專利名稱：抗cd30的人類單克隆抗體的制作方法
相關(guān)申請本申請要求于2002年1月9日提交的美國序列號60/347649、于2002年8月19日提交的美國序列號60/404427和于2002年12月6日提交的美國序列號60/431684的優(yōu)先權(quán)，在此處將其內(nèi)容整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
CD30細胞表面分子是腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族的一個成員。該分子家族在其成員中具有不定的同源性，且包括神經(jīng)生長因子受體(NGFR)、CD120(a)、CD120(b)、CD27、CD40和CD95。這些分子一般特征在于在胞質(zhì)外區(qū)域中存在多個富含半胱氨酸的重復(fù)(de Bruin，P.C.等人，Leukemia 91620-1627(1995))。據(jù)認(rèn)為該家族中成員對于調(diào)節(jié)淋巴細胞的增殖和分化是至關(guān)緊要的。
CD30是具有6個(人類)或3個(鼠和大鼠)富含半胱氨酸的重復(fù)的I型跨膜糖蛋白，且具有1個中央鉸鏈序列。CD30以從90kDa的細胞間前體蛋白發(fā)展來的120kDa膜分子存在。它作為約90kDa的可溶性蛋白質(zhì)(sCD30)從細胞表面釋放。sCD30的釋放作為有生活力的CD30細胞的活性過程發(fā)生，且不僅僅由從垂死或死亡細胞中的釋放引起。已通過用單克隆抗體Ki-1和Ber-H2進行免疫篩選而從HLTV-1人類T-細胞系HUT-102的表達文庫中克隆了編碼CD30蛋白質(zhì)的cDNA(Schwab，U.等人，Nature 29965(1982))。已發(fā)現(xiàn)小鼠和大鼠CD30 cDNA分別編碼498和193個氨基酸。人類CD30 cDNA編碼額外的90個氨基酸，其中部分是一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的重復(fù)。CD30基因已定位于人類中的1p36和大鼠中的5q36.2。
CD30優(yōu)選地由活化的淋巴樣細胞表達。特定地，依賴于細胞類型、分化階段和其他刺激的存在，淋巴樣細胞中CD30的刺激已顯示可誘導(dǎo)多效的生物學(xué)作用，包括增殖、活化、分化和細胞死亡(Gruss，H.J.等人，Blood 832045-2056(1994))。CD30最初通過單克隆抗體Ki-1進行鑒定，該單克隆抗體與表達于何杰金氏病的何杰金氏和Reed-Sternberg細胞上的抗原反應(yīng)(Schwab等人，Nature 29965(1982))。因此，CD30廣泛用作何杰金氏淋巴瘤和相關(guān)的血液惡性腫瘤的臨床標(biāo)記(Froese等人，J.Immunol.1392081(1987)；Carde等人，Eur.J.Cancer 26474(1990))。
隨后顯示CD30表達于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的亞型上，包括伯基特淋巴瘤、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T-細胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小切割的細胞淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、外周T-細胞淋巴瘤、Lennert氏淋巴瘤、免疫母細胞淋巴瘤、T-細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-細胞淋巴瘤(T-ALL)和內(nèi)分芽型/中央細胞(centrocytic)(cb/cc)濾泡淋巴瘤(Stein等人，Blood 66848(1985)；Miettinen，Arch.Pathol.Lab.Med.1161197(1992)；Piris等人，Histopathology 17211(1990)；Burns等人，Am.J.Clin.Pathol.93327(1990)和Eckert等人，Am.J.Dermatopathol.11345(1989))，以及幾種病毒轉(zhuǎn)化的品系，如人類T-細胞嗜淋巴細胞病毒I或II(human T-Cell Lymphotrophic Virus I or II)轉(zhuǎn)化的T-細胞和EB病毒(Epistein-Barr virus)轉(zhuǎn)化的B-細胞(Stein等人，Blood 66848(1985)；Andreesen等人，Blood 631299(1984))。此外，在分化晚期也在胚胎性瘤、非胚胎性瘤、惡性黑素瘤、間充質(zhì)腫瘤和骨髓細胞系和巨噬細胞中記錄到了CD30表達(Schwartting等人，Blood 741687(1989)；Pallesen等人，Am.J.Pathol.133446(1988)；Mechtersheimer等人，Cancer 661732(1990)；Andreesen等人，Am.J.Pathol.134187(1989))。
由于正常個體中CD30-陽性細胞的百分比相當(dāng)小，所以CD30在腫瘤細胞中的表達使其成為抗體介導(dǎo)的治療的重要目標(biāo)，以特異性地將治療劑導(dǎo)向CD30-陽性的孳生性細胞(Chaiarle，R.等人，Clin.Immunol.90(2)157-164(1999))。然而，盡管迄今獲得的結(jié)果清楚地確定CD30是免疫治療的有用目標(biāo)，但該結(jié)果也顯示目前可用的鼠抗體未構(gòu)成理想的治療劑。
因此，存在對改進治療性抗CD30抗體的需要，該抗體對于治療和/或預(yù)防由CD30介導(dǎo)的疾病是有效的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了單獨的與人類CD30結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，以及單獨的衍生物(如免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子)和其他含有該抗體的治療組合物，或者與額外治療劑的組合。同樣提供的是應(yīng)用本發(fā)明的抗體和組合物治療多種CD30介導(dǎo)的疾病的方法。
本發(fā)明的人類抗體與CD30結(jié)合，并抑制CD30的功能(和CD30介導(dǎo)的作用)和/或抑制表達CD30的細胞的生長(如介導(dǎo)殺傷)，該細胞如腫瘤細胞和免疫疾病中包括的細胞。這種細胞包括如骨髓細胞、肝細胞、淋巴結(jié)細胞、皮膚細胞、脾細胞、胸腺細胞、扁桃體細胞、蛻膜細胞、子宮內(nèi)膜細胞、何杰金氏細胞、Reed-Sternberg細胞、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞、多形的和免疫母細胞淋巴瘤細胞、T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞。在一個特定的實施方案中，人類抗體用于在淋巴瘤的治療中抑制何杰金氏細胞的生長/介導(dǎo)殺傷何杰金氏細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，人類抗體通過在人類效應(yīng)細胞(如單核細胞或單核的細胞)存在時誘導(dǎo)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)而抑制腫瘤細胞生長/介導(dǎo)殺傷腫瘤細胞。在另一個實施方案中，人類抗體在巨噬細胞存在時誘導(dǎo)表達CD30的腫瘤細胞的吞噬作用。因此，本發(fā)明的抗體提供了治療和預(yù)防由CD30活性介導(dǎo)的病癥的改進方法，這部分歸因于其獨特的特異性(如表位特異性和缺乏與相關(guān)的細胞表面抗原的交叉反應(yīng)性)、親和力、結(jié)構(gòu)、功能活性及它們完全是人類的事實，這使得它們當(dāng)施用于人類患者時比以前生成的其他CD30抗體(如鼠和人源化的抗體)具有顯著更低的免疫原性和更高的治療效果和有用性。
本發(fā)明分離的人類抗體包括多種抗體同種型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。一般地，它們包括IgG1(如IgGlk)、IgG3和IgM同種型?？贵w可為全長的(如IgG1或IgG3抗體)，或者可僅包括抗原-結(jié)合部分(如Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv片段)。
本發(fā)明特定的治療性抗體包括人類單克隆抗體(HuMab)17G1和功能等價的抗體，該抗體(a)由在其可變區(qū)包含分別在SEQ ID NO1和SEQ ID NO3中提出的核苷酸序列的人類重鏈和人類輕鏈核酸及其保守的序列修飾物編碼，或(b)包括分別在SEQ ID NO2和SEQ IDNO4中所示的氨基酸序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)及其保守的序列修飾物。
本發(fā)明另一種特定的治療性抗體包括人類單克隆抗體2H9和功能等價的抗體，該抗體(a)由在其可變區(qū)包含分別在SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中提出的核苷酸序列的人類重鏈和人類輕鏈核酸及其保守的序列修飾物編碼，或(b)包括分別在SEQ ID NO6和SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)及其保守的序列修飾物。
本發(fā)明另一種特定的治療性抗體包括人類單克隆抗體5F11和功能等價的抗體，該抗體(a)由在其可變區(qū)包含分別在SEQ ID NO9和SEQ ID NO11中提出的核苷酸序列的人類重鏈和人類輕鏈核酸及其保守的序列修飾物編碼，或(b)包括分別在SEQ ID NO10和SEQ IDNO12中所示的氨基酸序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)及其保守的序列修飾物。
同樣包括于本發(fā)明中的是如下抗體，該抗體與由抗體17G1、2H9或5F11限定的人類CD30上的表位結(jié)合，和/或與抗體17G1、2H9或5F11競爭與CD30的結(jié)合，或具有由抗體17G1、2H9或5F11展示的其他功能性結(jié)合特征。這種抗體包括以約10-11M的解離平衡常數(shù)(Kd)和/或以至少約107M-1的結(jié)合平衡常數(shù)(Ka)與CD30結(jié)合的抗體。這種抗體也包括那些不與相關(guān)的細胞表面抗原交叉反應(yīng)的抗體，因而不抑制其功能。
本發(fā)明另一個特定的人類抗體包括那些包含如下CDR結(jié)構(gòu)域的抗體，該CDR結(jié)構(gòu)域具有人類重鏈和輕鏈的CDR1區(qū)域、人類重鏈和輕鏈的CDR2區(qū)域和人類重鏈和輕鏈的CDR3區(qū)域，其中(a)人類重鏈區(qū)域的CDR1、CDR2和CDR3包含如下氨基酸序列，該氨基酸序列選自示于圖7(分別為SEQ ID NO16、17和18)、圖9(分別為SEQ ID NO28、29和30)和

圖11(分別為SEQ ID NO40、41和42)中的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域氨基酸序列及其保守的序列修飾物，和(b)人類輕鏈區(qū)域的CDR1、CDR2和CDR3包含如下氨基酸序列，該氨基酸序列選自示于圖8(分別為SEQ ID NO22、23和24)、圖10(分別為SEQ ID NO34、35和36)和圖12(分別為SEQ ID NO46、47和48)中的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域氨基酸序列及其保守的序列修飾物?？蛇x擇地，本發(fā)明特定的人類抗體包括那些包含如下CDR結(jié)構(gòu)域的抗體，該CDR結(jié)構(gòu)域具有人類重鏈和輕鏈的CDR1區(qū)域、人類重鏈和輕鏈的CDR2區(qū)域和人類重鏈和輕鏈的CDR3區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域包含與圖7-12中所示的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域的氨基酸序列(SEQ IDNO16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41、42、46、47和48)至少為80％同源性的氨基酸序列，優(yōu)選地為85％同源性，更優(yōu)選地為90％、95％、98％和99％同源性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的人類抗體與CD30結(jié)合并通過部分或完全阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合而抑制CD30功能(如CD30介導(dǎo)的作用)。CD30配體的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的人類抗體特征在于一種或多種下述性質(zhì)a)對CD30的特異性；b)親和常數(shù)至少為約107M-1的與CD30的結(jié)合親和力，該親和常數(shù)優(yōu)選地為108M-1，且更優(yōu)選地為約109M-1～1010M-1或更高；c)與CD30至少為約103M-1S-1的結(jié)合常數(shù)(Kassoc)，更優(yōu)選地為約104M-1S-1，且最優(yōu)選地為約105M-1S-1；d)從CD30至少為約10-3s-1的解離常數(shù)(Kdis)，優(yōu)選地為約10-4s-1，更優(yōu)選地為10-5s-1，且最優(yōu)選地為10-6s-1；e)調(diào)理表達CD30的細胞的能力；或f)在濃度為約10μg/ml或更低的人類效應(yīng)細胞存在時(如在體外)抑制表達CD30的細胞(如腫瘤細胞)生長和/或介導(dǎo)吞噬作用和殺傷的能力。
本發(fā)明的人類抗-CD30抗體可在宿主細胞(如CHO細胞或淋巴細胞)中進行重組生產(chǎn)，或者可直接從表達抗體的雜交瘤(即該雜交瘤包括與無限增殖化細胞融合的B細胞，該B細胞從轉(zhuǎn)基因的非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得，該動物具有包含編碼抗體的人類重鏈轉(zhuǎn)基因和人類輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組)中獲得。在一個特定實施方案中，抗體是通過在此處稱為17G1(SEQ ID NO1-4)、2H9(SEQ ID NO5-8)和SF11(SEQ ID NO9-12)的雜交瘤生產(chǎn)的。
在另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因的非人類動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠(在此處也稱為“HuMAb小鼠”)，該動物表達與CD30結(jié)合的人類單克隆抗體。在一個特定的實施方案中，轉(zhuǎn)基因的非人類動物是轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠具有包含編碼本發(fā)明所有或部分抗體的人類重鏈轉(zhuǎn)基因和人類輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。轉(zhuǎn)基因的非人類動物可用CD30抗原和/或表達CD30的細胞的純化或濃縮制劑進行免疫接種。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因的非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠能夠通過V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生多種抗CD30的人類單克隆抗體同種型(如IgG、IgA和/或IgM)。同種型轉(zhuǎn)換可通過如經(jīng)典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換發(fā)生。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了從如上所述的轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠分離的B-細胞，該B-細胞表達人類抗-CD30抗體。然后可通過與無限增殖化細胞融合而使分離的B-細胞無限增殖化，以提供人類抗-CD30抗體的來源(如雜交瘤)。這種雜交瘤(即產(chǎn)生人類抗CD30抗體的)也包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。
如在此處所示例的，本發(fā)明的人類抗體可直接從表達該抗體的雜交瘤獲得，或者可進行克隆并在宿主細胞(如CHO細胞或淋巴細胞)中進行重組表達。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)與人類CD30結(jié)合的人類單克隆抗體的方法。在一個實施方案中，該方法包括應(yīng)用純化或濃縮的人類CD30抗原和/或表達人類CD30的細胞對轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫接種，該轉(zhuǎn)基因非人類動物如前文所述(如具有包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因和人類輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，該轉(zhuǎn)基因編碼所有或部分抗-CD30抗體)。然后獲得動物的B細胞(如脾B細胞)，并與骨髓瘤細胞融合以形成無限增殖化雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞分泌抗CD30的人類單克隆抗體。
在另一方面，本發(fā)明的人類抗-CD30抗體是衍生化的，與另一種功能分子如另一種肽或蛋白質(zhì)(如Fab’片段)連接或共表達。例如，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分可在功能上與一種或多種其他分子實體連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合等)，如另一種抗體(如以便產(chǎn)生雙特異性或多特異性抗體)、細胞毒素、細胞配體或抗原(如以便產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物，如免疫毒素)。因此，本發(fā)明包含大量抗體偶聯(lián)物、雙特異性和多特異性分子和融合蛋白質(zhì)，它們?nèi)颗c表達CD30的細胞結(jié)合且可用于將其他分子導(dǎo)向于這些細胞。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一種雙特異性或多特異性分子，該分子包含至少一種對CD30的第一結(jié)合特異性(如人類抗-CD30抗體或其片段或模擬物)，以及對人類效應(yīng)細胞的第二結(jié)合特異性，如對Fc受體(如人類Fcγ受體(如FcγRI)或者人類Fcα受體)的結(jié)合特異性。一般地，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含至少-種抗體或其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv)，優(yōu)選地為人類抗體或其片段，或“嵌合的”或“人源化的”抗體或其部分(如具有源自非人類抗體(如鼠的)的可變區(qū)或互補性決定區(qū)(CDR)，而剩余部分的來源為人類)。
因此，本發(fā)明包括與人類CD30和Fc受體兩者結(jié)合的雙特異性和多特異性分子，該Fc受體如人類IgG受體，如Fcγ-受體(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。也可導(dǎo)向于其他Fc受體，如人類IgA受體(如FcαRI)。Fc受體優(yōu)選地定位于效應(yīng)細胞的表面，如單核細胞、巨噬細胞或活化的單核的細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性和多特異性分子在與受體的免疫球蛋白Fc(如IgG或IgA)結(jié)合位點不同的位點與Fc受體結(jié)合。因此，雙特異性和多特異性分子的結(jié)合不被免疫球蛋白的生理學(xué)水平阻斷。
在另一方面，本發(fā)明提供了通過與本發(fā)明具有有效量的抗體、抗體衍生物或其他治療組合物的細胞接觸而抑制表達CD30的細胞生長的方法，從而該細胞的生長受到了抑制。在一個實施方案中，該方法包括在存在效應(yīng)細胞時殺死表達CD30的細胞，如通過ADCC。在另一個實施方案中，該方法包括通過吞噬作用殺死表達CD30的細胞。將細胞優(yōu)選地殺死或抑制，而不殺死或抑制不表達CD30但可表達如結(jié)構(gòu)相關(guān)的細胞表面抗原的細胞活性(即與相關(guān)的但功能不同的細胞表面抗原無交叉反應(yīng)性)?？捎帽景l(fā)明的人類抗體抑制或殺死的表達CD30的細胞包括如腫瘤細胞、骨髓細胞、肝細胞、淋巴結(jié)細胞、皮膚細胞、脾細胞、胸腺細胞、扁桃體細胞、蛻膜細胞、子宮內(nèi)膜細胞、何杰金氏細胞、Reed-Sternberg細胞、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞、多形的和免疫母細胞淋巴瘤細胞、T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞。
因此，本發(fā)明的人類抗體可用于通過向患這種疾病的患者施用抗體而治療和/或預(yù)防多種CD30介導(dǎo)的疾病?？蛇M行治療(如改善)或預(yù)防的示例性疾病包括，但不局限于致瘤性疾病和自身免疫病?？蛇M行治療和/或預(yù)防的致瘤性疾病的例子包括何杰金氏病、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-細胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他T-細胞或B-細胞淋巴瘤?？蛇M行治療和/或預(yù)防的自身免疫病的例子包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細胞增多癥、HIV和皰疹病毒(herpesvirus)相關(guān)的疾病。
在本發(fā)明一個特定實施方案中，將施用了抗體的被試者額外用化療劑、放射或一種試劑如細胞因子進行治療，該試劑調(diào)節(jié)如增強或抑制Fc受體如Fcα或Fcγ受體的表達或活性。在治療過程中施用的一般細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。此外，一般的治療劑包括抗癌劑如阿霉素(adriamycin)、順式鉑氨硫酸博來霉素、亞硝基脲氮芥、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲。
為了增加本發(fā)明的人類抗-CD30抗體抗不高度表達CD30的癌細胞的治療功效，抗體可以與上調(diào)或另外影響CD30的表達的試劑共同施用，該試劑如導(dǎo)致CD30在腫瘤細胞上上調(diào)的且更均一表達的淋巴因子制劑。適合于施用的淋巴因子制劑包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子及其組合。這些可在靜脈內(nèi)施用。適當(dāng)?shù)牧馨鸵蜃觿┝恳话銥?0,000～1,000,000單位/患者。
在另一方面，本發(fā)明提供了在體外或在體內(nèi)探測樣品中CD30存在性的方法，如CD30-相關(guān)的疾病的診斷。在一個實施方案中，這是通過使要檢驗的樣品任選地和對照樣品一起與本發(fā)明的人類單克隆抗體(或其抗原結(jié)合部分)在如下條件下接觸，該條件使得能夠在抗體和CD30之間形成復(fù)合物。然后探測復(fù)合物的形成(如應(yīng)用ELISA)。當(dāng)應(yīng)用對照樣品連同檢驗樣品時，在兩種樣品中均探測到復(fù)合物，且樣品間復(fù)合物形成中的任何統(tǒng)計學(xué)顯著的差異可指示檢驗樣品中存在CD30。
在另一方面，本發(fā)明提供了編碼人類抗-CD30抗體及其部分(如其可變區(qū))的核酸分子，以及包括本發(fā)明的核酸的重組表達載體和用該載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。通過培養(yǎng)這些宿主細胞生產(chǎn)抗體的方法也包含于本發(fā)明中。由本發(fā)明提供的特定核酸包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列，分別編碼人類抗-CD30抗體(HuMab)17G1的重鏈和輕鏈；SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中所示的核苷酸序列，分別編碼人類抗-CD30抗體(HuMab)2H9的重鏈和輕鏈；以及SEQ IDNO9和SEQ ID NO11中所示的核苷酸序列，分別編碼人類抗-CD30抗體(HuMab)5F11的重鏈和輕鏈。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種(即其組合)人類抗-CD30抗體連同一種載體的治療性和診斷性組合物。在一個特定實施方案中，該組合物進一步包括一種或多種其他治療劑，如細胞毒性或放射毒性劑，或者包括上調(diào)CD30表達或在效應(yīng)細胞表面表達的分子表達的試劑，如上調(diào)Fc受體表達的GM-CSF。
對于在CD30介導(dǎo)的疾病的體內(nèi)治療和預(yù)防中的應(yīng)用，本發(fā)明的人類抗體是通過任何適當(dāng)?shù)氖┯猛緩揭灾委熡行┝渴┯糜诨颊?如人類被試者)的，如注射和其他本領(lǐng)域公知的用于基于抗體的臨床產(chǎn)品的施用途徑。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種免疫偶聯(lián)物，如免疫毒素，該免疫偶聯(lián)物包括與治療劑偶聯(lián)的本發(fā)明的完整人類抗-CD30抗體，該治療劑如細胞毒性劑，放射毒性劑，化療藥物，免疫抑制劑，或者抗炎試劑，如類固醇和非類固醇抗炎試劑。
可選擇地，本發(fā)明的人類抗體可與這種治療性和細胞毒性劑共同施用，但不與其連接。它們可同時與這種試劑共同施用(即在單個組合物中或單獨地)，或者可在這種試劑施用前或施用后施用。如上所述，這種試劑可包括細胞毒性劑、放射毒性劑或化療劑，如阿霉素(adriamycin)、順式鉑氨硫酸博來霉素、亞硝基脲氮芥、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺羥基脲及其組合。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點在下面的詳述和實施例中是顯而易見的，該詳述和實施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請中引用的所有參考文獻、專利和公布的專利申請的內(nèi)容均在此處清楚地引入作為參考。
附圖簡述圖1是比較抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同種型對照與重組CD30的劑量依賴性結(jié)合的圖。
圖2是比較抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同種型對照與何杰金氏淋巴瘤細胞系L540的劑量依賴性結(jié)合的圖。
圖3是比較抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同種型對照對L540何杰金氏腫瘤細胞的單核的細胞介導(dǎo)的抗體依賴性細胞毒性的圖。
圖4是比較抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同種型對照對L540何杰金氏腫瘤細胞的單核細胞介導(dǎo)的抗體依賴性細胞毒性的圖。
圖5A和B是顯示用HuMab 5F11對細胞生長進行抑制的圖。
圖6是顯示應(yīng)用異種移植的小鼠模型在體內(nèi)用HuMab 5F11對表達CD30的腫瘤細胞進行生長抑制的圖。
圖7顯示來自HuMab 17G1的VH-區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。顯示了CDR區(qū)域。
圖8顯示來自HuMab 17G1的VL-區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。顯示了CDR區(qū)域。
圖9顯示來自HuMab 2H9的VH-區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO5)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。顯示了CDR區(qū)域。
圖10顯示來自HuMab 2H9的VL-區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO7)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。顯示了CDR區(qū)域。
圖11顯示來自HuMab 5F11的VH-區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO9)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。顯示了CDR區(qū)域。
圖12顯示來自HuMab 5F11的VL-區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO11)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。顯示了CDR區(qū)域。
圖13分別顯示種系序列VH4-34、L15、VH3-11、A27和L6的核苷酸序列(SEQ ID NO49、50、51、52和53)。
圖14是顯示抗A聚簇的抗體能夠抑制FITC-標(biāo)記的HuMab 5F11與L540細胞結(jié)合，而抗B或C聚簇的抗體不能進行抑制的圖，從而顯示5F11結(jié)合或靠近A聚簇表位。
圖15是顯示在彌散性模型中HuMab 5F11的治療對用人類HL細胞L540CY攻擊的SCID小鼠的存活率的作用的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于治療和診斷多種由CD30和/或表達CD30的細胞介導(dǎo)的病癥(如由CD30的增殖作用導(dǎo)致的病癥)的改進的基于抗體的治療。本發(fā)明的治療應(yīng)用分離的人類單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，該抗體或其抗原結(jié)合部分與CD30或表達CD30的細胞結(jié)合并抑制其功能，特別是在人類治療中。
在一個實施方案中，人類抗體在非人類的轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生，該非人類的轉(zhuǎn)基因動物能夠通過V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多種抗CD30的人類單克隆抗體同種型(如IgG、IgA和/或IgE)。因此，本發(fā)明的特定方面不僅包括抗體、抗體片段及其藥物組合物，也包括產(chǎn)生單克隆抗體的非人類轉(zhuǎn)基因動物、B-細胞和雜交瘤。應(yīng)用本發(fā)明的抗體以在體外或在體內(nèi)探測表達CD30的細胞的方法也包含于本發(fā)明中。也提供了應(yīng)用本發(fā)明的抗體阻斷或抑制CD30誘導(dǎo)的活性如增殖活性的方法，且該方法可用于治療與CD30相關(guān)的病癥，如致瘤性疾病(如何杰金氏病)和自身免疫病(如HIV)。
為了使本發(fā)明更易于理解，首先定義了某些術(shù)語。額外的定義貫穿于詳述中提出。
術(shù)語“CD30”和“CD30抗原”在此處可互換應(yīng)用，且包括由細胞天然表達的人類CD30的各種變體、同種型和種類同系物。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與CD30-抗原的結(jié)合通過抑制或阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合抑制了表達CD30的細胞(如腫瘤細胞)的生長。術(shù)語“CD30配體”包含CD30的所有(如生理學(xué))配體。在一個優(yōu)選實施方案中，CD30配體是CD30L、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3或TRAF5。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與CD30-抗原的結(jié)合介導(dǎo)表達CD30的細胞的效應(yīng)細胞吞噬作用和/或殺傷。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與CD30-抗原的結(jié)合介導(dǎo)表達CD30的細胞的效應(yīng)細胞ADCC。
如在此處所用的，術(shù)語“抑制生長”(如涉及細胞)意欲包括與不接觸抗-CD30抗體的相同細胞的生長相比，當(dāng)接觸抗-CD30抗體時細胞生長中任何可測量的降低，如至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的細胞生長抑制。
此處涉及的術(shù)語“抗體”包括完整的抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈?！翱贵w”指通過二硫鍵相互連接的至少2個重鏈(H)和2個輕鏈(L)，或其抗原結(jié)合部分。每一個重鏈由重鏈可變區(qū)(此處縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每一個輕鏈由輕鏈可變區(qū)(此處縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由1個結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)域可進一步再分為高變區(qū)，稱為互補性決定區(qū)(CDR)，散布于更加保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域中。VH和VL均由3個CDR和4個FR組成，從氨基末端到羧基末端以如下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(如效應(yīng)細胞)和傳統(tǒng)補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。
如在此處所用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡單的“抗體部分”)指保持與抗原(如CD30)結(jié)合能力的一種或多種抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段履行。包含于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含由二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單個臂上的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341544-546)；和(vi)分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨的基因編碼，但它們可以應(yīng)用重組方法通過合成的連接體進行連接，該連接體使得它們能夠作為單個蛋白質(zhì)鏈進行制備，其中VL和VH區(qū)域配對以形成單價分子(已知為單鏈Fv(ssFv)；參見如Bird等人，(1988)Science242423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這種單鏈抗體也意欲包含于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。這些抗體片段通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，且這些片段以與完整抗體相同的方式進行有用性的篩選。
術(shù)語“表位”指能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由化學(xué)活性的分子表面基團組成，如氨基酸或糖側(cè)鏈，且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的帶電特征。構(gòu)象和非構(gòu)象的表位區(qū)別在于存在變性溶劑時與前者的結(jié)合喪失，而與后者的結(jié)合不喪失。
如在此處所用的，術(shù)語“抑制結(jié)合”和“阻斷結(jié)合”指抑制/阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合。抑制/阻斷可互換應(yīng)用，且包含部分和完全的抑制/阻斷。CD30的抑制/阻斷優(yōu)選地降低或改變當(dāng)不存在抑制或阻斷時CD30結(jié)合發(fā)生的活性的正常水平或類型，如抑制CD30誘導(dǎo)的增殖。抑制和阻斷也意欲包括與不接觸抗-CD30抗體的CD30相比，當(dāng)接觸抗-CD30抗體時CD30的結(jié)合親和力中任何可測量的降低，如對CD30與其受體的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的阻斷。
術(shù)語“雙特異性分子”意欲包括任何試劑，如蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物，該試劑具有兩種不同的結(jié)合特異性。例如，該分子可以與(a)細胞表面抗原和(b)效應(yīng)細胞表面的Fc受體結(jié)合或相互作用。術(shù)語“多特異性分子”或“異特異性分子”意欲包括任何試劑，如蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物，該試劑具有超過兩種不同的結(jié)合特異性。例如，該分子可以與(a)細胞表面抗原、(b)效應(yīng)細胞表面的Fc受體和(c)至少一種其他成分結(jié)合或相互作用。因此，本發(fā)明包括，但不局限于雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子，該分子導(dǎo)向于細胞表面抗原如CD30，或?qū)蛴谄渌繕?biāo)，如效應(yīng)細胞上的Fc受體。
術(shù)語“雙特異性抗體”也包括二價雙抗體(diabodies)。二價雙抗體是二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達于單個多肽鏈上，但應(yīng)用的連接體太短以至于在相同的鏈上不能進行兩個結(jié)構(gòu)域之間的配對，從而使得結(jié)構(gòu)域與另一個鏈的互補性結(jié)構(gòu)域配對并生成2個抗原結(jié)合位點(參見如Holliger，P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poljak，R.J.等人，(1994)Structure21121-1123)。如在此處所用的，術(shù)語“異種抗體”指兩種或多種抗體、抗體結(jié)合片段(如Fab)、其衍生物或連接在一起的抗原結(jié)合區(qū)，其至少兩個具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應(yīng)細胞上Fc受體的結(jié)合特異性和對目標(biāo)細胞如腫瘤細胞上抗原或表位的結(jié)合特異性。
如在此處所用的，術(shù)語“人類抗體”意欲包括具有源自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人類抗體可包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如通過體外隨機或位點專一誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。然而，如在此處所用的，術(shù)語“人類抗體”不意欲包括如下抗體，其中源自另一種哺乳動物物種如小鼠種系的CDR序列已移植入到人類構(gòu)架序列中。
如在此處所用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單個分子組合物的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物展示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。因此，術(shù)語“人類單克隆抗體”指展示單一結(jié)合特異性的抗體，該抗體具有源自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。在一個實施方案中，人類單克隆抗體通過雜交瘤生產(chǎn)，該雜交瘤包括與無限增殖化細胞融合的B細胞，該B細胞從轉(zhuǎn)基因非人類動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得，具有包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因。
如在此處所用的，術(shù)語“重組人類抗體”意欲包括所有通過重組方法制備、表達、生成或分離的人類抗體，如(a)從人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)中分離的抗體(進一步描述于下文的I部分中)，(b)應(yīng)用轉(zhuǎn)染入宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體，(c)從重組的組合人類抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過任何其他方法制備、表達、生成或分離的抗體，該方法包括人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列的剪接。這種重組人類抗體具有源自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，這種重組人類抗體可進行體外誘變(或者，當(dāng)應(yīng)用人類Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，進行體內(nèi)體細胞誘變)，因而重組抗體VH和VL區(qū)域的氨基酸序列盡管源自或與人類種系的VH和VL序列相關(guān)，但不是在體內(nèi)人類抗體種系所有組成成分中天然存在的。
如在此處所用的，“異源抗體”是相對于產(chǎn)生該抗體的轉(zhuǎn)基因非人類生物進行定義的。該術(shù)語指具有如下氨基酸序列或編碼性核酸序列的抗體，該氨基酸序列或編碼性核酸序列相應(yīng)于在不由轉(zhuǎn)基因非人類動物組成的生物中發(fā)現(xiàn)的，且通常來自除轉(zhuǎn)基因非人類動物之外的物種。
如在此處所用的，“異源雜交抗體”指具有不同生物來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠的輕鏈結(jié)合的人類重鏈的抗體是異源雜交抗體。異源雜交抗體的例子包括上述嵌合和人源化的抗體。
如在此處所用的，“分離的抗體”指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(如分離的與CD30結(jié)合的抗體基本不含與除CD30之外的抗原結(jié)合的抗體)。然而，與人類CD30的表位、同種型或變體結(jié)合的分離抗體與其他相關(guān)的抗原具有交叉作用性，該抗原如來自其他物種的(如CD30種類同系物)。此外，分離的抗體基本不含其他細胞材料和/或化學(xué)制劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，在充分限定的組合物中組合了具有不同特異性的“分離的”單克隆抗體組合。
如在此處所用的，“特異性結(jié)合”指抗體與預(yù)定抗原結(jié)合。一般地，抗體以至少約1×107M-1的親和力進行結(jié)合，且以比與除預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原之外的非特異性抗原(如BSA、酪蛋白)結(jié)合親和力高至少2倍的親和力與預(yù)定抗原結(jié)合。術(shù)語“識別抗原的抗體”和“抗原特異性的抗體”在此處與術(shù)語“特異性地與抗原結(jié)合的抗體”互換應(yīng)用。
如在此處所用的，術(shù)語IgG抗體的“高親和力”指至少約107M-1的結(jié)合親和力，優(yōu)選為至少約108M-1，更優(yōu)選為至少約109M-1、1010M-1、1011M-1或更高，如高達1013M-1或更高。然而，“高親和力”結(jié)合對于其他的抗體同種型可有變化。例如，對于IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指至少約1×107M-1的結(jié)合親和力。
如在此處所用的，術(shù)語“Kassoc”或“Ka”指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合常數(shù)。
如在此處所用的，術(shù)語“Kdis”或“Kd”指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。
如在此處所用的，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(如IgM或IgG1)。
如在此處所用的，“同種型轉(zhuǎn)換”指抗體的種類或同種型從一種Ig種類改變?yōu)槠渌鸌g種類之一的現(xiàn)象。
如在此處所用的，“非轉(zhuǎn)換的同種型”指當(dāng)不發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生的重鏈同種型類型；編碼非轉(zhuǎn)換的同種型的CH基因一般是緊在功能上重排的VDJ基因下游的第一個CH基因。同種型轉(zhuǎn)換已分類為傳統(tǒng)或非傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換。傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換通過在轉(zhuǎn)基因中包含至少一個轉(zhuǎn)換序列區(qū)域的重組事件發(fā)生。非傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換可通過如在人類σμ和人類∑μ(δ-相關(guān)的缺失)之間的同源重組發(fā)生。此外，可選擇的非傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組可發(fā)生并實現(xiàn)同種型轉(zhuǎn)換。
如在此處所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)換序列”指負責(zé)轉(zhuǎn)換重組的DNA序列?！稗D(zhuǎn)換供體”序列一般是μ轉(zhuǎn)換區(qū)，將是在轉(zhuǎn)換重組過程中缺失的構(gòu)建體區(qū)域的5’(即上游)。“轉(zhuǎn)換受體”區(qū)位于要缺失的構(gòu)建體區(qū)域和替代恒定區(qū)(如γ、ε等)之間。由于沒有始終發(fā)生重組的特異性位點，所以一般不能從構(gòu)建體預(yù)測最終的基因序列。
如在此處所用的，“糖基化模式”定義為共價附著于蛋白質(zhì)上的糖單位，更具體地為免疫球蛋白。異源抗體的糖基化模式特征在于基本與由非人類轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生的抗體上天然存在的糖基化模式相似，此時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到異源抗體的糖基化模式比轉(zhuǎn)基因的CH基因源自的物種更加與非人類轉(zhuǎn)基因動物中的該糖基化模式相似。
如在此處所用的，應(yīng)用于一個主題的術(shù)語“天然存在的”指該主題可在自然中發(fā)現(xiàn)。例如，存在于生物(包括病毒)中的可從天然來源分離且未由人類在實驗室中進行有目的的修飾的多肽或多核苷酸是天然存在的。
如在此處所用的，術(shù)語“重排的”指一種重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中在分別編碼基本完整的VH和VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中，V段緊緊接近D-J或J段。重排的免疫球蛋白基因座可通過與種系DNA的比較進行鑒定；重排的基因座具有至少一個重組的七堿基序列/九堿基順序同源性元件。
如在此處所用的，關(guān)于V段的術(shù)語“未重排的”或“種系構(gòu)型”指其中V段未進行重組從而緊緊接近D或J段的構(gòu)型。
如在此處所用的，術(shù)語“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈的DNA。
如在此處所用的，關(guān)于編碼與CD30結(jié)合的抗體或抗體部分(如VH、VL、CDR3)的核酸的術(shù)語“分離的核酸分子”指如下核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼與除CD30之外的抗原結(jié)合的抗體或抗體部分的其他核苷酸序列，該其他的序列可天然地位于人類基因組DNA中核酸序列的側(cè)翼。在一個實施方案中，人類抗-CD30抗體或其部分包括17G1、2H9或5F11的核苷酸或氨基酸序列，和具有分別示于SEQ ID NO1和2、5和6及9和10中的序列的重鏈(VH)可變區(qū)，以及具有分別示于SEQ ID NO3和4、7和8及11和12中的序列的輕鏈(VL)可變區(qū)。
如在此處公開和請求保護的，在SEQ ID NO1-12中提出的序列包括“保守的序列修飾”，即未顯著影響或改變由核苷酸序列編碼或含有氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的核苷酸和氨基酸序列修飾。這種保守的序列修飾包括核苷酸和氨基酸替代、添加和缺失。修飾可通過本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入到SEQ ID NO1-12中，如定點誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。保守性氨基酸替代包括氨基酸殘基由具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的替代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中進行了定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因而，人類抗-CD30抗體中預(yù)測的非基本氨基酸殘基優(yōu)選地由來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基替代。
可選擇地，在另一個實施方案中，突變可沿著全部或部分抗-CD30抗體編碼序列隨機引入，如通過飽和誘變，且可對結(jié)果所得修飾的抗-CD30抗體進行結(jié)合活性的篩選。
因此，由在此處公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))核苷酸序列編碼和/或含有在此處公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))氨基酸序列(即SEQ IDNO1-12)的抗體包括基本相似的抗體，該抗體由進行了保守修飾的相似序列編碼或含有進行了保守修飾的相似序列。在下文中提供了關(guān)于如何基于在此處如SEQ ID NO1-12中公開的部分(即重鏈和輕鏈可變區(qū))序列生成這種基本相似的抗體的進一步討論。
對于核酸，術(shù)語“基本同源性”顯示兩種核酸或其指定的序列當(dāng)最適地進行比對和比較時，在至少約80％的核苷酸中是相同的，通常為在至少約90％～95％，且更優(yōu)選為在至少約98％～99.5％的核苷酸中，而具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔??？蛇x擇地，當(dāng)段在選擇性雜交條件下與互補鏈雜交時，則存在基本同源性。
考慮空位數(shù)目和每一個空位的長度后，該空位是實現(xiàn)兩個序列之間的最適比對所需要引入的，兩個序列之間的百分比相同性是由序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同源性＝相同位置#/總的位置#×100)。序列比較和兩個序列間百分比相同性的確定可應(yīng)用數(shù)學(xué)算法實現(xiàn)，如在下文非限制性的例子中所述的。
兩個核苷酸序列之間的百分比相同性可應(yīng)用GCG軟件包中的GAP程序(可在http//www.gcg.com上獲得)進行確定，其中應(yīng)用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比相同性也可應(yīng)用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))的算法進行確定，該算法已整合入ALIGN程序(2.0版)中，其中應(yīng)用PAM120權(quán)重殘基表、12的空位長度罰分和4的空位罰分。此外，兩個氨基酸序列之間的百分比相同性可應(yīng)用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))的算法進行確定，該算法已整合入GCG軟件包中的GAP程序(可在http//www.gcg.com上獲得)中，其中應(yīng)用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。
本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可進一步用作如“詢問序列”以對公共數(shù)據(jù)庫進行搜索，以鑒定相關(guān)的序列。這種搜索可應(yīng)用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行。BLAST核苷酸搜索可應(yīng)用得分＝100、字長＝12的NBLAST程序進行，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可應(yīng)用得分＝50、字長＝3的XBLAST程序進行，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有空位的比對，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述應(yīng)用有空位的BLAST。當(dāng)應(yīng)用BLAST和有空位的BLAST程序時，可應(yīng)用各自程序(即XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可存在于完整細胞中、細胞裂解物中，或者為部分純化的或基本純的形式。核酸當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從其他細胞成分或其他污染物如其他細胞核酸或蛋白質(zhì)純化時，則是“分離的”或“基本純的”，該技術(shù)包括堿/SDS處理、CsCl顯帶法、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域中眾所周知的其他技術(shù)。參見如F.Ausubel等人，ed.CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York(1987)。
本發(fā)明來自cDNA、基因組或其混合物的核酸組合物盡管常為天然的序列(除修飾的限制位點等之外)，但可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行突變以提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可影響預(yù)期的氨基酸序列。具體而言，預(yù)期有基本與在此處描述的天然V、D、J、恒定區(qū)、轉(zhuǎn)換和其他這種序列同源或源自這些序列的DNA序列(其中“源自”顯示一個序列與另一個序列相同或從后者修飾得來)。
當(dāng)將核酸置于與另一個核酸序列功能相關(guān)的位置時，該核酸是“可操作連接的”。例如，啟動子和增強子如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則為與編碼序列可操作連接的。關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，可操作連接的指連接的DNA序列是連續(xù)的，且在需要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時，是連續(xù)并符合讀框的。對于轉(zhuǎn)換序列，可操作連接的顯示序列能夠影響轉(zhuǎn)換重組。
如在此處所用的，術(shù)語“載體”指能夠轉(zhuǎn)運另一個與其連接的核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！保冈谄渲锌蛇B接額外的DNA段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是病毒載體，其中額外的DNA段可連接入病毒基因組中。某些載體能夠在它們所引入的宿主細胞中自主復(fù)制(如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(如非附加型哺乳動物載體)當(dāng)引入到宿主細胞中時，可整合入宿主細胞的基因組中，因此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因的表達。此處將這種載體稱為“重組表達載體”(或簡單的“表達載體”)。通常，用于重組DNA技術(shù)中的表達載體常為質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換應(yīng)用，這是因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明意欲包括發(fā)揮等價功能的其他形式的表達載體，如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
如在此處所用的，術(shù)語“重組宿主細胞”(或簡單的“宿主細胞”)指已引入了重組表達載體的細胞。應(yīng)該理解的是，該術(shù)語不僅指特定的被試者細胞，而且指這種細胞的后代。因為在隨后的世代中由于突變或環(huán)境影響可發(fā)生某些修飾，所以這種后代事實上可能與親代細胞不同，但仍然包括在此處所用的術(shù)語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。重組宿主細胞包括如CHO細胞和淋巴細胞。
如在此處所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)染瘤”包括表達抗體的重組真核宿主細胞，如CHO細胞或NS/O細胞。
如在此處所用的，術(shù)語“被試者”包括任何人類或非人類動物。術(shù)語“非人類動物”包括所有脊椎動物，如哺乳動物和非哺乳動物，如非人類的靈長類、綿羊、狗、母牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的非人類動物”指具有包含一個或多個人類重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(transchromosomes)(整合或未整合入動物天然的基因組DNA中)的基因組的非人類動物，且該動物能夠表達完整的人類抗體。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可具有人類輕鏈轉(zhuǎn)基因和人類重鏈轉(zhuǎn)基因或人類重鏈轉(zhuǎn)染色體，從而該小鼠當(dāng)用CD64抗原和/或表達CD64的細胞免疫接種時，可產(chǎn)生人類抗-CD64抗體。人類重鏈轉(zhuǎn)基因可整合入小鼠的染色體DNA中，如在轉(zhuǎn)基因的小鼠如HuMAb小鼠的情形中，或者人類重鏈轉(zhuǎn)基因可維持在染色體外，如在WO 02/43478中描述的轉(zhuǎn)染色體(如KM)小鼠的情形中。這種轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠能夠通過V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多種人類抗CD64的單克隆抗體同種型(如IgG、IgA和/或IgE)。
本發(fā)明的各個發(fā)明進一步詳細描述于下面的小節(jié)中。
I.抗CD30的人類抗體的生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體(MAb)可通過多種技術(shù)生產(chǎn)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法學(xué)，如Kohler和Milstein(1975)Nature256495的標(biāo)準(zhǔn)體細胞雜交技術(shù)。盡管體細胞雜交方法是優(yōu)選的，但原則上，可以采用其他生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)，如B淋巴細胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。
用于制備雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)，小鼠中的雜交瘤生產(chǎn)是充分確立的方法。免疫接種規(guī)程和從融合中分離免疫接種的脾細胞的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。融合配偶體(如鼠骨髓瘤細胞)和融合方法也已知。
在一個優(yōu)選實施方案中，抗CD30的人類單克隆抗體可應(yīng)用帶有部分人類免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠生成。這些轉(zhuǎn)基因小鼠在此處稱為“HuMAb”小鼠，含有編碼未重排的人類重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人類免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及使內(nèi)源μ和κ鏈基因座失活的導(dǎo)向的突變(Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，小鼠展示降低的小鼠IgM或κ的表達，且在對免疫接種的反應(yīng)中，引入的人類重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因進行類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變以生成高親和力的人類IgGκ單克隆(Lonberg，N。等人，(1994)，見上文；Lonberg，N.(1994)Handbookof Experimental Pharmacology 11349-101中的綜述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷65-93，及Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546)。HuMAb小鼠的制備詳細描述于下文II節(jié)中，并描述于Taylor，L.等人，(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等人，(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等人，(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等人，(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474)856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology11349-101；Taylor，L.等人，(1994)International Immunology6579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷65-93；Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.等人，(1996)Nature Biotechnology14845-851，其所有內(nèi)容均在此處整體引入作為參考。進一步參見美國專利號5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；均授予Lonberg和Kay及GenPharm International；授予Surani等人的美國專利號5,545,807；于1998年6月11日公布的國際申請?zhí)朩O 98/24884；于1994年11月10日公布的WO 94/25585；于1993年6月24日公布的WO 93/1227；于1992年12月23日公布的WO 92/22645；于1992年3月19日公布的WO 92/03918，其所有公開內(nèi)容均在此處整體引入作為參考?？蛇x擇地，描述于實施例2中的HCO12轉(zhuǎn)基因小鼠可用于生成人類抗-CD30抗體。
HuMAb免疫接種為了生成抗CD30的全長人類單克隆抗體，可用純化或濃縮的CD30抗原和/或表達CD30的細胞制劑對HuMAb小鼠進行免疫接種，如由Lonberg，N.等人，(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等人，(1996)Nature Biotechnology 14845-851和WO 98/24884所描述的。優(yōu)選地，在第一次輸注時小鼠為6-16周齡。例如，純化或濃縮的CD30抗原制劑(5-20μg)(如從表達CD30的LNCaP細胞中純化的)可用于對HuMAb小鼠進行腹膜內(nèi)免疫接種。如果應(yīng)用純化或濃縮的CD30抗原制劑的免疫接種不產(chǎn)生抗體，那么可用表達CD30的細胞如腫瘤細胞系對小鼠進行免疫接種以促進免疫反應(yīng)。
各種抗原的累積經(jīng)歷已顯示，當(dāng)初始時用完全弗氏佐劑中的抗原進行腹膜內(nèi)(IP)免疫接種，隨后每兩周用不完全弗氏佐劑中的抗原進行腹膜內(nèi)(i.p.)免疫接種(總共達6次)時，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠的反應(yīng)是最好的。免疫反應(yīng)可在免疫接種規(guī)程的過程中以由眶后(retroorbital)放血獲得的血漿樣品進行監(jiān)控?？捎肊LISA對血漿進行篩選(如下文所述)，且具有足夠的抗-CD30人類免疫球蛋白效價的小鼠可用于進行融合。在處死和去除脾之前3日，可以用抗原在靜脈內(nèi)對小鼠進行強化。預(yù)期對于每一種抗原需要進行2-3次融合。可用每一種抗原對幾個小鼠進行免疫接種。例如，可對總共12個HCO7和HCO12品系的HuMAb小鼠進行免疫接種。
產(chǎn)生抗CD30的人類單克隆抗體的雜交瘤的生成基于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程可分離小鼠脾細胞，并將其與PEG一起與小鼠骨髓瘤細胞系進行融合。然后對結(jié)果所得的雜交瘤進行篩選以生產(chǎn)抗原特異性抗體。例如，使來自免疫接種的小鼠的脾淋巴細胞單細胞懸浮液與具有50％PEG的1/6數(shù)目的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1580)融合。將細胞以約2×105涂平板于平底的微量滴定板上，然后在選擇性培養(yǎng)基上進行兩周的溫育，該培養(yǎng)基含有20％胎兒克隆血清(Clone Serum)、18％“653”條件培養(yǎng)基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml艮他霉素和1×HAT(Sigma；HAT在融合后24小時添加)。兩周后，將細胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，其中HAT由HT替代。然后通過ELISA對單個孔進行人類抗-CD30單克隆IgM和IgG抗體的篩選。一旦發(fā)生了大量雜交瘤生長，則通常在10-14日后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次涂平板和篩選，且如果對于抗CD30的單克隆抗體人類IgG仍然是陽性的，則可通過限制性的稀釋進行至少兩次亞克隆。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中生成小量的抗體用于進行表征。
產(chǎn)生抗CD30的人類單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的生成本發(fā)明的人類抗體也可應(yīng)用如本領(lǐng)域中眾所周知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合在宿主細胞轉(zhuǎn)染瘤中生產(chǎn)(如Morrison，S.(1985)Science 2291202)。
例如，為了表達抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(如PCR擴增、定點誘變)獲得，且可插入到表達載體中，從而該基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作地連接。在該情形中，術(shù)語“可操作連接的”指抗體基因連接入載體中，從而載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可發(fā)揮其預(yù)期功能，以調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。對表達載體和表達控制序列進行選擇以與所用的表達宿主細胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可插入到單獨的載體中，或者更一般地，兩個基因插入到相同的表達載體中?？贵w基因通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入到表達載體中(如抗體基因片段和載體上的互補限制位點的連接，或者如果不存在限制位點時的平端連接)。此處描述的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)通過將其插入到表達載體中，而可用于生成任何抗體同種型的全長抗體基因，該表達載體編碼預(yù)期同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，從而VH段與載體中的CH段可操作地連接，而VL段與載體中的CL段可操作地連接。此外或可選擇地，重組表達載體可編碼促進抗體鏈從宿主細胞中分泌的信號肽?？贵w鏈基因可克隆入載體中，從而信號肽符合讀框地與抗體鏈基因的氨基末端連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。
除抗體鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達載體帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意欲包括啟動子、增強子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的其他表達控制元件(如多腺苷酸化信號)。這種調(diào)節(jié)序列描述于如Goeddel；Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解表達載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，依賴于如下因素，如要轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達水平等。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)哺乳動物細胞中高水平蛋白質(zhì)表達的病毒元件，如源自巨細胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(adenovirus)(如腺病毒的主要晚期啟動子(AdMLP))和多形瘤的啟動子和/或增強子?？蛇x擇地，可應(yīng)用非病毒調(diào)節(jié)序列，如遍在蛋白質(zhì)啟動子和β-珠蛋白啟動子。
除抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列之外，本發(fā)明的重組表達載體可帶有額外的序列，如調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中復(fù)制的序列(如復(fù)制起點)和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于對已引入了載體的宿主細胞的選擇(參見如美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017，均為Axel等人的)。例如，選擇性標(biāo)記一般賦予已引入了載體的宿主細胞對藥物的抗性，如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于由氨甲蝶呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞中)和neo基因(用于G418選擇)。
為了輕鏈和重鏈的表達，將編碼重鏈和輕鏈的表達載體用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)染入宿主細胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式意欲包括多種通常用于將外源DNA引入到原核或真核宿主細胞中的技術(shù)，如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管理論上可能在原核或真核宿主細胞中表達本發(fā)明的抗體，但在真核細胞及最優(yōu)選的在哺乳動物宿主細胞中的抗體表達是最優(yōu)選的，這是因為這種真核細胞，特別是哺乳動物細胞比原核細胞更可能裝配和分泌正確折疊且具有免疫學(xué)活性的抗體。已報道抗體基因的原核表達對于產(chǎn)生高產(chǎn)量的活性抗體是無效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 612-13)。
用于表達本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，與DHFR選擇性標(biāo)記一起應(yīng)用，如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。具體而言，對于NSO骨髓瘤細胞的應(yīng)用，另一個優(yōu)選的表達系統(tǒng)是在WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公開的GS基因表達系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達載體引入到哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養(yǎng)足夠的時間以使抗體在宿主細胞中表達，或者更優(yōu)選地，使抗體分泌到宿主細胞所生長的培養(yǎng)基中以生產(chǎn)抗體?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)從培養(yǎng)基中回收抗體。
應(yīng)用部分抗體序列以表達完整的抗體抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補性決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與目標(biāo)抗原相互作用。為此，CDR中的氨基酸序列比CDR之外的序列在單獨的抗體之間有更大的變化。因為CDR序列負責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以可能通過構(gòu)建表達載體而表達模擬特定的天然存在的抗體性質(zhì)的重組抗體，該表達載體包括移植到具有不同性質(zhì)的不同抗體的構(gòu)架序列上的來自特定天然存在的抗體的CDR序列(參見如Riechmann，L.等人，1998，Nature 332323-327；Jones，P.等人，1986，Nature 321522-525；和Queen，C.等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033)。這種構(gòu)架序列可從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫中獲得。這些種系序列與成熟的抗體基因序列不同，這是因為它們不包括完全裝配的V基因，該基因是在B細胞成熟過程中通過V(D)J連接形式的。種系基因序列在單獨均勻跨可變區(qū)中也不同于所有高親和力次級組成成分抗體的序列。例如，體細胞突變相對很少發(fā)生于構(gòu)架區(qū)的氨基末端部分。例如，體細胞突變相對很少發(fā)生于構(gòu)架區(qū)1的氨基末端部分和構(gòu)架區(qū)4的羧基末端部分。此外，許多體細胞突變不顯著改變抗體的結(jié)合性質(zhì)。因此，不必獲得特定抗體的完整DNA序列以重構(gòu)具有與初始抗體相似的結(jié)合性質(zhì)的完整重組抗體(參見于1999年3月12日提交的PCT/US99/05535，此處為所有目的將其引入作為參考)?？鏑DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列對于該目的一般是足夠的。該部分序列用于確定何種種系V和J基因段對重組的抗體V基因有貢獻。然后將種系基因用于填充可變區(qū)的缺失部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)成熟過程中切除，且不對最終抗體的性質(zhì)有貢獻。因此，對于表達構(gòu)建體必須應(yīng)用相應(yīng)的種系前導(dǎo)序列。為了添加缺失的序列，可通過連接或PCR擴增使克隆的cDNA序列cab與合成的寡核苷酸組合。可選擇地，完整的可變區(qū)可以合成為一套短的重疊寡核苷酸，并通過PCR擴增進行組合以生成完整的合成可變區(qū)克隆。該方法具有某些優(yōu)點，如消除了或不包括特定的限制位點，或使特定的密碼子最適化。
將來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物用于設(shè)計重疊的合成寡核苷酸組，以生成具有與天然序列相同的氨基酸編碼能力的合成V序列。合成的重鏈和κ鏈序列與天然序列在3個方面不同重復(fù)的核苷酸堿基鏈?zhǔn)情g斷的，以促進寡核苷酸合成和PCR擴增；最適的轉(zhuǎn)錄起始位點根據(jù)Kozak規(guī)則整合(Kozak，1991，J.Biol.Chem.26619867-19870)；和HindIII位點加工為處于翻譯起始位點的上游。
對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，最適的編碼鏈序列和相應(yīng)的非編碼鏈序列大約在相應(yīng)非編碼寡核苷酸的中點斷裂為30-50個核苷酸。因此，對于每一條鏈，寡核苷酸均可裝配為跨150-400個核苷酸的段的重疊雙鏈組。然后將該集合體用作模板以產(chǎn)生150-400個核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物。一般地，可變區(qū)寡核苷酸組將斷裂為2個可單獨擴增以生成2種重疊PCV產(chǎn)物的集合體。然后這些重疊產(chǎn)物通過PCT擴增進行組合以形成完整的可變區(qū)。也預(yù)期在PCR擴增中包括重鏈和輕鏈恒定區(qū)的重疊片段(包括κ輕鏈的Bbs I位點或γ重鏈的Age I位點)，以生成易于克隆入表達載體構(gòu)建體中的片段。
然后重構(gòu)的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、翻譯起始、恒定區(qū)、3’非翻譯的、多腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的序列組合，以形成表達載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達構(gòu)建體可組合入單個載體中，共轉(zhuǎn)染、連續(xù)地轉(zhuǎn)染或單獨轉(zhuǎn)染入宿主細胞中，然后將該宿主細胞融合以形成表達兩種鏈的宿主細胞。
用于構(gòu)建人類IgGκ的表達載體的質(zhì)粒描述如下。構(gòu)建質(zhì)粒，從而PCR擴增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可用于重構(gòu)完整的重鏈和輕鏈小基因。這些質(zhì)粒可用于完整地表達人類或嵌合的IgG1κ或IgG4κ抗體。可構(gòu)建類似的載體以表達其他重鏈同種型，或表達包含λ輕鏈的抗體。
因而，在本發(fā)明的另一個方面中，將本發(fā)明人類抗-CD30抗體如17G1、2H9或5F11的結(jié)構(gòu)特征用于生成結(jié)構(gòu)上相關(guān)的人類抗-CD30抗體，該結(jié)構(gòu)上相關(guān)的人類抗-CD30抗體保持了至少一種本發(fā)明抗體的功能性質(zhì)，如與CD30的結(jié)合。更特定地，17G1、2H9或5F11的一種或多種CDR可與已知的人類構(gòu)架區(qū)和CDR進行重組組合，以生成本發(fā)明額外的、重組加工的人類抗-CD30抗體。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了制備抗-CD30抗體的方法，包含制備如下抗體，該抗體包含(1)人類重鏈構(gòu)架區(qū)和人類重鏈CDR，其中至少一種人類重鏈CDR包含選自示于圖7、9或11中的氨基酸序列(SEQ ID NO16、17、18、28、29、30、40、41和42)的氨基酸序列，和(2)人類輕鏈構(gòu)架區(qū)和人類輕鏈CDR，其中至少一種人類輕鏈CDR包含選自示于圖8、10或12中的氨基酸序列(SEQ ID NO22、23、24、34、35、36、46、47和48)的氨基酸序列；其中抗體保持結(jié)合CD30的能力。
抗體結(jié)合CD30的能力可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測定進行確定，如那些在實施例中提出的(如ELISA)。
由于本領(lǐng)域中眾所周知的是抗體的重鏈和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和力中起特別重要的作用，所以上文提出的本發(fā)明制備的重組抗體優(yōu)選地包含10F8的重鏈和輕鏈CDR3。該抗體進一步包含17G1、2H9或5F11的CDR1。該抗體可進一步包含CDR的任何組合。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明進一步提供了抗-CD30抗體，包含(1)人類重鏈構(gòu)架區(qū)、人類重鏈CDR1區(qū)、人類重鏈CDR2區(qū)和人類重鏈CDR3區(qū)，其中人類重鏈CDR3區(qū)是如圖7、9或11所示的17G1、2H9或5F11的重鏈CDR3(SEQ ID NO18、30或42)；和(2)人類輕鏈構(gòu)架區(qū)、人類輕鏈CDR1區(qū)、人類輕鏈CDR2區(qū)和人類輕鏈CDR3區(qū)，其中人類輕鏈CDR3區(qū)是如圖8、10或12所示的17G1、2H9或5F11的輕鏈CDR3(SEQ ID NO24、36或48)，其中抗體結(jié)合CD30。該抗體可進一步包含17G1、2H9或5F11的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。該抗體可進一步包含17G1、2H9或5F11的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1。
上述加工的抗體的CDR1、2和/或3區(qū)域可包含此處公開的17G1、2H9或5F11的準(zhǔn)確序列。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解從17G1、2H9或5F11的準(zhǔn)確序列的一些偏離是可能的，而同時仍然保持抗體有效結(jié)合CD30的能力。因此，在另一個實施方案中，加工的抗體可由一種或多種CDR組成，該CDR與17G1、2H9或5F11的一種或多種CDR具有如95％、98％或99.5％的相同性。
除僅僅結(jié)合CD30之外，或者作為替代，可對如上所述加工的抗體針對其保持本發(fā)明抗體的其他功能性質(zhì)進行選擇，如(1)與人類CD30結(jié)合，并抑制表達CD30的腫瘤細胞的生長；(2)抑制CD30配體與人類CD30的結(jié)合；(3)在存在效應(yīng)細胞時誘導(dǎo)表達CD30的細胞的ADCC；(4)在存在巨噬細胞時誘導(dǎo)表達CD30的細胞的吞噬作用；和/或(5)以至少108M-1的平衡常數(shù)(Ka)與人類CD30結(jié)合。
人類單克隆抗體與CD30結(jié)合的表征為了表征本發(fā)明的人類單克隆CD30抗體的結(jié)合，可通過如ELISA對來自免疫接種的小鼠的血清進行檢驗。在ELISA規(guī)程的一個一般(但非限制性的)例子中，將微量滴定板用PBS中的0.25μg/ml純化的CD30覆蓋，然后用PBS中5％的牛血清清蛋白阻斷。將來自CD30-免疫接種的小鼠血漿的稀釋物加入到每一個孔中，并于37℃溫育1-2小時。將平板用PBS/Tween洗滌，然后于37℃與偶聯(lián)到堿性磷酸酶上的山羊抗人IgG Fc-特異性多克隆試劑溫育1小時。洗滌后，將平板用pNPP底物(1mg/ml)顯影，并在405-650的OD進行分析。優(yōu)選地，將發(fā)展了最大效價的小鼠用于融合。
如上所述的ELISA測定也可用于對顯示與CD30免疫原正反應(yīng)性的雜交瘤進行選擇。對以高親和力與CD30結(jié)合的雜交瘤進行亞克隆和進一步的表征。從每一個雜交瘤可選擇一個保持了親代細胞反應(yīng)性(通過ELISA)的克隆，以制備貯存于-140℃的5-10小瓶細胞庫，及進行抗體純化。
為了純化人類抗CD30抗體，選擇的雜交瘤可生長于2升旋轉(zhuǎn)的瓶中以進行單克隆抗體純化。在應(yīng)用A蛋白-瓊脂糖(Phannacia，Piscataway，NJ)的親和層析之前可將上清液進行過濾和濃縮。洗脫的IgG可通過凝膠電泳和高效液相層析進行檢查以確保純度。可將緩沖溶液交換為PBS，且濃度可通過應(yīng)用1.43消光系數(shù)的OD280進行確定。可將單克隆抗體等分試樣并貯存于-80℃。
為了確定選擇的人類抗-CD30單克隆抗體是否與唯一的表位結(jié)合，可將每一種抗體用商業(yè)上可購得的試劑(Pierce，Rockford，IL)進行生物素化?？梢詰?yīng)用如上所述的CD30覆蓋的ELISA平板進行應(yīng)用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體的競爭研究。生物素化的Mab結(jié)合可用鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針進行探測。
為了確定純化的抗體的同種型，可進行同種型ELISA。例如，微量滴定板的孔可于4℃用10μg/ml抗人的Ig包被過夜。在用5％BSA阻斷后，將平板于環(huán)境溫度與10μg/ml單克隆抗體或純化的同種型對照反應(yīng)2小時。然后使孔與人類IgG1或人類IgM-特異性的堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針進行反應(yīng)。使平板顯影并如上所述進行分析。
為了證明單克隆抗體與表達CD30的活細胞的結(jié)合，可應(yīng)用流式細胞儀。在流式細胞儀規(guī)程的一般(但非限制性)例子中，使表達CD30的細胞系(在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下生長)與含有0.1％ BSA和20％小鼠血清的各種濃度的單克隆抗體混合，并于37℃溫育1小時。洗滌后，使細胞在與一級抗體染色相同的條件下與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG的抗體反應(yīng)。樣品可通過FACScan設(shè)備進行分析，該設(shè)備應(yīng)用光學(xué)和側(cè)面散射的性質(zhì)以形成單個細胞的通道。除流式細胞儀測定之外或代替該測定，可應(yīng)用作為替代的應(yīng)用熒光顯微鏡的測定。細胞可精確地如上所述進行染色，并由熒光顯微鏡進行檢查。該方法使得能夠觀察到單個細胞，但依賴于抗原的密度可具有減少的靈敏性。
抗-CD30的人類IgG可進一步通過蛋白質(zhì)印跡檢驗與CD30抗原的反應(yīng)性。例如，可以制備來自表達CD30的細胞的細胞提取物，并將其進行十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用20％的小鼠血清進行阻斷，并用要檢驗的單克隆抗體進行探測。人類IgG結(jié)合可應(yīng)用抗人類IgG的堿性磷酸酶進行探測，并用BCIP/NBT底物片劑進行顯影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。
抗CD30的人類單克隆抗體的吞噬和細胞殺傷活性除與CD30的特異性結(jié)合之外，可對人類單克隆抗-CD30抗體介導(dǎo)表達CD30的細胞的吞噬作用和殺傷的能力進行檢驗。體外單克隆抗體活性的檢驗將在檢驗體內(nèi)模型之前提供初始的選擇。簡言之，來自健康供體的多形核細胞(PMN)或其他效應(yīng)細胞可通過Ficoll Hypaque密度離心及隨后裂解污染的紅細胞而進行純化。洗滌的PMN可懸浮于補充了10％熱滅活的胎牛血清的RPMI中，并以效應(yīng)細胞對腫瘤細胞(-效應(yīng)細胞腫瘤細胞)的各種比例與51Cr標(biāo)記的表達CD30的細胞混合。然后可以添加各種濃度的純化的人類抗-CD30 IgG。測定可于37℃進行4-18小時。可通過測量釋放入培養(yǎng)物上清液中的51Cr以測定樣品的細胞溶解。也可對抗-CD30單克隆抗體的相互組合進行檢驗，以確定多個單克隆抗體是否增強了細胞溶解。
也可在體內(nèi)模型(如小鼠)中檢驗與CD30結(jié)合的人類單克隆抗體，以確定它們在介導(dǎo)表達CD30的細胞如腫瘤細胞的吞噬作用和殺傷中的功效。例如，可基于如下標(biāo)準(zhǔn)選擇這些抗體，該標(biāo)準(zhǔn)不是排他的1.)與表達CD30的活細胞結(jié)合；2.)與CD30結(jié)合的高親和力；3.)與CD30上獨特的表位的結(jié)合(以消除當(dāng)組合應(yīng)用時具有互補活性的單克隆抗體將競爭結(jié)合相同表位的可能性)；4.)表達CD30的細胞的調(diào)理作用；5.)在存在人類效應(yīng)細胞時介導(dǎo)表達CD30的細胞的生長抑制、吞噬作用和/或殺傷。
本發(fā)明優(yōu)選的人類單克隆抗體滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的一個或多個，且優(yōu)選地滿足全部標(biāo)準(zhǔn)。在一個特定實施方案中，人類單克隆抗體組合應(yīng)用，如作為包含兩種或多種抗-CD30單克隆抗體或其片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的人類抗-CD30單克隆抗體可在單個治療中進行組合，以實現(xiàn)所需的治療或診斷作用。其一個例子為一種組合物，該組合物含有在效應(yīng)細胞存在時介導(dǎo)對目標(biāo)細胞的高效殺傷的抗-CD30人類單克隆抗體與另一種抑制表達CD30的細胞生長的人類抗-CD30單克隆抗體。
II.生成人類單克隆抗-CD30抗體的轉(zhuǎn)基因非人類動物的生產(chǎn)在另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體的非人類動物，如轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠，該動物能夠表達特異性結(jié)合CD30的人類單克隆抗體。在一個特定實施方案中，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠，該小鼠具有包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，從而當(dāng)用CD30抗原和/或表達CD30的細胞進行免疫接種時，該小鼠產(chǎn)生人類抗-CD30抗體。人類重鏈轉(zhuǎn)基因可整合入小鼠的染色體DNA中，如同在如轉(zhuǎn)基因HuMAb小鼠的情形中的，如在此處詳細描述和示例的?？蛇x擇地，人類重鏈轉(zhuǎn)基因可在染色體外維持，如同描述于WO 02/43478中的轉(zhuǎn)染色體(如KM)小鼠的情形中的。這種轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體動物能夠通過V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生抗CD30的人類單克隆抗體的多個同種型(如IgG、IgA和/或IgE)。同種型轉(zhuǎn)換可通過傳統(tǒng)或非傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換發(fā)生。
以所有異源抗體組成成分對外源抗原刺激進行反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人類動物的設(shè)計需要包含于轉(zhuǎn)基因動物中的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在整個B-細胞發(fā)育途徑過程中正確地發(fā)揮功能。這包括如異源重鏈轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。因此，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因以產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換和一種或多種下面的抗體(1)高水平和細胞類型特異性的表達，(2)功能性基因重排，(3)等位基因排斥的活化和對其的反應(yīng)，(4)足夠的所有初級組成成分的表達，(5)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細胞高變和(7)免疫反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)基因抗體基因座的顯性化。
不是所有前述標(biāo)準(zhǔn)均需滿足。例如，在其中轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源免疫球蛋白基因座功能破壞的那些實施方案中，轉(zhuǎn)基因不需活化等位基因排斥。此外，在其中轉(zhuǎn)基因包含功能上重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的那些實施方案中，功能性基因重排的第二個標(biāo)準(zhǔn)是不需要的，至少對于已經(jīng)重排的轉(zhuǎn)基因是這樣的。對于分子免疫學(xué)的背景，參見Fundamental Immunology，第二版(1989)，Paul William E.，ed.Raven Press，N.Y.。
在某些實施方案中，用于生成本發(fā)明的人類單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人類動物在轉(zhuǎn)基因動物種系中含有重排的、未重排的或重排和未重排的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的組合。每一種重鏈轉(zhuǎn)基因包含至少一種CH基因。此外，重鏈轉(zhuǎn)基因可含有功能性同種型轉(zhuǎn)換序列，該序列能夠支持轉(zhuǎn)基因動物B-細胞中編碼多個CH基因的異源轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。這種轉(zhuǎn)換序列可為克當(dāng)轉(zhuǎn)基因CH基因來源的物種的種系免疫球蛋白基因座中天然存在的序列，或者這種轉(zhuǎn)換序列可源自存在于接受轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物種(轉(zhuǎn)基因動物)的序列。例如，如果用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的人類轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體整合了與天然存在于小鼠重鏈基因座中的相似的轉(zhuǎn)換序列，則可產(chǎn)生較高頻率的同種型轉(zhuǎn)換事件，這可能是因為小鼠轉(zhuǎn)換序列與小鼠轉(zhuǎn)換重組酶可發(fā)揮最優(yōu)的功能，而人類轉(zhuǎn)換序列不可以。轉(zhuǎn)換序列可通過常規(guī)克隆方法進行分離和克隆，或者可從重疊的合成寡核苷酸從頭合成，該寡核苷酸是基于與免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)序列相關(guān)的公布序列信息設(shè)計的(Mills等人，Nucl.Acids Res.157305-7316(1991)；Sideras等人，Intl.Immunol.1631-642(1989))。對于每一種前述轉(zhuǎn)基因動物，功能性重排的異源重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因可見于轉(zhuǎn)基因動物B-細胞的顯著組分中(至少百分之十)。
生成用于產(chǎn)生本發(fā)明的人類單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人類動物的轉(zhuǎn)基因包括重鏈轉(zhuǎn)基因，該重鏈轉(zhuǎn)基因包含編碼至少一個V基因段、一個D基因段、一個J基因段和至少一個恒定區(qū)基因段的DNA。免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因包含編碼至少一個V基因段、一個J基因段和至少一個恒定區(qū)基因段的DNA。編碼輕鏈和重鏈基因段的基因段與轉(zhuǎn)基因動物是異源的，這表現(xiàn)為它們源自或相應(yīng)于編碼不由轉(zhuǎn)基因非人類動物組成的物種的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因段的DNA。在本發(fā)明的一個方面，這樣構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，從而單個基因段未重排，即未進行重排以編碼功能性免疫球蛋白輕鏈和重鏈。當(dāng)接觸CD30抗原時，在轉(zhuǎn)基因動物中，這種未重排的轉(zhuǎn)基因支持V、D和J基因段的重組(功能型重排)，且優(yōu)選地支持所有或部分D區(qū)基因段整合入結(jié)果所得的重排免疫球蛋白重鏈中。
在一可選擇的實施方案中，轉(zhuǎn)基因包含未重排的“小基因座”。這種轉(zhuǎn)基因一般包含C、D和J段的基本部分和V基因段的亞群。在這種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中，各種調(diào)節(jié)序列，如啟動子、增強子、類別轉(zhuǎn)換區(qū)、RNA加工的剪接供體和剪接受體序列、重組信號等包含源自異源DNA的相應(yīng)序列。這種調(diào)節(jié)序列可整合入來自用于本發(fā)明中的非人類動物的相同或相關(guān)物種的轉(zhuǎn)基因中。例如，人類免疫球蛋白基因段可以與鼠免疫球蛋白增強子序列在轉(zhuǎn)基因中進行組合以用于轉(zhuǎn)基因小鼠中?？蛇x擇地，合成的調(diào)節(jié)序列可整合入轉(zhuǎn)基因中，其中這種合成的調(diào)節(jié)序列與已知天然存在于哺乳動物基因組中的功能性DNA序列不同源。合成的調(diào)節(jié)序列是根據(jù)一致原則進行設(shè)計的，如那些限定剪接受體位點或啟動子/增強子基元的可允許的序列的。例如，小基因座包含基因組免疫球蛋白基因座的部分，該部分與天然存在的種系Ig基因座相比具有至少一個內(nèi)部的(即不位于該部分的末端的)非基本DNA部分的缺失。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，用于生成人類抗CD30抗體的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物含有至少一個，一般為2-10個，且有時為25-50或更多拷貝的描述于WO 98/24884的實施例12中的轉(zhuǎn)基因(如pHC1或pHC2)，使該動物與含有單拷貝的描述于WO 98/24884的實施例5、6、8或14中的輕鏈轉(zhuǎn)基因的動物進行交配，并使后代與描述于WO98/24884的實施例10中的JH缺失的動物進行交配。將動物交配至對這3個性狀的每一個都為純合性的。這種動物具有如下基因型單拷貝的(每個單倍的染色體組)人類重鏈未重排的小基因座(描述于WO98/24884的實施例12中)、單拷貝的(每個單倍的染色體組)重排的人類K輕鏈構(gòu)建體(描述于WO 98/24884的實施例14中)和去除所有功能性JH段的每一個內(nèi)源小鼠重鏈基因組中的缺失(描述于WO98/24884的實施例10中)。使這種動物與對JH段缺失純合的小鼠(WO98/24884的實施例10)進行交配，以生產(chǎn)對JH缺失純合且對人類重鏈和輕鏈構(gòu)建體半合的后代。將結(jié)果所得的動物用抗原進行注射，并用于生產(chǎn)抗這些抗原的人類單克隆抗體。
從這種動物分離的B細胞對于人類重鏈和輕鏈?zhǔn)菃翁禺愋缘?，這是因為它們僅含有單拷貝的每種基因。此外，它們對于人類和小鼠重鏈將是單特異性的，這是因為兩個內(nèi)源小鼠重鏈基因拷貝均由于跨JH區(qū)的缺失而是無功能的，該缺失如WO 98/24884的實施例9和12中所述引入。此外，B細胞的基本部分對于人類或小鼠輕鏈將是單特異性的，這是因為單拷貝重排的人類κ輕鏈基因的表達將等位性或同種型性地排除B-細胞極大部分中內(nèi)源小鼠κ和λ鏈基因的重排。
優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人類動物，如小鼠，將展示具有所有重要組成成分的免疫球蛋白生產(chǎn)，理想地為與天然小鼠的基本相似。因而，例如，在已使內(nèi)源Ig基因失活的實施方案中，總的免疫球蛋白水平將為血清中約0.1～10mg/ml，優(yōu)選為0.5～5mg/ml，理想地為至少約1.0mg/ml。當(dāng)將能夠影響從IgM向IgG轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)基因引入到轉(zhuǎn)基因小鼠中時，成人小鼠的血清IgG對IgM的比例優(yōu)選為約10∶1。IgG對IgM的比例在未成熟的小鼠中將非常低。通常，大于約10％，優(yōu)選為40～80％的脾和淋巴結(jié)B細胞專一地表達人類IgG蛋白質(zhì)。
所有組成成分理想地將接近示于天然小鼠中的，通常為至少高約10％，優(yōu)選地為25～50％或更高。通常，主要依賴于引入到小鼠基因組中的不同V、J和D區(qū)的數(shù)目，將產(chǎn)生至少約一千種不同的免疫球蛋白(理想地為IgG)，優(yōu)選地為104～106或更多。這些免疫球蛋白一般將識別約一半或更多高度抗原性的蛋白質(zhì)，如葡萄球菌A蛋白。免疫球蛋白對于預(yù)選的抗原一般將展示低于10-7M的親和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低。在一些實施方案中，優(yōu)選可生成具有預(yù)定的所有組成成分的非人類動物，以限制在抗體對預(yù)定的抗原類型反應(yīng)中表現(xiàn)的V基因的選擇。具有預(yù)定的所有組成成分的重鏈轉(zhuǎn)基因包含如優(yōu)選用于對人類中預(yù)定抗原類型的抗體反應(yīng)中的人類VH基因。可選擇地，由于各種原因(如具有低的編碼預(yù)定抗原的高親和力V區(qū)的可能性；具有低的進行體細胞突變和親和力銳化(sharpening)傾向；或?qū)τ谀承┤耸敲庖咴缘?，可從限定的所有組成成分中排除一些VH基因。因而，在含有各種重鏈或輕鏈基因段的轉(zhuǎn)基因進行重排之前，這種基因段易于通過如雜交或DNA測序鑒定為來自除轉(zhuǎn)基因動物之外的物種或生物。
如上所述的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人類動物，如小鼠可用如CD30抗原和/或表達CD30的細胞的純化或重組制劑進行免疫接種。可選擇地，轉(zhuǎn)基因動物可用編碼人類CD30的DNA進行免疫接種。然后動物將產(chǎn)生B細胞，該B細胞通過轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換(cis-switching))進行類別轉(zhuǎn)換，并表達與CD30反應(yīng)的免疫球蛋白。該免疫球蛋白可為人類抗體(也稱為“人類序列抗體”)，其中重鏈和輕鏈多肽由人類轉(zhuǎn)基因序列編碼，該序列包括通過體細胞突變和V區(qū)重組連接衍生的序列以及種系編碼的序列；這些人類抗體可稱為基本與由人類VL或VH基因段和人類JL或DH和JH段編碼的多肽序列相同，即使作為體細胞突變和不同V-J和V-D-J重組連接的結(jié)果可存在其他非種系序列。每一種抗體鏈的可變區(qū)一般至少有80％由人類種系V、J和在重鏈的情形中的D基因段編碼；常有至少85％的可變區(qū)由存在于轉(zhuǎn)基因上的人類種系序列編碼；且常有90％或95％或更多的可變區(qū)由存在于轉(zhuǎn)基因上的人類種系序列編碼。然而，由于非種系序列是通過體細胞突變和VJ和VDJ連接引入的，所以人類序列抗體常具有一些不是由小鼠種系中的人類轉(zhuǎn)基因中可見的人類V、D或J基因段編碼的可變區(qū)序列(及較不常見的恒定區(qū)序列)。一般地，這種非種系序列(或單獨的核苷酸位置)將在CDR中或靠近CDR聚簇，或者在已知聚簇了體細胞突變的區(qū)域中聚簇。
與預(yù)定的抗原結(jié)合的人類抗體可通過同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生，從而可產(chǎn)生包含人類序列γ鏈(如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人類序列輕鏈(如κ)的人類抗體。作為抗原對B細胞的親和力成熟和選擇的結(jié)果，特別是在二級(或隨后的)抗原攻擊之后，這種同種型轉(zhuǎn)換的人類抗體一般在可變區(qū)且常在CDR的約10個殘基中常含有一個或多個體細胞突變。3種高親和力的人類抗體可具有低于10-7M的結(jié)合親和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或更低。
本發(fā)明的另一個方面包括源自此處所述的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人類動物的B細胞。B細胞可用于生成表達人類單克隆抗體的雜交瘤，該單克隆抗體以高親和力(如低于10-7M)與人類CD30結(jié)合。因而，在另一個實施方案中，當(dāng)應(yīng)用重組人類CD30作為分析物并應(yīng)用抗體作為結(jié)合人類CD30的配體通過BIACORE 3000設(shè)備中的表面胞質(zhì)基因共振(SPR)技術(shù)進行確定時，本發(fā)明提供了產(chǎn)生人類抗體的雜交瘤，該人類抗體具有低于10-7M的親和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或更低，其中該抗體包含由以下成分組成的人類序列輕鏈，即(1)具有基本與由人類VL基因段和人類JL段編碼的多肽序列相同的多肽序列的輕鏈可變區(qū)，和(2)具有基本與由人類CL基因段編碼的多肽序列相同的多肽序列的輕鏈恒定區(qū)；和由以下成分組成的人類序列重鏈，即(1)具有基本與由人類VH基因段、任選的D區(qū)和人類JH段編碼的多肽序列相同的多肽序列的重鏈可變區(qū)，和(2)具有基本與由人類CH基因段編碼的多肽序列相同的多肽序列的恒定區(qū)。
高親和力的抗CD30的人類單克隆抗體的開發(fā)可由在具有包含整合的人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人類動物中擴張人類可變區(qū)基因段的所有組成成分的方法促進，該方法包含向基因組中引入V基因的轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因包含不存在于該整合的人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因中的V區(qū)基因段。V區(qū)轉(zhuǎn)基因常是包含人類VH或VL(VK)基因段陣列的酵母人工染色體，如天然存在于人類基因組中的或可單獨通過重組方法剪接在一起的，該酵母人工染色體可包括顛倒的或省略的V基因段。通常在YAC中含有至少5個或更多功能性V基因段。在該變體中，可能制備通過所有V組成成分?jǐn)U張方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物，其中該動物表達免疫球蛋白鏈，該免疫球蛋白鏈包含由存在于V區(qū)轉(zhuǎn)基因上的V區(qū)基因段編碼的可變區(qū)序列和在人類Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的C區(qū)。通過所有V組成成分?jǐn)U張方法，可生成具有至少5個不同V基因的轉(zhuǎn)基因動物；且可生成含有至少約24個V基因或更多的動物。一些V基因段是非功能性的(如假基因等)；如果需要，可通過技術(shù)人員可應(yīng)用的重組方法保留這些段，或?qū)⑵溥x擇性地刪除。
一旦小鼠種系已進行加工以含有功能性YAC，該功能性YAC具有基本不存在于含有J和C基因段的人類Ig轉(zhuǎn)基因中的擴張的V段所有組成成分，那么可使該性狀增殖，并交配到其他遺傳背景中，包括將具有擴張的V段所有組成成分的功能性YAC交配到具有不同人類Ig轉(zhuǎn)基因的非人類動物種系中的背景?？蓪⒕哂袛U張的V段所有組成成分的多功能性YAC交配到種系中以對人類Ig轉(zhuǎn)基因(或多個人類Ig轉(zhuǎn)基因)起作用。盡管此處稱為YAC轉(zhuǎn)基因，但當(dāng)整合入基因組中時，這種轉(zhuǎn)基因基本缺失酵母序列，如酵母中自主復(fù)制所必需的序列；在酵母中復(fù)制不再是必需的之后(即在引入到小鼠ES細胞或小鼠原合子(prozygote)中之前)，可通過基因工程(如限制酶切消化和脈沖場凝膠電泳或其他適當(dāng)?shù)姆椒?任選地將這種序列去除。人類序列免疫球蛋白表達性狀增殖的方法包括使轉(zhuǎn)基因動物繁殖，該轉(zhuǎn)基因動物具有人類Ig轉(zhuǎn)基因，且任選地也具有功能性YAC，該功能性YAC具有擴張的V段所有組成成分。VH和VL基因段兩者均存在于YAC上?？捎蓪嵺`者將轉(zhuǎn)基因動物交配到任何需要的背景中，包括帶有其他人類轉(zhuǎn)基因的背景，該其他人類基因包括人類Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其他人類淋巴細胞蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明也提供了由具有擴張的V區(qū)所有組成成分YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的高素和力人類序列免疫球蛋白。盡管前文描述了用于產(chǎn)生本發(fā)明的人類單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選實施方案，但可預(yù)期有其他實施方案，該實施方案分為4類I.含有未重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；II.含有未重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；III.含有重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；
IV.含有重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；在這些轉(zhuǎn)基因動物種類中，優(yōu)選順序如下當(dāng)內(nèi)源輕鏈基因(或至少K基因)已通過同源重組被敲除時為II＞I＞III＞IV，而當(dāng)內(nèi)源輕鏈基因未被敲除且必須由等位基因排斥支配時為I＞II＞III＞IV。
III.與CD30結(jié)合的雙特異性/多特異性分子在本發(fā)明另一個實施方案中，人類抗CD30的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分可進行衍生化或連接到其他功能性分子上，如另一種肽或蛋白質(zhì)(如Fab’片段)上，以生成與多個結(jié)合位點或目標(biāo)表位結(jié)合的雙特異性或多特異性分子。例如，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分可與一種或多種其他結(jié)合分子功能性連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、單價結(jié)合等)，如其他抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物。
因此，本發(fā)明包括雙特異性和多特異性的分子，該分子包含至少一個對CD30的第一結(jié)合特異性和對第二種目標(biāo)表位的第二結(jié)合特異性。在本發(fā)明一個特定實施方案中，第二種目標(biāo)表位是Fc受體，如人類FcγRI(CD64)或人類Fcα受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括既能與表達FcγR、FcαR或FcεR的效應(yīng)細胞(如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))結(jié)合，又能與表達CD30的目標(biāo)細胞結(jié)合的雙特異性和多特異性分子。這些雙特異性和多特異性的分子將表達CD30的細胞導(dǎo)向于效應(yīng)細胞，且與本發(fā)明的人類單克隆抗體相同，可觸發(fā)Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)細胞活性，如表達CD30的細胞的吞噬作用、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、細胞因子釋放或超氧陰離子的生成。
除抗-Fc結(jié)合特異性和抗-CD30結(jié)合特異性之外，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可進一步包括第三結(jié)合特異性。在一個實施方案中，第三結(jié)合特異性是抗增強因子(EF)部分，如與參與細胞毒性活性的表面蛋白質(zhì)結(jié)合并因而增加抗目標(biāo)細胞的免疫反應(yīng)的分子。“抗增強因子部分”可為與給定分子如抗原或受體結(jié)合，并因而導(dǎo)致結(jié)合決定簇對Fc受體或目標(biāo)細胞抗原的作用增強的抗體、功能性抗體片段或配體?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧笨山Y(jié)合Fc受體或目標(biāo)細胞抗原?？蛇x擇地，抗增強因子部分可以結(jié)合與第一和第二結(jié)合特異性結(jié)合的實體不同的實體。例如，抗增強因子部分可結(jié)合細胞毒性T-細胞(如通過導(dǎo)致增強的抗目標(biāo)細胞免疫反應(yīng)的CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫細胞)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，包括如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv。抗體也可為輕鏈或重鏈二聚體，或任何其模擬片段，如于1990年8月7日授予Ladner等人的美國專利號4,946,778中描述的Fv或單鏈構(gòu)建體，將該專利的內(nèi)容清楚地引入作為參考。
在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含對存在于效應(yīng)細胞表面的FcγR或FcαR的結(jié)合特異性，以及對目標(biāo)細胞抗原如CD30的第二結(jié)合特異性。
在一個實施方案中，對Fc受體的結(jié)合特異性由人類單克隆抗體提供，其結(jié)合不由人類免疫球蛋白G(IgG)阻斷。如在此處所用的，術(shù)語“IgG受體”指位于染色體1上的8個γ-鏈基因的任何一個。這些基因編碼總共12個跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分為3個Fcγ受體類型FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)cγ受體是人類高親和力FcγRI。人類FcγRI是72kDa的分子，顯示對單體IgG的高度親和力(108-109M-1)。
這些優(yōu)選單克隆抗體的生產(chǎn)和表征由Fanger等人在PCT申請WO88/00052和在美國專利號4,954,617中描述，在此處將其教導(dǎo)整體引入作為參考?？贵w在與受體的Fcγ結(jié)合位點不同的位點與FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位結(jié)合，因而，其結(jié)合基本不由生理學(xué)水平的IgG阻斷。用于本發(fā)明中的特定抗-FcγRI抗體為MAb 22、MAb 32、MAb 44、MAb 62和MAb 197。產(chǎn)生MAb 32的雜交瘤可購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC保藏號為HB9469?？?FcγRI的MAb 22和MAb22的F(ab’)2片段可購自Medarex，Inc.(Annandale，N.J.)。在另一個實施方案中，抗-Fcγ受體抗體是單克隆抗體22(H22)的人源化形式。H22抗體的生產(chǎn)和表征描述于Graziano，R.F.等人(1995)J.Immunol 155(10)4996-5002和PCT/US93/10384中。產(chǎn)生H22抗體的細胞系于1992年11月4日以HA022CL1的名稱保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，且具有保藏號CRL 11177。
在另外一個優(yōu)選實施方案中，對Fc受體的結(jié)合特異性由與人類IgA受體如Fc-α受體(FcαRI(CD89))結(jié)合的抗體提供，其結(jié)合優(yōu)選地不由人類免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術(shù)語“IgA受體”意欲包括位于染色體19上的一個α-基因(FcαRI)的基因產(chǎn)物。已知該基因編碼7個55～110kDa的可變剪接的跨膜同種型。FcαRI(CD89)在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性和嗜中性粒細胞上組成型表達，但不在非效應(yīng)細胞群體上組成型表達。FcαRI對IgA1和IgA2兩者均具有中等親和力(≈5×107M-1)，在暴露于細胞因子如G-CSF或GM-CSF后該親和力增加(Morton，H.C.等人(1996)Critical Reviews inImmunology 16423-440)。已描述了4種鑒定為A3、A59、A62和A77的FcαRI-特異性單克隆抗體，該單克隆抗體在IgA配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外結(jié)合FcαRI(Monteiro，R.C.等人，1992，J.Immunol.1481764)。
FcαRI和FcγRI是用于本發(fā)明中的優(yōu)選觸發(fā)受體，這是因為它們(1)主要表達于免疫效應(yīng)細胞上，如單核細胞、PMN、巨噬細胞和樹突細胞；(2)以高水平進行表達(如每細胞5,000-100,000)；(3)是細胞毒性活性(如ADCC、吞噬作用)的介質(zhì)；(4)介導(dǎo)導(dǎo)向于它們的抗原(包括自身抗原)增強的抗原呈遞。
在其他實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子進一步包含識別如與目標(biāo)細胞抗原如CD30結(jié)合的結(jié)合特異性。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)合特異性由本發(fā)明的人類單克隆抗體提供。
如在此處所用的，“效應(yīng)細胞特異性抗體”指結(jié)合效應(yīng)細胞的Fc受體的抗體或功能性抗體片段。用于主題發(fā)明中的優(yōu)選抗體在未由內(nèi)源免疫球蛋白結(jié)合的位點結(jié)合效應(yīng)細胞的Fc受體。
如在此處所用的，術(shù)語“效應(yīng)細胞”指與免疫反應(yīng)的識別階段和活化階段相反，參與免疫反應(yīng)的效應(yīng)階段的免疫細胞。示例性的免疫細胞包括髓樣或淋巴樣來源的細胞，如淋巴細胞(如B細胞和T細胞，包括細胞毒性T細胞(CTL))、殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞。一些效應(yīng)細胞表達特定的Fc受體，并發(fā)揮特定的免疫功能。在優(yōu)選實施方案中，效應(yīng)細胞能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，如嗜中性粒細胞能夠誘導(dǎo)ADCC。例如，表達FcR的單核細胞、巨噬細胞參與目標(biāo)細胞的特異性殺傷和將抗原呈遞到免疫系統(tǒng)的其他成分或與呈遞抗原的細胞結(jié)合。在其他實施方案中，效應(yīng)細胞可吞噬目標(biāo)抗原、目標(biāo)細胞或微生物。效應(yīng)細胞上特定FcR的表達可由體液因子如細胞因子調(diào)節(jié)。例如，已發(fā)現(xiàn)FcγRI的表達可由干擾素γ(IFN-γ)上調(diào)。該增強的表達可增加帶有FcγRI的細胞對目標(biāo)的細胞毒性活性。效應(yīng)細胞可吞噬或溶解目標(biāo)抗原或目標(biāo)細胞。
“目標(biāo)細胞”應(yīng)指被試者(如人類或動物)中任何不需要的細胞，該細胞可由本發(fā)明的組合物(如人類單克隆抗體、雙特異性或多特異性分子)導(dǎo)向。在優(yōu)選實施方案中，目標(biāo)細胞是表達或超量表達CD30的細胞。表達CD30的細胞一般包括腫瘤細胞，如膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎、卵巢、前列腺、腎細胞、扁平細胞、肺(非小細胞)和頭和頸腫瘤細胞。其他目標(biāo)細胞包括滑膜成纖維細胞。
盡管人類單克隆抗體是優(yōu)選的，可用于本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子中的其他抗體為鼠的、嵌合的和人源化的單克隆抗體。
嵌合的鼠-人單克隆抗體(即嵌合抗體)可由本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，用限制酶消化編碼鼠(或其他物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區(qū)的基因，以去除編碼鼠Fc的區(qū)域，并替代為編碼人類Fc恒定區(qū)的基因的等價部分。(參見Robinson等人，國際專利申請PCT/US86/02269；Akira等人，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等人，歐洲專利申請173,494；Neuberger等人，國際申請WO 86/01533；Cabilly等人，美國專利號4,816,567，Cabilly等人，歐洲專利申請125,023；Better等人(1988Science 2401041-1043)；Liu等人(1987)PNAS 843439-3443；Liu等人，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等人(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等人，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等人(1985)Nature 314446-449和Shaw等人，1988，J.NatlCancer Inst.801553-1559)。
嵌合的抗體可進一步通過用來自人類Fv可變區(qū)的等價序列替代不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)序列而進行人源化。人源化抗體的綜述由Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207和由Oi等人，1986，BioTechniques 4214提供。這些方法包括分離、處理和表達核酸序列，該核酸序列編碼來自至少一個重鏈或輕鏈的全部或部分免疫球蛋白Fv可變區(qū)。這種核酸的來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且例如，可從7E3獲得，即一種產(chǎn)生抗-GPIIbIIIa抗體的雜交瘤。然后，可將編碼嵌合抗體的重組DNA或其片段克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中。適當(dāng)?shù)娜嗽椿贵w可選擇地由CDR替代產(chǎn)生。美國專利號5,225,539；Jones等人，1986 Natufe 321552-525；Verhoeyan等人，1988Science 2391534和Beidler等人，1988 J.Immunol.1414053-4060。
特定的人類抗體的所有CDR均可由至少一部分非人類的CDR替代，或者僅有一些CDR可由非人類的CDR替代。僅需要替代將人源化抗體結(jié)合到Fc受體上所必需的CDR的數(shù)目。
抗體可通過任何方法進行人源化，該方法能夠用源自非人類抗體的CDR替代至少一部分人類抗體的CDR。Winter描述了可用于制備本發(fā)明的人源化抗體的方法(于1989年3月26日提交的英國專利申請GB 2188638A)，將其內(nèi)容清楚地引入作為參考。人類CDR可應(yīng)用寡核苷酸定點誘變而由非人類的CDR替代，如描述于題為HumanizedAntibodies to Fc Receptorsfor Immunoglobulin G on HumanMononuclear Phagocytes的國際申請WO 94/10332中的。
同樣在本發(fā)明范圍內(nèi)的是嵌合的和人源化的抗體，其中特定的氨基酸已被替代、缺失或添加。具體而言，優(yōu)選的人源化抗體在構(gòu)架區(qū)中具有氨基酸替代，從而改進與抗原的結(jié)合。例如，在一種具有小鼠CDR的人源化抗體中，位于人類構(gòu)架區(qū)中的氨基酸可由位于小鼠抗體中相應(yīng)位置的氨基酸替代。已知這種替代在一些例子中可改進人源化抗體與抗原的結(jié)合。此處將氨基酸已進行添加、缺失或替代的抗體稱為修飾的抗體或改變的抗體。
術(shù)語修飾的抗體也意欲包括已通過如缺失、添加或替代部分抗體進行修飾的抗體，如單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。例如，抗體可通過缺失恒定區(qū)并由意欲增加抗體的半衰期如血清半衰期、穩(wěn)定性或親和力的恒定區(qū)替代而進行修飾。任何修飾均在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要雙特異性和多特異性分子具有至少一個對FcγR特異性的抗原結(jié)合區(qū)，并觸發(fā)至少一種效應(yīng)功能。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可應(yīng)用化學(xué)技術(shù)(參見如D.M.Kranz等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785807)、“polydoma”技術(shù)(參見授予Reading的美國專利號4,474,893)或重組DNA技術(shù)制備。
具體而言，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可通過應(yīng)用本領(lǐng)域中公知的和在此處提供的實施例中描述的方法偶聯(lián)組分結(jié)合特異性制備，如抗-FcR和抗-CD30結(jié)合特異性。例如，雙特異性和多特異性分子的每一種結(jié)合特異性可單獨生成，然后相互偶聯(lián)。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時，多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑可用于共價偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括A蛋白、碳二亞氨基、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸鹽(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)已基-1-羧酸鹽(sulfo-SMCC)(參見如Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828648)。其他方法包括那些由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等人(Science(1985)22981-83和Glennie等人，(J.Immunol.(1987)1392367-2375)所描述的。優(yōu)選的偶聯(lián)試劑為SATA和sulfo-SMCC，兩者均可購自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(如兩種人源化抗體)，它們可通過兩個重鏈C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵偶聯(lián)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，對鉸鏈區(qū)進行修飾以使其在偶聯(lián)前含有奇數(shù)個巰基殘基，優(yōu)選為1個。
可選擇地，兩種結(jié)合特異性可在相同的載體中編碼，并在相同的宿主細胞中表達和裝配。當(dāng)雙特異性和多特異性分子是MAb x MAb，MAb x Fab，F(xiàn)ab x F(ab’)2或配體x Fab融合蛋白質(zhì)時，該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子，如雙特異性分子可為單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體、包含一個單鏈抗體和一個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子或包含兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子也可為單鏈分子，或者可包含至少兩個單鏈分子。用于制備雙特異性和多特異性分子的方法描述于如美國專利號5,260,203、美國專利號5,455,030、美國專利號4,881,175、美國專利號5,132,405、美國專利號5,091,513、美國專利號5,476,786、美國專利號5,013,653、美國專利號5,258,498和美國專利號5,482,858中。
雙特異性和多特異性分子與其特異性目標(biāo)的結(jié)合可通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(如生長抑制)或蛋白質(zhì)印跡測定進行證實。這些測定的每一個通常通過應(yīng)用對感興趣的復(fù)合物特異性的標(biāo)記試劑(如抗體)探測特別感興趣的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，F(xiàn)cR-抗體復(fù)合物可應(yīng)用如識別并特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段進行探測?？蛇x擇地，該復(fù)合物可應(yīng)用多種其他免疫測定中的任何一種進行探測。例如，抗體可為放射性標(biāo)記的并用于放射免疫測定(RIA)中(參見如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，1986年3月，在此處將其引入作為參考)。放射性同位素可通過以下方法探測，即γ計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或放射自顯影。
IV.免疫偶聯(lián)物在另一方面，本發(fā)明的特征為與治療部分如細胞毒素、藥物(如免疫抑制劑)或放射毒素偶聯(lián)的人類抗-CD30單克隆抗體或其片段。此處將這種偶聯(lián)物稱為“免疫偶聯(lián)物”。包括一種或多種細胞毒素的免疫偶聯(lián)物稱為“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒性劑包括任何對細胞有害(如殺傷細胞)的試劑。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩葡糖苷、長春花新堿、長春花堿、秋水仙素、阿霉素、道諾紅菌素、二羥炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同系物。
用于形成本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物的適當(dāng)治療劑包括，但不局限于抗代謝物(如氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化劑(如氨芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和羅氮芥(CCNJ)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順式二氯二胺鉑(II)(DDP)順式鉑氨)、安慈那環(huán)素(如道諾紅菌素(以前為道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(如更生霉素(以前為放線菌素)、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(如長春花新堿和長春花堿)。在一個優(yōu)選實施方案中，治療劑是細胞毒性劑或放射毒性劑。在另一個實施方案中，治療劑是免疫抑制劑。在另一個實施方案中，治療劑是GM-CSF。在一個優(yōu)選實施方案中，治療劑是阿霉素(阿霉素(adriamycin))、順式鉑氨博來霉素硫酸鹽(cisplatin bleomycinsulfate)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺羥脲或蓖麻毒蛋白A。
本發(fā)明的抗體也可與放射毒素如放射性碘偶聯(lián)，以生成用于治療CD30-相關(guān)的病癥如癌的細胞毒性防放射藥物。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可用于修飾給定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可為具有需要的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括如酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；一種蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或者生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白細胞介素-1(“IL-1”)、白細胞介素-2(“IL-2”)、白細胞介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。
使這種治療部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，第243-56頁(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等人(eds.)，第623-53頁(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，MonoclonalAntibodies’84Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(eds.)，第475-506頁(1985)；“Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，第303-16頁(AcademicPress 1985)和Thorpe等人，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
V.藥物組合物在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，如藥物組合物，該組合物含有與藥物可接受的載體配制在一起的本發(fā)明的一種人類單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，或它們的組合。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物包括本發(fā)明多種(如兩種或更多)分離的人類抗體或其抗原結(jié)合部分的組合。優(yōu)選地，組合物的每一種抗體或其抗原結(jié)合部分與不同的預(yù)選CD30表位結(jié)合。
本發(fā)明的藥物組合物也可在組合治療中施用，即與其他試劑組合。例如，組合治療可包括具有至少一種抗炎劑或至少一種免疫抑制劑的本發(fā)明的組合物。此外，這種治療劑包括甾族和非甾族的抗炎藥物(NSAIDS)，如阿司匹林和其他水楊酸鹽，如布洛芬(布洛芬(Motrin)，阿迪維爾片(Advil))、萘普生(萘普生(Naprosyn))、舒林酸(舒林酸(Clinoril))、扶他林(扶他林(Voltaren))、吡羅昔康(吡羅昔康(Feldene))、酮基布洛芬(酮基布洛芬(Orudis))、二氟尼柳(二氟尼柳(Dolobid))、萘丁美酮(萘丁美酮(Relafen))、依托度酸(依托度酸(Lodine))、噁丙嗪(噁丙嗪(Daypro))、吲哚美辛(吲哚美辛(Indocin))，且阿司匹林為高劑量。
如在此處所用的，“藥物可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。依賴于施用途徑，可將活性化合物即雙特異性和多特異性分子包被于一種材料中，以保護該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。
“藥物可接受的鹽”指保持了親代化合物的所需生物學(xué)活性且不引起任何不想要的毒理學(xué)作用的鹽(參見如Berge，S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這種鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些源自非毒性無機酸的，如鹽酸、硝酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，以及源自非毒性有機酸的，如脂族單和二酸酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。堿加成鹽包括那些源自堿土金屬的，如鈉、鉀、鎂、鈣等，以及源自非毒性有機胺的，如N，N’-二芐基亞乙基二酰胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。
本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域中公知的多種方法施用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，施用的途徑和/或模式將依賴于需要的結(jié)果而變化?；钚曰衔锟梢耘c防止該化合物快速釋放的載體一起制備，如有控制的釋放制劑，包括植入物、經(jīng)皮的藥膏和微囊化的送遞系統(tǒng)。可應(yīng)用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這種制劑的許多方法是獲得專利的，且通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
為了通過某些施用途徑施用本發(fā)明的化合物，必須用防止其失活的材料包被化合物，或使該化合物與防止其失活的材料共同施用。例如，化合物可在適當(dāng)?shù)妮d體中給被試者施用，例如脂質(zhì)體或稀釋劑。藥物可接受的稀釋劑包括鹽水和含水的緩沖液。脂質(zhì)體包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳劑以及常規(guī)的脂質(zhì)體(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.727)。
藥物可接受的載體包括用于臨時制備無菌注射型溶液或分散體的無菌的含水溶液或分散體和無菌粉末。這種藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的用途是本領(lǐng)域中公知的。除在任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物相容的情況之外，可以預(yù)期其在本發(fā)明的藥物組合物中的用途。也可將補加的活性化合物整合入組合物中。
治療組合物一般必須為無菌的，且在制造和貯藏條件下為穩(wěn)定下。組合物可制備為溶液、微乳、脂質(zhì)體或其他適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌?。適當(dāng)?shù)牧鲃有缘木S持可通過如應(yīng)用包被物如卵磷脂，通過在分散的情形中維持必需的顆粒大小及通過應(yīng)用表面活性劑。在許多情形中，在組合物中優(yōu)選地包括等滲劑，例如，糖；多元醇，如甘露醇、山梨糖醇；或氯化鈉。注射型組合物延長的吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑來實現(xiàn)，如單硬脂酸鹽和明膠。
無菌的注射型溶液的制備包括將必需量的活性化合物與必需的一種上述列舉的成分或成分的組合整合入適當(dāng)?shù)娜軇┲校S后為滅菌的微量過濾。通常，分散體通過將活性化合物整合入無菌的載體中進行制備，該載體含有基本的分散介質(zhì)和來自上述列舉的其他必需成分。在用于制備無菌注射型溶液的無菌粉末的情形中，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥(凍干)，這可從其前述無菌過濾的溶液中得到活性成分加任何額外必需成分的粉末。
對劑量方案進行調(diào)整以提供最適的所需反應(yīng)(如治療反應(yīng))。例如，可施用單個大丸劑，隨時間可施用幾個分開的劑量，或者可如治療狀況的緊急情況所示按比例降低或增加劑量。尤其有利的是為了便于施用和劑量的一致，以劑量單位形式制備腸胃外組合物。如在此處所用的劑量單位形式指適用做要治療的被試者的單位劑量的物理上不連續(xù)的單位；每一個單位含有預(yù)定量的活性化合物，該活性化合物經(jīng)計算可以與必需的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生所需的治療作用。對本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨特特征和要達到的特殊治療作用，和(b)本領(lǐng)域中化合這樣的活性化合物以治療個體中的敏感性中固有的限制。
藥物可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、半胱鹽酸(cysteine hydrochloride)、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁化羥基甲苯(DHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合物，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
對于治療組合物，本發(fā)明的制劑包括那些適合于口服、經(jīng)鼻的、局部的(包括經(jīng)口的和舌下的)、直腸的、陰道的和/或腸胃外施用的。制劑可方便地以單位劑量形式存在，且可通過藥劑學(xué)領(lǐng)域中公知的任何方法制備。可以與載體材料組合以產(chǎn)生單個劑量形式的活性成分的量將依賴于要治療的被試者和特殊的施用模式而變化?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單個劑量形式的活性成分的量通常為產(chǎn)生治療作用的組合物的量。通常，在100％中，該量范圍為約0.01％～約99％的活性成分，優(yōu)選地為約0.1％～70％，最優(yōu)選地為約1％～約30％。
本發(fā)明適用于陰道施用的制劑也包括含有本領(lǐng)域中公知的適當(dāng)載體的陰道栓、塞子、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑。用于本發(fā)明組合物的局部或經(jīng)皮施用的劑量形式包括粉末、噴霧、軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑?；钚曰衔锟稍跓o菌條件下與藥物可接受的載體及與任何必需的防腐劑、緩沖液或推進劑進行混合。
如在此處所用的短語“腸胃外施用”和“腸胃外施用的”指不同于腸的和局部施用的施用模式，通常通過注射，且包括但不局限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)注射和輸注。
可用于本發(fā)明的藥物組合物中的適當(dāng)?shù)暮虿缓d體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油如橄欖油，和注射型有機酯如油酸乙酯。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥赏ㄟ^如應(yīng)用包被材料如卵磷脂、在分散情形中維持必需的顆粒大小和應(yīng)用表面活性劑而維持。
這些組合物也可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包括各種抗細菌和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等而確保防止存在微生物。也預(yù)期在組合物中包括等滲劑如糖類、氯化鈉等。此外，可通過包括延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠而實現(xiàn)注射型藥物形式的延長的吸收。
當(dāng)本發(fā)明的化合物作為藥物施用于人和動物時，它們可單獨施用，或者作為藥物組合物施用，該藥物組合物含有如與藥物可接受的載體組合的0.01～99.5％(更優(yōu)選地為0.1～90％)的活性成分。
不管所選擇的施用途徑，將本發(fā)明可以以適當(dāng)?shù)乃闲问绞┯玫幕衔锖?或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法制備為藥物可接受的劑量形式。
本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可進行改變，以獲得可對特定患者、組合物和施用方式有效實現(xiàn)所需治療反應(yīng)，而不對患者有毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平將依賴于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括本發(fā)明應(yīng)用的特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，施用方式，施用時間，應(yīng)用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時間，與應(yīng)用的特定組合物組合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和以前病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的類似因素。
本領(lǐng)域普通的醫(yī)生或獸醫(yī)易于確定并開出有效量的所需藥物組合物的藥方。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以由低于為實現(xiàn)所需的治療作用所必需的劑量開始應(yīng)用藥物組合物中應(yīng)用的本發(fā)明化合物，并逐漸增加劑量，直到實現(xiàn)了所需的作用。通常，本發(fā)明組合物適當(dāng)?shù)娜沼脛┝繛榭捎行Мa(chǎn)生治療作用的最小劑量。這種有效劑量通常依賴于上述因素。優(yōu)選的是通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下進行施用，且優(yōu)選的是施用于目標(biāo)位點近處。如果需要，治療組合物的有效日用劑量可在一日中以適當(dāng)間隔單獨施用的2次、3次、4次、5次、6次或更多次副劑量進行施用，任選地以單位劑量的形式。盡管可能單獨施用本發(fā)明的化合物，但優(yōu)選的是作為藥物制劑(組合物)施用。
治療組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療設(shè)備施用。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針的皮下注射設(shè)備施用，如在美國專利號5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公開的設(shè)備。用于本發(fā)明的眾所周知的植入物和組件的例子包括美國專利號4,487,603，該專利公開了用于以有控制的速率分散藥物的植入型微量輸注泵；美國專利號4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚施用藥物(medicant)的治療設(shè)備；美國專利號4,447,233，該專利公開了用于以精確的輸注速率送遞藥物的醫(yī)學(xué)輸注泵；美國專利號4,447,224，該專利公開了用于連續(xù)的藥物送遞的變流植入型輸注設(shè)備；美國專利號4,439,196，該專利公開了具有多個室的區(qū)室的滲透藥物送遞系統(tǒng)；和美國專利號4,475,196，該專利公開了一種滲透藥物送遞系統(tǒng)。在此處將這些專利引入作為參考。許多其他這種植入物、送遞系統(tǒng)和組件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在某些實施方案中，可對本發(fā)明的人類單克隆抗體進行配制以確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)排除了任何高親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療組合物跨BBB(如果需要)，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。對于制造脂質(zhì)體的方法，參見如美國專利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂質(zhì)體可包含一種或多種選擇性地轉(zhuǎn)運入特定細胞或器官中的部分，從而增強導(dǎo)向的藥物送遞(參見如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。示例性的導(dǎo)向性部分包括葉酸或生物素(參見如授予Low等人的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等人，(1995)FEBSLett.357140；M.Owais等人，(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39180)；表面活性劑A蛋白受體(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233134)，其不同種類可包含本發(fā)明的制劑以及發(fā)明的分子的成分；p120(Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。在本發(fā)明的一個實施方案中，將本發(fā)明的治療化合物配制在脂質(zhì)體中；在更優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體包括導(dǎo)向性部分。在一個最優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體中的治療化合物通過快速灌注送遞到靠近所需區(qū)域的位點，如炎癥或感染位點，或者送遞到腫瘤位點。組合物必須具有易于注射的流動程度。它在制造和貯藏條件下必須是穩(wěn)定的，且必須防止微生物如細菌和真菌的污染作用。
相對于未治療的被試者而言，“治療有效劑量”優(yōu)選地抑制細胞生長或腫瘤生長的至少約20％，更優(yōu)選地為至少約40％，更優(yōu)選地為至少約60％，更優(yōu)選地為至少約80％。組合物抑制腫瘤的能力可在預(yù)示在人類腫瘤中的功效的動物模型中進行估計。可選擇地，組合物的該性質(zhì)可通過用技術(shù)人員公知的測定檢查組合物進行抑制如體外抑制的能力而進行估計。治療有效量的治療化合物可減小腫瘤大小，或者改善患者中的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于如下因素確定這種量，該因素如被試者大小、被試者癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或施用途徑。
組合物必須是無菌的，且流動性達到該組合物可通過注射器送遞的程度。除水之外，載體可為等滲緩沖的鹽溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。適當(dāng)?shù)牧鲃有缘木S持可通過如應(yīng)用包被物如卵磷脂，通過在分散的情形中維持必需的顆粒大小及通過應(yīng)用表面活性劑。在許多情形中，在組合物中優(yōu)選地包括等滲劑，例如，糖；多元醇(polyalcohol)，如甘露醇、山梨糖醇；和氯化鈉。注射型組合物長期的吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑來實現(xiàn)，如單硬脂酸鹽或明膠。
如上所述，當(dāng)活性化合物得到適當(dāng)保護時，該化合物可應(yīng)用如惰性稀釋劑或可同化的可食用載體進行口服。
VI.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的人類抗體、抗體組合物和方法具有許多體外和體內(nèi)診斷和治療效用，包括CD30介導(dǎo)的病癥的診斷和治療。例如，可將這些分子如在體外或來自體內(nèi)施用于培養(yǎng)物中的細胞，或者如在體內(nèi)施用于人類被試者，以治療、預(yù)防和診斷多種病癥。如在此處所用的，術(shù)語“被試者”意欲包括人類和非人類動物。優(yōu)選的被試者包括患有CD30活性介導(dǎo)的病癥的患者。
例如，本發(fā)明的人類抗體、抗體組合物和方法可用于治療患有致瘤性病癥的被試者，如特征在于存在表達CD30的腫瘤細胞的病癥，包括如何杰金氏病、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-細胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西?nèi)瘤和其他T-細胞或B-細胞淋巴瘤。本發(fā)明的人類抗體、抗體組合物和方法可用于治療患有其他病癥的患者，如自身免疫病，包括如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)的疾病。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體(如人類單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可用于探測CD30的水平，或用于探測其膜表面含有CD30的細胞的水平，然后該水平與某些疾病癥狀關(guān)聯(lián)?？蛇x擇地，抗體可用于抑制或阻斷CD30的功能，這反過來可與某些疾病癥狀的預(yù)防或改善關(guān)聯(lián)，從而提示CD30是疾病的介質(zhì)。這可通過使樣品和對照樣品與抗-CD30在使得抗體和CD30之間能夠形成復(fù)合物的條件下接觸而實現(xiàn)。在樣品和對照中可探測并比較抗體和CD30之間形成的任何復(fù)合物。
在另一個實施方案中，最初可檢驗本發(fā)明的抗體(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)與在體外的治療或診斷用途相關(guān)的結(jié)合活性。例如，可應(yīng)用在下文實施例中描述的ELISA和流式細胞儀測定檢驗本發(fā)明的組合物。此外，可以測定這些分子在觸發(fā)至少一種效應(yīng)物介導(dǎo)的效應(yīng)細胞活性中的活性，包括抑制表達CD30的細胞的生長和/或殺死該細胞。用于測定效應(yīng)細胞介導(dǎo)的ADCC或吞噬作用的規(guī)程描述于下文實施例中。
本發(fā)明的抗體(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)在CD30-相關(guān)的疾病的治療和診斷中具有額外的效用。例如，人類單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物可用于在體內(nèi)或在體外引起一種或多種下述生物學(xué)活性抑制表達CD30的細胞的生長和/或殺死該細胞；在人類效應(yīng)細胞存在時介導(dǎo)表達CD30的細胞的吞噬作用或ADCC；抑制可溶性CD30的釋放、阻斷與CD30結(jié)合的CD30配體、抑制IL-4表達或介導(dǎo)Th2表型的表達，如在低劑量時。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)不能誘導(dǎo)補體介導(dǎo)的細胞裂解，因此，在觸發(fā)補體活化的痛苦如痤瘡中具有較少的副作用。痤瘡的主要起因是產(chǎn)皮脂的濾泡中角化模式中的改變。由于角質(zhì)細胞表達CD30，所以對皮膚中CD30信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的干擾可改變?yōu)V泡中角質(zhì)細胞的生長和分化，這導(dǎo)致痤瘡的形成。直接的免疫熒光研究已顯示在早期非發(fā)炎的和發(fā)炎的痤瘡損害中，存在補體經(jīng)典途徑和補體旁路途徑的活化。
在一個特定實施方案中，本發(fā)明的抗體(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可在體內(nèi)用于治療、預(yù)防或診斷多種CD30-相關(guān)的疾病。其中，CD30-相關(guān)的疾病的例子包括癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-細胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他T-細胞或B-細胞淋巴瘤。此外，其他CD30介導(dǎo)的疾病包括自身免疫病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)的疾病。
在一個特定實施方案中，本發(fā)明的抗體(如人類單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可用于治療或預(yù)防何杰金氏病(HD)，這是因為抗體可限制CD30在HD和其他致瘤性疾病中所起的作用。何杰金氏病是一類淋巴瘤。淋巴瘤是在淋巴系統(tǒng)中發(fā)展的癌，該淋巴系統(tǒng)是身體免疫系統(tǒng)的一部分。因為在身體的許多部分存在淋巴組織，所以HD幾乎可在身體的任何部分開始。癌可擴散到身體中的幾乎任何器官或組織，包括肝、骨髓(身體大骨骼中產(chǎn)生血細胞的海綿組織)和脾。已報道何杰金氏和Reed-Sternberg細胞中CD30升高的表達與HD的區(qū)分性診斷相關(guān)。因此，本發(fā)明的CD30抑制性抗體可用于預(yù)防或阻斷導(dǎo)致HD的CD30的作用，因而，可用于預(yù)防或治療該疾病。
本發(fā)明的人類抗體(如人類單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子)也可用于阻斷或抑制CD30的其他作用。例如，已知CD30也由多種非何杰金氏淋巴瘤亞型進行有規(guī)律的表達。因此，本發(fā)明抗體的另一個用途包括預(yù)防和治療包括非何杰金氏淋巴瘤的疾病。這些疾病包括伯基特淋巴瘤、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T-細胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小切割的細胞淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、外周T-細胞淋巴瘤、Lennert氏淋巴瘤、免疫母細胞淋巴瘤、T-細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-細胞淋巴瘤(T-ALL)和內(nèi)分芽型/中央細胞(centrocytic)(cb/cc)濾泡淋巴瘤。
在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的人類抗體(如人類單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可用于阻斷或抑制CD30的其他作用。例如，已知可溶性CD30有規(guī)律地從表達CD30的細胞表面釋放。在患有多種致瘤性和自身免疫病癥的患者血清中已報道有升高的sCD30水平。因此，本發(fā)明抗體的另一個用途包括預(yù)防或治療疾病，包括阻斷或抑制sCD30的釋放。這種疾病包括，但不局限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病和Omen氏綜合征。
在體內(nèi)和在體外施用本發(fā)明的抗體組合物(如人類單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)的適當(dāng)途徑是本領(lǐng)域中眾所周知的，且可由技術(shù)人員進行選擇。例如，抗體組合物可通過注射(如靜脈內(nèi)或皮下)施用。所用的分子的適當(dāng)劑量將依賴于被試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或配方。
如上所述，本發(fā)明的人類抗-CD30抗體可以與一種或其他多種治療劑一起施用，如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑。抗體可以與試劑連接(作為免疫復(fù)合物)，或者可以與試劑單獨施用。在后一種情形(單獨施用)中，抗體可在試劑之前、之后或與其同時施用，或者與其他已知的治療如抗癌治療如放射共同施用。其中，這種治療劑包括抗癌劑如阿霉素(adriamycin)、順式鉑氨硫酸博來霉素、亞硝基脲氮芥、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲，這些治療劑自身僅在對患者有毒性或亞毒性的水平上有效。順式鉑氨每隔4日1次以100mg/m2的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)施用，而阿霉素每隔21日1次以60-75mg/m2的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明的人類抗-CD30抗體或其抗原結(jié)合片段與化療劑的共同施用提供了兩種通過不同機制起作用的抗癌劑，該抗癌劑可對人類腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性作用。這種共同施用可解決歸因于腫瘤細胞對藥物發(fā)展抗性和抗原性變化而使其與抗體無反應(yīng)性的問題。
目標(biāo)特異性效應(yīng)細胞也可用作治療劑，如與本發(fā)明的組合物(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子)連接的效應(yīng)細胞。導(dǎo)向性效應(yīng)細胞可為人類白細胞，如巨噬細胞、嗜中性粒細胞或單核細胞。其他細胞包括嗜酸性粒細胞、天然殺傷細胞和其他帶有IgG-或IgA-受體的細胞。如果需要，效應(yīng)細胞也可從要治療的被試者中獲得。目標(biāo)特異性效應(yīng)細胞可作為生理學(xué)可接受的溶液中的細胞懸浮液施用。施用的細胞數(shù)目可在108-109的量級，但將依賴于治療目的而變化。通常，該量將足以獲得在目標(biāo)細胞如表達CD30的腫瘤細胞的定位，并足以通過如吞噬作用影響細胞殺傷。施用途徑也有變化。
應(yīng)用目標(biāo)特異性效應(yīng)細胞的治療可以與用于去除導(dǎo)向的細胞的其他技術(shù)聯(lián)合進行。例如，應(yīng)用本發(fā)明的組合物(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或用這些組合物武裝的效應(yīng)細胞的抗癌治療可以與化學(xué)療法聯(lián)合應(yīng)用。此外，組合免疫療法可用于將兩種不同的細胞毒性效應(yīng)物群體導(dǎo)向于腫瘤細胞排斥。例如，與抗-Fc-γRI或抗-CD3連接的抗-CD30抗體可用于與IgG-或IgA-受體特異性結(jié)合劑的聯(lián)合。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子也可用于調(diào)節(jié)效應(yīng)細胞上的FcγR或FcαR水平，如通過覆蓋或消除細胞表面上的受體?？?Fc受體的混合物也可用于該目的。
在補體存在時也可應(yīng)用本發(fā)明的組合物(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)，該組合物具有補體結(jié)合位點，如來自結(jié)合補體的IgG1、-2或-3或IgM的部分。在一個實施方案中，可以通過添加該補體或含有該補體的血清來補充來自體內(nèi)的細胞群體治療，該細胞群體包含具有本發(fā)明結(jié)合劑的目標(biāo)細胞和適當(dāng)?shù)男?yīng)細胞。用本發(fā)明的結(jié)合劑包被的目標(biāo)細胞的吞噬作用可通過結(jié)合補體蛋白質(zhì)而改進。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子)包被的目標(biāo)細胞也可通過補體裂解。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物不活化補體。
本發(fā)明的組合物(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)也可與補體一起施用。因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)的有包含人類抗體、多特異性或雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物和血清或補體的組合物。這些組合物優(yōu)點在于補體位于人類抗體、多特異性或雙特異性分子的最近處?？蛇x擇地，本發(fā)明的人類抗體、多特異性或雙特異性分子和補體或血清可單獨施用。
同樣在本發(fā)明范圍內(nèi)的是包含本發(fā)明的抗體組合物(如人類抗體和免疫偶聯(lián)物)及其使用說明的試劑盒。該試劑盒可進一步含有一種或多種額外試劑，如免疫抑制劑、細胞毒性劑或放射毒性劑，或一種或多種本發(fā)明額外的人類抗體(如具有補體活性的人類抗體，該抗體與不同于第—人類抗體的CD30抗原中的表位結(jié)合)。
因此，用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者可額外施用(在本發(fā)明的人類抗體施用之前、同時或之后)另一種治療劑，如細胞毒性劑或放射毒性劑，該治療劑可增強或增加人類抗體的治療作用。
在另一個實施方案中，被試者可額外用如下試劑進行治療，該試劑通過如用細胞因子治療被試者而調(diào)節(jié)如增強或抑制Fcγ或Fcα受體的表達或活性。用于在多特異性分子的治療中施用的優(yōu)選細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
在另一個實施方案中，被試者可額外用淋巴因子制劑進行治療。應(yīng)用淋巴因子制劑可誘導(dǎo)不高度表達CD30的癌細胞表達CD30。淋巴因子制劑可導(dǎo)致腫瘤細胞中更均一的CD30表達，這可導(dǎo)致更有效的治療。適合于施用的淋巴因子制劑包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子及其組合。這些制劑可在靜脈內(nèi)施用。適當(dāng)?shù)牧馨鸵蜃觿┝繛?0,000～1,000,000單位/患者。
本發(fā)明的組合物(如人類抗體、多特異性和雙特異性分子)也可用于導(dǎo)向于表達FcγR或CD30的細胞，例如標(biāo)記這些細胞。對于這種用途，結(jié)合劑可以與可探測的分子連接。因而，本發(fā)明提供了來自體內(nèi)或在體外定位表達Fc受體如FcγR或CD30的細胞的方法?？商綔y的標(biāo)記可為如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。
在一個特定實施方案中，本發(fā)明提供了探測樣品中存在CD30抗原或測量CD30抗原的量的方法，包含在使得在抗體或其部分和CD30之間能夠形成復(fù)合物的條件下，使樣品和對照樣品與特異性結(jié)合CD30的人類單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分接觸。然后探測形成的復(fù)合物，其中與對照樣品相比在樣品間形成的不同復(fù)合物是樣品中存在CD30抗原的指示。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過給被試者施用上述人類抗體而治療被試者中CD30介導(dǎo)的病癥的方法，如何杰金氏病、成人T-細胞淋巴瘤、傳染性單核細胞增多癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。將這種抗體及其衍生物用于抑制與某些病癥相關(guān)的CD30誘導(dǎo)的活性，如增殖和分化?？捎杀景l(fā)明的抗體抑制的其他CD30誘導(dǎo)的活性包括增加的sCD30生產(chǎn)、增加的IL-4表達和增加的Th2表型的生產(chǎn)。通過使抗體與CD30接觸(如通過給被試者施用抗體)，CD30誘導(dǎo)這種活性的能力受到抑制，因而相關(guān)的病癥得到治療。優(yōu)選地，抗體與對CD30特異性的表位結(jié)合，因而，有利地抑制CD30誘導(dǎo)的活性，但不干擾結(jié)構(gòu)相關(guān)的表面抗原如NGFR、CD27和CD40的活性。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防由人類CD30介導(dǎo)的致瘤性病癥的方法，如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-細胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他T-細胞或B-細胞淋巴瘤。該方法包括以治療和預(yù)防病癥的有效量給被試者施用本發(fā)明的抗體組合物。抗體組合物可單獨施用，或者與另一種治療劑一起施用，如與抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同作用以治療或預(yù)防CD30介導(dǎo)的疾病的細胞毒性劑或放射毒性劑。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療何杰金氏病的方法。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療ALCL的方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防由人類CD30介導(dǎo)的自身免疫病的方法，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)的疾病。該方法包括以治療和預(yù)防病癥的有效量給被試者施用本發(fā)明的抗體組合物。抗體組合物可單獨施用，或者與另一種治療劑一起施用，如與抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同作用以治療或預(yù)防CD30介導(dǎo)的疾病的免疫抑制劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在體內(nèi)或在體外探測表達Fc的細胞的存在或?qū)ζ淞窟M行定量的方法。該方法包含(i)給被試者施用與可探測的標(biāo)記偶聯(lián)的本發(fā)明的組合物(如多特異性或雙特異性分子)或其片段；(ii)對被試者應(yīng)用探測該可探測的標(biāo)記的方法以鑒定含有表達Fc的細胞的區(qū)域。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可用于通過使這種化合物與抗體連接而將化合物(如治療劑、標(biāo)記、細胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)導(dǎo)向于在其表面上(如膜結(jié)合的或與CD30受體結(jié)合的)結(jié)合有CD30的細胞。因而，本發(fā)明也提供了來自體內(nèi)或在體外定位表達CD30和CD30受體的細胞的方法，該細胞如何杰金氏和Reed-Sternberg細胞(如具有可探測的標(biāo)記，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。可選擇地，免疫偶聯(lián)物可用于通過將細胞毒素或放射毒素導(dǎo)向于CD30而殺傷在其表面上(如膜結(jié)合的或與CD30受體結(jié)合的)結(jié)合有CD30的細胞。
本發(fā)明進一步通過下面的實施例進行闡述，不應(yīng)將該實施例理解為進一步的限制。
實施例實施例1 CD30-特異性人類單克隆抗體(HuMab)的生成I.用于生產(chǎn)完整的人類抗CD30單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因(Cmu導(dǎo)向的)小鼠的生成CMD導(dǎo)向性載體的構(gòu)建質(zhì)粒pICEmu含有跨mu基因的鼠Ig重鏈基因座的EcoR I/Xho I片段，該質(zhì)粒購自Balb/C基因組λ噬菌體文庫(Marcu等人，Cell22187，1980)。將該基因組片段亞克隆入質(zhì)粒pICEMI9H的Xho I/EcoR I位點(Marsh等人，Gene 32，481-485，1984)。在pICEmu中包括的重鏈序列從緊靠在mu內(nèi)含子增強子3’的EcoR I位點下游延伸到位于mu基因最后一個跨膜外顯子下游約1kb的Xho I位點；然而，mu轉(zhuǎn)換重復(fù)區(qū)的大部分均已通過在大腸桿菌(E.coli)中的傳代而刪除。
導(dǎo)向性載體構(gòu)建如下。從pICEmu中切下1.3kb的Hind III/SmaI片段，并亞克隆入Hind III/Sma I消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)中。該pICEmu片段從位于Cmu1的5’約1kb的Hind III位點延伸到位于Cmu1中的Sma I位點。將結(jié)果所得的質(zhì)粒用Sma I/Spe I進行消化，并插入來自pICEmu的約4kb的SmaI/Xba I片段，該片段從Cmu1的3’中的Sma I位點延伸到緊靠在Cmu外顯子上游的Xba I位點。將結(jié)果所得的質(zhì)粒pTAR1在Sma I位點線性化，并插入neo表達盒。該盒由在小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動子控制下轉(zhuǎn)錄(Xba I/Taq I片段；Adra等人，(1987)Gene 6065-74)和含有pgk多腺苷酸化位點(Pvu II/Hind III片段；Boer等人，(1990)Biochemical Genetics 28299-308)的neo基因組成。該盒從質(zhì)粒pKJ1(由Tybulewicz等人，(1991)Cell 651153-1163描述)獲得，其中neo盒作為EcoR I/Hind III片段從該質(zhì)粒中切下并亞克隆入EcoR I/Hind III消化的pGEM-7Zf(+)中以生成pGEM-7(KJ1)。通過EcoR I/Sal I消化將neo盒從pGEM-7(KJ1)中切下，平端化，并在基因組Cmu序列的相反方向亞克隆入質(zhì)粒pTAR1的Sma I位點。用Not I使結(jié)果所得的質(zhì)粒線性化，并插入單純皰疹病毒(herpessimplex virus)胸苷激酶(tk)盒，以使得帶有同源重組的ES克隆能夠富集，如Mansour等人，(1988)Nature 336348-352所述。該盒由小鼠pgk啟動子和多腺苷酸化位點所夾的tk基因組成，如Tybulewicz等人，(1991)Cell 651153-1163所述。結(jié)果所得的CMD導(dǎo)向性載體含有總共約5.3kb的重鏈基因座同源物，并設(shè)計為能夠生成突變的mu基因，在該基因中已在第一個Cmu外顯子的Sma I位點插入了一個neo表達盒。在電穿孔進入ES細胞中之前，將該導(dǎo)向性載體用Pvu I進行線性化，該Pvu I在質(zhì)粒序列中進行切割。
導(dǎo)向的ES細胞的生成和分析AB-1 ES細胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.，(1990)Cell621073-1085)在基本如所述的無有絲分裂活性的SNL76/7細胞飼養(yǎng)層(如上)上生長(Robertson，E.J.(1987)Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cellsa Practical Approach.(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，第71-112頁)。將線性化的CMD導(dǎo)向性載體通過Hasty等人描述的方法電穿孔入AB-1細胞中(Hasty，P.R.等人(1991)Nature 350243-246)。將電穿孔的細胞以1-2×106細胞/皿的密度涂平板于100mm的皿中。24小時后，將G418(200微克/毫升活性成分)和FIAU(5×10-7M)加入到培養(yǎng)基中，并使藥物抗性克隆能夠發(fā)育8-9日。挑取克隆，用胰蛋白酶消化，將其分為兩部分，并進一步擴張。然后將源自每一個克隆的一半細胞冷凍，而用另一半分析載體和目標(biāo)序列之間的同源重組。
通過Southern印跡雜交進行DNA分析。如Laird等人所述，從克隆中分離DNA(Laird，P.W.等人，(1991)Nucleic Acids Res.194293)。用Spe I消化分離的基因組DNA，并用915bp的Sac I片段探針A(見圖1)進行探測，該探針A與mu內(nèi)含子增強子和mu交換區(qū)之間的序列雜交。探針A在野生型基因座中探測到9.9kb的Spe I片段，而在與CMD導(dǎo)向性載體(neo表達盒含有Spe I位點)同源重組的mu基因座中探測到診斷性的7.6kb條帶。在通過Southern印跡分析篩選的1132個G418和FIAU抗性克隆中，3個顯示了指示在mu基因座進行了同源重組的7.6kb Spe I片段。進一步用酶Bgl I、BstX I和EcoR I消化這3個克隆，以證實載體同源整合入mu基因中。當(dāng)與探針A雜交時，用Bgl I、BstX I和EcoR I消化的野生型DNA的Southern印跡分別產(chǎn)生15.7、7.3和12.5kb的片段，而mu等位基因的存在分別通過7.7、6.6和14.3kb的片段顯示。通過Spe I消化探測的所有3個陽性克隆均顯示預(yù)期的Bgl I、BstX I和EcoR I限制片段，該片段是neo盒插入到Cmu1外顯子中的診斷性片段。
帶有突變的mu基因的小鼠的生成如Bradley所述，將稱為264、272和408號的3個導(dǎo)向的ES克隆解凍并注射入C57BL/6J胚泡中(Bradley，A.(1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsa PracticalApproach.(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，第113-151頁)。將注射的胚泡轉(zhuǎn)移到假孕雌性的子宮中，以生成表現(xiàn)為源自輸入的ES細胞和宿主胚泡的混合物的嵌合小鼠。ES細胞對嵌合體的貢獻程度可通過黑色C57BL/6J背景上源自ES細胞系的野灰色皮毛顏色而進行可視的估計?？寺?72和408僅產(chǎn)生低百分比的嵌合體(即，低百分比的野灰色色素)，但克隆264產(chǎn)生高百分比的雄性嵌合體。使這些嵌合體與C57BL/6J雌性交配，生成了野灰色的子代，顯示ES細胞基因組的種系傳播。通過來自尾巴活體解剖Bgl I消化的DNA的Southern印跡分析進行對導(dǎo)向的mu基因的篩選(如上文對ES細胞DNA的分析所述)。約50％的野灰色子代顯示除15.7kb野生型條帶之外的7.7kb雜交性Bgl I條帶，從而證明導(dǎo)向的mu基因的種系傳播。
對轉(zhuǎn)基因小鼠mu基因功能失活的分析為了確定neo盒插入到Cmu1中是否使Ig重鏈基因失活，使克隆264嵌合體與對JHD突變純合的小鼠交配，該突變使由于JH基因段的缺失而使重鏈表達失活(Chen等人，(1993)Immunol.5647-656)。生成了4個野灰色子代。從1月齡的這些動物獲得血清，并通過ELISA測定鼠IgM的存在。4個子代中的2個完全缺乏IgM(參見表1)。通過Bgl I消化并與探針A雜交(參見圖1)及通過Stu I消化并與475bp的EcoR I/Stu I片段雜交(如上)的來自尾巴活體解剖的Southern印跡分析對4個動物的基因分型證明不能表達血清IgM的動物是如下動物，其中重鏈基因座的一個等位基因帶有JHD突變，另一個等位基因帶有Cmu1突變。對JHD突變雜合的小鼠顯示野生型水平的血清Ig。這些數(shù)據(jù)證明Cmu1突變使mu基因的表達失活。
表1
表1顯示如下小鼠的通過ELISA探測的血清IgM水平，即帶有CMD和JHD突變兩者的小鼠(CMD/JHD)，對于JHD突變雜合的小鼠(+/JHD)，野生型(129Sv×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)和對于JHD突變純合的B細胞缺陷型小鼠(JHD/JHD)。
II.HCO12轉(zhuǎn)基因小鼠的生成HCO12人類重鏈轉(zhuǎn)基因通過共同注射80kb的pHC2插入片段(Taylor等人，1994，Int.Immunol.，6579-591)和25kb的pVx6插入片段生成。質(zhì)粒pVx6如下所述進行構(gòu)建。
將8.5kb的Hind III/Sal I DNA片段亞克隆入質(zhì)粒載體pSP72(Promega，Madison，WI)中以生成質(zhì)粒p343.7.16，該DNA片段包含人類種系VH1-18(DP-14)基因及約2.5kb的5’側(cè)翼的和5kb的3’側(cè)翼的基因組序列。將7kb的BamH I/Hind III DNA片段克隆入基于pBR322的質(zhì)?？寺≥d體pGPlf(Taylor等人，1992，Nucleic AcidsRes.206287-6295)中以生成質(zhì)粒p251f，該DNA片段包含人類種系VH5-51(DP-73)基因及約5kb的5’側(cè)翼的和1kb的3’側(cè)翼的基因組序列。將源自pGPlf的新克隆載體pGPlk用EcoR I/BamH I消化，并與10kb的EcoR V/BamH I DNA片段連接，該DNA片段包含人類種系VH3-23(DP47)基因及約4kb的5’側(cè)翼的和5kb的3’側(cè)翼的基因組序列。將結(jié)果所得的質(zhì)粒p112.2RR.7用BamH I/Sal I消化，并與7kb純化的BamH I/Sal I p251f插入片段連接。將結(jié)果所得的質(zhì)粒pVx4用Xho I消化，并與8.5kb的Xho I/Sal I p343.7.16插入片段連接。
獲得了具有與其他2個V基因方向相同的VH1-18基因的克隆。然后用Not I消化稱為pVx6的該克隆，并如Hogan等人所述，將純化的26kb插入片段和純化的80kb pHC2的Not I插入片段以1∶1的摩爾比共注射入半日的(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎原核中(B.Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，第2版，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，PlainviewNY)。從來自注射的胚胎發(fā)育的小鼠中確立了包含來自Vx6和HC2的序列的3個轉(zhuǎn)基因小鼠獨立品系。將這些品系稱為(HCO12)14881、(HCO12)15083和(HCO12)15087。然后使這3個品系與包含描述于實施例1中的CMD突變、JKD突變(Chen等人，1993，EMBO J.12811-820)和(KCo5)9272轉(zhuǎn)基因(Fishwild等人，1996，NatureBiotechnology 14845-851)的小鼠交配。結(jié)果所得的小鼠在對于內(nèi)源小鼠重鏈和κ輕鏈基因座的破壞純合的背景上，表達人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈轉(zhuǎn)基因。
III.抗CD30的HuMab的生產(chǎn)抗人類CD30的人類單克隆抗體在如上所述生成的轉(zhuǎn)基因小鼠中生產(chǎn)如下。
抗原將可溶性CD30與完全弗氏(Sigma F5881)佐劑混合以進行第一次免疫接種。然后，將抗原與不完全弗氏佐劑(Sigma F5506)混合。應(yīng)用乳化針將100μL PBS中的25微克CD30與佐劑進行1∶1的混合。將0.2毫升(cc)制備的抗原注射入小鼠腹膜內(nèi)腔中。
轉(zhuǎn)基因小鼠將小鼠置于過濾筐中，并進行估計以使其在免疫接種、出血日期和融合日處于良好的生理狀況。
免疫接種程序?qū)⑿∈笥萌缦陆M合進行免疫接種，即一次腹膜內(nèi)注射完全弗氏佐劑中的L540細胞，和隨后每隔14日腹膜內(nèi)注射不完全弗氏佐劑中的可溶性重組CD30。將發(fā)展了抗表達CD30的細胞系L540的抗-CD30效價的動物在融合前72小時靜脈內(nèi)注射可溶性重組CD30。收獲、純化并融合小鼠脾細胞。雜交瘤制備將P3 X63 ag8.653鼠骨髓瘤細胞系(ATCC CRL 1580，lot F-15183)用于融合。將最初的ATCC小瓶解凍，并在培養(yǎng)基中擴張。從該擴張中制備冷凍小瓶的原種。將細胞在培養(yǎng)基中維持3-6月，每周傳代2次。將P388D1(ATCC TIB-63 FL)擴張為200mL并使其衰竭。將上清液沉淀且過濾，并用作稱為條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基添加物。將該細胞系傳代3-6個月，然后解凍一個新瓶。
將含有5％ FBS和青霉素-Strepatientomycin(Cellgro#30004030)的高葡萄糖DMEM(Mediatech，Cellgro#10013245)用于培養(yǎng)骨髓瘤和P388D1細胞。將含有5％ FBS和青霉素-Strepatientomycin(Cellgro #30004030)的高葡萄糖DMEM(Mediatech，Cellgro #10013245)用于培養(yǎng)骨髓瘤和P388D1細胞。向雜交瘤生長培養(yǎng)基中添加額外的培養(yǎng)基補加物，包括3％ Origen-雜交瘤克隆因子(Igen，36335)、10％ P388D1條件培養(yǎng)基(8/10/99DH)、10％ FBS(Hyclone，SH30071 lot #AGH6843)、L-谷氨酰胺(Gibco#1016483)、0.1％艮他霉素(Gibco #1020070)、2-巰基乙醇(Gibco#1019091)、HAT(Sigma，H0262)、1.0×104M次黃嘌呤、4.0×10-7M Aminopatienterin、1.6×10-5M胸腺嘧啶核苷或HT((Sigma，H0137)、1.0×10-4M次黃嘌呤、1.6×10-5M胸腺嘧啶核苷)。
使雜交瘤能夠生長超過1周，直到確立了可見的群體。收獲上清液，并將其用于通過ELISA應(yīng)用人類κ鏈特異性捕獲和人類Fc特異性探測對人類IgG進行初始篩選。然后通過流式細胞儀應(yīng)用L540細胞和CD30 ELISA測定IgG陽性上清液。
將產(chǎn)生特異性HuMab IgG的雜交瘤亞克隆并擴張。然后應(yīng)用如下程序通過A蛋白柱層析純化HuMab(1)加載條件將上清液加載在5ml用磷酸緩沖鹽水(PBS)平衡的A蛋白柱上；(2)洗滌PBS緩沖液；(3)洗脫pH 2.9的具有150mM NaCl的0.1M甘氨酸。將洗脫液用1M Tris緩沖液進行中和(每2ml組分用30μl)。在集合之前將每一種洗脫的組分進行凝膠電泳。一旦通過考馬斯染色證實了純度，則將組分集合，并用150mM pH 7.2的NaCl對10mM磷酸鈉緩沖液進行透析。該規(guī)程導(dǎo)致3種目標(biāo)抗體的分離17G1-1、5F11和2H9。
從來自雜交瘤的RNA分離HuMab 17G1-1、5F11和2H9的VH和VL區(qū)，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將V區(qū)用PCR進行擴增，且對PCR產(chǎn)物進行測序。
實施例2 結(jié)合研究I.HuMab 5F11的親和力和速度常數(shù)的確定材料(1)2個克隆HuMab 5F11的IgG形式樣品(Medarex，Inc.，Annandale，N.J.)。
(2)人類CD30抗原(Medarex，Inc.，Annandale，N.J.)。
(3)抗人類CD30/TNFRSF8多克隆抗體(R&D Systems；catalogno.AF229)。
(4)CM5芯片、偶聯(lián)緩沖液10mM乙酸鹽緩沖液，pH 6.0(CD30偶聯(lián))和pH 3.5(A蛋白偶聯(lián))，再生緩沖液10mM HCL。
(5)Biacore 3000，BiaEval軟件3.0.1版。
A蛋白偶聯(lián)應(yīng)用氨基偶聯(lián)化學(xué)將A蛋白(Fc2，2367Rus，注射時間10分鐘，流速5μL/分鐘，pH 3.5)偶聯(lián)在CH5芯片上。
結(jié)合研究將HuMab 5F11(1μL/mL)在A蛋白表面捕獲2.5分鐘。(在獨立的實驗中，在G蛋白芯片上未捕獲顯著量的抗體)。在兩個實驗進行中，使不同濃度范圍的CD30經(jīng)過捕獲的抗體。實驗1的濃度范圍包括10、6.67、3.33和1.67μL/mL；實驗2包括5、4、2、1和0.5μL/mL。結(jié)合階段持續(xù)10分鐘，隨后為10分鐘的解離階段。使數(shù)據(jù)符合朗繆爾結(jié)合模型，以確定各種參數(shù)，如下表所示。
表2
捕獲的抗體表面的穩(wěn)定性將HuMab 5F11(1μL/mL)在A蛋白表面捕獲2.5分鐘。使緩沖液流動1.5小時以模擬CD30抗原的結(jié)合和解離階段，以檢查捕獲的抗體表面是否穩(wěn)定。對于5F11，在整個實驗期間顯示了表面水平未改變(＜0.1％)的穩(wěn)定表面。因此，5F11樣品顯示對CD30抗原相似的親和常數(shù)，且捕獲的抗體表面是穩(wěn)定的，可進行進一步的結(jié)合研究。
II.HuMab與重組CD30的劑量依賴性結(jié)合如下所述，通過捕獲ELISA應(yīng)用商業(yè)上可購得的鼠抗-CD30抗體BER-H2(DAKO Corp.，Carpenteria，CA)研究選擇的HuMab與重組CD30結(jié)合的能力。
將微量滴定板的孔用BerH2包被。在用5％BSA溶液阻斷孔后，使得來自轉(zhuǎn)染的表達重組CD30細胞的上清液與BER-H2包被的孔進行反應(yīng)。去除上清液，并使不同濃度的A蛋白純化的HuMab 5F11、2H9、17G1和同種型對照與CD30-結(jié)合的孔在37℃進行溫育。1小時后，用PBS-tween洗滌孔，并通過使細胞與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗人類IgGFc-特異性探針在37℃進行溫育而探測結(jié)合的抗體。從孔中將過量的探針洗滌除去，并用pNPP顯影液使平板顯影。應(yīng)用微量滴定板讀數(shù)器確定405nm的光密度。
如圖1所示，抗-CD30 HuMab而不是同種型對照顯示劑量依賴性結(jié)合。這顯示抗-CD30 HuMab特異性地識別重組CD30?？?CD30 HuMab與CD30結(jié)合中量的差異顯示5F11、2H9和17G1是獨特的抗體，這是因為結(jié)合中量的差異可能是由于親和力差異和在重組形式CD30的識別中的差異。
III.HuMab與L540的劑量依賴性結(jié)合如下所述，通過流式細胞儀研究抗-CD30 HuMab與何杰金氏腫瘤細胞上的CD30結(jié)合的能力。
對抗體與L540的結(jié)合進行檢驗，該L540是一種表達高水平CD30的何杰金氏淋巴瘤細胞系。使A蛋白純化的HuMab 5F11、2H9、17G1和同種型對照以不同濃度與L540細胞系在4℃進行溫育。1小時后，用PBS洗滌細胞，并通過使細胞與FITC標(biāo)記的山羊抗人類IgG Fc-特異性探針在4℃進行溫育而探測結(jié)合的抗體。從細胞中用PBS將過量的探針洗滌除去，并通過應(yīng)用FACScalibur設(shè)備的分析確定細胞結(jié)合的熒光。
如圖2所示，HuMab 5F11、2H9和17G1顯示與L540細胞高水平的結(jié)合，且在低于1μg/ml的濃度達到飽和。這些數(shù)據(jù)證明這些抗體有效且特異性地與活腫瘤細胞上表達的天然CD30結(jié)合。
IV.表位作圖已顯示CD30含有至少3個命名為A、B和C的血清學(xué)限定的聚簇。為了確定HuMab 5F11結(jié)合哪個聚簇，研究了對聚簇A(Ki4和BerH2)、聚簇B(Ki-1)或聚簇C(AC10)特異性的鼠抗體抑制FITC-標(biāo)記的5F11與L540細胞結(jié)合的能力。簡言之，使L540細胞同時與FITC-5F11連同10-20倍的未標(biāo)記的抗體在冰上溫育60分鐘。洗滌細胞并通過FACS進行分析。所有阻斷性抗體均為鼠來源的，且在其飽和濃度的10-倍過量水平應(yīng)用。5F11 HuMab(1μg/ml)是異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的，且與CD30的結(jié)合通過熒光激活細胞分選儀(FACS)流式細胞計(FACScan，Becton Dickinson，Heidelberg，德國)確定。將一級抗體在冰冷的含有0.2％牛血清清蛋白和0.02％疊氮化鈉(染色緩沖液)的磷酸緩沖鹽水(PBS)中稀釋，與1×105的L540細胞和5F11-FITC mAb在冰上溫育60分鐘。
如圖14所示，與聚簇A結(jié)合的抗體能夠抑制FITC-5F11與L540細胞的結(jié)合，而與聚簇B或C結(jié)合的抗體不能，從而顯示5F11與聚簇A表位結(jié)合或靠近聚簇A表位結(jié)合。
實施例3 抗體依賴性細胞毒性(ADCC)研究I.HuMab對L540何杰金氏腫瘤細胞的單核細胞介導(dǎo)的抗體依賴性細胞毒性應(yīng)用健康人類單核細胞的51Cr-釋放測定對抗-CD30 HuMab介導(dǎo)表達CD30的細胞裂解的能力進行了研究。在培養(yǎng)物中用IFN-γ活化健康人類單核細胞，以增量調(diào)節(jié)Fc受體和細胞溶解活性。將L540細胞用作由IFN-γ-活化的單核細胞進行裂解的目標(biāo)。將從正常成人來源的leukopacs純化的單核細胞(Biological Specialty Corp.，PA)在巨噬細胞無血清培養(yǎng)基(M-SFM，Gibco，Grand Island，NY)上培養(yǎng)2日，該培養(yǎng)基補充了10％FBS和IFN-γ(1000u/ml，R&D Systems，Minneapolis，MN)。在U-底的微量滴定板上與效應(yīng)細胞(E∶T＝50∶1)和HuMab組合之前，將目標(biāo)細胞用100μCi的51Cr標(biāo)記1-2小時。于37℃溫育16小時后，收集上清液，并分析放射性。細胞毒性通過如下公式計算％裂解＝(實驗的CPM-目標(biāo)泄露(target leak)CPM)/(去污劑裂解CPM-目標(biāo)泄露CPM)×100％。特異性裂解＝具有HuMab的裂解％-不具有HuMab的裂解％。將測定進行3次。
如圖3所示，與同種型對照相比，HuMab 5F11、2H9和17G1介導(dǎo)何杰金氏腫瘤來源的L540細胞的特異性裂解。結(jié)果證明這些HuMab能夠?qū)⒈磉_CD30的腫瘤細胞導(dǎo)向于效應(yīng)細胞，以進行Fc受體介導(dǎo)的裂解。
II.HuMab對L540何杰金氏腫瘤細胞的單核的細胞介導(dǎo)的抗體依賴性細胞毒性應(yīng)用新鮮人類單核的細胞的51Cr-釋放測定對抗-CD30 HuMab介導(dǎo)表達CD30的細胞裂解的能力進行了研究。
將L540細胞用作由新鮮人類單核的細胞進行裂解的目標(biāo)。單核的細胞通過ficoll hypaque密度離心從肝素化的全血中純化。在U-底的微量滴定板上與效應(yīng)細胞以各種效應(yīng)細胞目標(biāo)細胞比例和與HuMab(5μg/ml)組合之前，將目標(biāo)細胞用100μCi的51Cr標(biāo)記1-2小時。于37℃溫育4小時后，收集上清液，并分析放射性。細胞毒性通過如下公式計算％裂解＝(實驗的CPM-目標(biāo)泄露CPM)/(去污劑裂解CPM-目標(biāo)泄露CPM)×100％。特異性裂解＝具有HuMab的裂解％-不具有HuMab的裂解％。將測定進行3次。
如圖4所示，與同種型對照相比，HuMab 5F11和17G1介導(dǎo)何杰金氏腫瘤來源的L540細胞的特異性裂解。結(jié)果證明這些HuMab能夠?qū)⒈磉_CD30的腫瘤細胞導(dǎo)向于未活化的效應(yīng)細胞，最可能導(dǎo)向于天然殺傷細胞(NK)，以進行Fc受體介導(dǎo)的裂解。
實施例4 HuMab 5F11的生長抑制在96孔平板上由山羊抗人類IgG(GAH-IgG)抗體(10倍過量)使可溶性HuMab 5F11抗體(0.1、1和10μg/ml)與2×104細胞/孔(L540、L1236、Karpas 299、L428、BL38)交聯(lián)。在37℃和5％ CO2中溫育96小時后，應(yīng)用XTT測定確定生長抑制，其中XTT即產(chǎn)色的四氮唑鹽(鈉3’-[1-[(苯基氨基)-羰基]-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯-磺酸水合物)。簡言之，將具有或不具有10-倍過量的GAH-IgG的各種HuMab 5F11稀釋物分配在96-孔平板的100μl等分試樣中。添加100μl完全培養(yǎng)基等分試樣中2-4×104的目標(biāo)細胞(L540、L1236、Karpas 299)，并在37℃和5％ CO2空氣中溫育48小時。然后用100μl新鮮培養(yǎng)基對細胞培養(yǎng)物脈沖4小時，該新鮮培養(yǎng)基補充了XTT和N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸鹽(終濃度分別為1.49mM和0.025mM)。應(yīng)用ELISA讀數(shù)器(MWG Biotech，Ebersberg，德國)測量樣品在450nm和650nm(參考波長)的分光光度吸收值。陰性對照的測量僅應(yīng)用GAH-IgG和上述目標(biāo)細胞，且應(yīng)用HuMab 5F11和CD30陰性細胞系(BL38)上的交聯(lián)抗體GAH-IgH。相對于未處理的對照培養(yǎng)物的細胞生存力用公式檢驗值/未處理的*100計算。所有測量均進行3次，并重復(fù)2次。具體而言，應(yīng)用下面的對照(1)無二級交聯(lián)抗體；(2)僅有二級交聯(lián)抗體；(3)無抗體的細胞；和(4)僅有XTT。
T-細胞如HD細胞L540和Karpas 299細胞顯示對細胞代謝的清楚的劑量依賴作用，而B-細胞如HD細胞L428和L1236不顯示該作用。在10μg/ml的最高濃度達到了IC50，提示細胞毒性作用是中等的(參見圖5)。這并不是一種假象，因為單獨的GAH-IgG和5F11均不顯示任何作用，且活性限制于L540和Karpas 299細胞。
實施例5 HuMab 5F11的體內(nèi)活性局部性腫瘤模型在體內(nèi)應(yīng)用異種移植的小鼠模型對HuMab 5F11抑制表達CD30的腫瘤細胞生長的能力進行檢查。通過將重懸于200μL PBS中的L540CY細胞(1×107)注射入SCID小鼠的右協(xié)腹中而確立皮下實體L540CY腫瘤。每隔3日對腫瘤發(fā)展進行測量，且腫瘤體積用公式(長*寬*高)/2確定。具有確立的最大直徑為4～6mm的腫瘤的動物隨機分為不同的組，并每隔4日接受100μg 5F11(在200μL PBS中，腹膜內(nèi))，總共為4次注射。對照小鼠僅接受PBS。當(dāng)對照組中的腫瘤直徑中值超過20mm(第107日)時，停止實驗并處死小鼠。治療和各自由5個動物組成的對照組和結(jié)果由第二組實驗證實。
每隔4日在腹膜內(nèi)4次施用HuMab 5F11。在治療第1日靜脈內(nèi)施用1次外周血淋巴細胞(PBL)。結(jié)果表示為腫瘤體積對以日表示的時間的圖(圖6)。單獨施用的PBL對腫瘤生長具有影響，但添加抗體可增強該作用。抗體單獨顯示相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性(圖6)。這些結(jié)果證明單獨施用或與人類PBL組合施用的HuMab 5F11能夠抑制動物模型中表達CD30的腫瘤細胞的生長。
彌散性腫瘤模型在無病原體的條件下維持無病原體的雌性C.B-17/Icr SCID小鼠(FOX CHASE SCID，M & B A/S，Ry，丹麥)，并飼喂高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)食物和水。將彌散性模型用于估計HuMab 5F11治療對用人類HL細胞L540CY攻擊的SCID小鼠存活力的作用。對于彌散性模型，將1×107指數(shù)生長的L540CY細胞通過尾部靜脈(靜脈內(nèi))注射入3～4周齡的SCID小鼠中。注射L540CY細胞后1日，使小鼠每隔4日在腹膜內(nèi)(ip)接受在200μl PBS中稀釋的100μg 5F11，總共為4次注射。對照組包括僅僅PBS、5F11+10倍過量的GAH-IgG mAb和應(yīng)用相同治療方案的單獨GAH-IgG mAb。將具有漸進性疾病病征(波緣的皮毛、失活、頭骨畸形)的小鼠處死。總體檢查后，將肉眼可見的L540CY細胞浸潤的器官用福爾馬林固定。將存活到200日的動物殺死，并用福爾馬林固定主要器官以進行進一步的檢查。
如由Kaplan-Meier分析所記錄的(圖15)，PBS治療的對照組的平均存活時間為43日(范圍為40-46日)，而GAH-IgG治療的組為39日(范圍為15-51日)。在5F11治療組中，3/5小鼠是長期存活的(139日)，且在尸體解剖中未顯示疾病病征。一個動物在第17日死亡，而未發(fā)展任何肉眼可見的疾病病征，提示死亡的原因與腫瘤無關(guān)。第二只小鼠在第57日死于漸進性疾病。在與GAH-IgG mAb交聯(lián)后，4/4小鼠未發(fā)展任何腫瘤病征，并于第200日處死。因而，在該HL異種移植模型中，用HuMab 5F11的治療對于高百分比的動物是有療效的(對于5F11+GAH-IgG和5F11治療組分別為p＝0.01和p＝0.046)。
實施例6 熒光素化的HuMab 5F11與正常人類組織的交叉反應(yīng)性為了估計HuMab 5F11的熒光素化形式與正常人類組織冷凍切片的交叉反應(yīng)性，應(yīng)用了間接的免疫過氧化物酶方法。未觀察到出乎意料的交叉反應(yīng)性。
該研究根據(jù)食品和藥物管理實驗室實踐(GLP)規(guī)定(Food and DrugAdministration’s Laboratory Practice(GLP)Regulations)(21CFR Part 58)進行。人類組織實驗組包括EC CPMP Guideline III/5271/94附件II中“建議用于交叉反應(yīng)性免疫組織化學(xué)研究的人類組織列表(suggested list of human tissues to be used forimmunohistochemical investigations of cross reactivity)”上的組織和在1997 US FDA/CBER“在制造和檢驗用于人類的單克隆抗體中考慮的要點(Points to Consider in the Manufacture andTesting of Monoclonal Antibody Products for Human Use)”中建議的組織。
將以前通過尸體解剖或外科活體解剖獲得的組織在Tissue-TekO.C.T.基質(zhì)中包埋，并在干冰上冷凍。將組織以約5μm進行切片，并于室溫在丙酮中固定10分鐘。將檢驗項目以兩種濃度(2和10μg/mL)應(yīng)用于載玻片，并將間接的免疫過氧化物酶方法(DakoEnVision Kit)用于探測結(jié)合。
結(jié)果顯示檢驗項目HuMab 5F11-FITC特異性地對陽性對照表達CD30的L540細胞的膜、何杰金氏病衍生的細胞系以及人類扁桃體中陽性對照表達CD30的淋巴細胞的膜進行染色。與陽性對照冷凍切片的反應(yīng)性在兩種檢查的濃度(10μg/mL和2μg/mL)均是非常強的。在人類扁桃體中，CD30-陽性細胞位于濾泡外周以及濾泡間區(qū)域附近，并代表了低于1-2％的扁桃體細胞。
對人類實驗組織組的檢查顯示在除人類扁桃體之外的任何組織中未觀察到交叉反應(yīng)性。在所有3個檢查的供體中，在位于濾泡外周以及濾泡間區(qū)域附近的淋巴細胞/單核的細胞中觀察到了反應(yīng)性。少于1％的扁桃體細胞被染色。該反應(yīng)性是基于以前對CD30的扁桃體表達的報道預(yù)測的(Hecht等人，1985)。
實施例7 抗體測序如上文實施例1所述，通過A蛋白柱層析純化了來自產(chǎn)生特異性HuMab IgG的雜交瘤的HuMab，這導(dǎo)致了3種目標(biāo)抗體的分離17G1-1、5F11和2H9。隨后從質(zhì)粒RNA中分離了HuMab 17G1-1、5F11和2H9的VH和VL區(qū)，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將V區(qū)通過PCR進行擴增，并將PCR產(chǎn)物測序。下面是HuMab的VH和VL區(qū)的核酸和氨基酸序列。
17G1 VH核酸序列GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTCTTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACGAAGATGGAAGTGAGAAATTCTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCGAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGTTCATTGGTACTTCCATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQ ID NO1)17G1 VH氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSNSWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSEKFYVDSVKGRFTFSRDNAENSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVHWYFHLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO2)17G1 VL核酸序列GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQ ID NO3)17G1 VL氨基酸序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO4)2H9 VH核酸序列
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAAGTACACCCCGTCCCTCAAGAGCCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGCACCAATTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGACTGTCTACTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQ ID NO5)2H9 VH氨基酸序列QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTKYTPSLKSRVTISVDTSKHQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETVYYFDLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO6)2H9 VL核酸序列GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTAAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGCTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGCGTAGCAACTGGCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQ ID NO7)2H9 VL氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARLSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO8)5F11 VH核酸序列CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGCTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGACATCAATCATGGTGGAGGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTAACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGCCTAACTGCCTACTGGGGCCAGGGAAGCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNQ9)5F11 VH氨基酸序列QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSAYYWSWIRQPPGKGLEWIGDINHGGGTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCASLTAYWGQGSLVTVSS(SEQ ID NO10)
5F11 VL核酸序列GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAACCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAACCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATAGTTACCCTATCACCITCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA(SEQ ID NO11)5F11 VL氨基酸序列DIQMTQSPATIENTSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLTWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSYPITFGQGTRLEIK(SEQ D NO12)實施例8 對人類何杰金氏病(HD)的CD30介導(dǎo)的治療由于引入多化學(xué)療法方案如MOPP或ABVD及改進的放射技術(shù)(Devita VT，Jr.等人，Ann Intern Med 73881(1970)；BonadonnaG等人，Cancer Treat Rep 66881(1982)；Kaplan H.S.Cancer452439(1980))，何杰金氏病(HD)已成為可以治愈的疾病。最近，應(yīng)用由German Hodgkin’s Lymphom Study Group(Diehl V等人，J Clin Oncol 163810(1998))確立的BEACOPP-方案后，晚期疾病患者顯示改善的反應(yīng)和存活率。然而，盡管大多數(shù)患者可通過標(biāo)準(zhǔn)方法治愈，但那些復(fù)發(fā)患者中低于30％的在第二線治療后可達到持久無疾病的減輕(Carella A.M.等人，Leuk Lymphoma 7增刊21(1992))。對于那些患有原發(fā)性難治疾病的患者結(jié)果更差(Linch D.C.等人，Lancet 3411051(1993))。
來自何杰金氏病以及其他惡性疾病的數(shù)據(jù)提示在第一線治療后剩余的少數(shù)殘留的腫瘤細胞可引起晚期的復(fù)發(fā)，該惡性疾病包括結(jié)腸直腸癌、骨髓白血病或非何杰金氏淋巴瘤(NHL)(Kanzler H等人，Blood873429(1996)；Wolf J等人，Blood 873418(1996)；RiethmullerG等人，Lancet 3431177(1994)；Roy D.C.Blood 772404(1991)；Gribben J.G.等人，N Engl J Med 3251525(1991))。因而，在第一線治療后消除殘留的何杰金氏-Reed/Sternberg(H-RS)細胞可進一步改善HD中的結(jié)果。已對用于治療HD患者的許多不同單克隆進行了估計，包括抗體-毒素構(gòu)建體(免疫毒素)、放射免疫偶聯(lián)物和未修飾的單克隆抗體。(Herpst J.M.等人，J Clin Oncol 132394(1995)；Schnell R.等人，Leuk Lymphoma 30525(1998)；Engert A.等人，Blood 89403(1997)；Schnell R.等人，已提交，(2001))。作為可能的替代物，雙特異性抗體令人注意地可用作HD中的免疫試劑。通常，雙特異性抗體已顯示是良好耐受的。然而，這些構(gòu)建體的副作用和細胞毒性潛力主要依賴于導(dǎo)向的效應(yīng)細胞。
迄今為止，大多數(shù)雙特異性抗體包括淋巴細胞或NK細胞的不同亞群，它們在惡性疾病且特別是HD患者中是低效的(Hartmann F.等人，Blood 892042(1997))。因而，構(gòu)建了一種新的基于高親和力FcγRI受體(CD64)的雙特異性分子(雙特異性分子)，該受體在活化的嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞上表達(Ravetch J.V.等人，Annu Rev Immunol 9457(1991))。CD64充當(dāng)對表達FcγRI的細胞毒性效應(yīng)細胞的觸發(fā)分子。單體IgG和IgG-抗原復(fù)合物均與FcγRI結(jié)合。僅有IgG-抗原復(fù)合物與FcγRI的結(jié)合導(dǎo)致增加的細胞毒性活性，包括細胞溶解、呼吸爆發(fā)和氧化性酶的產(chǎn)生(Fanger M.W.等人，Immunol Today 1092(1989)；van de Winkel J.G.等人，J Leukoc Biol 49511(1991))。
鼠單克隆抗體M22在正常Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域外部的表位結(jié)合FcγRI，從而避免與血清IgG的競爭(Guyre P.M.等人，J Immunol 1431650(1989))。用于構(gòu)建本發(fā)明報道的新雙特異性分子的結(jié)合單位基于稱為H22的抗-CD64單克隆抗體M22的人源化形式(Graziano R.F.等人，J Immunol 1554996(1995))。H22F(ab’)片段與源自抗CD30單克隆抗體Ki-4的F(ab’)片段化學(xué)連接。結(jié)果所得的雙特異性分子H22xKi-4具有104kDa的分子量，因而使得與完整抗體相比具有更好的腫瘤穿透力。此外，該類構(gòu)建體不活化補體或與表達Fc-受體的非細胞毒性細胞結(jié)合，從而導(dǎo)致最小的副作用(Fanger M.W.等人，Crit Rev Immunol 12101(1992))。
H22xKi-4的臨床前體外檢驗證明該雙特異性分子介導(dǎo)與單核細胞結(jié)合的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及與源自單核細胞的巨噬細胞結(jié)合的吞噬作用(MDM)(Sundarapandiyan K.等人，J Immunol Methods248113(2001))。因而，CD64是用于在HD中募集免疫活性效應(yīng)細胞的有希望的目標(biāo)。進行了下面的I期臨床研究，以證明該新治療性雙特異性分子在HD患者中的功效。
I.患者和方法患者符合條件的患者具有可測量的和活性的晚期難治的HD，該HD不能由常規(guī)化學(xué)療法改善。在≥30％從腫瘤活體解剖獲得的H-RS細胞中通過與抗-CD30的反應(yīng)性記錄了CD30抗原的存在，該活體解剖在用H22xKi-4治療前1年中進行。以前的化學(xué)療法或放射療法必須在研究藥物施用前4周完成。此外，必須滿足如下條件存在可客觀測量的疾病位點、2或更低的世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)(WHO)表現(xiàn)狀態(tài)、18～70歲的年齡、至少3個月的生命期望、低于2mg/100ml的血清-肌酸酐、超過低限的75％的血清清蛋白、通過超聲波心動描記法測量的基線左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)大于35％的心臟功能，和沒有其他主要的醫(yī)學(xué)問題。伴隨的皮質(zhì)類固醇治療不是被排除的準(zhǔn)則，因為漸進性HD患者常需要皮質(zhì)類固醇治療。該規(guī)程由制度上的道德委員會批準(zhǔn)，且患者必須簽署對治療研究特性的書面同意書。研究設(shè)計該臨床實驗是開放標(biāo)記的(open-label)非隨機I期劑量增加性研究。主要目的是確定當(dāng)通過靜脈內(nèi)輸注施用時，人類中H22xKi-4的最大耐受劑量(MTD)。第二個目的包括藥物代謝動力學(xué)、劑量限制性毒性(DLT)、生物學(xué)最適劑量和任何抗腫瘤活性?；颊呓邮苤辽賰蓚€各自由4次輸注組成的療程。H22xKi-4分別在第1、3、5和7日施用。根據(jù)單個研究者對患者反應(yīng)的判斷添加額外的療程。
劑量增加和主要毒性規(guī)則最大耐受劑量(MTD)定義為緊在由毒性限制的劑量下的最高劑量水平。該劑量通過在3個或6個患者的至少2個中DLT的出現(xiàn)進行限定。6個患者均必須在MTD進行治療。MTD應(yīng)用如下加速的滴定設(shè)計進行估計雙步驟(100％)的劑量增加，其中每個同齡組中一個患者處于加速階段，直到觀察到任何療程中的第一個DLT例子，或者觀察到任何療程II級毒性的第二個例子為止(Simon R.等人，J Natl CancerInst 891138(1997))。然后，必須將目前劑量水平的同齡組擴展到至少3個患者，并將標(biāo)準(zhǔn)修飾的費氏(Fibonacci)劑量增加方案(具有50％的劑量增加)用于所有隨后的劑量水平。未斷定與研究藥物相關(guān)的不利事件根據(jù)這些劑量增加規(guī)則和確定MTD的規(guī)則不認(rèn)為是毒性。劑量組如下1.0mg/m2/d、2.5mg/m2/d、5mg/m2/d、10mg/m2/d和20mg/m2/d。不管毒性的缺乏，在20mg/m2/d的劑量水平上總共登記了6個患者。DLT定義為任何III或IV級非血液學(xué)毒性(根據(jù)NCI準(zhǔn)則)或IV級血液學(xué)毒性，不包括淋巴細胞減少、單核細胞減少或嗜中性粒細胞減少。如果已完成了以前劑量水平的H22xKi-4第三次施用而無DLT，那么患者可開始下一個劑量水平。在輸注中的每一個小時和其后6小時中控制至關(guān)重要的病征。每周對患者進行監(jiān)控，包括根據(jù)WHO準(zhǔn)則的全血細胞計數(shù)、生物化學(xué)、尿狀況、表現(xiàn)狀況和毒性估計。在每一個療程的第28日，重復(fù)基線估計，包括心電描記術(shù)、胸部x-射線、超聲波心動描記法、肺功能檢驗、血清肌酸酐和腫瘤反應(yīng)估計。
藥物配制和施用H22xKi-4應(yīng)用Glennie如前文所述的方法生產(chǎn)(Glennie M.J.等人，J Immunol 1392367(1987))。藥物在含有1mg/ml H22xKi-4的10ml無菌小瓶中提供，并必須貯存于4℃。在每次輸注前，使患者接受總劑量10％或0.2mg(兩者取較小的)H22xKi-4的初始檢驗劑量，該H22xKi-4溶于50ml生理鹽水中并在10分鐘內(nèi)于靜脈內(nèi)施用。然后，在接受最終劑量的H22xKi-4之前30分鐘，用口服1000mg對乙酰氨基酚和口服1mg氯馬斯汀對患者進行前驅(qū)用藥。如果在30分鐘后，該檢驗劑量被耐受，而無任何顯著毒性，則將H22xKi-4在500ml生理鹽水中稀釋，并開始以3mg/小時進行靜脈內(nèi)施用。如果在60分鐘后未注意到不利反應(yīng)，則將輸注速率分別增加到6mg/小時和9mg/小時。
藥物代謝動力學(xué)在H22xKi-4施用的第1日，在下述時間點抽取血液到肝素化的試管中輸注前，緊在輸注后，每一次輸注后第2、4、8、12、24和48小時。通過1,200g旋轉(zhuǎn)10分鐘從血液細胞分離血漿，隨后貯存于-20℃中，直到進行藥物代謝動力學(xué)的分析。H22xKi-4測定的探測限制對于前3個患者為0.125μg/ml，而對于所有隨后的患者為0.04μg/ml。隨時間過去的血漿H22xKi-4濃度數(shù)據(jù)在每一個被試者中H22xKi-4濃度對時間的半對數(shù)圖上進行檢查。Cmax和Tmax值是從原始藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)中觀察到的值。其他標(biāo)準(zhǔn)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)應(yīng)用WinNonlin Pro藥物代謝動力學(xué)程序(Pharsight Corporation，Mountain View，CA.)進行估計。濃度-時間數(shù)據(jù)應(yīng)用開放的非分區(qū)方法(open non-compartmental method)(WinNonlin model 202)進行分析。未期消除速率常數(shù)(ko)通過非分區(qū)分析確定，該分析應(yīng)用末期3-6個點的血漿H22xKi-4濃度對數(shù)對時間作圖的線性回歸，應(yīng)用非加權(quán)的范例。末期消除半衰期(T1/2)從0.693/ke估計。到最后一個數(shù)據(jù)點的AUC應(yīng)用線性梯形法則(linear-trapezoidal rule)進行估計，并通過添加Wagner-Nelson校正(Clast/ke)外推到無窮大?？偵眢w的清除(CL)通過用AUC(0-無窮大)除劑量來計算。表觀分配體積(Vdz)從CL/ke估計。平均滯留期(MRT)從AUMC/AUC估計。穩(wěn)定狀態(tài)的表觀分配體積(Vdss)從方程式Vdss＝CL×MRT估計。累積因子-R從方程式Treat X AUC(0-τ)/Treat 1 AUC(0-∞)估計。其中Treat X AUC(0-τ)是從0到任何治療時給藥間隔的AUC，而AUC(0-∞)是在第1日從0-無窮大的AUC。
生物學(xué)活性的估計由于本發(fā)明雙特異性分子的DLT不大可能發(fā)生，所以研究了生物學(xué)活性的替代參數(shù)。緊在H22xKi-4輸注前后和輸注后第2、4、8和24小時測量了外周血中的單核細胞計數(shù)。CD64-表達通過應(yīng)用適當(dāng)抗體(FACS-Calibur，Becton-Dickinson)的FACS-分析確定，且與同種型對照相關(guān)。在相同的時間點，應(yīng)用商業(yè)上可購得的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒確定了Il-6、Il-15、G-CSF和TNFα的血清水平。然后使治療前的細胞因子水平與用雙特異性分子治療后的那些細胞因子相關(guān)，并應(yīng)用Wilcoxcon-檢驗對顯著性進行檢驗。與雙特異性分子水平的相關(guān)應(yīng)用Pearson系數(shù)進行檢驗。
關(guān)于腫瘤，在每次施用雙特異性分子日期的前后均通過ELISA(DAKO)測量sCD30水平。2個患者同意對最后輸注H22xKi-4后24小時增大的外周淋巴結(jié)進行診斷性活體解剖。將該材料分為兩部分，一部分立即進行新鮮的冷凍并貯存于-80℃，而另一部分包埋在石蠟中。對于免疫組織化學(xué)研究，將組織脫石蠟，切為5μm的切片，并用豬血清阻斷10分鐘，以減少非特異性染色。然后應(yīng)用在PBS中1∶50稀釋的一級單克隆抗體、多克隆兔抗小鼠Ab(DAKO)，并于4℃溫育過夜，隨后為生物素化的豬抗兔抗體(1∶200，于室溫進行45分鐘，E431DAKO)和標(biāo)準(zhǔn)的生物素-鏈霉抗生物素蛋白試劑盒(DAKO)。最后，用固紅(DAKO)對載玻片進行染色。作為第一個陰性對照(無雙特異性分子)，在相同的程序中對來自未在本研究中進行處理的患者的HD標(biāo)本進行染色。第二個陰性對照(以從其他用于染色程序的抗體中排除非特異性交叉反應(yīng)性)是在該實驗中獲得的且未用一級抗體染色的材料。
HABA/HAMA-反應(yīng)人類抗雙特異性分子反應(yīng)應(yīng)用如前文所述的方法確定(PullarkatV.等人，Cancer Immunol Immunother 489(1999))。簡言之，用雙特異性分子包被的微量滴定板與血漿樣品稀釋物溫育，且抗雙特異性分子抗體應(yīng)用堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗(人類IgG)Fc-特異性探針進行探測。HABA-水平表示為在基線輸注前值上x-倍的增加。
反應(yīng)的估計根據(jù)Ann-Arbor分類系統(tǒng)進行階段劃分。完全的減輕(CR)定義為在至少4周的期間內(nèi)不存在活性疾病的任何臨床或放射性證據(jù)。部分的減輕(PR)定義為所有可測量的損害的兩個最大垂直直徑乘積中50％或更多的降低，如由不小于4周間隔的兩次連續(xù)觀察確定的。再次持續(xù)至少4周的小于25％的降低或總腫瘤體積的增加定義為無變化(NC)。漸進性疾病定義為出現(xiàn)任何新的損害，或腫瘤大小中大于25％的增加。
II.結(jié)果患者特征總共包括了10個可以估計的在5個不同劑量水平治療的多次預(yù)治療復(fù)發(fā)的HD患者，其中2個是女性。年齡中值為34.6歲，范圍為21～53歲。組織學(xué)包括3個具有何杰金氏病的混合細胞性的患者和7個具有結(jié)節(jié)性硬化亞型的患者。復(fù)發(fā)數(shù)目中值為3(范圍為1～7)。已施用了中值為4的在前化學(xué)療法(范圍為2～6)，包括在9/10患者中具有自身干細胞支持的高劑量化學(xué)療法。此外，所有患者已用放射療法進行預(yù)治療。在患者組中，分別為7個患者具有IV期疾病，3個患者具有III期疾病，5個患者具有研究登記(study entry)的B-癥狀，而8個患者用2個H22xKi-4療程進行治療，一個患者接受3個而一個患者接受4個治療療程(每個療程均由4次輸注組成)。
毒性在輸注過程中和輸注結(jié)束后6小時中，所有副作用均是瞬時發(fā)生的(參見表2)。在所有10個患者中，均觀察到輕微的疲勞。其他毒性包括輕微低血壓(4個，I級)、心動過速(6個，I級)、發(fā)燒(2個，I級；3個，II級)、寒冷(4個，I級)和肌痛(3個，I級)。所有這些副作用均在24小時中解決。未觀察到血液學(xué)或器官毒性。
藥物代謝動力學(xué)雙特異性分子水平均在那些接受超過5mg/m2/d的患者中可探測。在所有被試者的所有治療日中，Tmax發(fā)生在輸注結(jié)束時或其后。血漿濃度隨時間的衰減對于所有患者均為單指數(shù)的。在Cmax和AUC中存在隨時間增加的趨勢。因此，在一周的時間上對Cmax、T1/2z、AUC、Cl和Vdz進行了單變量、單因子重復(fù)的變異測量分析。該分析揭示了對Cmax(F＝5.885；p＝0.006)和AUC(F＝5.976；p＝0.005)的顯著時間作用。這提示H22xKi-4隨重復(fù)的給藥而累積(參見圖1和2)。對于所有研究的患者，通過第4次給藥的累積因子R中值是1.36(范圍為0.98-3.90)。H22xKi-4末期半衰期在10mg/m2/d的劑量為7.9小時(n＝1)，而在20mg/m2/d的劑量水平具有11.1小時的值(平均)(中值11.1小時；范圍為5.3-18.2小時)(參見表3)。分配體積范圍為20.26～183.20L/m2。20mg/m2組的分配體積(Vdz)平均值為53.17L/m2。在第1日的總身體的H22xKi-4清除范圍為1.02～14.06L/m2，其中接受了20mg/m2的患者組的平均值為3.91L/h/m2(SD 5.04L/h/m2)。在所有具有可測量的雙特異性分子水平的患者中可在第二個療程結(jié)束后探測到低水平的HABA，這既不導(dǎo)致雙特異性分子降低的血清水平，也不導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)(參見表2)。用4個雙特異性分子循環(huán)治療的患者發(fā)展了高了HABA水平。
生物學(xué)活性存在Il-6、IL-15、TNFα和G-CSF的釋放，其最大值在H22xKi-4輸注結(jié)束后2～4小時。細胞因子釋放是不顯著的，可能是由于可估計的患者的有限數(shù)目(n＝6)和細胞因子水平的高患者間變異性。然而，存在如圖3和4所示的細胞因子釋放的清楚趨勢。細胞因子釋放看來隨重復(fù)施用雙特異性分子而改善，且對于G-CSF、TNFα和IL-6比IL-15是更顯著的。一致地，外周血單核細胞上的CD64表達存在顯著的降低(p＝0.018)，且其血量也下降(參見圖5)。血清sCD30-水平在具有高腫瘤負擔(dān)的患者中顯著升高，但在第一次輸注雙特異性分子后不再可以探測，且維持非常低的水平，直到在所有患者中的治療結(jié)束(未顯示數(shù)據(jù))。
免疫組織化學(xué)鼠的雙特異性分子片段可應(yīng)用上述方法在兩個患者的淋巴結(jié)標(biāo)本中進行探測(參見圖6)。存在清楚的HRS-細胞染色，該染色定位于整個胞質(zhì)中。此外，該組織中的巨噬細胞顯示相同的染色模式。因而，存在雙特異性分子穿入惡性淋巴結(jié)中的清楚證據(jù)。
腫瘤反應(yīng)總的說來，有4個患者具有對H22xKi-4雙特異性分子的客觀反應(yīng)。在彌散性肺小結(jié)最大為10mm的一個患者中觀察到了CR。該反應(yīng)持續(xù)3個月，然后肺小結(jié)變?yōu)樵俅慰捎蒀T-掃描測量的，并且起始了援救性的化學(xué)療法。在3個患者中記錄了持續(xù)4周～5個月的PR。一個患者(No 4)在4周后進行了額外的化學(xué)療法。在該患者中，唯一的疾病位點是胸椎浸潤。用雙特異性分子的治療導(dǎo)致神經(jīng)學(xué)缺陷的完全解決和可測量的部分反應(yīng)。由于在另外2個H22xKi-4循環(huán)后不存在額外改善的反應(yīng)，所以進行化學(xué)療法以使疾病進展和可能的脊柱致命性骨折的危險最小化。
在2個最低劑量水平治療的2個患者具有漸進性的疾病，而4個患者顯示穩(wěn)定的疾病。在這些中，一個具有大塊腫瘤(具有胸膜和胸壁浸潤的右肺上部浸潤)負擔(dān)的患者(No 6)實現(xiàn)了該癥狀(咳嗽、盜汗)的顯著改善，該患者在以前的化學(xué)療法后經(jīng)歷了威脅生命的毒性(2個月的膿毒、急性腎衰竭、機械通氣)。疾病穩(wěn)定化和其一般狀況的正?；掷m(xù)12個月。
III.結(jié)論上述研究證明了以下內(nèi)容1)H22xKi-4在劑量達80mg/m2(在第1、3、5和7日給予)時是良好耐受的，僅具有輕微到中等的和瞬時的副作用。不存在劑量限制性毒性，且未達到該構(gòu)建體的最大耐受劑量；2)在給予的最大劑量時H22xKi-4的半衰期是11.1小時，導(dǎo)致治療期間由Cmax和AUC確定的藥物的顯著累積；3)存在IL-6、IL-15、TNFα和G-CSF的釋放，以及單核細胞和CD64-表達的降低，提示了生物學(xué)活性劑量和方案；4)H22xKi-4誘導(dǎo)患有預(yù)治療的晚期和難治的HD的患者中的腫瘤反應(yīng)。H22xKi-4是一種新的雙特異性分子，由源自鼠抗-CD30單克隆抗體Ki-4和人源化抗-CD64單克隆抗體H22的2個化學(xué)連接的F(ab’)片段組成。該構(gòu)建體已顯示在體外抗H-RS細胞系的活性(Sundarapandiyan K.等人，J Immunol Methods 248113(2001))。
在現(xiàn)有的和第一個H22xKi-4臨床實驗中，最常見的副作用是在所有治療的10個患者中的疲勞。其他副作用包括心動過速、低血壓、寒冷、發(fā)燒和肌痛。H22xKi-4的毒性特征類似如對幾個抗淋巴瘤細胞的單克隆抗體描述的“細胞因子釋放綜合征”，該單克隆抗體包括Rituximab、Campath-1H或OKT3(Winkler U.等人，Blood 942217(1999)；Wing M.G.等人，J Clin Invest 982819(1996)；Norman D.J.等人，Transplant Proc 2589(1993))。這些癥狀在所有劑量水平發(fā)作，提示即使在較低水平也有生物學(xué)活性。僅有II級發(fā)燒和輕微的肌痛局限于最高的劑量水平。癥狀的發(fā)作是多樣的，但在輸注結(jié)束后持續(xù)不超過6小時。未觀察到副作用和本研究中確定的H22xKi-4或細胞因子血清水平之間的直接相關(guān)。
盡管有應(yīng)用類似的高劑量的雙特異性分子的事實，但不可確定H22xKi-4的MTD。6個患者用每個循環(huán)80mg/m2進行治療，且給予一個患者的雙特異性分子的最高總量為740mg。由于在該劑量水平不存在主要的副作用，所以在1、3、5和7日給予每個循環(huán)80mg/m2是安全的劑量。已知在其他特異性的單克隆抗體如rituximab中有非常相似的發(fā)現(xiàn)(Maloney D.G.等人，J Clin Oncol 153266(1997))。因而，每個循環(huán)80mg/m2是生物學(xué)活性劑量，特別是由于已經(jīng)觀察到與應(yīng)用類似抗-CD64雙特異性分子的在前研究相似的外周血單核細胞飽和(Pullarkat V.等人，Cancer Immunol Immunother 489(1999))。
計算得出的11.1小時的半衰期也在對其他基于抗-CD64的雙特異性分子報道的范圍內(nèi)(Curnow R.T.，Cancer Immunol Immunother 45210(1997))。該半衰期與基于人源化IgG的抗體如rituximab相比較短，在人源化IgG的抗體中已描述了超過400小時的半衰期。然而，H22xKi-4較短的半衰期并不令人驚訝，這是因為該新的分子與完整的基于IgG的抗體相比較小(104kDa對180kDa)，且缺乏Fc-部分(Tobinai K.等人，Ann Oncol 9527(1998))。此外，與完整抗體相比，H22xKi-4的分子大小更易于使其穿入惡性淋巴結(jié)中(Jain R.K.，Cancer Res.50(增刊)814s(1990))。
用于本研究中的方案設(shè)計為用雙特異性分子飽和所有外周血單核細胞和sCD30，從而導(dǎo)致可穿入組織中以結(jié)合HRS-細胞的過量的未結(jié)合的雙特異性分子。與sCD30的結(jié)合可對H22xKi-4的分布產(chǎn)生重要的影響。觀察到了以峰水平和AUC測量的H22xKi-4顯著累積，從而提示該區(qū)室的飽和。此外，在整個治療期間，sCD30在第一次H22xKi-4輸注后仍然保持非常低的水平，這部分可能是由于由Ki-4抗體對CD30釋放的阻斷(Horn-Lohrens O.等人，Int J Cancer 60539(1995))。此外，觀察到了H22xKi-4與HRS-細胞的免疫組織化學(xué)結(jié)合。最后，觀察到單核細胞來源的細胞因子即G-CSF、IL-6、IL-15和TNFα的釋放與雙特異性分子與效應(yīng)細胞上的CD64顯著結(jié)合的組合。
對H22xKi-4的有希望的反應(yīng)確證了應(yīng)用抗-FcγRI單克隆抗體H22的實體瘤報道的數(shù)據(jù)。在晚期乳腺癌患者中證明了通過與CD64結(jié)合對ADCC的誘導(dǎo)(van Ojik H.H.等人，Cancer Immunol Immunother45207(1997))。在激素難治的前列腺癌中，抗-CD64×抗-HER2雙特異性分子即使在比本實驗中所應(yīng)用的低的劑量也顯示活性(JamesN.D.等人，Br J Cancer 85152(2001))。
總的說來，前述研究證明本發(fā)明的雙特異性分子如H22xKi-4顯示極好的毒性特征，以及在預(yù)治療的晚期或難治的HD患者中有前途的功效。
等同方案僅僅應(yīng)用常規(guī)實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員就將認(rèn)識到或者能夠確定，在此處描述的本發(fā)明特定實施方案的許多等同方案。這種等同方案意欲包含在下面的權(quán)利要求中。
作為參考引入在此將所有此處引用的專利、未決的專利申請和其他出版物均整體引入作為參考。
序列表<110>Medarex，Inc.et al.
<120>抗CD30的人類單克隆抗體<130>MXI-180PC<150>US 60/347649<151>2002-01-09<150>US 60/404427<151>2002-08-19<150>US 60/431684<151>2002-12-06<160>53<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>348<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(348)<400>1gag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tct96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser20 25 30tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg144Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45gcc aac ata aac gaa gat gga agt gag aaa ttc tat gtg gac tct gtg192Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp ger Val50 55 60aag ggc cga ttc acc ttc tcc aga gac aac gcc gag aac tca ctg tat240Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg agg gtt cat tgg tac ttc cat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc336Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val100 105 110act gtc tcc tca348Thr Val Ser Ser
115<210>2<211>116<212>PRT<213>人<400>2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser20 25 30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>3<211>324<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(324)<400>3gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg gag 240Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu65 70 75 80cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt agc tca ccg 288Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95
tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa324Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>4<211>108<212>PRT<213>人<400>4Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>5<211>348<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(348)<400>5cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag48Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac96Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr20 25 30tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att144Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45ggg gaa atc aat cat agt gga agc acc aag tac acc ccg tcc ctc aag192Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys50 55 60agc cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag cac caa ttc tcc ctg240Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu65 70 75 80aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg288Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
aga gag act gtc tac tac ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc336Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val100 105 110act gtc tcc tca348Thr Val Ser Ser115<210>6<211>116<212>PRT<213>人<400>6Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr20 25 30Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45GIy Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys50 55 60Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>7<211>321<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(321)<400>7gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gta agc agc aac96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ctc agt ggc192Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly50 55 60agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt caa cag cgt agc aac tgg ccg tgg288Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp85 90 95acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>8<211>107<212>PRT<213>人<400>8Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>9<211>336<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(336)<400>9cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag48Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt gct tac96Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr20 25 30tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att144Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45ggg gac atc aat cat ggt gga ggc acc aac tac aac ccg tcc ctc aag192Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg240Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80aag ctg aac tct gta acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg288Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95agc cta act gcc tac tgg ggc cag gga agc ctg gtc acc gtc tcc tca336Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser100 105 110<210>10<21l>112<212>PRT<213>人<400>10Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr20 25 30Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser100 105 110<210>11<211>321<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(321)<400>11gac atc cag atg acc cag tct cca acc tca ctg tct gca tct gta gga48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30tta acc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc144Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc192Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat gat agt tac cct atc288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile85 90 95acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>12<211>107<212>PRT<213>人<400>12Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>13<211>15<212>DNA<213>人<400>13aactcttgga tgagc 15<210>14<211>5<212>PRT<213>人<400>14Asn Ser Trp Met Ser1 5<210>15<211>51<212>DNA<213>人<400>15aacataaacg aagatggaag tgagaaattc tatgtggact ctgtgaaggg c 51<210>16<211>l7<212>PRT
<213>人<400>16Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>17<211>21<212>DNA<213>人<400>17gttcattggt acttccatct c 21<210>18<211>5<212>DNA<213>人<400>18vhwyh 5<210>19<211>36<212>DNA<213>人<400>19agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc36<210>20<211>12<212>PRT<213>人<400>20Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>21<211>21<212>DNA<213>人<400>21ggtgcatcca gcagggccac t21<210>22<211>7<212>PRT<213>人<400>22Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5
<210>23<211>27<212>DNA<213>人<400>23cagcagtatg gtagctcacc gtggacg 27<210>24<211>9<212>PRT<213>人<400>24Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr1 5<210>25<211>15<212>DNA<213>人<400>25ggttactact ggagc 15<210>26<211>5<212>PRT<213>人<400>26Gly Tyr Tyr Trp Ser1 5<210>27<211>48<212>DNA<213>人<400>27gaaatcaatc atagtggaag caccaagtac accccgtccc tcaagagc 48<210>28<211>16<212>PRT<213>人<400>28Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>29<211>24<212>DNA<213>人<400>29gagactgtct actacttcga tctc 24
<210>30<211>8<212>PRT<213>人<400>30Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu1 5<210>31<211>33<212>DNA<213>人<400>31agggccagtc agagtgtaag cagcaactta gcc 33<210>32<211>11<212>PRT<213>人<400>32Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala1 5 10<210>33<211>21<212>DNA<213>人<400>33gatgcatcca acagggccac t21<210>34<211>7<212>PRT<213>人<400>34Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>35<211>27<212>DNA<213>人<400>35caacagcgta gcaactggcc gtggacg 27<210>36<211>9<212>PRT<213>人<400>36
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr1 5<210>37<211>15<212>DNA<213>人<400>37gcttactact ggagc 15<210>38<211>5<212>PRT<213>人<400>38Ala Tyr Tyr Trp Ser1 5<210>39<211>48<212>DNA<213>人<400>39gacatcaatc atggtggagg caccaactac aacccgtccc tcaagagt 48<210>40<211>16<212>PRT<213>人<400>40Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>41<211>12<212>DNA<213>人<400>41ctaactgcct ac 12<210>42<211>4<212>PRT<213>人<400>42Leu Thr Ala Tyr1<210>43<211>33<212>DNA
<213>人<400>43cgggcgagtc agggtattag cagctggtta acc 33<210>44<211>11<212>PRT<213>人<400>44Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Thr1 5 10<210>45<211>21<212>DNA<213>人<400>45gctgcatcca gtttgcaaag t21<210>46<211>7<212>PRT<213>人<400>46Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5<210>47<211>27<212>DNA<213>人<400>47caacagtatg atagttaccc tatcacc 27<210>48<211>9<212>PRT<213>人<400>48Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile Thr1 5<210>49<211>291<212>DNA<213>人<400>49caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag a 291<210>50<211>285<212>DNA<213>人<400>50gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accct 285<210>51<211>294<212>DNA<213>人<400>51gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaga294<210>52<211>288<212>DNA<213>人<400>52gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacct 288<210>53<211>285<212>DNA<213>人<400>53gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcct 28權(quán)利要求
1.一種與人類CD30結(jié)合的分離的人類單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1的人類抗體，其中抗體抑制表達CD30的腫瘤細胞的生長。
3.權(quán)利要求1的人類抗體，其中抗體在效應(yīng)細胞存在時誘導(dǎo)對表達CD30的腫瘤細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
4.權(quán)利要求3的人類抗體，其中ADCC由單核細胞介導(dǎo)。
5.權(quán)利要求3的人類抗體，其中ADCC由單核的細胞介導(dǎo)。
6.權(quán)利要求2的人類抗體，其中腫瘤細胞選自骨髓細胞、肝細胞、淋巴結(jié)細胞、皮膚細胞、脾細胞、胸腺細胞、扁桃體細胞、蛻膜細胞、子宮內(nèi)膜細胞、何杰金氏細胞、Reed-Sternberg細胞、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞、多形的和免疫母細胞淋巴瘤細胞、T細胞、B細胞、NK細胞或單核細胞。
7.權(quán)利要求2的人類抗體，其中腫瘤細胞是何杰金氏細胞或Reed-Sternberg細胞。
8.權(quán)利要求1的人類抗體，其中抗體以至少107M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合。
9.前述任一項權(quán)利要求的人類抗體，包含人類IgG重鏈和人類κ輕鏈。
10.前述任一項權(quán)利要求的人類抗體，包含IgG1或IgG3重鏈。
11.一種分離的人類單克隆抗體，包含含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人類重鏈可變區(qū)以及含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人類輕鏈可變區(qū)，其中(a)人類重鏈可變區(qū)CDR3序列選自SEQ ID NO18、30和42及其保守的修飾；(b)人類輕鏈可變區(qū)CDR3序列選自SEQ ID NO24、36和48及其保守的修飾；人類抗體以至少107M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合；人類抗體在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)測定中介導(dǎo)CD30+腫瘤細胞的裂解；和(c)人類抗體抑制體內(nèi)CD30+腫瘤細胞的生長。
12.權(quán)利要求11的分離的人類抗體，其中人類重鏈可變區(qū)CDR2序列選自SEQ ID NO17、29和41及其保守的修飾；人類輕鏈可變區(qū)CDR2序列選自SEQ ID NO23、35和47及其保守的修飾。
13.權(quán)利要求12的分離的人類抗體，其中人類重鏈可變區(qū)CDR1序列選自SEQ ID NO16、28和40及其保守的修飾；人類輕鏈可變區(qū)CDR1序列選自SEQ ID NO22、34和46及其保守的修飾。
14.權(quán)利要求11的分離的人類抗體，該抗體以至少108M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合。
15.權(quán)利要求11的分離的人類抗體，該抗體以至少109M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合。
16.權(quán)利要求11的分離的人類抗體，其中人類重鏈可變區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4序列源自人類重鏈VH4-34或VH3-11種系序列。
17.權(quán)利要求11的分離的人類抗體，其中人類輕鏈可變區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4序列源自人類輕鏈L15、A27或L6種系序列。
18.一種分離的人類單克隆抗體，包含人類重鏈可變區(qū)和人類輕鏈可變區(qū)，其中(a)人類重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO2、6、10的氨基酸序列和與SEQ ID NO2、6、10具有至少80％同源性的序列；(b)人類輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO4、8、12的氨基酸序列和與SEQ ID NO4、8、12具有至少80％同源性的序列；(c)人類抗體以至少107M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合；(d)人類抗體在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)測定中介導(dǎo)CD30+腫瘤細胞的裂解；和(e)人類抗體抑制體內(nèi)CD30+腫瘤細胞的生長。
19.權(quán)利要求18的分離的人類抗體，其中抗體以至少108M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合。
20.權(quán)利要求18的分離的人類抗體，其中抗體以至少109M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合。
21.一種分離的人類單克隆抗體，包含源自人類重鏈VH4-34種系序列的人類重鏈可變區(qū)和源自人類輕鏈L15種系序列的人類輕鏈可變區(qū)，其中(a)人類重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列或與SEQ IDNO10具有至少80％同源性的序列；(b)人類輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12的氨基酸序列或與SEQ IDNO12具有至少80％同源性的序列；(c)人類抗體以至少107M-1的親和常數(shù)與人類CD30結(jié)合；(d)人類抗體在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)測定中介導(dǎo)CD30+腫瘤細胞的裂解；和(e)人類抗體抑制體內(nèi)CD30+腫瘤細胞的生長。
22.一種分離的人類單克隆抗體，包含分別含有示于SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中的氨基酸序列的人類重鏈和人類輕鏈可變區(qū)。
23.一種分離的人類單克隆抗體，該抗體與權(quán)利要求22的人類單克隆抗體競爭對CD30的結(jié)合。
24.一種分離的人類單克隆抗體，包含分別含有示于SEQ ID NO6和SEQ ID NO8中的氨基酸序列的人類重鏈和人類輕鏈可變區(qū)。
25.一種分離的人類單克隆抗體，該抗體與權(quán)利要求24的人類單克隆抗體競爭對CD30的結(jié)合。
26.一種分離的人類單克隆抗體，包含分別含有示于SEQ ID NO10和SEQ ID NO12中的氨基酸序列的人類重鏈和人類輕鏈可變區(qū)。
27.一種分離的人類單克隆抗體，該抗體與權(quán)利要求26的人類單克隆抗體競爭對CD30的結(jié)合。
28.通過雜交瘤產(chǎn)生的權(quán)利要求1-27中任一項的分離的人類抗體，其中雜交瘤從與無限增殖化細胞融合的B細胞制備，該B細胞從轉(zhuǎn)基因的非人類動物中獲得，該動物具有包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體和人類輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的基因組。
29.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-27中任一項的人類抗體和藥物可接受的載體。
30.一種免疫偶聯(lián)物，包含與治療劑連接的權(quán)利要求1-27中任一項的人類抗體。
31.權(quán)利要求30的免疫偶聯(lián)物，其中治療劑是細胞毒素。
32.權(quán)利要求30的免疫偶聯(lián)物，其中治療劑是放射性同位素。
33.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求30-32中任一項的免疫偶聯(lián)物和藥物可接受的載體。
34.一種編碼權(quán)利要求1-27中任一項的人類抗體的分離的核酸分子。
35.權(quán)利要求34的分離的核酸分子，其中核酸分子整合入表達載體中。
36.一種包含權(quán)利要求35的表達載體的轉(zhuǎn)染瘤。
37.一種表達權(quán)利要求1-27中任一項的人類抗體的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中轉(zhuǎn)基因非人類動物具有包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體和人類輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的基因組。
38.一種抑制表達CD30的細胞生長的方法，包含使細胞與有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項的抗體接觸，從而該細胞的生長受到了抑制。
39.一種治療或預(yù)防特征在于表達CD30的腫瘤細胞生長的疾病的方法，包含以有效治療或預(yù)防該疾病的量向被試者施用權(quán)利要求1-27中任一項的人類抗體。
40.權(quán)利要求39的方法，其中疾病選自何杰金氏病、退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-細胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭　⒖úㄎ魅饬龊推渌鸗-細胞或B-細胞淋巴瘤。
41.權(quán)利要求39的方法，其中疾病是何杰金氏病。
42.權(quán)利要求39的方法，其中疾病是非何杰金氏淋巴瘤。
43.權(quán)利要求39的方法，其中非何杰金氏淋巴瘤是退行發(fā)育的大細胞淋巴瘤(ALCL)。
44.一種治療或預(yù)防涉及表達CD30的免疫細胞的自身免疫病的方法，包含以有效治療或預(yù)防自身免疫病的量向被試者施用權(quán)利要求1-27中任一項的人類抗體。
45.權(quán)利要求44的方法，其中自身免疫病選自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)的疾病。
46.權(quán)利要求38-45中任一項的方法，其中人類抗體與一種治療劑偶聯(lián)。
47.權(quán)利要求46的方法，其中治療劑是細胞毒素。
48.權(quán)利要求46的方法，其中治療劑是放射性同位素。
全文摘要
公開了分離的與CD30(如人類CD30)結(jié)合的人類單克隆抗體。人類抗體可在非人類的轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生，該轉(zhuǎn)基因動物能夠通過V－D－J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生多種人類單克隆抗體同種型。同樣公開的是人類抗體的衍生物(如雙特異性抗體和免疫偶聯(lián)物)、包含人類抗體的藥物組合物、產(chǎn)生人類抗體的非人類轉(zhuǎn)基因動物和雜交瘤，以及應(yīng)用人類抗體的治療和診斷方法。
文檔編號A61P31/18GK1638800SQ03805221
公開日2005年7月13日 申請日期2003年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月9日
發(fā)明者T·科勒, R·格拉茲安諾, J·特雷姆, Y·M·德奧 申請人:米德列斯公司