專利名稱：一種抗氧化降血脂的口服藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于含有原料或其與不明結(jié)構(gòu)之反應(yīng)產(chǎn)物的醫(yī)用配制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到來(lái)源于植物的材料。
背景技術(shù)：
氧自由基在人類許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用，如衰老、腫瘤的發(fā)生、心腦血管病，臟器缺血——重灌注損傷、老年性癡呆、帕金森氏病、動(dòng)脈硬化、白內(nèi)障、糖尿病并發(fā)癥、酒精性肝損傷、慢性肝炎、肺氣腫等等。隨著對(duì)氧自由基與疾病關(guān)系的理論研究不斷深入，抗氧化劑的應(yīng)用價(jià)值日益受到重視，相關(guān)的抗氧化劑藥品也日益受到人們的重視，有的抗氧化劑甚至作為保健食品的成分而應(yīng)用，如維生素E族、胡蘿卜素、不飽和脂肪酸、輔酶Q10類黃酮類化合物等，所以開(kāi)發(fā)新型的抗氧化劑藥物有十分廣闊的市場(chǎng)前景。
心血管病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率居高不下，是目前人類健康的頭號(hào)殺手，而高血脂癥是心腦血管發(fā)病的主要因素，因此，人們將血脂調(diào)節(jié)藥物的開(kāi)發(fā)作為治療心血管病的重點(diǎn)。目前臨床應(yīng)用的降血脂藥物主要有他汀類、貝特類、膽酸鱉合劑類和煙酸類四大類。
他汀類藥物能特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶，酶可使羥甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆u戊酸，合成膽固醇，此酶受抑制則膽固醇合成減少，還可反饋性刺激細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體增加，使血液中脂蛋白降低，此類藥物控制血脂較好，適用于降低高膽固醇和甘油三酯的高血脂癥患者，常用藥物有洛伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀等。
貝特類藥物能激活過(guò)氧化酶體、激活型增殖體受體，增加脂蛋白脂酶、載脂蛋白AI、AII的基因表達(dá)，減少載脂蛋白ApocIII基因表達(dá)，增加高密度脂蛋白膽固醇濃度，減少載脂蛋白ApocIII濃度，使血中極低密度脂蛋白膽固醇加速降解，降低血中甘油三酯水平，常用藥物有非諾貝特、吉非貝齊、復(fù)方氯貝丁酸鈣等。膽酸鱉合劑口服后在腸道與膽酸結(jié)合，干擾肝腸循環(huán)，阻止膽酸或膽固醇從腸道吸收，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物排出體外，并且促使膽固醇降解，對(duì)甘油三酯無(wú)影響，常用藥物有考來(lái)烯胺。
煙酸及其衍生物類藥物可抑制脂肪組織的脂解作用，降低游離脂肪酸的濃度，減少肝中極低低密度脂蛋白的合成，通過(guò)抑制環(huán)腺苷一磷酸的形成，導(dǎo)致血漿中甘油三酯濃度降低，常用藥物有煙酸、阿西莫司等。
上述藥物中他汀類、貝特類降血脂效果較好，但均存在一定的副作用，他汀類主要不良反應(yīng)為肝功能異常和肌病，貝特類最常見(jiàn)不良反應(yīng)為胃腸道反應(yīng)，其中有的可致結(jié)石，故有膽石或膽囊病的患者禁用，雖然貝特類與他汀類聯(lián)用也十分有效，但是偶有肌病和橫紋肌溶解的發(fā)生等。
我國(guó)目前沒(méi)有降血脂藥物上市，而進(jìn)口的相關(guān)藥物價(jià)格昂貴，普通患者難以承受，因此，開(kāi)發(fā)廉價(jià)的無(wú)副作用的降血脂藥物是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于克服上述藥物的缺點(diǎn)，提供一種抗氧化降血脂的口服藥物。
解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是連翹苷與常規(guī)藥物固體賦形劑按1∶0.25～100重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成固體口服藥劑。連翹苷與常規(guī)藥物液體賦形劑按1∶100～350重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成液體口服藥劑。
本發(fā)明的固體口服藥劑為片劑、顆粒劑、膠囊劑。本發(fā)明的液體口服藥劑為糖漿劑。
本發(fā)明的優(yōu)選配比為連翹苷與常規(guī)藥物固體賦形劑按1∶1～50重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成固體口服藥劑。連翹苷與常規(guī)藥物液體賦形劑按1∶200～350重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成液體口服藥劑。
本發(fā)明的最佳配比為連翹苷與常規(guī)藥物固體賦形劑按1∶7重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成固體口服藥劑。連翹苷與常規(guī)藥物液體賦形劑按1∶300重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成液體口服藥劑。
連翹苷(Forsythia，Phillyrin，)是從我國(guó)常用中藥連翹或連翹葉中提取分離得到的，連翹在我國(guó)廣泛栽培，資源十分豐富，是一類極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的降血脂藥物。連翹苷的分子結(jié)構(gòu)式為 連翹苷為木脂素甙類化合物，化學(xué)式為C27H34O11分子量為534，熔點(diǎn)181℃。
連翹苷的制備方法如下將連翹葉粉碎，加入10倍量甲醇回流提取4小時(shí)，過(guò)濾，濾液濃縮至提取液的5-10％體積，加入3倍體積的20％中性醋酸鉛溶液，使沉淀完全，過(guò)濾，濾液濃縮至無(wú)醇味，沸水提取2小時(shí)，提取液放冷，待沉淀完全后，過(guò)濾，沉淀用熱水溶解，通入H2S氣體脫鉛至無(wú)沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，濾液濃縮后用乙醇溶解，重結(jié)晶即得連翹苷。
本發(fā)明的活性成分連翹苷經(jīng)發(fā)明人委托試驗(yàn)單位進(jìn)行了藥效試驗(yàn)，藥效試驗(yàn)結(jié)果表明連翹苷具有良好的清除羥自由基的作用，可以有效抑制組織、細(xì)胞器水平的氧化損傷作用。連翹苷不同劑量組組織中的超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量均低于模型對(duì)照組，表現(xiàn)出顯著差異或極顯著差異，與正常對(duì)照組的超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量接近。連翹苷有延緩衰老的作用，可以有效的提高衰老小鼠抗氧化酶系的活力，減少衰老產(chǎn)物過(guò)氧化脂質(zhì)在組織中的積累。連翹苷有良好的降低營(yíng)養(yǎng)性高血脂癥小鼠血脂的作用。


圖1是本發(fā)明活性成分連翹苷對(duì)肝線粒體腫脹度的影響圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1以制備本發(fā)明產(chǎn)品片劑1000片為例所用原料和輔料及其配比如下連翹苷 30g
淀粉150g乳糖120g其制備工藝按制劑學(xué)片劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，每片重0.3g，含連翹苷30mg。
用法用量口服，每次一片，一日三次，小兒酌減。
實(shí)施例2以制備本發(fā)明產(chǎn)品膠囊劑1000粒為例所用原料和輔料及其配比如下連翹苷 30g玉米淀粉35g硬脂酸鎂5g其制備工藝按制劑學(xué)膠囊劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，每粒膠囊含連翹苷30mg。
用法用量口服，每次一粒，一日三次，小兒酌減。
實(shí)施例3以制備本發(fā)明產(chǎn)品顆粒劑1000g為例所用原料和輔料及其配比如下連翹苷 10g蔗糖粉 650g糊精340g制備工藝按制劑學(xué)顆粒劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，1g含連翹苷10mg。
用法用量口服，每次3g，一日三次，小兒酌減。
實(shí)施例4以制備本發(fā)明產(chǎn)品糖漿劑1000mL為例所用原料和輔料及其配比如下連翹甙 3g蔗糖600g苯甲酸 1g蒸餾水 加至1000mL其制備工藝按制劑學(xué)糖漿劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，1mL含連翹苷3mg。
用法用量口服，每次10mL，一日三次，小兒酌減。
為了驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明的活性成分連翹苷委托試驗(yàn)單位進(jìn)行了藥效實(shí)驗(yàn)，各種藥效試驗(yàn)情況如下1、連翹苷的體外抗氧化作用試驗(yàn)?zāi)康挠^測(cè)連翹苷對(duì)自由基的清除作用和連翹苷對(duì)自由基導(dǎo)致的組織及細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
受試藥物連翹苷(批號(hào)0821-9903)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，經(jīng)高效液相峰面積歸一化法測(cè)定含量大于99.54％，連翹苷用0.3％的羧甲基纖維素鈉按劑量要求配制成相應(yīng)濃度。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠由陜西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重20～22g，動(dòng)物合格證為醫(yī)動(dòng)字08-24號(hào)。
(1)連翹苷清除·OH效果的測(cè)定試驗(yàn)方法按Smirnoff等的方法改進(jìn)用FeSO4+H2O2產(chǎn)生·OH，以·OH氧化水楊酸所得產(chǎn)物測(cè)A510，以(對(duì)照組-加藥組/對(duì)照組)×100％計(jì)算·OH的清除率。
試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1連翹苷對(duì)·OH的清除作用(N＝6)組別 劑量(μg/ml) A510nm抑制率(％)對(duì)照組0 0.285±0.009-連翹苷組1 0.167 0.227±0.003**20.35連翹苷組2 0.333 0.205±0.020**28.07連翹苷組3 0.667 0.194±0.019**31.93統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示.兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，**P＜0.01。
試驗(yàn)結(jié)論連翹苷在0.167μg/ml濃度時(shí)對(duì)·OH就有一定的清除能力，數(shù)據(jù)差異達(dá)極顯著水平。說(shuō)明連翹苷對(duì)·OH具有較強(qiáng)的清除作用。連翹苷的濃度與清除率之間呈較好的量效關(guān)系。
(2)連翹苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)小鼠血紅細(xì)胞溶血的抑制作用試驗(yàn)方法各取紅細(xì)胞懸浮液1ml，加不同濃度的連翹苷，最后加100mmol/LH2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃作用1小時(shí)，生理鹽水稀釋5倍，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液測(cè)A415，計(jì)算溶血度和抑制率。
表2連翹苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)小鼠血紅細(xì)胞(RBC)溶血的影響(N＝6)組別 劑量(μg/ml) A510nm抑制率(％)對(duì)照組 0 0.285±0.009 -連翹苷組1 0.167 0.227±0.003**20.35連翹苷組2 0.333 0.205±0.020**28.07連翹苷組3 0.667 0.194±0.019**31.93試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，**P＜0.01。
試驗(yàn)結(jié)論H2O2加入后溶血量顯著高于正常組，H2O2使紅細(xì)胞膜受氧化而損傷，胞內(nèi)容物外流，連翹苷可顯著抑制紅細(xì)胞氧化性溶血的發(fā)生。表明連翹苷可抑制氧化損傷，保護(hù)紅細(xì)胞膜，且呈良好的量效關(guān)系。
(3)連翹苷對(duì)小鼠組織及肝線粒體和微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛生成的影響試驗(yàn)方法迅速取取血后小鼠的腦、心、肝，用冷的生理鹽水洗凈后冰浴下勻漿，制成0.5％的懸浮液備測(cè)定用；取肝組織在冰浴下以0.25mol/L蔗糖制成10％勻漿，用BeckmanL8-80離心機(jī)的80Ti轉(zhuǎn)頭3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心20分鐘，沉淀用冷的0.25mol/L蔗糖水溶液洗滌兩次，合并上清液，用80Ti轉(zhuǎn)頭10000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心20分鐘，所得沉淀為線粒體，用10mmol/L Tris-HCl緩沖液配成含蛋白質(zhì)0.5mg/ml線粒體懸浮液備用；上清液用80Ti轉(zhuǎn)頭42000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心30分鐘，所得沉淀即為微粒體，用10mmol/L Tris-HCl緩沖液配成含蛋白質(zhì)0.5mg/ml微粒體懸浮液備用。
1ml0.5％組織勻漿或蛋白含量為0.5mg/mL(用Lowry法測(cè)定)肝線粒體和微粒體，加不同濃度連翹苷，6mmol/L FeSO4100μl，最后加60mmol/L H2O240μl，在37℃下水浴1小時(shí)后，加入1ml 15％三氯乙酸結(jié)束反應(yīng)，再加入1ml0.67％硫代巴比妥酸，于沸水浴中顯色15分鐘，冷卻后離心，測(cè)上清液的A532nm，檢測(cè)組織或膜組分脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的生成量。
試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。
表3連翹苷對(duì)小鼠組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛生成的影響(N＝6)組 劑量 腦心 肝別 (μg/ml) A532nm抑制率(％)A532nm抑制率(％) A532nm抑制率(％)

表4連翹苷對(duì)小鼠肝線粒體和微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛生成的影響(N＝6)組別 劑量線粒體 微粒體(μg/ml)A532nm抑制率(％) A532nm抑制率(％)正常組 0 0.07±0.02**- 0.02±0.01**-模型組 0 0.76±0.09 - 0.94±0.09 -F1 1.5 0.43±0.11*43.85 0.48±0.09**48.67F2 3.0 0.24±0.06**69.24 0.34±0.05**63.84F3 4.5 0.22±0.06**71.47 0.24±0.01**75.08F4 6.0 0.11±0.02**85.60 0.13±0.03**86.32統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示.兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；F代表連翹苷。
試驗(yàn)結(jié)論由表3、表4結(jié)果表明模型組丙二醛含量比正常組顯著增加，說(shuō)明·OH可誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，若同時(shí)加入連翹苷，丙二醛生成量比只加·OH組顯著減少，說(shuō)明連翹苷可抑制·OH誘導(dǎo)的氧化作用，此抑制作用有一定的量效關(guān)系。
(4)小鼠肝線粒體腫脹度的測(cè)定試驗(yàn)方法3ml肝線粒體懸浮液，加不同濃度連翹苷后，以5μmol/L FeSO4和0.1mmol/L維生素C激發(fā)線粒體膨脹，測(cè)不同時(shí)間的A520，確定線粒體受損傷程度。
試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。
試驗(yàn)結(jié)論參見(jiàn)圖1，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)各組在520nm吸光值下降，說(shuō)明線粒體膜被氧化損傷而發(fā)生了腫脹，其中對(duì)照組下降幅度最大，說(shuō)明·OH誘導(dǎo)加速了氧化損傷，腫脹嚴(yán)重。加連翹苷組與對(duì)照組相比下降趨勢(shì)減緩，表明連翹苷可抑制·OH所致氧化損傷程度，腫脹減輕。而且連翹苷高濃度組損傷程度低于低濃度組，這表明連翹苷作用效果呈劑量依賴關(guān)系。
2、連翹苷對(duì)小鼠氧化損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)?zāi)康挠^測(cè)連翹苷對(duì)四氧嘧啶致小鼠氧化損傷的保護(hù)作用。
受試藥物連翹苷(批號(hào)0821-9903)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所經(jīng)高效液相峰面積歸一化法測(cè)定含量大于99.54％，連翹苷用0.3％的羧甲基纖維素鈉按劑量要求配制成相應(yīng)濃度。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠由陜西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重20～22g，動(dòng)物合格證為醫(yī)動(dòng)字08-24號(hào)。
試驗(yàn)用化學(xué)試劑四氧嘧啶為Sigma公司產(chǎn)品，鄰苯三酚、硫代巴比妥酸為天津市天河化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，過(guò)氧化氫、愈創(chuàng)木酚為上海試劑三廠產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)方法50只ICR小鼠，按體重隨機(jī)分為5組，雌雄各半。各組動(dòng)物均隨機(jī)進(jìn)食飲水，其中小劑量組按每天10mg/kg、中劑量組按每天30mg/kg、大劑量組按每天90mg/kg的連翹苷0.4ml灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等體積0.3％羧甲基纖維素鈉溶液，20天后禁食不禁水16小時(shí)，除正常對(duì)照組外的各組動(dòng)物均腹腔注射四氧嘧啶150mg/kg，72小時(shí)后稱重，眼眶采血，檸檬酸鈉抗凝，血漿或適當(dāng)稀釋的溶血液用于測(cè)定超氧化物歧化酶、過(guò)氧化脂質(zhì)和血紅蛋白以及過(guò)氧化物酶活性。肝和腦分別用0.05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH為7.8，低溫勻漿，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，上清液用于測(cè)定超氧化物歧化酶、丙二醛、過(guò)氧化物酶。
測(cè)試指標(biāo)及方法血紅蛋白測(cè)定用氰化高鐵比色法，超氧化物歧化酶測(cè)定用鄰苯三酚自氧化法，過(guò)氧化物酶測(cè)定用愈創(chuàng)木酚比色法，丙二醛測(cè)定用硫代巴比妥酸反應(yīng)比色法。
發(fā)明人委托試驗(yàn)單位采用本發(fā)明的活性成分連翹苷對(duì)小鼠紅細(xì)胞抗氧化作用的影響、對(duì)肝臟抗氧化作用的影響、對(duì)小鼠腦抗氧化作用的影響、對(duì)小鼠心臟抗氧化作用的影響進(jìn)行了試驗(yàn)，各種試驗(yàn)結(jié)果如下(1)連翹苷對(duì)小鼠紅細(xì)胞抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5連翹苷對(duì)小鼠紅細(xì)胞抗氧化作用的影響(X±s，n＝10)

注*表示與模型對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)論紅細(xì)胞超氧化物歧化酶為抗氧化酶類，過(guò)氧化脂質(zhì)為脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，血紅蛋白與機(jī)體總耗氧量有關(guān)。模型組的超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化脂質(zhì)、血紅蛋白均高于正常對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有顯著意義，說(shuō)明紅細(xì)胞氧化損傷模型的制造是成功的。不同加藥組的超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化脂質(zhì)、血紅蛋白均低于模型對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有顯著意義，說(shuō)明連翹苷可提高紅細(xì)胞的抗氧化能力。
(2)連翹苷對(duì)肝臟抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。
表6連翹苷對(duì)小鼠肝臟抗氧化作用的影響(X±s，n＝10)

注*表示與模型對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示.兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論肝臟的超氧化物歧化酶活性、丙二醛和過(guò)氧化物酶活性均高于正常對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有顯著意義，說(shuō)明用四氧嘧啶制造肝臟的氧化損傷模型是成功的，連翹苷不同劑量組的超氧化物歧化酶活性、丙二醛和過(guò)氧化物酶活性均低于模型對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有極顯著意義。
(3)連翹苷對(duì)小鼠腦抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。
表7連翹苷對(duì)小鼠腦抗氧化作用的影響(X±s，n＝10)

注*表示與模型對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示。兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)論模型對(duì)照組的超氧化物歧化酶活性、丙二醛和過(guò)氧化物酶活性均高于正常對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有顯著意義，連翹苷不同劑量組的超氧化物歧化酶活性、丙二醛和過(guò)氧化物酶活性均低于模型對(duì)照組，也表現(xiàn)出顯著差異或極顯著差異。
(4)連翹苷對(duì)小鼠心臟抗氧化作用的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。
表8連翹苷對(duì)小鼠心臟抗氧化作用的影響(X±s，n＝10)

注*表示與模型對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示.兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)論模型對(duì)照組的超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性、丙二醛含量均高于正常對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有顯著意義。連翹苷不同劑量組的超氧化物歧化酶活性、丙二醛和過(guò)氧化物酶活性均低于模型對(duì)照組，也表現(xiàn)出顯著差異或極顯著差異。
3、連翹苷對(duì)小鼠的抗衰老作用試驗(yàn)?zāi)康挠^測(cè)連翹苷對(duì)小鼠的抗衰老作用。
受試藥物連翹苷(批號(hào)0821-9903)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所經(jīng)高效液相峰面積歸一化法測(cè)定含量大于99.54％，連翹苷用0.3％的羧甲基纖維素鈉按劑量要求配制成相應(yīng)濃度。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠由陜西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重20～22g，動(dòng)物合格證為醫(yī)動(dòng)字08-24號(hào)。
試驗(yàn)用化學(xué)試劑四氧嘧啶為Sigma公司產(chǎn)品，鄰苯三酚、硫代巴比妥酸為天津市天河化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，過(guò)氧化氫、愈創(chuàng)木酚為上海試劑三廠產(chǎn)品。
試驗(yàn)方法選用1月齡ICR小鼠12只為少齡對(duì)照組，12月齡ICR小鼠36只，按體重隨機(jī)分為高齡對(duì)照組、高齡給藥組1和高齡給藥組2。各組動(dòng)物均雌雄各半。高齡給藥組1和高齡給藥組2分別以每天30mg/kg和90mg/kg的劑量灌胃，少齡對(duì)照組和高齡對(duì)照組以等體積0.3％羧甲基纖維素鈉蒸餾水灌胃。21天后處死動(dòng)物，眼眶采血，取心臟、腦和肝臟測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。
線粒體的制備取小鼠肝臟1g加7ml 0.25mol/Tris-HCl溶液研磨，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，上清液于10000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，收集線粒體。
指標(biāo)及測(cè)定方法單胺氧化酶-B活性采用紫外吸收法，超氧化物歧化酶活性測(cè)定用鄰苯三酚自氧化法，丙二醛含量測(cè)定用硫代巴比妥酸反應(yīng)比色法，過(guò)氧化物酶活性測(cè)定用愈創(chuàng)木酚法。
發(fā)明人委托試驗(yàn)單位采用本發(fā)明的活性成分連翹苷對(duì)心臟丙二醛含量、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活性的影響進(jìn)行了試驗(yàn)，連翹苷對(duì)腦組織丙二醛含量和超氧化物歧化酶、單胺氧化酶-B活性的影響進(jìn)行了試驗(yàn)，連翹苷對(duì)線粒體中丙二醛含量、單胺氧化酶-B活性的影響進(jìn)行了試驗(yàn)，連翹苷對(duì)小鼠肝指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響進(jìn)行了試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如下(1)連翹苷對(duì)心臟丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9表9連翹苷對(duì)小鼠心臟MDA含量、POD、SOD酶活性的影響(X±s，n＝12)

注*P＜0.05，**P＜0.01表示與高齡對(duì)照組相比較。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示.兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)論連翹苷可抑制高齡小鼠心臟丙二醛的生成，數(shù)據(jù)差異有顯著意義?？商岣叱趸锲缁傅幕钚?、過(guò)氧化物酶的活性，在給藥量為90mg/kg時(shí)超氧化物歧化酶的數(shù)據(jù)差異有極顯著意義，在給藥量為30mg/kg時(shí)過(guò)氧化物酶活性的數(shù)據(jù)差異有顯著意義。
(2)連翹苷對(duì)腦組織丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性、單胺氧化酶-B活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10。
表10連翹苷對(duì)小鼠腦MDA含量和SOD、MAO-B酶活性的影響(X±s，n＝12)

*P＜0.05，**P＜0.01表示與高齡對(duì)照組相比較統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示.兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)論連翹苷可以降低高齡小鼠腦組織中的丙二醛含量，同時(shí)在一定劑量條件下對(duì)機(jī)體內(nèi)的超氧化物歧化酶活力有顯著的增強(qiáng)作用，對(duì)單胺氧化酶-B的活性有明顯的抑制作用。
(3)連翹苷對(duì)線粒體中丙二醛含量、單胺氧化酶-B活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11。
表11連翹苷對(duì)小鼠線粒體中MDA含量、MAO-B活性的影響(X±s，n＝12)組別 劑量(mg/kg.d) MDA(nmol/mg) MA0-B(u/mg.hr)少齡對(duì)照組 0 38.29±1.52**2.00±0.87**高齡對(duì)照組 0 70.24±2.61 7.59±0.72連翹苷小劑量組 30 60.52±10.65*4.66±0.74**連翹苷大劑量組 90 40.08±0.44**3.37±0.14***P＜0.05，**P＜0.01表示與高齡對(duì)照組相比較統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示.兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)論丙二醛和單胺氧化酶-B都隨衰老程度的增加而升高，與衰老密切相關(guān)。連翹苷可顯著地降低高齡小鼠線粒體中丙二醛含量，抑制單胺氧化酶-B的活性。
(4)連翹苷對(duì)小鼠肝指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。
表12連翹苷對(duì)小鼠肝指數(shù)、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響(X±s，n＝12)組別 肝指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g) 脾指數(shù)(mg/g)少齡對(duì)照組 51.08±4.36**2.04±0.56**5.90±0.88*高齡對(duì)照組 34.35±6.56 0.61±0.15 3.17±1.16連翹苷小劑量組 39.35±4.54*0.90±0.08**4.06±1.08連翹苷大劑量組 39.61±4.29*0.98±0.13**3.59±0.81*P＜0.05，**P＜0.01表示與高齡對(duì)照組相比較。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以X±s表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論連翹苷顯著增加高齡小鼠肝指數(shù)，說(shuō)明對(duì)小鼠的肝有一定的保護(hù)作用。對(duì)高齡小鼠的脾指數(shù)沒(méi)有明顯作用。老年小鼠的胸腺隨衰老程度的增加而逐漸變小，連翹苷顯著增加小鼠的胸腺指數(shù)，說(shuō)明連翹苷可延緩衰老。
4、連翹苷對(duì)營(yíng)養(yǎng)性高血脂癥小鼠的影響試驗(yàn)?zāi)康挠^測(cè)連翹苷對(duì)營(yíng)養(yǎng)性高血脂小鼠的降血脂作用。
受試藥物連翹苷(批號(hào)0821-9903)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所經(jīng)高效液相峰面積歸一化法測(cè)定含量大于99.54％。連翹苷用0.3％的羧甲基纖維素鈉按劑量要求配制成相應(yīng)濃度。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠由陜西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重20～22g，動(dòng)物合格證為醫(yī)動(dòng)字08-24號(hào)。
試驗(yàn)用化學(xué)試劑測(cè)定血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的試劑盒由北京中生生物工程高科技公司生產(chǎn)，陽(yáng)性對(duì)照藥非諾貝特由中國(guó)藥科大新藥開(kāi)發(fā)中心廣州威爾曼藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)020801)。
指標(biāo)及測(cè)定方法體重和腹腔內(nèi)脂肪用精確度為0.01g的電子天平稱量，計(jì)算脂肪系數(shù)(脂肪系數(shù)＝脂肪重量/體重×100)；脂肪細(xì)胞的記數(shù)和直徑測(cè)量方法為取腹腔同一部位的脂肪一小塊，用2.5％甲醛乙醇液固定，石蠟切片，HE染色，在400倍顯微鏡下記數(shù)全視野中脂肪細(xì)胞數(shù)，并用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)物鏡測(cè)微尺校正的目鏡測(cè)微器測(cè)脂肪細(xì)胞的最大徑與最小徑；肝臟膽固醇測(cè)定采用鄰苯二甲醛法；血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均用美國(guó)ACE公司全自動(dòng)生化分析儀采用酶法測(cè)定。
試驗(yàn)方法ICR小鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、連翹苷高劑量組、連翹苷中劑量組、連翹苷低劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組，劑量見(jiàn)表13。正常對(duì)照組喂普通飼料由陜西省中藥醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，其余5組飼喂高脂飼料(由陜西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，配方為基礎(chǔ)飼料79％、膽固醇1％、蛋黃粉10％、豬油10％)。三周后各組動(dòng)物均禁食12小時(shí)后稱重。正常對(duì)照組與其他各組的體重相比，數(shù)據(jù)差異顯著，說(shuō)明小鼠的高血脂癥模型已經(jīng)形成。隨后按表1劑量對(duì)各組小鼠等體積灌胃給藥，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃等體積.3％羧甲基纖維素鈉。各種藥物均用0.3％羧甲基纖維素鈉制成懸浮液。給藥三周后，各組動(dòng)物眼眶采血，離心分離血清，隨即引頸處死，分離腹腔脂肪和肝臟備用。
表13動(dòng)物分組及劑量

*表示與正常對(duì)照組相比，經(jīng)t檢驗(yàn)，*P＜0.05。
發(fā)明人委托試驗(yàn)單位采用本發(fā)明的活性成分連翹苷對(duì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)性高血脂癥小鼠腹腔脂肪濕重和脂肪細(xì)胞大小的影響，連翹苷對(duì)高血脂癥小鼠血脂及肝臟總膽固醇含量的影響，進(jìn)行了試驗(yàn)，各種試驗(yàn)結(jié)果如下(1)連翹苷對(duì)營(yíng)養(yǎng)性高血脂癥小鼠腹腔脂肪濕重和脂肪細(xì)胞大小的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表14。
表14F連翹苷對(duì)高血脂癥小鼠脂肪濕重和脂肪細(xì)胞大小的影響(X±s，n＝12)組別 脂肪濕重(g) 脂肪系數(shù)(％) 脂肪細(xì)胞數(shù)(視野)最大徑(um) 最小徑(um)正常對(duì)照組 0.53±0.10** 2.04±0.10** 123±13** 109±11**32±4**模型對(duì)照組 0.89±0.223.16±0.67 75±7 161±12 64±7連翹苷低劑量組 0.73±0.132.64±0.37*99±6** 125±10**50±5**連翹苷中劑量組 0.71±0.10* 2.42±0.37*103±12** 114±10**44±5**連翹苷高劑量組 0.72±0.192.37±0.49*89±7** 142±6** 57±4**陽(yáng)性對(duì)照組 0.66±0.08** 2.44±0.20*104±7**112±12**51±3**注*表示與模型對(duì)照組相比*P＜0.05，**P＜0.01。
試驗(yàn)結(jié)論模型對(duì)照組的脂肪濕重、脂肪系數(shù)和脂肪細(xì)胞直徑均大于正常對(duì)照組，而脂肪細(xì)胞數(shù)目小于正常對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有顯著意義，說(shuō)明其腹腔內(nèi)脂肪蓄積明顯增多。連翹苷三個(gè)劑量組的脂肪系數(shù)和脂肪細(xì)胞直徑均小于模型對(duì)照組，脂肪細(xì)胞數(shù)目多于模型對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有顯著意義。
(2)連翹苷對(duì)高血脂癥小鼠血脂及肝臟總膽固醇含量的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表15。
表15連翹苷對(duì)高血脂癥小鼠血脂及肝臟總膽固醇的影響(X±s，n＝12)組別TG(mmol/l)TC(mmol/l)HDL-C(mmol/l) LDL-C(mmol/l) 肝臟TC正常對(duì)照組 0.53±0.14** 3.05±0.35** 2.29±0.15** 1.13±0.30** 3.62±0.51**模型對(duì)照組 0.72±0.13 3.87±0.511.74±0.211.90±0.267.16±1.09連翹苷低劑量組 0.60±0.08*3.38±0.34* 2.08±0.12* 1.70±0.24* 6.20±0.61*連翹苷中劑量組 0.62±0.05*3.35±0.35* 2.20±0.31** 1.59±0.27* 5.39±0.78**連翹苷高劑量組 0.60±0.06*3.28±0.51* 2.18±0.30* 1.64±0.405.09±0.93**陽(yáng)性對(duì)照組 0.55±0.10** 3.32±0.43* 2.13±0.32** 1.62±0.21* 4.83±0.75**注*表示與模型對(duì)照組相比t檢驗(yàn)，*P＜0.05，**P＜0.01。
試驗(yàn)結(jié)論模型對(duì)照組的血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白高于正常對(duì)照組，高密度脂蛋白低于正常對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異極顯著，說(shuō)明已形成高血脂癥模型。連翹苷中劑量組、大劑量組的血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白低于模型對(duì)照組，高密度脂蛋白高于模型對(duì)照組，說(shuō)明其對(duì)血脂調(diào)節(jié)有良好的作用。正常對(duì)照組及各給藥組肝臟總膽固醇含量皆低于模型對(duì)照組，說(shuō)明連翹苷也有降低肝臟膽固醇的作用。
權(quán)利要求
1.一種抗氧化降血脂的口服藥物，其特征在于連翹苷與常規(guī)藥物固體賦形劑按1∶0.25～100重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成固體口服藥劑；連翹苷與常規(guī)藥物液體賦形劑按1∶100～350重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成液體口服藥劑。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種抗氧化降血脂的口服藥物，其特征在于所說(shuō)的固體口服藥劑為片劑、顆粒劑、膠囊劑；所說(shuō)的液體口服藥劑為糖漿劑。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種抗氧化降血脂的口服藥物，其中連翹苷與常規(guī)藥物固體賦形劑按1∶1～50重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成固體口服藥劑；連翹苷與常規(guī)藥物液體賦形劑按1∶200～350重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成液體口服藥劑。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種抗氧化降血脂的口服藥物，其中連翹苷與常規(guī)藥物固體賦形劑按1∶7重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成固體口服藥劑；連翹苷與常規(guī)藥物液體賦形劑按1∶300重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成液體口服藥劑。
全文摘要
一種抗氧化降血脂的口服藥物，連翹苷與常規(guī)藥物固體賦形劑按1∶0.25～100重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成固體口服藥劑；連翹苷與常規(guī)藥物液體賦形劑按1∶100～350重量比混合，按常規(guī)制劑工藝制成液體口服藥劑。本發(fā)明的活性成分連翹苷經(jīng)藥效試驗(yàn)表明，它具有良好的清除羥自由基的作用，可以有效抑制組織、細(xì)胞器水平的氧化損傷作用。不同劑量組組織中的超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量均低于模型對(duì)照組與正常對(duì)照組接近。有延緩衰老的作用，可以有效的提高衰老小鼠抗氧化酶系的活力，減少衰老產(chǎn)物過(guò)氧化脂質(zhì)在組織中的積累。有良好的降低營(yíng)養(yǎng)性高血脂癥小鼠血脂的作用。可進(jìn)入初期臨床觀察試驗(yàn)。
文檔編號(hào)A61P39/06GK1452973SQ0310807
公開(kāi)日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2003年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月23日
發(fā)明者李發(fā)榮, 王喆之, 楊建雄 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)