(shí)和/或最初增加之后已經(jīng)達(dá)到峰值時(shí)、和/或最初增加之后病毒負(fù)荷可能降低(如圖18所示)時(shí)、和/或最遲在病毒負(fù)荷第二次升高剛剛開(kāi)始時(shí)。
在絕大多數(shù)情況下，給予所述試劑的時(shí)間點(diǎn)需要在感染的不同階段，根據(jù)被試者免疫應(yīng)答動(dòng)力學(xué)的變化而憑經(jīng)驗(yàn)確定。其它因素，如被試者的一般健康狀況和/或被試者的遺傳組成也將影響給予所述試劑的適宜時(shí)間。
人們已經(jīng)確定了c-反應(yīng)性蛋白水平的增加與病毒負(fù)荷增加大約同時(shí)發(fā)生(見(jiàn)圖18)。隨后，由于效應(yīng)細(xì)胞活性對(duì)病毒負(fù)荷的作用，使逆轉(zhuǎn)錄病毒數(shù)降低，從而致c-反應(yīng)性蛋白的水平降低。因此，該信息可用于確定所述試劑的正確給藥時(shí)間。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑大約是在c-反應(yīng)性蛋白水平已經(jīng)達(dá)到峰值并開(kāi)始降低時(shí)給藥的。
確定給予所述試劑時(shí)間點(diǎn)的另一途徑是在刺激免疫應(yīng)答后監(jiān)測(cè)病毒負(fù)荷。因?yàn)閏-反應(yīng)性蛋白測(cè)定法相對(duì)簡(jiǎn)單而且靈敏，且c-反應(yīng)性蛋白的水平與病毒負(fù)荷相關(guān)聯(lián)(見(jiàn)圖18)，因此這種測(cè)定法可用于確定何時(shí)開(kāi)始結(jié)束監(jiān)測(cè)病毒負(fù)荷。例如，當(dāng)c-反應(yīng)性蛋白的水平已經(jīng)開(kāi)始增加時(shí)，可開(kāi)始監(jiān)測(cè)病毒負(fù)荷。
上述與c-反應(yīng)性蛋白有關(guān)的這些方法可使用其它急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)進(jìn)行。
預(yù)期病毒負(fù)荷降低是由于效應(yīng)細(xì)胞的活性，然而，隨后調(diào)節(jié)細(xì)胞的增加將對(duì)效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行下調(diào)，導(dǎo)致病毒負(fù)荷降低減緩。因此，所述試劑可在病毒負(fù)荷降低減緩之前給藥。本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如RT-PCR可用于監(jiān)測(cè)這些情況下的病毒負(fù)荷。
監(jiān)測(cè)可能需要非常頻繁地進(jìn)行，例如，常常每隔幾小時(shí)進(jìn)行一次，以確保選擇給予所述試劑的正確的時(shí)間點(diǎn)。優(yōu)選，至少每隔48小時(shí)進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)。更優(yōu)選，每隔24小時(shí)進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)。
最好持續(xù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)以測(cè)定所述試劑的作用。治療大約7天內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的不充分消除、再現(xiàn)或病毒負(fù)荷的增加是指應(yīng)當(dāng)重復(fù)本發(fā)明的方法。這種治療的重復(fù)循環(huán)可產(chǎn)生免疫記憶。因此，很可能以重復(fù)方式使用的本發(fā)明可提供某些預(yù)防性保護(hù)作用。
急性期炎癥指標(biāo)如上所述，一些急性期炎癥指標(biāo)在免疫應(yīng)答過(guò)程中開(kāi)始增加(此后稱(chēng)為急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo))，而另一些則在免疫應(yīng)答過(guò)程中開(kāi)始降低(此后稱(chēng)為急性期炎癥陰性指標(biāo))。在本領(lǐng)域中，急性期炎癥指標(biāo)也被稱(chēng)為急性期反應(yīng)物或急性期蛋白。
急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)的例子包括，但不限制于，c-反應(yīng)性蛋白、血清淀粉樣A、血清淀粉樣P成分、補(bǔ)體蛋白如C2、C3、C4、C5、C9、B、C1抑制劑和C4結(jié)合蛋白、血纖蛋白原、馮維勒布蘭德因子、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-抗纖維蛋白溶酶、肝素輔因子II、纖溶酶原激活物抑制劑I、觸珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白(haemopexin)、血漿銅藍(lán)蛋白、超氧化錳歧化酶、α1-酸性糖蛋白、血紅素(haeme)加氧酶、甘露糖-結(jié)合蛋白、白細(xì)胞蛋白I、脂蛋白(a)和脂多糖-結(jié)合蛋白。急性期炎癥陰性指標(biāo)的例子包括，但不限制于，白蛋白、前-白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、apoAI、apoII、α2HS糖蛋白、間-α-胰蛋白酶抑制劑和富含組氨酸的糖蛋白。
血清淀粉樣A的水平可按照本領(lǐng)域已知的來(lái)測(cè)定，見(jiàn)，例如O′Hara等，(2000)。
c-反應(yīng)性蛋白(CRP)是一種重要的急性期陽(yáng)性反應(yīng)蛋白，在急性期反應(yīng)過(guò)程中，其在血清中的濃度可增加多達(dá)1,000-倍。CRP是一種由5個(gè)相同亞單位組成的五聚物，每個(gè)亞單位的分子量約為23,500。
c-反應(yīng)性蛋白的水平可使用本領(lǐng)域抑制的技術(shù)測(cè)定，這些包括，但不限制于，在Senju等人(1983)，Price等人(1987)和Eda等人(1998)中公開(kāi)的那些。
HAART術(shù)語(yǔ)“HAART”包括具有至少3種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑的任何聯(lián)合療法，其中每種試劑都以治療有效量給予被試者。就本發(fā)明的目的而言，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑包括可抑制、減少或消除細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的任何物質(zhì)。這些試劑多數(shù)可商業(yè)獲得，并按照制造商建議的劑量用于給藥。這些抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑包括，但不限制于，逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑兩類(lèi)，以及屬于病毒侵入抑制劑的試劑。雖然可使用三種或更多這些試劑的任何組合，但優(yōu)選HAART包括給予治療有效量的至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和至少一種蛋白酶抑制劑聯(lián)合至少一種其它的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑。
很多逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑都可商業(yè)獲得，用于給予HAART。例子包括，但不限制于，從Glaxo-Wellcome Inc.，Research Triangle，NC27709獲得的商標(biāo)為RETROVIR的齊多夫定(AZT)；從Bristol-MyersSquibb Co.，Princeton，NJ 08543獲得的商標(biāo)為VIDEX的地達(dá)諾新(ddl)；從Roche Pharmaceuticals，Nutley，N.J.07110獲得的商標(biāo)為HIVID的扎西胞苷(ddC)；從Bristol-Myers Squibb Co.，Princeton，N.J.08543獲得的商標(biāo)為ZERIT的司他夫定(d4T)；從Glaxo-Wellcome Research Triangle，N.C.27709獲得的商標(biāo)為EPIVIR的拉米夫定(3TC)；在WO 96/30025中公開(kāi)并且從Glaxo-Wellcome Research Triangle，N.C.27709獲得的商標(biāo)為ZIAGEN的abacavir(1592U89)；從Gilead Sciences，F(xiàn)oster City，Calif.94404獲得的商標(biāo)為PREVON的阿德福韋二叔戊酰氧甲酯[雙(POM)-PMEA]；洛布卡韋(BMS-180194)，一種在EP-0358154和EP-0736533中公開(kāi)并由Bristol-Myers Squibb，Princeton，N.J.08543研制的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；BCH-10652，一種由Biochem Pharma，Laval，Quebec H7V，4A7，Canada研制的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(BCH-10618和BCH-10619的外消旋混合物形式)；由Emory University under EmoryUniv.US 5,814,639許可并由Triangle Pharmaceuticals，Durham，N.C.27707研制的emitricitabine[(-)-FTC]；由Yale大學(xué)許可Vion Pharmaceuticals，NewHaven Conn.06511生產(chǎn)的β-L-FD4(也稱(chēng)作β-L-D4C和β-L-2′，3′-dicleoxy-5-氟cytidene)；和DAPD，在EP 0656778中公開(kāi)并由Emory大學(xué)和Georgia大學(xué)許可TrianglePharmaceuticals，Durham，N.C.27707生產(chǎn)的嘌呤核苷，(-)-β-D-2，6，-二氨基嘌呤二氧戊環(huán)；和lodenosine(FddA)，9-(2，3-二脫氧-2-氟-b-D-蘇型-pentofuranosyl)腺嘌呤，一種由NIH發(fā)現(xiàn)并由U.S.Bioscience Inc.，West Conshohoken，Pa.19428研制的酸穩(wěn)定性的嘌呤-基逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。
用于本發(fā)明中的蛋白酶抑制劑的例子包括，但不限制于，從RochePharmaceuticals，Nutley，N.J.07110-1199獲得的沙喹那韋(Ro31-8959)的商標(biāo)為INVIRASE的硬明膠膠囊和商標(biāo)為FORTOUASE的軟明膠膠囊；從Abbott Laboratories，Abbott Park，111.60064獲得的商標(biāo)為NORVIR的利托那韋(ABT-538)；從Merck & Co.，Inc.，West Point，Pa.19486-0004獲得的商標(biāo)為CRIXIVAN的吲哚那韋(MK-639)；從Agouron Pharmaceuticals，Inc.，LaJolla，Calif.92037-1020獲得的商標(biāo)為VIRACEPT的奈非那韋(AG-1 343)；安潑那韋(141W94)，一種由Vertex Pharmaceuticals，Inc.，Cambridge，Mass.02139-4211研制并從Glaxo-Wellcome，Research Triangle，N.C.獲得的非-肽蛋白酶抑制劑，在擴(kuò)展存取程序下；從Bristol-Myers Squibb，Princeton，N.J.08543獲得的lasinavir(BMS-234475)(最初由Novartis，Basel，Switzerland(CGP-61755發(fā)現(xiàn))；DMP-450，一種由Dupont發(fā)現(xiàn)并由Triangle Pharmaceuticals研制的環(huán)狀脲；BMS-2322623，一種由Bristol-Myers Squibb，Princeton，N.J.08543研制的，作為第2代HIV-1 PI的氮雜肽；和由Abbott，Abbott Park，I11.60064研制的ABT-378；和AG-1549，一種由Shionogi(Shionogi #S-1153)發(fā)現(xiàn)并由AgouronPharmaceuticals，Inc.)，LaJolla Calif.92037-1020研制的口服活性咪唑氨基甲酸酯。
這些化合物的適宜人用劑量可廣泛變化。然而，這種劑量可由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員很容易地確定。治療有效量的這些藥物是在HAART過(guò)程中給予的。“治療有效量”是指足以降低HIV感染作用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑的用量、或足以有利地影響HAART方案所用的一種或多種其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑的藥動(dòng)學(xué)分布的用量?！坝欣赜绊憽笔侵府?dāng)以治療有效量給藥時(shí)，所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑可影響HAART中所用的一種或多種其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑的代謝，這樣就可增加其它試劑的生物利用度。
有關(guān)任何已知抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑的給藥劑量的指導(dǎo)在本領(lǐng)域中可以獲得，且包括以它們的建議劑量給予商業(yè)獲得的試劑。
抗原多肽這里所用的“抗原”多肽是含有能夠產(chǎn)生抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的免疫應(yīng)答的表位的任何多肽序列。通常，抗原多肽含有在絕大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒分離物中高度保守的序列。然而，預(yù)期可以對(duì)感染個(gè)體的特定逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行表征，且與分離物的序列最大程度匹配的抗原多肽產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答的可能性。
有關(guān)HIV抗原，如gp120和其它候選物的信息參見(jiàn)Stott等人(1998)。
抗原多肽可以本領(lǐng)域已知的任何方式提供，其可導(dǎo)致免疫應(yīng)答。抗原多肽可以是，例如，天然的、重組的或合成的。這種抗原多肽包括，但不限制于，負(fù)責(zé)與細(xì)胞表面受體連接從而引發(fā)感染過(guò)程的病毒蛋白，如包膜糖蛋白。
例如，天然抗原多肽可通過(guò)提供減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒、熱滅活的逆轉(zhuǎn)錄病毒或任何其它被殺死的逆轉(zhuǎn)錄病毒而制備。
抗原多肽可以分離多肽的形式在疫苗組合物中提供。在這種情況下，所述多肽可從感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞純化，表達(dá)并從重組細(xì)胞分離，或使用肽合成儀合成產(chǎn)生。
疫苗疫苗可從一個(gè)或多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒多肽制備。含有抗原多肽的疫苗的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常，這種疫苗可被制成可注射的，或口服的，如液體溶液或混懸液；還可制備注射之前適用于溶液或混懸液中的、或適于口服消耗的固體形式。所述制劑還可以被乳化，或?qū)⒌鞍装谥|(zhì)體中。所述抗原多肽常常與藥學(xué)上可接受的且與活性成分相容的載體/賦形劑混合。適宜的載體/賦形劑是，例如，水、生理鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。
此外，如果需要，所述疫苗還可含有微量的輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑，pH緩沖劑、和/或可提高疫苗有效性的佐劑。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指非特異性提高對(duì)抗原多肽的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。有效佐劑的例子包括但不限制于N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正-胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(CGP 11637，被稱(chēng)作正-MDP)、N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨?；?L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基磷氧?；?-乙胺(CGP 19835A，稱(chēng)作MTP-PE)、和RIBI，在2％角鯊烯/Tween 80乳液中，其含有從細(xì)菌中提取的3個(gè)成分，單磷酰脂A、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑的其它例子包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀(alum)、細(xì)菌性?xún)?nèi)毒素、脂類(lèi)X、棒狀桿菌屬(痤瘡丙酸桿菌)、百日咳桿菌、多核糖核苷酸、藻酸鈉、羊毛脂、溶血卵磷脂、維生素A、皂甙、脂質(zhì)體、左旋咪唑、DEAE-葡萄糖、嵌段共聚物或其它合成的佐劑。這種佐劑可從各種來(lái)源商業(yè)獲得，例如，Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。
抗原多肽與佐劑的比例可在較寬的范圍內(nèi)變化，只要以有效量存在。例如，氫氧化鋁可占疫苗混合物的約0.5％用量(Al2O3主要成分)。很方便地，將所述疫苗配制成含有0.2-200μg/ml、優(yōu)選5-50μg/ml、最優(yōu)選15μg/ml終濃度的抗原多肽。
配制后，可將所述疫苗加入到無(wú)菌容器中，然后將容器密封并在低溫，例如4℃下貯存，或?qū)⑺鋬龈稍铩＠鋬龈稍锟墒沟靡苑€(wěn)定形式長(zhǎng)期貯存。
通常，所述疫苗可通過(guò)注射，例如，皮下或肌內(nèi)注射而非腸道給藥。適于其它給藥方式的其它制劑包括栓劑和，在某些情況下，口服制劑。就栓劑而言，常規(guī)的粘合劑和載體可包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯；這種栓劑可從含有0.5-10％、優(yōu)選1-2％活性成分的混合物形成?？诜苿┌ㄟ@類(lèi)正常使用的賦形劑，例如，制藥級(jí)的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物可采用溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或粉劑的形式，并含有10％-95％、優(yōu)選25％-70％的活性成分。在將疫苗組合物冷凍干燥的情況下，可在給藥之前，將冷凍干燥的物質(zhì)重構(gòu)，例如，重構(gòu)成混懸液。重構(gòu)優(yōu)選在緩沖劑中進(jìn)行。
用于口服給予患者的膠囊劑、片劑和丸劑可用含有，例如，Eudragit ″S″、Eudragit ″L ″、醋酸纖維素酯、鄰苯二甲酸乙酸纖維素或羥丙基甲基纖維素的腸溶衣提供。
DNA接種DNA接種包括將編碼抗原的DNA直接體內(nèi)引入到被試者的組織中，使患者組織的細(xì)胞表達(dá)該抗原。此處稱(chēng)這種疫苗為“DNA疫苗”或“基于核酸的疫苗”。DNA疫苗在US 5,939,400、US 6,110,898、WO95/20660和WO 93/19183中描述，其中公開(kāi)的內(nèi)容整體引入此處作為參考。編碼抗原、直接注射的DNA引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力已經(jīng)在若干實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中被證實(shí)(見(jiàn)，例如，Conry等人，1994；Cardoso等人，1996；Cox等人，1993；Davis等人，1993；Sedegah等人，1994；Montgomery等人，1993；Ulmer等人，1993；Wang等人，1993；Xiang等人，1994；Yang等人，1997)。
迄今為止，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的絕大多數(shù)DNA疫苗依賴(lài)源于巨細(xì)胞病毒(CMV)的病毒啟動(dòng)子。這些在很多哺乳動(dòng)物物種的肌肉和皮膚接種中都具有良好的效能。已知可影響由DNA免疫接種引發(fā)的免疫應(yīng)答的因子屬于DNA送遞的方法，例如，非腸道途徑可產(chǎn)生低速的基因轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生基因表達(dá)的大量變異(Montgomery等人，1993)。使用基因槍高速接種質(zhì)?？商岣咝∈蟮拿庖邞?yīng)答(Fynan等人，1993；Eisenbraun等人，1993)，這大概是由于更高效率的DNA轉(zhuǎn)染和樹(shù)狀細(xì)胞的更有效的抗原呈遞。還可將含有本發(fā)明基于核酸的疫苗的載體通過(guò)本領(lǐng)域已知的其它方法，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、微量注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而引入到所需宿主中。
來(lái)源于轉(zhuǎn)基因植物的疫苗產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽的轉(zhuǎn)基因植物可使用本領(lǐng)域熟知的過(guò)程構(gòu)造。目前，已經(jīng)相對(duì)于動(dòng)物和人類(lèi)的病原體研制了很多可食用的植物來(lái)源的疫苗(Hood和Jilka，1999)。免疫應(yīng)答還可能是由于用產(chǎn)生病毒樣顆粒(VLP)、或展示表位的嵌合植物病毒的轉(zhuǎn)基因植物口服接種(Mason等人，1996；Modelska等人，1998；Kapustra等人，1999；Brennan等人，1999)而產(chǎn)生。人們已經(jīng)提出顆粒形式的這些VLP或嵌合病毒可導(dǎo)致抗原在胃中的更高穩(wěn)定性，有效增加腸中吸收的抗原量(Mason等人，1996；Modelska等人，1998)。
實(shí)施例實(shí)施例1為了證實(shí)本發(fā)明，使用鼠AIDS模型。
由易感小鼠中LP-BM5鼠白血病病毒(MuLV)誘導(dǎo)的鼠AIDS(MAIDS)病理是研究逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的免疫缺陷機(jī)理的有效工具。該MAIDS動(dòng)物模型顯示出很多人AIDS的特征。易感株，如用LP-BM5感染C57BL/6小鼠的感染可導(dǎo)致慢性脾腫大、血丙球蛋白過(guò)多和T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫缺陷的發(fā)展。在體外，T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)致有絲分裂或特異性抗原刺激的應(yīng)答能力出現(xiàn)進(jìn)展性損害。在體內(nèi)，感染小鼠對(duì)使用各種機(jī)會(huì)生物進(jìn)行的侵襲越來(lái)越敏感，并發(fā)展成B-細(xì)胞淋巴瘤。首先在感染后(pi)8-10周時(shí)觀察到死亡，且在24周內(nèi)所有小鼠均死亡(圖1)。免疫功能的這些改變反映了免疫網(wǎng)所有組份的表型和功能的復(fù)雜變化。
1.在感染后的不同時(shí)間給予的單一劑量的長(zhǎng)春花堿的治療作用用單一劑量的抗-有絲分裂劑長(zhǎng)春花堿(Vb)在pi不同時(shí)間治療能夠防止MAIDS的發(fā)展/進(jìn)行。圖2顯示在從6hr到28天的pi不同時(shí)間給予單一6mg/kg i.p.劑量的Vb對(duì)MAIDS發(fā)展的作用(由pi 10周的平均脾重量表示)。顯然，在pi 6hr或14天給藥時(shí)，Vb治療分別對(duì)100％(10/10)和74％(20/27)的小鼠具有顯著的治療作用，pi 10周時(shí)則沒(méi)有MAIDS發(fā)展的體征(通過(guò)脾重量、組織學(xué)和FACS分析測(cè)定)。類(lèi)似的保護(hù)作用在pi 6天(6/13或46％)治療的某些小鼠中觀察到。其它實(shí)驗(yàn)提供的結(jié)果是pi 14天用Vb治療(沒(méi)有數(shù)據(jù)顯示)后至少12個(gè)月，100％的小鼠沒(méi)有MAIDS發(fā)展的體征。雖然不像治療第14天后見(jiàn)到的保護(hù)那樣顯著，但仍然觀察到對(duì)MAIDS發(fā)展的適度保護(hù)。然而，也很重要的是注意到在很多其它時(shí)間點(diǎn)的治療，如pi第2天和第7天，對(duì)MAIDS的發(fā)展沒(méi)有保護(hù)作用。在pi 6小時(shí)給予Vb的小鼠中見(jiàn)到的對(duì)MAIDS發(fā)展的全部保護(hù)并不是預(yù)料不到的，這是因?yàn)椴《驹诜e極復(fù)制的細(xì)胞中復(fù)制，這些細(xì)胞是抗-有絲分裂藥物的靶，因此感染病毒的任何細(xì)胞都可被Vb殺死，Vb可防止病毒在宿主中迅速建立感染。然而，在pi 14天用Vb單一治療后觀察到的高度保護(hù)作用十分顯著，在這個(gè)階段，病毒感染被很好地建立，且早期疾病過(guò)程在很好的進(jìn)行當(dāng)中。我們提出這種高度的治療作用是由于Vb在免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的擴(kuò)展階段針對(duì)它們的特定亞組，并由此改變對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答。免疫效應(yīng)細(xì)胞的下調(diào)是通過(guò)針對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的Vb治療而被除去的，由此通過(guò)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞更有效且甚至可能完全清除該病毒。這樣一來(lái)，可在感染后并治療的多個(gè)月時(shí)間內(nèi)，使長(zhǎng)期疾病患者自由存活。
2.進(jìn)一步描述第14天的治療作用2.1.在感染后10周，Vb治療小鼠中的脾組織學(xué)將pi第14天Vb治療的小鼠及感染和未感染對(duì)照小鼠的脾臟稱(chēng)重并進(jìn)行組織學(xué)檢查。所有MAIDS感染小鼠的脾臟結(jié)構(gòu)像先前報(bào)道的那樣被嚴(yán)重破壞(Hartley等人，1989)。相反，具有標(biāo)準(zhǔn)脾重量(低于0.25g)的Vb治療小鼠的脾臟結(jié)構(gòu)與未感染的對(duì)照小鼠不能區(qū)別(圖3)。
作為該組織學(xué)數(shù)據(jù)的支持，在pi 10周時(shí)，基于pi第14天Vb治療的小鼠脾細(xì)胞的FACS分析的初步結(jié)果顯示出與在正常未感染小鼠(沒(méi)有給出數(shù)據(jù))中觀察到的那些類(lèi)似的細(xì)胞比例(CD4+、CD8+和B細(xì)胞)和分布。
2.2.Vb治療后對(duì)MAIDS發(fā)展的長(zhǎng)期保護(hù)為了測(cè)定感染小鼠的MAIDS發(fā)展是否完全受到保護(hù)或是否Vb治療僅僅延遲疾病的發(fā)作和進(jìn)行，我們?cè)趐i第14天用Vb治療小鼠并等到pi 20周檢查小鼠。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖4)顯示在pi 20周，80％(4/5小鼠)的任何脾腫大都受到保護(hù)，證實(shí)第14天Vb治療法的高度有效作用。
2.3.Vb治療后，對(duì)病毒再次侵襲沒(méi)有保護(hù)作用為了測(cè)定MAIDS在pi第14天受到Vb治療保護(hù)的小鼠是否發(fā)生免疫應(yīng)答，其然后保護(hù)它們免受隨后小鼠MAIDS病毒組的再次侵襲，在pi第14天進(jìn)行Vb治療，在Vb治療后3或8周，用MAIDS病毒再次侵襲。該小鼠沒(méi)有免受病毒的再次侵襲并發(fā)展成脾腫大和淋巴結(jié)病，表明在第20周MAIDS發(fā)展(圖5)。這并不是意想不到的，是由于調(diào)節(jié)細(xì)胞群所致的優(yōu)勢(shì)免疫抑制已經(jīng)因?qū)Φ诙?未治療的)感染的免疫效應(yīng)應(yīng)答而恢復(fù)。
3.針對(duì)CD4+細(xì)胞的Vb治療3.1.在感染后第14天進(jìn)行Vb治療后，脾細(xì)胞的直接FACS分析對(duì)從pi第14天用Vb治療小鼠的脾臟制備的CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行FACS分析(圖6)。并時(shí)CD25+CD4+T細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)，這是因?yàn)榻鼇?lái)它們已經(jīng)被鑒定為在自身免疫疾病和腫瘤免疫學(xué)的小鼠模型中具有重要的調(diào)節(jié)功能(Takahashi等人，1998；Shimizu等人，1999)?？赡苓@些細(xì)胞可在對(duì)MAIDS的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。對(duì)pi第14天和未感染對(duì)照小鼠給予Vb療法，并在Vb治療后48小時(shí)收集脾臟。數(shù)據(jù)分析顯示所有細(xì)胞亞組都可被Vb療法降低，未感染與感染比例的比較顯示它是CD4+T細(xì)胞和CD25+CD4+T細(xì)胞，在MAIDS感染小鼠中，這些細(xì)胞優(yōu)選可通過(guò)Vb治療。
3.2.脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)針對(duì)CD4+細(xì)胞的Vb療法先前的實(shí)驗(yàn)顯示存留于脾臟中的主要免疫細(xì)胞亞組(CD4+和CD8+細(xì)胞)都可受到Vb治療的影響，然而，似乎優(yōu)選針對(duì)CD4+細(xì)胞，表明這些細(xì)胞的亞組可在pi第14天被克隆擴(kuò)展。圖7所示的實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)用于測(cè)定在pi第14天給藥的單一劑量的Vb正在消除擴(kuò)展的CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞群，并由此釋放下調(diào)的效應(yīng)細(xì)胞，并清除MAIDS病毒的宿主。
感染MAIDS的小鼠在pi第14天接受Vb處理，然后接受按照?qǐng)D7所述制備的源于供體小鼠的約107個(gè)脾細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)[指定為(I)、(II)和(III)]組而言，都由7只受體小鼠和9只供體小鼠組成。I組小鼠接受沒(méi)有進(jìn)行任何Vb治療的感染小鼠的整個(gè)脾臟。II組小鼠接受感染小鼠的整個(gè)脾細(xì)胞制劑，其中在用熒光染料-標(biāo)記的抗-CD4單克隆抗體染色后，使用FACS細(xì)胞分類(lèi)器可知所述感染小鼠的CD4+細(xì)胞已經(jīng)損耗。細(xì)胞分類(lèi)可除去源于脾細(xì)胞制劑的99.5％CD4+細(xì)胞。III組小鼠接受感染供體小鼠的整個(gè)脾臟，其中所述感染供體小鼠也在pi第14天接受Vb治療。
將MAIDS感染供體的脾細(xì)胞注入Vb-治療的MAIDS感染小鼠中會(huì)完全阻礙Vb對(duì)小鼠MAIDS發(fā)展的保護(hù)(圖8)。此外，排除Vb保護(hù)作用的脾細(xì)胞是CD4+細(xì)胞，這是因?yàn)楫?dāng)在轉(zhuǎn)移前除去供體脾細(xì)胞中的CD4+細(xì)胞時(shí)，通過(guò)FACS分類(lèi)，Vb的保護(hù)作用沒(méi)有被排除。此外，將在第14天接受Vb的MAIDS感染供體小鼠的脾細(xì)胞注入到Vb-治療的MAIDS中，顯示這些小鼠的MAIDS發(fā)展完全受到保護(hù)(圖8)。
3.3感染后14天，CD4+細(xì)胞的體內(nèi)損耗導(dǎo)致免于MAIDS發(fā)展脾轉(zhuǎn)移結(jié)果與解釋相一致，在pi 14天，免疫效應(yīng)細(xì)胞與調(diào)節(jié)細(xì)胞的克隆擴(kuò)展群體共存，所述調(diào)節(jié)細(xì)胞是CD4+，且Vb是依靠其破壞后者的能力而治療的。因此，pi第14天，CD4+細(xì)胞體內(nèi)損耗的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)當(dāng)模擬Vb的作用。實(shí)驗(yàn)的流程圖在圖9中給出。用MAIDS病毒感染每組5只小鼠，然后用單克隆抗體治療，從而在pi 14天使宿主CD4+或CD8+T細(xì)胞損耗。收集產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞系上清液中的單克隆抗體，并通過(guò)硫酸銨沉淀純化。體內(nèi)試驗(yàn)顯示，單一注射(0.5mg i.p.)適當(dāng)濃縮的單克隆抗體制劑可導(dǎo)致CD4+細(xì)胞降低98％，CD8+細(xì)胞降低95％。
顯然，用抗-CD4+單克隆抗體在pi 14天治療可防止感染小鼠MAIDS發(fā)展，由此模擬pi 14天Vb注射的作用(圖10)。相反，pi 14天的CD8+細(xì)胞的體內(nèi)損耗對(duì)疾病發(fā)展沒(méi)有作用。該結(jié)果進(jìn)一步支持了CD4+T細(xì)胞群對(duì)應(yīng)答病毒感染的免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行功能性下調(diào)的假設(shè)。此外，除去優(yōu)勢(shì)CD4+調(diào)節(jié)細(xì)胞可使免疫效應(yīng)細(xì)胞更有效地應(yīng)答病毒感染，導(dǎo)致疾病發(fā)展更緩慢或可能完全清除宿主的MAIDS病毒。
4.CD4+CD25+T細(xì)胞作為調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)直接檢驗(yàn)CD4+CD25+T細(xì)胞在鼠AIDS模型中起調(diào)節(jié)細(xì)胞作用的假設(shè)。用于確定調(diào)節(jié)細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的相同方法可用于試驗(yàn)CD4+CD25+亞組是否是第14天長(zhǎng)春花堿治療的目標(biāo)。圖11顯示實(shí)驗(yàn)完全合理。調(diào)節(jié)CD4+CD25+表型的2.0×106個(gè)細(xì)胞是用兩個(gè)正選擇步驟，使用MACS珠(Miltenyi Biotec)從供體脾臟的單細(xì)胞混懸液純化的。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試細(xì)胞純度(CD4+CD25+和CD4+CD25-部分＞90％純度)，并在轉(zhuǎn)移到未感染(對(duì)照)和感染MAIDS且在第14天進(jìn)行長(zhǎng)春花堿治療的小鼠中前，使用臺(tái)盼藍(lán)排除測(cè)試細(xì)胞的活力。轉(zhuǎn)移CD4+CD25-細(xì)胞，使調(diào)節(jié)細(xì)胞不存在于CD25+部分中，并可能使這些推定的調(diào)節(jié)細(xì)胞損失CD25表達(dá)，因?yàn)樗鼈償U(kuò)展并被激活，如Gavin等人，2002所報(bào)道的。
接受細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移的小鼠或者未感染(對(duì)照)或感染了MAIDS，并在第14天接受長(zhǎng)春花堿治療，從而檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移是否導(dǎo)致疾病發(fā)展。基本上，如果CD4+CD25+T細(xì)胞起調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用，那么這些細(xì)胞經(jīng)由過(guò)繼轉(zhuǎn)移的恢復(fù)應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致疾病發(fā)展，消除第14天長(zhǎng)春花堿治療的保護(hù)性作用。疾病的發(fā)展是通過(guò)MAIDS感染后10周，利用脾重量評(píng)估的。
使用未感染供體小鼠進(jìn)行過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖12中顯示。在陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，CD4+CD25+/-表型的未感染供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移不會(huì)導(dǎo)致pi 10周未感染受體脾重量的任何改變。然而，當(dāng)CD4+CD25+/-細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到感染MAIDS、第14天接受Vb治療的受體中時(shí)，疾病發(fā)展迅速明顯。有趣的是，這兩組的脾重量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p＝0.033)，表明在接受CD4+CD25+細(xì)胞的組中，疾病發(fā)展更顯著。事實(shí)上，在這些實(shí)驗(yàn)中，pi 10周的對(duì)照MAIDS脾臟約為0.5-0.6g。這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)細(xì)胞存在于CD4+CD25+和CD25-部分中，CD25+部分在抑制效應(yīng)細(xì)胞方面更有效。
5.MAIDS感染后的細(xì)胞因子水平5.1血清ELISA在感染后的前3周進(jìn)行定量ELISA，測(cè)試小鼠血清中是否存在IL-4和IL-10。IL-4和IL-10都是已經(jīng)證明過(guò)的、由調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生，且是調(diào)節(jié)細(xì)胞成熟所需的細(xì)胞因子(Gavin等人，2002，McGuirk和Mills，2002)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在感染后的不同天，通過(guò)小鼠尾部放血獲得血液，并高速離心收集血清。然后測(cè)定這些樣品的細(xì)胞因子水平，最終的數(shù)據(jù)在圖13和14中表示。
在增加超過(guò)pi 21天之前，有2個(gè)清晰的IL-4產(chǎn)生的峰，第1個(gè)位于pi 7天，第2個(gè)位于pi 14-16天。最后的增加可能與B細(xì)胞寡克隆擴(kuò)展有關(guān)，寡克隆擴(kuò)展是其后期MAIDS的主要特征。
測(cè)定相同的血液樣品中是否存在IL-10。IL-10也顯示出3個(gè)峰，第1個(gè)位于pi 4-5天，第2個(gè)位于pi 12-14天，第3個(gè)位于pi 16天。有趣的是，注意到CD4+CD25+細(xì)胞百分比的峰出現(xiàn)在第10-12天(沒(méi)有給出數(shù)據(jù))，與第2個(gè)IL-10的峰重疊。特別是，CD25(即IL-2受體)在細(xì)胞群進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)并有絲分裂之前，是以瞬時(shí)方式表達(dá)的(Roitt等人，1989)。組合方式提示當(dāng)Vb或抗-CD4治療消除MAIDS發(fā)展時(shí)，少量調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)展并在準(zhǔn)確時(shí)間發(fā)揮作用。也就是說(shuō)，該數(shù)據(jù)與這里所述的T細(xì)胞調(diào)節(jié)假設(shè)相一致。
5.2通過(guò)胞內(nèi)流動(dòng)測(cè)定細(xì)胞因子水平胞內(nèi)流動(dòng)是一種已經(jīng)得到發(fā)展的方法，并可用于使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)存在于個(gè)體細(xì)胞中的細(xì)胞因子的離體水平。在該實(shí)驗(yàn)中，用MAIDS感染小鼠，在感染后的每個(gè)第4天(第4、8、12、16和20天)收集脾臟，并收集第0天的未感染對(duì)照小鼠的脾臟，得到胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生的基線(xiàn)。將脾臟制備成單細(xì)胞混懸液，將紅細(xì)胞溶解，然后固定WBC，滲透并對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記和細(xì)胞因子的組合染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖15中表示。
IL-4和IL-10的表達(dá)水平與pi 16天的兩個(gè)峰值非常相似，然后在pi 20天降低，但沒(méi)有恢復(fù)到基線(xiàn)水平。此數(shù)據(jù)與血清ELISA的結(jié)果相一致(圖13和14)，其中兩個(gè)細(xì)胞因子產(chǎn)生的峰值都是在pi 16天觀察到的，正如先前所述，與MAIDS感染后CD4+CD25+百分比的分布十分相關(guān)。
5.3通過(guò)ELISpot測(cè)定細(xì)胞因子水平ELISpot是一種以ELISA為基礎(chǔ)的技術(shù)，可在單細(xì)胞水平分析細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在孔中培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞，其基質(zhì)是用目標(biāo)細(xì)胞因子的單克隆抗體預(yù)-涂覆的薄膜。該培養(yǎng)步驟可具有或沒(méi)有細(xì)胞的刺激。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有移動(dòng)平板，因此分泌的細(xì)胞因子局限于細(xì)胞的位置，它被與薄膜基質(zhì)結(jié)合的抗體捕獲，這樣一來(lái)，分泌細(xì)胞因子的每個(gè)細(xì)胞都在薄膜上留下一個(gè)斑點(diǎn)，斑點(diǎn)在抗體檢測(cè)后可見(jiàn)。該技術(shù)可將產(chǎn)生目標(biāo)細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量化至單細(xì)胞水平。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)而言，使用與胞內(nèi)流動(dòng)相同的方案在pi 0、4、8、12、16和20天收集小鼠的脾WBC。然后在沒(méi)有刺激的條件下，在IL4-和IL-10 ELISpot平板上培養(yǎng)這些細(xì)胞過(guò)夜。然后將該平板顯色，并計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)。IL-4的結(jié)果在圖16中表示，IL-10的結(jié)果在圖17中表示。
又，正如胞內(nèi)流動(dòng)和血清ELISA那樣，可見(jiàn)到兩個(gè)細(xì)胞因子的相似趨勢(shì)，即在pi 16天，表達(dá)各細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)增加到峰值，接著在pi 20天顯著降低。
6.概述本實(shí)施例表明，存在著將對(duì)MAIDS病毒的免疫應(yīng)答下調(diào)的“調(diào)節(jié)細(xì)胞”群，它可使病毒增殖并引起疾病。在感染后的適宜時(shí)間除去調(diào)節(jié)細(xì)胞可使效應(yīng)細(xì)胞(如B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞)更有效地清除病毒，阻止疾病發(fā)展。這些調(diào)節(jié)細(xì)胞被提出用于控制細(xì)胞，如CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活和/或功能，它們可起效應(yīng)細(xì)胞的作用，排除病毒感染。
通過(guò)特異性除去免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞群而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答先前已經(jīng)由Robert North及其同事使用鼠T細(xì)胞淋巴瘤模型而研究過(guò)(North和Awwad，1990)。North提出免疫原性腫瘤能夠由于CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞群對(duì)免疫應(yīng)答的下調(diào)而建立和生長(zhǎng)。這種調(diào)節(jié)不能使免疫應(yīng)答在強(qiáng)度上充分發(fā)展從而引起腫瘤退化。值得注意的是，在腫瘤接種后的不同時(shí)間用單一劑量的長(zhǎng)春花堿(Vb)進(jìn)行治療可導(dǎo)致腫瘤的增強(qiáng)(第10天)或退化(第4、6、13和15天)。North假設(shè)所觀察到的退化是由于在那些時(shí)間點(diǎn)，CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的消除。在一系列涉及CD4+和CD8+T細(xì)胞選擇性損耗的實(shí)驗(yàn)中，將調(diào)節(jié)細(xì)胞鑒定為CD4+表型。
近交和野生小鼠的染色體DNA含有與MuLV核酸探針?lè)磻?yīng)的序列的多個(gè)拷貝。這些序列中包括完全的，若干MuLV的潛在感染性基因組(Chattopadhyay等人，1980)。所有MuLV共有高度的序列同源性。我們假設(shè)當(dāng)這些內(nèi)源性MuLV蛋白在發(fā)展過(guò)程中表達(dá)，則它們可作為自身抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別。由于內(nèi)源性和外源性MuLV核酸及氨基酸序列之間的高水平同源性，感染MuLV也可作為自身抗原被免疫系統(tǒng)部分識(shí)別，且對(duì)病毒感染的任何免疫應(yīng)答將被下調(diào)，導(dǎo)致病毒清除減少且疾病發(fā)展。
實(shí)施例2使患有HIV感染的人類(lèi)患者接受HAART至少6個(gè)月，然后取消治療。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定在HAART過(guò)程中和結(jié)束后獲得的樣品的病毒負(fù)荷及c-反應(yīng)性蛋白水平。
正如在圖18中所看到的那樣，結(jié)果顯示HAART結(jié)束后，病毒負(fù)荷增加。之后由于效應(yīng)細(xì)胞的活性，病毒負(fù)荷降低，接著由于效應(yīng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)，病毒負(fù)荷再次增加。c-反應(yīng)性蛋白水平近似反映病毒負(fù)荷，表明該蛋白的測(cè)定可用作效應(yīng)細(xì)胞活性以及病毒負(fù)荷的標(biāo)記。
實(shí)施例3將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽的疫苗給予患有HIV感染的人類(lèi)患者。這種疫苗的例子在Dennehy(2001)和Moore等(2001)中討論。
給予疫苗后，按照實(shí)施例2的一般性描述分析c-反應(yīng)性蛋白的水平。優(yōu)選，至少每隔24小時(shí)測(cè)定一次c-反應(yīng)性蛋白的水平。自然，應(yīng)當(dāng)檢查患者的任何體征，例如，可導(dǎo)致c-反應(yīng)性蛋白水平升高的其它病毒或細(xì)菌感染。在沒(méi)有這種體征的情況下，繼續(xù)監(jiān)測(cè)c-反應(yīng)性蛋白的水平，直到c-反應(yīng)性蛋白的水平達(dá)到峰值并開(kāi)始降低。作為效應(yīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)的指示，大約在c-反應(yīng)性蛋白的水平開(kāi)始降低時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)劑量，如300mg給予被試者抗-CD4+抗體。
然后繼續(xù)監(jiān)測(cè)患者的HIV標(biāo)記，如測(cè)定病毒負(fù)荷。如果有證據(jù)顯示感染還未被適當(dāng)控制，則可重復(fù)治療。
實(shí)施例4使患有HIV感染的人類(lèi)患者接受標(biāo)準(zhǔn)的HAART治療。結(jié)束HAART后，按照實(shí)施例2中的一般性描述分析被試者的c-反應(yīng)性蛋白的水平。優(yōu)選，至少每隔24小時(shí)測(cè)定一次c-反應(yīng)性蛋白的水平。作為效應(yīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)的指示，大約在c-反應(yīng)性蛋白水平的開(kāi)始降低時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)劑量，如3-4mg/m2靜脈內(nèi)給予被試者長(zhǎng)春花堿(Casciato和Lowitz，1995)。長(zhǎng)春花堿將針對(duì)分裂細(xì)胞，如調(diào)節(jié)細(xì)胞，它們開(kāi)始克隆擴(kuò)展，從而控制效應(yīng)細(xì)胞的水平。
然后，繼續(xù)監(jiān)測(cè)患者的HIV指標(biāo)，如測(cè)定病毒負(fù)荷。如果有證據(jù)表明感染還沒(méi)有被適當(dāng)控制，則可重復(fù)治療。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可在不背離廣泛描述的本發(fā)明精神或范圍的前提下，對(duì)具體實(shí)施方案所示的本發(fā)明進(jìn)行若干變化和/或修改。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案在所有方面中都被認(rèn)為是舉例說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
上面討論的所有公開(kāi)出版物都整體引入此處作為參考。
包括在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中的有關(guān)文獻(xiàn)、作用、材料、裝置、物品的任何討論都僅僅是為本發(fā)明提供內(nèi)容的目的。在本申請(qǐng)每個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前，不應(yīng)認(rèn)為這些事件的任何或全部形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是現(xiàn)有的與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的一般性知識(shí)，特別是在澳大利亞。
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權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物被試者中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法，該方法包括給予被試者一種可增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，和/或激活效應(yīng)細(xì)胞的組合物，隨后給予被試者一種抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述急性期炎癥指標(biāo)是急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)是c-反應(yīng)性蛋白。
4.權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述試劑大約是在急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)的水平已經(jīng)達(dá)到峰值并開(kāi)始降低時(shí)給予的。
5.按照權(quán)利要求2-4任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述試劑大約是在給予所述組合物后，病毒顆粒的數(shù)量已經(jīng)開(kāi)始穩(wěn)定或增加時(shí)給予的，其中在給予所述組合物后，當(dāng)急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)水平開(kāi)始增加時(shí)開(kāi)始測(cè)試被試者中的病毒顆粒水平。
6.按照權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物含有逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽是通過(guò)給予一種含有逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽和藥學(xué)上可接受載體的疫苗而提供給被試者的。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述疫苗還含有佐劑。
9.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗原多肽是通過(guò)給予一種編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽的DNA疫苗而提供給被試者的。
10.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗原多肽是通過(guò)食用表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原多肽的轉(zhuǎn)基因植物而提供給被試者的。
11.一種治療哺乳動(dòng)物被試者中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法，該方法包括使被試者接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法，隨后給予被試者一種抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，其中該試劑是在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法已經(jīng)結(jié)束后給予的，且逆轉(zhuǎn)錄病毒數(shù)量的最終擴(kuò)展導(dǎo)致抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量增加，和/或激活效應(yīng)細(xì)胞，其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述急性期炎癥指標(biāo)是急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)是c-反應(yīng)性蛋白。
14.權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述試劑大約是在急性期炎癥指標(biāo)的水平已經(jīng)達(dá)到峰值并開(kāi)始降低時(shí)給予的。
15.按照權(quán)利要求12-14任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述試劑大約是在給予所述組合物后，病毒顆粒的數(shù)量已經(jīng)開(kāi)始穩(wěn)定或增加時(shí)給予的，其中在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法結(jié)束后，急性期炎癥陽(yáng)性指標(biāo)水平開(kāi)始增加時(shí)開(kāi)始測(cè)試被試者中的病毒顆粒水平。
16.按照權(quán)利要求11-15任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法是HAART。
17.按照權(quán)利要求1-16任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述試劑選自抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞下調(diào)活性的抗-增殖藥物、放療、和抗體。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述抗-增殖藥物選自長(zhǎng)春花堿和脫水長(zhǎng)春花堿。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述抗體是抗-CD4+。
20.按照權(quán)利要求1-19任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒選自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。
21.按照權(quán)利要求1-20任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法重復(fù)至少一次。
22.按照權(quán)利要求1-21任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物被試者是人。
23.可增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量、和/或激活效應(yīng)細(xì)胞的組合物用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中隨后給予該被試者可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
24.可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中先前已經(jīng)給予該被試者可增加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量、和/或激活效應(yīng)細(xì)胞的組合物，其中給予該試劑的時(shí)間是以效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
25.抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中隨后給予該被試者可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑，其中給予該試劑的時(shí)間是以抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
26.可抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)生、限制調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能、和/或破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞的試劑用于制造給予感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物被試者的藥物的用途，其中先前已經(jīng)給予該被試者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物，其中給予該試劑的時(shí)間是以抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的效應(yīng)細(xì)胞的活性不顯著降低而選擇的，且其中當(dāng)給予該試劑時(shí)，被試者中急性期炎癥指標(biāo)水平的波動(dòng)被用于幫助測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明人指出在應(yīng)答感染哺乳動(dòng)物的逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)產(chǎn)生至少兩個(gè)免疫細(xì)胞群體。具體而言，感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)能夠通過(guò)一組細(xì)胞、此處通常稱(chēng)作“效應(yīng)細(xì)胞”來(lái)增強(qiáng)抗所述病毒的免疫應(yīng)答，然而，第二細(xì)胞群體也同時(shí)產(chǎn)生，它們可調(diào)節(jié)“效應(yīng)細(xì)胞”，此處通常稱(chēng)作“調(diào)節(jié)細(xì)胞”(或抑制細(xì)胞)，限制哺乳動(dòng)物有效控制或消除逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的能力。因此，本發(fā)明利用這些觀察結(jié)果提供用于治療感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物的方法。此外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)急性期炎癥指標(biāo)可用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)“效應(yīng)細(xì)胞”對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原的應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K45/06GK1646156SQ03808873
公開(kāi)日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2003年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月20日
發(fā)明者M·L·阿什當(dāng) 申請(qǐng)人:免疫援助有限公司