專利名稱：一種重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因及其非融合表達(dá)產(chǎn)物、生產(chǎn)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種修改后的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因，含有該基因的表達(dá)載體和原核表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及該修改后基因的非融合表達(dá)產(chǎn)物及其該產(chǎn)物在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)是成纖維細(xì)胞因子家族中的一種。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)最初是作為對(duì)balb/c3T3細(xì)胞具有生長(zhǎng)促進(jìn)活性的因子，從牛腦垂體組織中分離的(D.Gospodarrowicz，Nature 249123，1974)。該因子對(duì)酸和溫度敏感，具有高的(堿性)等電點(diǎn)，pI＝9.3-9.6。
bFGF可以選擇性地激發(fā)包括中胚層細(xì)胞和神經(jīng)外胚層細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，這些細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、成肌細(xì)胞及成骨細(xì)胞。bFGF除可以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)外，還可刺激許多類型的細(xì)胞以非有絲分裂方式發(fā)生不同的反應(yīng)，例如促進(jìn)細(xì)胞向受傷部位遷移(趨化因子活性)、促進(jìn)新的血管生成、調(diào)節(jié)神經(jīng)退化和存活性(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能以及刺激或抑制特異性細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及細(xì)胞存活等(Baird，A.and Bohler，P.，Handbook of Exp.Pharmacol.，95(1)369-418，1990)。這些性質(zhì)為使用bFGF制備用來(lái)加速傷口愈合、神經(jīng)組織修復(fù)、預(yù)防和治療腦和心肌局部缺血(側(cè)枝血管生成)的藥物提供了基礎(chǔ)。
人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human basic Fibroblast Growth Factor，hbFGF，下稱hbFGF)由于其氨基酸序列與人體天然的hbFGF完全一致，因此應(yīng)用于人體治療不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可以廣泛應(yīng)用于包括神經(jīng)系統(tǒng)損傷、燒燙傷、創(chuàng)傷、各類潰瘍方面疾病的治療。因此有極高的開發(fā)價(jià)值。
自1986年Abraham等首次克隆bFGF的cDNA以來(lái)，bFGF基因的克隆和表達(dá)研究取得了重大的進(jìn)展，使人們不再依賴組織提取來(lái)進(jìn)行基礎(chǔ)研究。細(xì)菌、酵母、病毒等bFGF表達(dá)體系的構(gòu)建極大地方便了bFGF的研究。但若要采用這些表達(dá)體系大規(guī)模生產(chǎn)hbFGF，則由于其表達(dá)量不足而限制了其使用。
在國(guó)內(nèi)，暨南大學(xué)生物工程研究所構(gòu)建了bFGF表達(dá)載體，并成功開發(fā)出牛bFGF產(chǎn)品(專利申請(qǐng)?zhí)?6114279.0)。在hbFGF表達(dá)研究方面，采用融合蛋白方法表達(dá)的可取得較高的表達(dá)量。也有采用信號(hào)肽OmpA序列重組分泌型表達(dá)載體，在周質(zhì)中獲得的hbFGF蛋白可占總周質(zhì)蛋白的15％。但融合hbFGF由于其含有的這一段融合蛋白而極大地限制了其應(yīng)用。而照常規(guī)方法構(gòu)建胞內(nèi)型表達(dá)載體表達(dá)非融合rhbFGF，表達(dá)率均不高，未有超過15％的報(bào)道。
翻譯起始區(qū)(translation initiation region，下簡(jiǎn)稱TIR)是指mRNA上影響到翻譯起始的一段mRNA序列。一般意義上認(rèn)為mRNA起始密碼子附近的70個(gè)堿基對(duì)翻譯的順利起始非常重要，包含了翻譯起始的大部分重要信息。因此翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為對(duì)翻譯的順利起始具有非常重要的意義。mRNA一般情況下會(huì)形成各種各樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如各種發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在能量較低的情況下，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)有時(shí)會(huì)通過形成假結(jié)(pseudoknot)結(jié)構(gòu)，從而形成更復(fù)雜的各種三級(jí)結(jié)構(gòu)。一般而言，過于穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)嚴(yán)重地影響核糖體RNA對(duì)TIR區(qū)內(nèi)重要位點(diǎn)的識(shí)別，例如SD區(qū)等。翻譯的起始階段，當(dāng)核糖體16S亞基開始識(shí)別SD序列并開始結(jié)合到mRNA時(shí)，必須先打開發(fā)夾之類的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如果這些二級(jí)結(jié)構(gòu)很難打開，翻譯將不能起始。故理論上認(rèn)為當(dāng)二級(jí)結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定時(shí)，翻譯的起始效率也會(huì)越高。
有實(shí)驗(yàn)證明mRNA中G+C含量的減少時(shí)，一般情況下會(huì)減小TIR區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。堿基G和堿基C分別都含有三個(gè)成氫鍵基團(tuán)。而堿基A和堿基U只含有二個(gè)成氫鍵基團(tuán)。因此G+C含量增高時(shí)，形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，故理論上認(rèn)為序列具有更大的自由能降，從而降低mRNA的翻譯起始效率。
另外，密碼子系統(tǒng)的選擇采用對(duì)于翻譯的順利也意義重大。大多數(shù)氨基酸由于密碼子的簡(jiǎn)并性而具有不只一種密碼子，它們對(duì)應(yīng)tRNA的豐度在不同表達(dá)系統(tǒng)中會(huì)有很大差異，相應(yīng)地造成在密碼子偏好性上的巨大差異，因此不同的表達(dá)系統(tǒng)均有密碼子偏好性的不同。因此外源基因在某一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，采用該表達(dá)系統(tǒng)偏好的密碼子比例高的其mRNA翻譯速度快，而稀有密碼子比例高的mRNA翻譯速度慢。而當(dāng)mRNA中具有較多的稀有密碼子時(shí)，往往會(huì)造成外源基因表達(dá)效率很低或不表達(dá)的嚴(yán)重的后果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能在原核表達(dá)體系中高效表達(dá)的hbFGF非融合基因；本發(fā)明的另一目的是提供一種含有這種hbFGF非融合基因的表達(dá)載體；本發(fā)明的另一目的是提供一種能高效表達(dá)hbFGF非融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種依據(jù)該原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯表達(dá)產(chǎn)生的具有人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性的非融合型多肽；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)上述基因表達(dá)產(chǎn)物的方法；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述非融合重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的能在原核表達(dá)體系中高效表達(dá)的hbFGF非融合基因，是在不改變天然hbFGF氨基酸序列的情況下，將該基因的翻譯起始區(qū)經(jīng)過適當(dāng)?shù)男薷?，使具有較高的密碼子偏好性，較低的G+C含量。這種hbFGF基因通過適當(dāng)?shù)妮d體可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中有較高的翻譯起始效率，從而提高表達(dá)率，而且可溶性蛋白的表達(dá)較高，大大節(jié)省了中下游發(fā)酵、純化條件的優(yōu)化時(shí)間及生產(chǎn)成本，也可以同時(shí)簡(jiǎn)化下游的蛋白產(chǎn)物純化工藝和提高h(yuǎn)bFGF的生物活性。該hbFGF基因具有如序列表所示的核甘酸序列。
本發(fā)明的含有這種hbFGF非融合基因的表達(dá)載體，該載體具有能在原核表達(dá)體系中翻譯表達(dá)這種hbFGF基因的能力。其中，優(yōu)選的一種載體是基于pET-3c克隆構(gòu)建的。
本發(fā)明的能高效表達(dá)hbFGF非融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含上述含有hbFGF的載體，而且能夠有效地防止本底表達(dá)。其中優(yōu)選的原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，特別優(yōu)選的是BL21(DE3)plySs。
根據(jù)上述提供的hbFGF基因、表達(dá)載體和原核表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明提供一種依據(jù)該原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯表達(dá)產(chǎn)生的具有人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性的非融合型多肽，該非融合hbFGF多肽具有如序列表所示的氨基酸序列，具有17.2KD的分子量，且等電點(diǎn)為9.3-9.6。
根據(jù)上述提供的hbFGF基因、表達(dá)載體和原核表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明生產(chǎn)該基因表達(dá)產(chǎn)物的方法包括(1)設(shè)計(jì)合適的PCR引物，通過PCR擴(kuò)增，得到適當(dāng)?shù)匦薷倪^的編碼具有非融合hbFGF的DNA序列；(2)將經(jīng)過修改的DNA序列與適當(dāng)?shù)目寺”磉_(dá)載體相連接，得到重組表達(dá)載體；根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中所說(shuō)的重組表達(dá)載體為基于pET-3c構(gòu)建的pET-JN系列；(3)用所說(shuō)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞并篩選所得到的被轉(zhuǎn)化的重組工程菌株；根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中所說(shuō)的原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，其中最優(yōu)選的是BL21(DE3)plySs(4)在適于表達(dá)所說(shuō)的具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性之多肽的條件下發(fā)酵培養(yǎng)所說(shuō)的被轉(zhuǎn)化的工程菌，收集菌體，破碎離心，分別從離心的上清和沉淀產(chǎn)物中分離并純化所說(shuō)的多肽；(5)純化的步驟依次為離子交換層析-親合層析-凝膠層析，產(chǎn)物純度達(dá)到98％以上。
本發(fā)明上述非融合hbFGF還可以在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中進(jìn)行應(yīng)用。該應(yīng)用含有按本發(fā)明方法生產(chǎn)的非融合hbFGF作為必要的活性成分外，還可含有適當(dāng)量的以及醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。該藥物組合物用于制備預(yù)防或治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷等藥物，特別是用于制備治療神經(jīng)組織損傷如外周神經(jīng)損傷、神經(jīng)性耳聾、急性缺血性腦中風(fēng)、腦外傷等方面的藥物。
以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案首先，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊锶舾蓪?duì)，以我所保存的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因作為模板(基因序列見中國(guó)專利96114279.0之附圖2)，PCR擴(kuò)增，將hbFGF基因的TIR即將ATG起始密碼子開始的前0-30個(gè)密碼子進(jìn)行修改，如此獲得的修改后的hbFGF基因再用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，在T4連接酶的作用下將所得到的基因連接到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體，再借助CaCl2法或電穿孔法等常規(guī)方法將所得到的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中，再基于所用質(zhì)粒載體所攜帶的抗生素抗性或其他抗性標(biāo)志選擇轉(zhuǎn)化體。例如可使用pET-3c/3b/3c作為克隆載體，將修改了TIR的hbFGF基因克隆其中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α或JM109的情況下，可在含有氨芐青霉素(Ampicillin，下簡(jiǎn)稱AMP)的LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％醇母提取物，1％NaCl，pH7.2，下略)平皿上培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，得到相應(yīng)的菌落。
對(duì)獲得的菌落，需進(jìn)一步鑒定其是否為重組子?？梢圆捎秒p酶切的方法進(jìn)行初步鑒定。如在使用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞的情況下，可以用常規(guī)方法從重組體大腸桿菌細(xì)胞中抽取質(zhì)粒，用限制性酶消化所得到的質(zhì)粒，溴乙錠(EB)染色，DNA瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，如在紫外光下可見清晰的酶切片斷，則可初步證實(shí)修改后的hbFGF基因已克隆入表達(dá)載體。為進(jìn)一步證實(shí)，可以將初步鑒定確定的含有該克隆表達(dá)載體的宿主菌直接交由專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，以進(jìn)一步證實(shí)基因序列是否與預(yù)期的一致，可推知氨基酸序列是否與預(yù)期完全相同。
然后將含有這種修改過TIR的hbFGF基因的重組表達(dá)載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主細(xì)胞內(nèi)。在適于表達(dá)具有hbFGF活性蛋白的通用條件下，培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。例如在分別使用pET-3c或pET-35b+和大腸桿菌BL21(DE3)或BL21(DE3)plySs作為質(zhì)粒載體和宿主時(shí)，可在含有100μg/ml AMP的LB培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后收獲細(xì)胞，用超聲波破碎細(xì)胞，離心分離細(xì)胞的可溶性部分并從中分離和純化所需的hbFGF。
這里應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)指出的是，在本發(fā)明中是由于利用突變了TIR區(qū)域的hbFGF基因從而大大提高了hbFGF的表達(dá)效率，特別是增加了從細(xì)胞可溶性部分中獲得的表達(dá)產(chǎn)物的比例(因?yàn)閺陌w中分離純化表達(dá)產(chǎn)物時(shí)往往因使用破碎包含體的變性劑而導(dǎo)致產(chǎn)物的活性效率很低或失活)。
經(jīng)發(fā)酵和層析純化后獲得的hbFGF可按照本領(lǐng)域已知的噻唑藍(lán)(MTT)法(ArmelinHA.，Pituitary extracts and steroid hormones in the control of 3T3 cell growth，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 702702-2706，1973)，以提取的非融合hbFGF作為試驗(yàn)樣品，以細(xì)胞最大半數(shù)增殖濃度(ED50)標(biāo)定本發(fā)明的具有hbFGF之生物學(xué)活性。
可以使用多種常規(guī)層析技術(shù)純化依照本發(fā)明提供方法培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中具有hbFGF活性的多肽。例如可在破碎細(xì)胞后溶解所需的多肽，溶胞物離心后對(duì)所得上清層析分離。所使用的層析方法包括但不只限于離子交換層析，疏水相互作用層析，凝膠過濾層析和親合層析。其中親合層析包括但不只限于金屬螯合例如銅或鋅鉻合的親合柱層析和結(jié)合有對(duì)hbFGF有高度親合力之硫酸肝素柱層析。
用于本發(fā)明的疏水柱層析介質(zhì)是可共價(jià)連接正(異)丁基、辛烷基和苯基等的瓊脂糖樹脂，例如可以是購(gòu)自Phamacia Co.Sweden的Butyl Sepharose phenyl sepharose 4L-4B等。可以使用本領(lǐng)域已知的方法通過1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷或2，3-二溴丙醇作為間隔臂，將上述基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到Sepharose固相基質(zhì)上。在以疏水相互作用層析分離hbFGF時(shí)，可以使用等度或梯度冼脫，但較好是使用選自磷酸鹽緩沖液、Tris-Hcl緩沖液，硝酸鹽緩沖液的緩沖鹽溶液，以50-600cm/小時(shí)的流速進(jìn)行洗脫。使用的濃度梯梯度一般為3.5M-0M，洗脫液的pH范圍為6-9。
為進(jìn)行金屬螯合物親合層析，可以使用偶聯(lián)有Zn+、Cu2+、Fe3+、Mn2+等金屬離子固相樹脂，但較好是偶聯(lián)Zn2+的Sepharose或Sephadex，羧甲基纖維素樹脂柱(例如購(gòu)自Pharmacia Co.，Swedem的Chelating Sepharose Fast Flow)?？稍诖蠹spH7-9條件下，以大約250-370cm/小時(shí)的流速進(jìn)行洗脫?？墒褂煤蠳aCl緩沖液的洗脫液洗脫。
用于分離hbFGF的最重要的層析基質(zhì)是攜帶共價(jià)交聯(lián)的硫酸多糖，或瓊脂糖、藥聚糖或纖維素的基質(zhì)，例如按前述方法制得的或購(gòu)自Phramacia Co.，Sweden的產(chǎn)品名為Sepharose 6 FastFlow，或Hyperp的親合層析樹脂?？捎煤蠳aCl的緩沖液梯度洗脫。
進(jìn)行離子交換層析是根據(jù)不同蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)不同而將其分離。層析介質(zhì)是采用X-連接瓊脂或X-連接右旋糖苷為樹脂基。通常通過加大反荷離子的濃度來(lái)進(jìn)行分離。最常使用為Nacl溶液進(jìn)行步進(jìn)式或梯度式洗脫，使用濃度梯度為0-1M，洗脫液的范圍為pH6-9。
凝膠層析介質(zhì)為X-鏈葡聚糖或雙丙烯酰胺。例如選擇Pharmacia公司的Sgphacryl S-100?？筛鶕?jù)蛋白質(zhì)分子大小不同達(dá)到分離的效果?？捎靡话愕木彌_體系或含低濃度鹽緩沖體系緩沖體系進(jìn)行洗脫，而通常選用磷酸鹽緩沖液。洗脫液的pH范圍為6-9。
我們依次使用疏水相互作用層析-金屬螯合物親合層析-硫酸多糖親合層析純化或依次使用離子交換層析-親合層析-凝膠層析等方法來(lái)制備的hbFGF，產(chǎn)物純度達(dá)到98％以上。
在本表達(dá)系統(tǒng)中，所表達(dá)的hbFGF還有部分是在重組體的菌胞中是以可溶性包含體的形式積聚的。在這種情況下，可以回收并用變性劑(例如尿素)溶解后，除去變性劑以使hbFGF重新折疊并恢復(fù)其原有活性，然后再基本上按前述方法進(jìn)行層析處理，以得到具有所需的非融合hbFGF多肽。
本發(fā)明還涉及含有非融合hbFGF的藥物組合物，這些藥物組合物可應(yīng)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷如外周神經(jīng)損傷、神經(jīng)性耳聾、急性缺血性腦中風(fēng)、腦外傷等方面的治療?？梢园凑毡景l(fā)明所述方法制備的非融合hbFGF作為主要成分，與藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑，以及其他輔助成分混合，制成適于臨床治療應(yīng)用的藥物組合物。可以按照醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域已知的方法將本發(fā)明的藥物組合物配制成可供靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦脊髓腔內(nèi)注射的注射液。
特別是在使用本發(fā)明的非hbFGF作為基本活性成分的情況下，可以使用選自聚乙二醇、羧甲基纖維素、硫酸多糖、肝素、多聚賴氨酸等高分子化合物，以及可與hbFGF分子中的半胱氨酸形成二硫鍵的谷胱苷肽作為穩(wěn)定劑，用以防止hbFGF分子在溶液中或病人血流中被迅速降解，或在儲(chǔ)存期間發(fā)生分子多聚化而減少或喪失其生物學(xué)活性。
最后還應(yīng)指出的是，根據(jù)使用目的的不同，本發(fā)明的藥物組合物中除含有作為主要成分的非融合hbFGF外，還可含有其他相關(guān)的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)，例如表皮因子(EGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)及腦衍生的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)，這些活性因子可與hbFGF協(xié)同作用，提高本發(fā)明藥物組合物的治療效果。
以下通過具體實(shí)施例和


對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

附件顯示非融合hbFGF基因序列及氨基酸序列圖1顯示重組表達(dá)載體pET-JN的構(gòu)建。
圖2顯示重組表達(dá)載體pET-JN的酶切鑒定瓊脂糖電泳圖。標(biāo)記如下MDNA分子量標(biāo)記之λ/Hind III；M*DNA分子量標(biāo)記之φ174/Hae III；C對(duì)照，未酶切的pET-JN表達(dá)質(zhì)粒；Lanel-10pET-JN表達(dá)質(zhì)粒的BemH I+Nde I酶切圖3、圖4顯示在還原條件下SDS-PAGE對(duì)pET-JN系列誘導(dǎo)表達(dá)hbFGF的情況分析。除pET-JN系列的七株菌株外，還以克隆了未修改過TIR的hbFGF基因的pET-Yb菌株同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)作為對(duì)照，進(jìn)行表達(dá)情況分析。
標(biāo)記說(shuō)明如下M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記；1*/2*/3*/4*/5*/6*/7*誘導(dǎo)表達(dá)后pET-JN1/2/3/4/5/6/7的上清；1/2/3/4/5/6/7誘導(dǎo)表達(dá)后pET-JN1/2/3/4/5/6/7的沉淀；C*對(duì)照菌株pET-Yb誘發(fā)表達(dá)后的上清；C對(duì)照菌株pET-Yb誘發(fā)表達(dá)后的沉淀。圖5顯示在還原條件下SDS-PAGE對(duì)pET-JN1的大規(guī)模表達(dá)hbFGF的結(jié)果分析。標(biāo)記說(shuō)明如下Lanel破碎后沉淀；Lane2破碎后上清Lane3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記圖6顯示對(duì)hbFGF的離子交換層析(步驟1，脈沖梯度洗脫方式)。平衡液0.1mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液0.3mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)和0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
圖7顯示對(duì)hbFGF的親合層析(步驟2，脈沖梯度洗脫方式)。平衡液0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液1.2mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)和2.0mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
圖8顯示對(duì)hbFGF的凝膠層析(步驟3，等度洗脫方式)。洗脫液0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
圖9顯示使用純化后的hbFGF-與人抗hbFGF單克隆抗體所作Western-blotting分析的結(jié)果。標(biāo)識(shí)說(shuō)明如下C對(duì)照，hbFGF標(biāo)準(zhǔn)品Lane1、2待檢測(cè)的非融合hbFGF。
圖10顯示hbFGF生物活性檢測(cè)曲線圖。其中數(shù)字標(biāo)識(shí)為1表示4-1，2表示4-2，......，7表示4-7，以此類推。
具體實(shí)施例方式
以下提供具體實(shí)施例并參照附圖進(jìn)一步深入描述本發(fā)明，這些實(shí)施例并不以任何方式限定本發(fā)明待批權(quán)利要求所要求的保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1TIR區(qū)域修改的hbFGF基因的制備設(shè)計(jì)上游引物如下F1GAA GCT GCT AGT ATT ACG ACA CTG CCG GCT CTG CCG GAA GAT GGTGGT AGC GGT GCTF2GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACG ACG CTG CCG GCC CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCAF3GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACT ACA CTG CCG GCC CTG CCG GAA GAT GGTGTT AGC GGT GCGF4GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACT ACG CTG CCG GCT CTG CCG GAA GAT GGTGGT AGT GGT GCG
F5GAA

GCT GCT GGT AGC ATT ACA ACT CTG CCG GCA CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCCF6GAA

GCT GCT GGT AGT ATT ACA ACT CTG CCG GCA CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCAF7GAA

GCT GCT GGT AGC ATT ACG ACC CTG CCG GCG CTG CCG GAA GATGGT GAT AGT GGT GCT設(shè)計(jì)下游引物如下RGACA

TTA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG方框內(nèi)的堿基序列為酶切位點(diǎn)。
以F1和R，F(xiàn)2和R，......F7和R組合分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
將合成的PCR引物作適當(dāng)稀釋。在潔凈的Eppendof管中加入以下成分

充分混勻后，按以下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增95℃，4min→[95℃，30”→52℃，30”→72℃，45”]×30→72℃，10min，然后冷卻至室溫。PCR反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，在紫外燈下切膠回收PCR產(chǎn)物，用QG-PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen公司出品)純化，純化后的PCR產(chǎn)物，用Bgl II和Nde I酶切后電泳，再次用QG試劑盒純化。取少量酶切后的純化產(chǎn)物電泳進(jìn)行定量，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2pET-JN的構(gòu)建及重組子的酶切將經(jīng)酶切、純化后的載體質(zhì)粒DNA pET-3c/Nde I /BamH I和hbFGF/Nde I /Bgl II的DNA片段按照常規(guī)方法，在16℃的恒溫水浴鍋中連接30min，連接反應(yīng)終了時(shí)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100μL轉(zhuǎn)化液涂AMP抗性LB平板，37℃恒溫箱中培養(yǎng)12-16h。構(gòu)建過程見圖1分別用無(wú)菌牙簽挑取每個(gè)抗性平板上生長(zhǎng)的菌落3-5個(gè)，分別接種到加有100μg/mLAMP的5mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，37℃、200rpm/min振蕩培養(yǎng)12-16h后，用堿法小量抽提質(zhì)粒法，抽提質(zhì)粒作BamH I+Nde I雙酶切酶切，電泳鑒定，選出重組子。
從圖中可以看出，重組質(zhì)粒雙酶切均產(chǎn)生一約440bp的小片段，說(shuō)明7個(gè)hbFGF的基因均已經(jīng)克隆到pET-3c載體質(zhì)粒上，將篩選出的重組子命名為pET-JN.則由7對(duì)引物分別PCR擴(kuò)增構(gòu)建的重組子分別稱為pET-JN1、pET-JN2，...，pET-JN7。見圖2實(shí)施例3非融合hbFGF蛋白質(zhì)的表達(dá)分析將含有經(jīng)過酶切鑒定的重組質(zhì)粒pET-JN系列的DH5α細(xì)胞在含100μg/ml AMP的5mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增，按堿法小量方法抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS細(xì)胞，涂布于含有100μg/mlAMP和氯霉素(Chloromycetin，下稱CHL)雙抗的LB培養(yǎng)平皿上培養(yǎng)，于37℃下培養(yǎng)過夜。挑取陽(yáng)性菌落并接種于加入100μg/ml AMP和100μg/ml CHL的50ml LB試管中作表達(dá)試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)至OD600為0.8，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)4小時(shí)。
為分析所得的菌株表達(dá)非融合hbFGF的更詳細(xì)情況，將得到的有表達(dá)的菌株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)、誘導(dǎo)后，收集菌體，于8倍的破碎緩沖液中超聲波破碎，離心，取上清和沉淀，分別進(jìn)行還原型SDS-PAGE電泳，分析其產(chǎn)物表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。
對(duì)表達(dá)的7株菌株，進(jìn)一步送測(cè)序公司測(cè)序(以T7啟動(dòng)子序列作為測(cè)序引物)，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期構(gòu)建的結(jié)果一致，推測(cè)出的氨基酸序列與天然的一致。
實(shí)施例4非融合hbFGF蛋白的大規(guī)模培養(yǎng)和純化取pET-JN1工程菌株，進(jìn)一步于10L的發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，收集如此得到的培養(yǎng)液，于4℃以8000-15000rpm離心收獲細(xì)胞。按10ml/g濕重的量向收獲的細(xì)胞中加入菌體裂解緩沖液(每升含0.1M NaCl、10mM EDTA和20mM PB，pH7.0)，使用超聲波破碎儀或高壓勻漿儀裂解細(xì)胞。4℃下，8000-18500rpm離心30min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，試驗(yàn)結(jié)果見圖4、圖5。
將所得上清液分別進(jìn)行如下層析離子交換層析采用脈沖梯度洗脫方式；平衡液0.1mol/LNaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液0.3mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。再進(jìn)行親合層析采用脈沖梯度洗脫方式，平衡液0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液1.2mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)2.0mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。最后進(jìn)行凝膠層析采用等度洗脫方式，洗脫液0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。以上配制的層析用溶液均于4℃保存。結(jié)果分別見圖6、圖7、圖8。
實(shí)施例5非融合hbFGF的免疫印跡檢測(cè)和體外生物活性檢測(cè)。
為了證實(shí)如此純化的非融合hbFGF蛋白的均質(zhì)性，對(duì)洗脫物樣品Western-blot印跡分析。按前述方法制備分離膠，在非還原條件下以10mA恒定電流電泳3小時(shí)，電泳后以大約8mA/cm2的穩(wěn)定電流將電泳分離的樣品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用封閉緩沖液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween 20+1％BSA)處理30分鐘，然后加入溶于漂洗緩沖液的鼠抗hbFGF單克隆抗體(由Promega生產(chǎn))，37℃下反應(yīng)2小時(shí)。用漂洗液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween20)洗3次后(10分鐘/次)后，再加入溶于封閉緩沖液中，再用過氧化物酶偶聯(lián)的抗鼠IgG(由Promega生產(chǎn))37℃下保溫2小時(shí)。保溫后將濾膜用漂洗液洗3次(10分鐘/次)。然后加入緩沖液(0.1M PBC(pH60)+1mg DAB+10ul H2O)，直到顯現(xiàn)出清晰的條帶后加入50mM EDTA終止反應(yīng)。
免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果見圖9。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的MIT法對(duì)hbFGF進(jìn)行測(cè)活。取傳代3T3細(xì)胞，用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基按5×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度稀釋3T3細(xì)胞，分別加入到兩塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，培養(yǎng)24h，更換含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(維持培養(yǎng)基)繼續(xù)饑餓培養(yǎng)24h。然后在兩塊板的第一行分別加入含有bFGF參比品的維持培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)bFGF的濃度至終濃度400ng/mL，之后的各行，分別用維持培養(yǎng)基倍比稀釋，同時(shí)取不含細(xì)胞的維持培養(yǎng)基和含有細(xì)胞但不含bFGF的維持培養(yǎng)基作空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入濃度為1mg/mL的MTT50μL，與細(xì)胞結(jié)合4～5h后，吸出含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入100μL酸性異丙醇，振蕩10～20min，570nm與630nm雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，并以不含細(xì)胞的空白維持培養(yǎng)基的吸光值為零，繪制相關(guān)曲線，確定bFGF生物學(xué)活性。計(jì)算公式如下， 根據(jù)公式計(jì)算比活1.09×106AU/mg；得出ED50＝0.92ng/ml。
活性檢測(cè)結(jié)果見圖9。
實(shí)施例6非融合hbFGF在制備預(yù)防、治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用
1、材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選用正常成年SD大鼠70只，體重300-400g，雌雄不拘，隨機(jī)分7組腦缺血3小時(shí)后再灌流或同時(shí)給予hbFGF低、中、高劑量各一組、生理鹽水組、假手術(shù)組和正常對(duì)照組，每組10只。
1.2大鼠腦缺血及再灌流模型制作 采用Nagasawa’s法加以改良。分離、暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎之，并分離結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈根部，分離左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，分離結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，于左側(cè)頸總動(dòng)脈距末端約2mm處剪一小口，將一單股尼龍細(xì)絲插入頸總動(dòng)脈，經(jīng)分叉部進(jìn)到頸內(nèi)動(dòng)脈，繼續(xù)沿頸內(nèi)動(dòng)脈輕輕推送入顱腔，插入深度共約22～25.0mm，缺血達(dá)3小時(shí)時(shí)撒出細(xì)絲即行再灌流，hbFGF組和生理鹽水組即在再灌流同時(shí)股靜脈滴注hbFGF和生理鹽水，hbFGF低、中、高劑+生理鹽水組顯著減少，說(shuō)明高、中、低劑量的hbFGF均能阻止腦梗塞范圍的擴(kuò)大，且中劑量組較低劑量組的腦梗塞體積百分?jǐn)?shù)明顯減少，而高中劑量組之間、高低劑量組之間無(wú)明顯差異。說(shuō)明hbFGF在中劑量(50ug/kg體重)以下，存在劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系，即隨著hbFGF劑量由5ug-＞50ug/kg體重逐漸增加，腦梗塞體積百分?jǐn)?shù)逐漸減少。而再加大劑量，如hbFGF250ug/kg體重，其效應(yīng)與50ug/kg體重沒有明顯差異，即當(dāng)hbFGF濃度增加到一定量時(shí)，再加大hbFGF劑量就不再出現(xiàn)效應(yīng)增加。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)中選擇的三個(gè)劑量，hbFGF50ug/kg體重功效最佳。
實(shí)施例7非融合hbFGF在制備治療外周神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用1、材料入選對(duì)象340例患者，男190例，女150例，年齡4個(gè)月至76歲，病因以跌傷、擊傷、墜傷、車禍為主；同時(shí)選擇年齡、病情相近的300例為對(duì)照。
2、治療方法(1)采用直流電導(dǎo)入法即導(dǎo)入部位為損傷神經(jīng)的體表投影部位，hbFGF用量為4ug/ml至10ug/ml，共5ml，均勻撒布在100-200cm2的正極電極墊濾紙或紗布上，陰極置于對(duì)側(cè)，電流6-15mA，每日一次，30天為一療程，對(duì)照組則給予溫?zé)岑煼ê透鞣N低、中、高頻電療等物理治療。二組治療前后均進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(縮寫為MNCV)的檢測(cè)。
(2)周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致的肌肉萎縮患者可在肌萎縮部位多點(diǎn)注射。
3、治療效果如下表

4、結(jié)論hbFGF直流電導(dǎo)入或肌萎縮處多點(diǎn)注射法治療周圍神經(jīng)損傷引起的活動(dòng)功能障礙，感覺異常等有明顯療效。
實(shí)施例8非融合hbFGF在制備治療神經(jīng)藥物中的應(yīng)用1、材料入選對(duì)象280例神經(jīng)性耳聾患者，其中男性152例，女性128例，年齡最小10個(gè)月，最大64歲，病程1年內(nèi)為28例，1-10年為190例，11年以上為62例，病因多為藥物中毒、腦膜炎、外傷和突聾等造成。聽力損失多在70-95分貝。
2、治療方法hbFGF配制成4ug/ml，聽宮、聽會(huì)等穴位注射，每日一次，4周為一個(gè)療程。
3、療效評(píng)定痊愈聽力恢復(fù)到25分貝以內(nèi)，頭痛消失，耳鳴消失；顯效聽力提高30分貝；有效聽力提高15分貝無(wú)效聽力未提高，耳鳴頭痛未消失。
4、治療結(jié)果見下表

典型病例王某，男，7歲，三歲因高燒用鏈霉素導(dǎo)致耳聾，左耳聽力損失在95分貝，由于極重聾，患兒不會(huì)說(shuō)話，經(jīng)用hbFGF穴位注射，二個(gè)療程聽力提高40分貝，正常談話的聲音已能聽見，現(xiàn)說(shuō)話基本正常。
一來(lái)自四川的一歲半男孩，因應(yīng)用慶大霉素致聾，腦干誘發(fā)電位檢查為右耳110dB，左耳全聾，經(jīng)hbFGF聽宮、聽會(huì)等穴位注射，每日一次，每次4ug/1ml，，一個(gè)療程后，聽力提高為雙耳70dB，配助聽器可學(xué)習(xí)說(shuō)話。
5、結(jié)論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分析得到，hbFGF具有修復(fù)內(nèi)耳毛細(xì)胞和聽神經(jīng)的既成病變的功能。
hbFGF SEQUENCE LISTING<110> Jinan University<120> nonfusion hbFGF<160>
<170> Patentln version 3.2<210> 1<211> 468<212> DNA<213> Unknown<220>
<223> The translation initiation region of human basic fibroblastgrowth factor was mutated<220>
<221> CDS<222> (1)..(468)<220>
<221> misc_feature<222> (15，54)<223> Y＝T or C<220>
<221> misc_feature<222> (21，24，33，60)<223> n is a，c，g，or t<400> 1atg gct gct ggt agy att acn acn ctg ccg gcn ctg ccg gaa gat ggt48Met Ala Ala Gly Xaa Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15ggt agy ggt gcn ttc ccg ccg ggc cac ttc aag gac ccc aag cgg ctg96Gly Xaa Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30tac tgc aag aac ggg ggc ttc ttc ctg cgc atc cac ccc gac ggc cga 144Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45gtg gac ggg gtc cgc gag aag agc gac cca cac atc aaa cta caa ctt 192Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60caa gca gaa gag aga ggg gtt gtg tct atc aaa gga gtg tgt gca aac 240Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65 70 75 80
cgt tac ctt gct atg aaa gaa gat gga aga tta cta gct tct aaa tgt 288Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95gtt aca gac gag tgt ttc ttt ttt gaa cga ttg gag tct aat aac tac 336Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110aat act tac cgg tca agg aaa tac acc agt tgg tat gtg gca ctg aaa 384Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125cga act ggg cag tat aaa ctt gga tcc aaa aca gga cct ggg cag aaa 432Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140gct aga ctt ttt ctt cca atg tct gct aag agc tga 468Ala Arg Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155<210> 2<211> 155<212> PRT<213> Unknown<220>
<221> misc_feature<222> (5，18)<223> The’Xaa’at location 5 stands for Ser.
<220>
<223> The translation initiation region of human basic fibroblastgrowth factor was mutated<400> 2Met Ala Ala Gly Xaa Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15Gly Xaa Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65 70 75 80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140Ala Arg Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 15權(quán)利要求
1.一種非融合重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因，其特征是其5’端的前60個(gè)堿基序列為ATG GCT GCT GGT AGY ATT ACN ACN CTG CCG GCN CTG CCG GAA GATGGT GGT AGY GGT GCN，其中Y＝T或C，N＝A或T或C或G。
2.一種質(zhì)粒載體，其特征是含有如權(quán)利要求1所述的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒載體，其特征是以pET-3c載體為基礎(chǔ)構(gòu)建的。
4.一種原核表達(dá)系統(tǒng)，其特征是含有如權(quán)2或3所述的載體。
5.如權(quán)利要求4所述的原核表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
6.如權(quán)利要求5所述的原核表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述的大腸桿菌為BL21(DF3)plysS。
7.一種非融合重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其特征是由權(quán)利要求4或5或6所述的原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯表達(dá)產(chǎn)生的。
8.制備如權(quán)利要求7所述重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的方法，其步驟為(1)設(shè)計(jì)合適的PCR引物，通過PCR擴(kuò)增，得到修改過的編碼具有非融合人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DNA序列；(2)將經(jīng)過修改的DNA序列與適當(dāng)?shù)目寺”磉_(dá)載體相連接，得到重組表達(dá)載體；(3)用所說(shuō)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)脑怂拗骷?xì)胞并篩選所得到的被轉(zhuǎn)化的重組工程菌株；(4)在適于表達(dá)所說(shuō)的具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性之多肽的條件下發(fā)酵培養(yǎng)所說(shuō)的被轉(zhuǎn)化的工程菌，收集菌體，破碎離心，分別從離心的上清和沉淀產(chǎn)物中分離并純化所說(shuō)的多肽；(5)純化的步驟依次為離子交換層析-親合層析-凝膠層析，產(chǎn)物純度達(dá)到98％以上。
9.權(quán)利要求7所述的非融合重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于神經(jīng)系統(tǒng)疾病為外周神經(jīng)損傷、急性缺血性腦中風(fēng)或神經(jīng)性耳聾的。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種非融合重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因，該基因的翻譯起始區(qū)經(jīng)過修改后有較高的密碼子偏好性和較低的G+C含量。本發(fā)明還提供含有該基因的載體和原核表達(dá)系統(tǒng)。該基因在本發(fā)明提供的原核表達(dá)系統(tǒng)中有較高的表達(dá)效率。本發(fā)明還涉及一種非融合重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。本發(fā)明還涉及該非融合重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1513991SQ0310888
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月3日
發(fā)明者陳小佳, 孫奮勇, 林劍, 洪岸, 謝秋玲, 張玲, 汪炬, 李志英 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)