專利名稱：新的血管內皮細胞生長抑制劑同種型的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用于治療其中抑制血管生成較為有利的疾病(例如，治療實體瘤、糖尿病性視網膜病、卡波西肉瘤、銀屑病和類風濕性關節(jié)炎)的組合物。具體地，本發(fā)明涉及新的血管內皮細胞生長抑制劑(VEEGI)同種型、它們的DNA及相關蛋白序列、其組合物及變體以及它們在治療血管生成驅動的疾病中的用途。
背景技術：
在正常生理條件下，人類和動物在非常特殊有限的情況下經歷血管生成(組織或器官內新血管的生成)。例如，血管生成正常地見于傷口愈合、胚胎發(fā)育、以及黃體、子宮內膜和胎盤的形成中。術語“內皮”是指襯在漿液腔、淋巴管和血管內的薄層扁平上皮細胞。術語“抗血管生成”或“血管生成抑制活性”通常指分子抑制血管生成的能力。
控制性和非控制性血管生成兩者被認為是以相似的方式進行的。內皮細胞活躍地參與炎癥、細胞粘附、凝結、血栓形成、纖維蛋白溶解和血管生成。內皮細胞及外膜細胞，由基底膜環(huán)繞，形成毛細血管。血管生成起始于內皮細胞和白細胞釋放的酶對基底膜的侵蝕。沿血管腔排列的內皮細胞隨之自基底膜向外突出。血管生成刺激物誘導內皮細胞遷移穿過侵蝕的基底膜。遷移細胞形成脫離親本血管的“芽突”，內皮細胞在此處經歷有絲分裂并增殖。內皮芽突彼此融合形成毛細管環(huán)，產生新血管。
持續(xù)非調控性血管生成在多種疾病狀態(tài)、腫瘤轉移和內皮細胞異常生長中發(fā)生，并助長了這些疾病中觀察到的病理損傷。存在非調控性血管生成的各種病理疾病狀態(tài)被集合起來作為血管生成依賴性或血管生成相關性疾病。
在腫瘤生長期間，內皮細胞增殖、侵入基質、向血管生成刺激物如癌細胞遷移、與血管周圍細胞和基質細胞相互作用并最終形成連接腫瘤組織和循環(huán)的毛細管(J.Folkman(1995)Nat.Med 127-31)。雖然毋庸置疑，調控血管生成的高度復雜機制尚有待了解，但逐漸變得清晰的是該過程的起始和終止是血管生成的正調節(jié)子和負調節(jié)子之間平衡的結果。許多血管生成因子(常在腫瘤組織中顯著上調)已有描述，包括成纖維細胞生長因子家族的數個成員，例如FGF-I(G.Gimenez-Gallego等(1985)Science 230.1385)、FGF-2(L.Schweigerer等(1987)Nature 325257)以及血管內皮細胞生長因子家族(VEGF)的那些成員(D.W.Leung等(1989)Science 2461306)，還有這些生長因子的受體(L.W.Burrus和B.B.Olwin(1989)J Biol.Chem.26418647；S.Wemistrom等(1991)Growth Factors 4197；B.Tennan等(1992)Biochem.Biophys.Res.Comm.1871579.C.de Vries等，(1992)Science 255989)。最近，發(fā)現兩種新的蛋白因子，即增殖素和增殖素相關蛋白，參與調控小鼠胎盤新血管形成的起始和停止(Jackson D，等Science 266，1581-4，1994)。特此將本文上文和下文引用的所有文獻特別地整體并入作為參考。
已經報道了數種血管生成抑制劑，包括血小板反應蛋白(D.J Good等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.876624)、制管張素(angiostatin)(M.S.O′Reilly等(1994)Cell 79315)、內抑素(endostatin)(M.S.O′Reilly等(1997)Cell 88277)和血小板因子-4(E.Maione等(1997)Science 24777)。顯然正常血管生成在需要時迅速激活，并且當不再需要時即刻終止，而病理性血管生成一旦起始，通常拖延并難以停止。這表明在正常血管生成過程中行使功能的負調控機制在病理性血管生成過程中喪失或者抑制。已有提示，由許多前體釋放血管生成抑制劑的蛋白水解活性可部分地解釋血管生成的下調，正如從凝血酶原蛋白水解激活制管張素以及從膠原蛋白XVIII蛋白水解激活內抑素所表明的那樣(M.S.O′Reilly，(1997)Cell 88277)。盡管許多已知的血管生成調節(jié)劑是多效性的，可作用于其它細胞類型以及產生該調節(jié)劑的細胞類型，但人們可以想到內皮細胞可能產生自分泌因子以抑制血管生成過程或者維持成熟脈管系統(tǒng)的靜止。因而本申請的目標在于描述一類特異性地由內皮細胞表達的稱之為血管內皮細胞生長抑制劑(VEGI)的新的自分泌血管生成負調節(jié)劑。
公開的PCT申請WO 99/23105公開了VEGI蛋白(VEGI-174)和VEGI-251剪接變體以及它們相應的核苷酸序列，特此將其全文公開的內容特別并入本申請作為參考。描述了VEGI-174的N-末端截短形式的抗-血管生成活性。蛋白VEGI-174與人類TNFα、TNFβ以及Fas配體表現出20-30％的序列同源性。利用cDNA克隆作為模板的體外轉錄和翻譯實驗產生了分子量為22kD的蛋白，與預測的174個氨基酸的開放讀框一致。該蛋白在文中稱之為VEGI-174。該蛋白的疏水性分析預測了緊接在N-末端區(qū)的14個非疏水氨基酸后面的12個氨基酸的疏水區(qū)。這與II型跨膜蛋白的結構相符，類似于TNF(B.B.Aggarwal和K.Natarajan(1996)Eur.CytokineNews.793)。也描述了VEGI同種型。該蛋白在文中稱之為VEGI-251，它被預測為膜蛋白。
最近來自多種譜系的22種不同類型的培養(yǎng)細胞的總RNA制備物的RNA分析表明該蛋白的轉錄僅能在內皮細胞的兩種細胞系中檢測到HUVE細胞和早期傳代的人類靜脈內皮細胞。在稍后傳代的人類靜脈內皮細胞中未檢測到mRNA，也未見于人類動脈細胞中。作為強烈對比，TNF家族成員主要地在免疫細胞中表達(B.B.Aggarwal和K.Natarajan(1996)，同前)。例如，TNFα由巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞和T細胞產生，而TNFβ主要由有絲分裂原刺激的T淋巴細胞和白細胞產生。同樣地，Fas及其它TNF家族成員CD27、CD30、CD40、OX40和4-1 BBr的配體，均在免疫系統(tǒng)的細胞類型中表達。利用多組織RNA印跡，發(fā)現EGI轉錄本在胎盤、肺、腎、骨骼肌、腦、肝、胸腺、睪丸、卵巢和外周血淋巴細胞中表達。
抑制腫瘤血管生成是治療癌癥例如乳腺癌及其它實體瘤的重要方法。首先，腫瘤生長和轉移有賴于血管生成。已在模型系統(tǒng)中表明通過特異性誘導的凝結封閉腫瘤新生血管的毛細管，能引起腫瘤脈管系統(tǒng)的根除，并導致腫瘤的消除。另外，已有提示內皮細胞在腫瘤組織中高度增殖，但在正常組織中通常是靜止的。這使得腫瘤的新血管形成成為特殊和引人注目的靶。此外，盡管癌細胞的特征在不同的腫瘤中可能極大地不同，多數實體瘤中的內皮細胞群卻可能是未轉化的，因而保持同質。這對于人類和動物受試者都適用。因而有可能開發(fā)出能夠普遍地用于治療許多不同癌癥的抗血管生成治療劑。
除了實體瘤之外，其它重要的血管生成驅動的疾病包括糖尿病性視網膜病、卡波西肉瘤、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎?；加羞@些疾病的患者可受益于抗-血管生成治療方法。
本發(fā)明鑒定并描述了VEGI蛋白家族成員新同種型的序列、功能、組合物和治療用途。兩個新同種型分別被命名為VEGI-192a和VEGI-192b，包括就其表達、分泌和抗-血管生成性質而言充分改變了蛋白性質的新的N-末端序列。
提供了命名為VEGI-192a和VEGI-192b的兩個新VEGI同種型，兩者均由192個氨基酸殘基構成。兩個同種型表現出內皮細胞特異性的表達并與早先描述的VEGI-174和VEGI-251共有C-末端的151個殘基片斷。這些同種型通過可變剪接產生自17kb的人類基因。VEGI251(最豐富的同種型)含有推斷的分泌信號。VEGI蛋白在內皮細胞、人類血清和VEGI251轉染的哺乳動物細胞的條件培養(yǎng)基中檢測到。VEGI251的亞細胞定位模式暗示其為分泌蛋白。VEGI251在內皮細胞中的過表達導致劑量依賴性的細胞死亡。VEGI251轉染的癌細胞，與VEGI174轉染子腫瘤相比，產生生長速率和微血管密度下降的異種移植腫瘤。本發(fā)明提供了內皮細胞分泌的VEGI可行使自分泌血管生成抑制劑和天然存在的血管穩(wěn)態(tài)調節(jié)劑的功能的觀點。
特此將本文引用的所有出版物全部并入作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明一般涉及內皮細胞增殖抑制劑，尤其涉及血管生成抑制劑，以及它們的使用方法。VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251的完整核苷酸序列示于表1(SEQ ID NO1)、表2(SEQ ID NO2)和表3(SEQ ID NO3)中，并且推斷的氨基酸序列分別示于表4(SEQ ID NO4)、表5(SEQ ID NO5)和表6(SEQ ID NO6)中。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含表1(SEQ ID NO1)中所示的序列或者它們的互補物的分離的多核苷酸。本發(fā)明也提供了包括SEQ ID NO1中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個以及至少100個或更多個連續(xù)的核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93位之內。本發(fā)明也提供了包括SEQ ID NO1中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個以及至少100個或更多個連續(xù)的核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的核苷酸包括SEQ IDNO1的核苷酸93和94。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包含表2(SEQ ID NO2)中所示的序列或者它們的互補物的分離的多核苷酸。本發(fā)明也提供了包括SEQ IDNO2中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個以及至少100個或更多個連續(xù)的核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的核苷酸位于SEQ ID NO2的核苷酸1-386位之內。本發(fā)明也提供了包括SEQ ID NO2中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個以及至少100個或更多個連續(xù)的核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸386和387。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼SEQ ID NO4多肽的序列的分離的多核苷酸。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO4中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的多核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的氨基酸位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26位之內。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO4中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的多核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的氨基酸包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27。在有些實施方案中，連續(xù)的氨基酸大約為表4中所示序列(SEQ ID NO4)的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼SEQ ID NO5多肽的序列的分離的多核苷酸。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO5中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的多核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的氨基酸位于SEQ ID NO5的氨基酸1-26位之內。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO5中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的多核苷酸的分離的多核苷酸，其中連續(xù)的氨基酸包括SEQ ID NO5的氨基酸26和27。在有些實施方案中，連續(xù)的氨基酸大約為表5中所示序列(SEQ ID NO5)的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
在有些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸提供了編碼本文公開的核酸序列的功能性保守變體的序列，其包括核酸替代、添加和/或缺失。變體包括所述多核苷酸序列天然存在的變體(例如簡并變體、等位基因變體等)。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了與本文描述的本發(fā)明的多核苷酸具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分離的多核苷酸。一個實施方案提供了與表1(SEQ ID NO1)中所示核苷酸1-93或者表2(SEQ ID NO2)中所示核苷酸1-386的序列具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分離的多核苷酸。
在有些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸進一步包括可檢測的標記。在有些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸被固定在表面上。在本發(fā)明的有些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是單鏈的。在本發(fā)明的有些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸選自DNA和RNA。在本發(fā)明的有些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸部分地通過化學合成制備。
應當理解(除非另有規(guī)定或者需求)，本文描述的本發(fā)明的多核苷酸的任何實施方案既包括雙鏈形式，也包括已知或者預測構成雙鏈形式的兩互補單鏈形式中的每一個。
還應理解，本發(fā)明提供了“由”或“基本上由”本文描述的多核苷酸、多肽和/或抗體“組成”的實施方案。
在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的任何多核苷酸的載體和表達載體。
又在其它方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的任何多核苷酸或載體的宿主細胞。在有些實施方案中，宿主細胞為原核的，例如大腸桿菌(E.coli)。在有些實施方案中，宿主細胞為真核的，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本發(fā)明也包括含有包括VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸或者VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸之變體的重組多核苷酸的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了遺傳改造的哺乳動物細胞或者細菌細胞如大腸桿菌，其包括重組修飾的VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸，從而所述多核苷酸過表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸之變體的細胞。在另一個實施方案中，VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸可操作地連接于可誘導的啟動子。又在另一個實施方案中，遺傳改造的細胞具有變體VEGI-192a或VEGI-192b基因而非天然VEGI-192a或VEGI-192b基因。
本發(fā)明也提供了VEGI-192a多肽。因此，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NO4序列的分離的多肽。本發(fā)明也提供了包括由本文描述的本發(fā)明的任一多核苷酸編碼的多肽的分離的多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明也提供了包括表4(SEQ ID NO4)所示序列中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的分離的多肽，其中連續(xù)的氨基酸位于表4(SEQ ID NO4)所示序列的氨基酸1-26位之內。在其它實施方案中，本發(fā)明也提供了包括表4(SEQ ID NO4)所示序列中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的分離的多肽，其中連續(xù)的氨基酸包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27。在有些實施方案中，連續(xù)的氨基酸大約為SEQ ID NO4的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
本發(fā)明也提供了VEGI-192b多肽。因此，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NO5序列的分離的多肽。本發(fā)明也提供了包括由本文描述的本發(fā)明的任一多核苷酸編碼的多肽的分離的多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明也提供了包括表5(SEQ ID NO5)所示序列中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的分離的多肽，其中連續(xù)的氨基酸位于表5(SEQ ID NO5)所示序列的氨基酸1-26位之內。在其它實施方案中，本發(fā)明也提供了包括表5(SEQ ID NO5)所示序列中至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的分離的多肽，其中連續(xù)的氨基酸包括SEQ ID NO5的氨基酸26和27。在有些實施方案中，連續(xù)的氨基酸大約為SEQ ID NO5的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了本文描述的任一多肽，其中多肽包括表位。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了本文描述的任一多肽，其中多肽固定在固相支持物上。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了保留了VEGI-192a和/或VEGI-192b和/或VEGI-251的生物活性的多肽。如實施例中所示，VEGI-192a抑制血管內皮細胞生長；VEGI-251在體外血管生成模型中在表達后抑制血管內皮細胞的生長、毛細管樣管的形成，而且也在無胸腺裸鼠中抑制異種移植腫瘤的生長。
本發(fā)明也提供了與VEGI-192a和/或VEGI-192b選擇性結合的抗體。因此，本發(fā)明提供了與本文描述的任一VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽選擇性結合的抗體。在一個實施方案中，抗體能夠選擇性地與VEGI-192a或VEGI-192b結合。在其它實施方案中，抗體能夠選擇性地與VEGI-192a和VEGI-192b兩者都結合，但不結合其它VEGI同種型。在有些實施方案中，抗體與由本文描述的任一多核苷酸編碼的多肽結合。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了能夠與本發(fā)明的多肽結合的抗體。在另一個實施方案中，抗體能夠特異性地與包括(a)表4(SEQ ID NO4)和/或表5(SEQ ID NO5)中所示序列；或(b)SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5中至少10個連續(xù)的氨基酸(其中連續(xù)氨基酸位于表4(SEQ ID NO4)和/或表5(SEQ ID NO5)中所示的氨基酸1-26位之內)的多肽結合。本發(fā)明也提供了能夠與表4(SEQ ID NO4)和/或表5(SEQ ID NO5)中所示的多肽區(qū)段結合的抗體，其中所述區(qū)段為SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5中至少大約5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸，并且所述區(qū)段包括SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5的氨基酸26和27。
在有些實施方案中，抗體為多克隆抗體。在其它實施方案中，抗體為單克隆抗體。又在其它實施方案中，抗體被固定在固相支持物上。又在其它實施方案中，抗體還包括可檢測的標記。
本發(fā)明也提供了組合物(包括藥物組合物)，其包含本發(fā)明的多核苷酸、多肽、抗體、重組載體和宿主細胞。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含處于藥學上可接受的賦形劑中的SEQ ID NO4的多肽或其片斷，其中所述片斷包括氨基酸26和27。
本發(fā)明也提供了血管生成抑制劑，其中抑制劑包括處于藥學上可接受的載體中的藥學上可接受量的VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或衍生物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了癌生長阻遏劑或抑制劑組合物，其包含基本上純的本發(fā)明的VEGI同種型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或多肽。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了血管生成促進劑，該促進劑包括當以藥學上可接受的量在藥學上可接受的載體中供給時可降低或消除VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251功能的抗體、反義寡核苷酸、拮抗劑、核酶、藥物或藥劑。
本發(fā)明也提供了包括本文描述的任一多核苷酸、多肽和抗體的陣列和試劑盒。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含本文描述的任一多核苷酸用于評價樣品中多核苷酸的量的試劑盒或陣列。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于評價樣品中多肽水平的包含本文描述的任一抗體的試劑盒或陣列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制血管生成的方法，其包括向個體(例如人類或動物)以足以抑制血管生成的劑量給予組合物，所述組合物包含基本上純的本發(fā)明的VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或者此處公開的這些VEGI同種型的修飾形式。在一個實施方案中，該組合物包含含有表3(SEQ ID NO3)中所示多核苷酸或者編碼SEQ IDNO6的多肽的多核苷酸的基因遞送載體。在有些實施方案中，多核苷酸可操作地與控制基因表達的調控序列結合。在其它實施方案中，組合物包含基本上純的表4(SEQ ID NO4)中所示序列的VEGI-192a多肽或其功能性片斷，其中所述片斷包含SEQ ID NO4的氨基酸26和27，或者包含SEQID NO4氨基酸1-26中的至少一個氨基酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療或改善由非控制性血管生成介導的疾病或過程的方法，包括向個體給藥劑量足以控制血管生成的組合物的步驟，所述組合物包括VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或者此處描述的這些公開的VEGI同種型的修飾形式。在一個實施方案中，組合物包括含有表3(SEQ ID NO3)中所示多核苷酸或者編碼SEQID NO6的多肽的多核苷酸的基因遞送載體。在有些實施方案中，多核苷酸可操作地與控制基因表達的調控序列結合。在其它實施方案中，組合物包括基本上純的具有表4(SEQ ID NO4)中所示序列的VEGI-192a多肽或其功能性片斷，其中所述片斷包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27，或者包括至少一個來自SEQ ID NO4氨基酸1-26的氨基酸。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥或抑制腫瘤生長的方法，其包括向個體給藥劑量足以抑制腫瘤生長的組合物，所述組合物包括VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或者此處描述的這些公開的VEGI同種型的修飾形式。在一個實施方案中，組合物包括含有表3(SEQ ID NO3)中所示多核苷酸或者編碼SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸的基因遞送載體。在有些實施方案中，多核苷酸可操作地與控制基因表達的調控序列結合。在其它實施方案中，組合物包括基本上純的具有表4(SEQ ID NO4)中所示序列的VEGI-192a多肽或其功能性片斷，其中所述片斷包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27，或者包括至少一個來自SEQ IDNO4氨基酸1-26的氨基酸。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了加速血管生成的方法，其包括向人類或者動物給藥降低或消除VEGI-192a、VEGI-192b和/或VEGI-251活性的抗體、反義寡核苷酸、拮抗劑、核酶、藥物或藥劑。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或改善由血管生成介導的疾病和過程的治療方法和組合物，所述疾病和過程包括但不限于，血管瘤、實體瘤、白血病、瘤轉移、毛細管擴張癥、銀屑病性硬皮病、膿性肉芽腫、心肌血管生成、plagie新血管形成、冠脈側枝(coronary collateral)、缺血性四肢血管生成、角膜病、潮紅、新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病、晶狀體后纖維組織形成、關節(jié)炎、糖尿病性新血管形成、眼色素層炎、早產兒視網膜病變、黃斑變性、角膜移植新血管形成、移植物抗宿主疾病、炎癥性腸病、骨髓抑制和再狹窄；其中血管生成是非控制性的或者過度的，因而需要抑制，該方法包括向需要此種治療的個體提供有效量的本發(fā)明的VEGI同種型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或多肽，從而抑制血管生成。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或改善其中期望血管生成的疾病(例如黃斑變性、傷口愈合、消化性潰瘍、骨折、瘢痕瘤、血管發(fā)生、血細胞生成、排卵、月經和胎盤形成)的治療方法和組合物，該方法包括向需要此種治療的個體給藥處于藥學上可接受的載體中的藥學上可接受量的本發(fā)明的VEGI同種型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或多肽的拮抗劑、VEGI同種型多核苷酸特異性的反義寡核苷酸或者減少或消除VEGI功能的抗-VEGI抗體、藥劑或藥物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測VEGI同種型多肽(VEGI-192a或VEGI-192b)的方法，包括使來自個體的樣品與本文描述的選擇性結合本發(fā)明的VEGI多肽的抗體接觸，并檢測樣品中的多肽和該抗體之間形成的復合物的存在或不存在。這些檢測方法也適用于檢測本文描述的任一VEGI-192a或VEGI-192b。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測VEGI同種型(VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸的方法，包括使來自個體的樣品與選擇性結合本發(fā)明的VEGI多核苷酸的多核苷酸(例如寡核苷酸)接觸，并檢測該寡核苷酸與樣品中的多核苷酸之間形成的雙鏈體的存在或不存在。這些方法也適用于檢測本文描述的任一VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷涉及病理性血管生成的疾病的方法，其中該方法包括檢測樣品中存在或不存在衍生自VEGI-192a或VEGI-192b的多肽，該方法包括步驟(i)使來自懷疑具有病理性血管生成的受試者的樣品與本發(fā)明VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽特異性的抗體接觸；和(ii)檢測VEGI-192a和/或VEGI-192b與該抗體之間形成的復合物的存在或不存在。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷病理性血管生成的方法，包括檢測樣品中存在或不存在VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸(優(yōu)選RNA)，該方法包括步驟(i)使來自懷疑具有病理性血管生成的受試者的樣品與特異性結合本發(fā)明VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸(例如RNA)的多核苷酸(例如寡核苷酸)接觸；和(ii)檢測多核苷酸與衍生自VEGI-192a或VEGI-192b的寡核苷酸之間形成的雙鏈體的存在或不存在。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了利用聚合酶鏈式反應(PCR)診斷病理性血管生成的方法，該方法包括利用如SEQ ID NO1及SEQ IDNO2中所示的VEGI同種型(即VEGI-192a、VEGI-192b)的核苷酸序列設計引物，其中所述聚合酶鏈式反應特異性地擴增VEGI的區(qū)段用作為檢測的基礎。該引物可用于擴增VEGI DNA或VEGI RNA，后一種擴增發(fā)生在通過RNA反轉錄將RNA轉化為互補DNA(cDNA)之后。通過將擴增產物與標準(其可利用本領域公知的方法產生)進行比較，可使得所述PCR試驗成為定量的。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中VEGI同種型(即VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸的方法，該方法包括通過雜交測定法測定樣品中存在或不存在VEGI-192a或VEGI-192b同種型RNA或DNA。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了診斷或預后試劑盒，包含與本發(fā)明的VEGI同種型(即VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸或多肽結合的抗體；與VEGI DNA或RNA雜交的寡核苷酸；和/或用于擴增VEGI DNA或RNA的PCR引物，以及適用于檢測樣品中VEGI同種型的存在的輔助試劑。由于VEGI可作為膜蛋白行使功能，膜結合VEGI的天然存在的可溶形式可作為其拮抗劑起作用，而且檢測該可溶形式的方法包括在本發(fā)明的另一個實施方案中。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了診斷測定法，包括檢測VEGI同種型(即VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸中存在或不存在突變，所述突變導致VEGI同種型表達或功能的下降或提高。此種測定法將包括雜交測定、限制性圖譜多態(tài)分析以及基因測序等等。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了測試可能的藥劑或藥物的血管生成抑制活性的方法，該方法通過測試藥物或藥劑是否能夠上調VEGI同種型(即VEGI-192a或VEGI-192b)的表達和/或活性而實施。由于VEGI同種型，象其它血管生成抑制劑一樣，被從細胞膜中釋放該蛋白的蛋白酶激活，(因此)蛋白酶還有促進此激活的其它試劑如金屬離子將可用作為提高VEGI同種型表達的藥劑。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了測試可能的抗腫瘤藥劑或藥物的方法，該方法通過測試所述藥物或藥劑是否能夠通過上調VEGI同種型的表達和/或活性而抑制血管生成來實施。
又在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了測試可能的促進血管生成的藥物或藥劑的方法，該方法通過測試所述藥劑或藥物是否能夠阻斷和/或抑制VEGI功能(例如抑制血管生成)來實施。在這種情況下，通過抑制如上文所討論的激活VEGI同種型的蛋白酶或抑制此激活所需的試劑或者抑制能促進此激活的試劑如金屬離子，可下調VEGI，由此加強血管生成。
附圖的簡短說明

圖1.正常成人的血清VEGI水平。利用抗-VEGI抗體通過ELISA對來自40個正常志愿者(男性20名、女性20名)的血清進行測量。每點代表單個數值。利用純化的重組VEGI產生標準曲線。這些點中的水平條指示每個性別組的中值。
圖2.VEGI以多種轉錄本形式在人類組織中表達。利用32P-標記的全長VEGI-174cDNA作為探針通過多組織RNA印跡分析測定VEGI在成人組織中的表達。檢測到了所示大小的3個不同的VEGI-相關信息。
圖3.新VEGI cDNA的分離。A.表示合成5′RACE產物接著篩選cDNA文庫以從各種人類組織中分離全長VEGI cDNA的方案。陰影框代表存在于RACE板中的連接的5′銜接物。PCR引物由具有空心箭頭的箭頭記號指示。不同大小的PCR產物通過溴化乙錠染色觀看。分離PCR產物并進行測序。L＝肺；U＝子宮；B＝腦。在L和U泳道之間顯示了1Kb DNA分子量標梯。B.3個VEGI同種型的氨基酸序列的比對(alignment)。推斷的VEGI-251和VEGI-174疏水區(qū)以下劃線標出。星號表示同源序列的起點。
圖4.VEGI-174和VEGI-251在人類組織中的差異表達。利用VEGI-251和VEGI-174特異性的cDNA片斷對成人組織進行VEGI表達的RNA印跡分析。用VEGI-174探針檢測到2kb的轉錄本，而用VEGI-251探針檢測到7.5kb的信息。所檢測的人類組織如下1.外周血白細胞，2.肺，3.胎盤，4.小腸，5.肝，6.腎，7.脾，8.胸腺，9.結腸，10.骨骼肌，11.心臟，12.腦。
圖5.各種培養(yǎng)細胞中VEGI同種型的核糖核酸酶保護分析。來自所示各培養(yǎng)物的總RNA與同種型特異性VEGI探針雜交，而β-肌動蛋白作為上樣對照。全長未消化探針示于探針泳道(P)，由實心箭頭指示，而RNase保護產物由空心箭頭指示。Y＝酵母RNA，Hc＝人類冠狀動脈內皮細胞，Hm＝人類皮膚微血管內皮細胞，Hu＝人類臍靜脈內皮細胞，Sm＝人類冠狀動脈平滑肌細胞，3T＝NIH3T3胚胎小鼠細胞系，Ba＝成年牛大動脈內皮細胞，Bh＝胎牛心臟內皮細胞，Hy＝EA.Hy926人類雜交瘤細胞，bE＝bEND.3小鼠腦內皮瘤細胞。
圖6.人類VEGI基因結構以及推斷的同種型的產生。編號1到9的片斷代表基因作圖期間產生的PCR片斷，特異性引物對列于材料和方法中。上方帶羅馬數字的框代表外顯子，而水平線代表內含子序列。推斷的轉錄起始位點由雙箭頭指示。R表示每個轉錄本各自特有的5′非翻譯序列，而帶點框代表共同的3′非翻譯區(qū)。顯示了內含子近似的大小。VEGI-251、VEGI-192a或VEGI-174特異性序列標記為′251′、′192′或′174′。外顯子IIIb編碼VEGI-251和VEGI-192a共有的殘基。外顯子III和IV 5′的內含子以虛線表示，因為VEGI-192a和VEGI-174轉錄本的該5′端或者起始位點尚未確定?！銫OM′表示所有三個同種型共有的最后一個外顯子的編碼區(qū)。
圖7.TNFα誘導VEGI同種型在微血管和大血管內皮細胞中表達。核糖核酸酶保護試驗證明了并行誘導的VEGI表達。箭頭指示保護的RNA。A.用15、50和90ng/ml TNFα處理達24小時的HMVE細胞。B.HUVE細胞中TNFα對VEGI基因表達的誘導。HUVE細胞由20ng/ml TNFα處理4、8和24小時(+)。對照(-)接受相應的載體處理。
圖8.重組VEGI-174和VEGI-251在轉染的內皮細胞中的胞內定位。A.VEGI-174-myc和VEGI-251-myc(B)通過結合的myc標簽的德克薩斯紅染色在轉染的ABAE細胞中檢測到。C.在轉染的HUVE細胞中的VEGI-251-myc(紅)和馮·威利布蘭德因子(綠)雙重染色。D圖描繪了具有C-末端myc標簽的VEGI表達構建物。E-J.N-末端標記GFP的VEGI構建物在ABAE細胞中表現出不同的分布。由載體質粒(E)轉染的細胞在整個細胞中到處顯示出GFP，而3個VEGI構建物(F，H-J)產生局部的GFP分布。在I和J中，VEGI-2511-99指導GFP分布在質膜中。K.在F到J所用的表達構建物中GFP標簽定位在VEGI片斷的氨基末端。
圖9.通過Western分析檢測轉染的MB231細胞和未轉染的HUVE細胞的條件培養(yǎng)基中的VEGI-251。A.來自穩(wěn)定轉染子MDA-MB231的條件培養(yǎng)基。泳道1＝僅pcDNA3載體，泳道2和3＝表達VEGI-251的兩個獨立的克隆。B.泳道1＝HUVE細胞-條件培養(yǎng)基，泳道2＝HUVE細胞裂解物。在兩個實驗中，條件培養(yǎng)基用Centricon柱(分子量截留10,000)濃縮，用多克隆抗體免疫沉淀，然后進行SDS-PAGE并利用針對VEGI共有C-末端區(qū)(殘基29-174)的單克隆抗體1-8F進行Western檢測。兩組都顯示了大約25kD的VEGI肽。
圖10.VEGI-251過表達導致內皮細胞死亡并干擾腫瘤新血管形成。A.分泌VEGI的慢病毒遞送對于HUVE細胞是致死的。表達VEGI-251和sVEGI的慢病毒原液與表達VEGI-174的慢病毒原液相比的劑量依賴性細胞毒性。病毒感染后24小時，通過Coulter計數對保留在培養(yǎng)物中的貼壁細胞計數。估計病毒p24水平，且病毒劑量表示為感染復數(MOI)。所示數值為3個獨立實驗的平均數±SEM。B.VEGI-251和sVEGI對異種移植MDA-MB231乳腺腫瘤生長的阻滯。將表達所示構建物的穩(wěn)定轉染的MDA-MB231細胞庫皮下注射到雌性無胸腺小鼠的乳房脂墊中，并以不知情的方式監(jiān)測腫瘤大小。對照小鼠接受轉染空pcDNA3載體的MDA-MB231細胞。對于VEGI-251和sVEGI都觀察到腫瘤生長的減弱，但對于全長VEGI-174則沒有。C.VEGI-251和sVEGI轉染導致MB231異種移植腫瘤中降低的微血管密度。腫瘤石蠟切片(5μm)取自圖10A中所述小鼠。血管如材料和方法中所述通過CD31免疫染色鑒定。利用了單向方差分析。aP＜0.0005；bP＜0.05，與具有載體pcDNA3的對照異種移植物相比而言。
圖11.利用P-32-標記的VEGI-174cDNA作為探針，對各種人類器官中VEGI表達的多組織RNA印跡分析結果的照片。可見不同大小的VEGImRNA信號。
圖12.舉例說明用于尋找可能的VEGI同種型的RACE-PCR操作方案。ADP1和ADP2表示銜接物特異性引物。GSP1和GSP2表示基因特異性引物。
圖13.RACE-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果的照片。利用溴化乙錠染色觀察到來自不同人類組織的不同大小的4個PCR產物。分離PCR產物并進行測序。
圖14.轉染了空載體(泳道1)或VEGI-251cDNA(泳道2)的MDA-MB-231細胞的條件培養(yǎng)基的蛋白質印跡分析照片。對條件培養(yǎng)基進行凝膠過濾層析，并收集分子量為10-50kD范圍內的級分，并進行SDS-PAGE。圖A凝膠考馬斯亮藍染色。圖B利用VEGI的單克隆抗體(13-2D)的蛋白質印跡。
圖15.顯示由轉染了VEGI-174、VEGI-251、IL6/VEGI或者空pCDNA-3載體的MDA-MB-231細胞形成的異種移植腫瘤的生長抑制。將1百萬穩(wěn)定轉染的細胞注射到雌性無胸腺裸鼠的乳房脂墊中。每只動物有2個注射部位，且每組有5只動物。對各組編號，并以不知情方式監(jiān)測異種移植腫瘤的大小。對于VEGI-251或IL6-VEGI過表達細胞觀察到統(tǒng)計學意義的腫瘤生長抑制。VEGI-174過表達對腫瘤生長沒有影響。
圖16.利用針對人類VEGI的mAb 13-2D對獲自圖7所述實驗中的腫瘤樣品進行的免疫組織化學分析。VEGI過表達細胞被染成棕色。左側圖是由VEGI-251轉染的細胞形成的腫瘤的切片照片。VEGI-251的產生水平顯然高度可變，正如有些腫瘤切片(G9-1R)的強烈染色(表明高水平的VEGI產生)而同組中有些腫瘤顯著低的染色(G9-2R)所證明的那樣。右側圖是由載體-對照細胞形成的腫瘤的切片照片。對照腫瘤切片中的棕色染色可能是抗體與位于小鼠內皮上的內在VEGI分子交叉反應的結果。
圖17.顯示由VEGI-251轉染的MDA-MB-231癌細胞形成的腫瘤的生長速率根據癌細胞產生的VEGI的量變化。VEGI水平較高的腫瘤(G9-1R)生長得比具有低VEGI水平的腫瘤(G9-2R)慢得多。
圖18.VEGI轉錄本的蛋白質印跡分析。圖A，VEGI在人類細胞中的表達Jurkat，人類T細胞白血病細胞；L923，人類胎腎細胞；HL60，人類早幼粒細胞白血?。籚.E，人類靜脈內皮細胞(第10代)；A431，人類表皮樣癌；V.E.-2，人類靜脈內皮細胞(第20代)；Raji，人類伯基特氏淋巴瘤；A.E，人類動脈內皮細胞；THP-1，人類單核細胞白血?。籆CD-29Lu，人類肺氣腫；CAMA1，乳腺癌；AN3CA，子宮癌；SK.UT.1，子宮癌；MG63，成骨細胞瘤；HOS，成骨細胞瘤；MCF7，乳腺癌；OVCAR-3，卵巢癌；CAOV-3，卵巢癌；HUVE，人類臍靜脈內皮細胞；AOSMIC，平滑肌。估計的信使RNA大小為6.5kb。圖B，運用多組織RNA印跡(Clonetech)檢測的VEGI在成人組織中的表達進行三個獨立的印跡。顯示了來自三個實驗中任一的陽性結果。
圖19.顯示VEGI對內皮細胞和乳腺癌細胞增殖的影響。細胞數目針對所示的VEGI濃度繪圖。顯示了對ABAE細胞(實心圓)而非MDA-MB-231(空心圓)或MDA-MB-435(三角形)細胞生長的抑制。癌細胞和ABAE細胞分別以2000和8000細胞/孔一式三份種植于24孔板中。培養(yǎng)基含IMEM(Gibco)和10％ FCS。對于ABAE細胞向培養(yǎng)基中添加FGF-2(1ng/ml)。培養(yǎng)于37℃、5％ CO2中維持6天。然后用胰蛋白酶作用細胞，并利用Coulter計數器測定細胞數目。顯示了回收的ABAE細胞總數目的五分之一，以使和癌細胞的比較標準化。
圖20.VEGI在增殖或靜止內皮細胞中的表達。通過RNA印跡分析測定培養(yǎng)的HUVE細胞中的VEGI mRNA水平。于每一泳道上樣等量的總RNA(15μg)，如β-肌動蛋白強度所指示的那樣?？俁NA在指定的時間點制備(種植后天數)。同時測定每個培養(yǎng)瓶中的細胞數目。實驗進行雙份。細胞以125,000細胞每瓶(T-25)種植于IMEM、10％ FCS、6ng/ml FGF-2中，并培養(yǎng)于37℃、5％ CO2中。
圖21.顯示VEGI對ABAE細胞在膠原凝膠上形成毛細管樣管能力的影響的曲線圖。顯示了重組VEGI抑制ABAE細胞形成毛細管樣管的能力。柱上方給出的p-值(t-檢驗)通過將ABAE細胞在存在所示的各種濃度的VEGI時形成毛細管樣管的程度與培養(yǎng)基中不存在VEGI時相比較獲得。
圖22.顯示了VEGI對置于雞胚尿囊絨膜(CAM)上的膠原凝膠中血管生成的抑制。新毛細血管由包埋在凝膠中的FGF-2(100ng)或者VEGF(250ng)誘導生長進入置于CAM上的膠原凝膠球(0.05ml)中。凝膠中血管生成的程度通過評價注射入CAM循環(huán)并且滯留在凝膠中的FTIC-葡聚糖的熒光強度確定。顯示了由低于100的數值所指示的VEGI對毛細血管生長的抑制。抑制劑也包埋在凝膠中。誤差棒代表一式三份實驗數值的標準差。
圖23.顯示了VEGI對無胸腺裸鼠中人類乳腺癌異種移植腫瘤生長的抑制。將過表達VEGI或者載體轉染的CHO細胞(5×106細胞/次注射)與人類乳腺癌細胞(1×106細胞/次注射)的混合物注射到雌性裸鼠的乳房脂墊中。注射后監(jiān)測腫瘤大小。圖A將MDA-MB-231異種移植腫瘤的大小(mm2)作為接種后時間(天數)的函數繪圖。圖B將MDA-MB-435異種移植腫瘤的大小(mm2)作為接種后時間(天數)的函數繪圖。空心圓，與載體轉染的CHO細胞共接種。實心圓，與分泌型VEGI轉染的CHO細胞共接種。
圖24.顯示VEGI-192a對內皮細胞增殖的影響。顯示了正確折疊的VEGI-192a而不是不正確折疊的VEGI-192a或緩沖液對ABAE細胞生長產生抑制。ABAE細胞分別以8000細胞/孔一式三份種植于24孔板中。培養(yǎng)基含IMEM(Gibco)和10％ FCS。對于ABAE細胞向培養(yǎng)基中添加FGF-2(1ng/ml)。培養(yǎng)物于37℃、5％ CO2中維持6天。然后用胰蛋白酶作用細胞，并利用Coulter計數器測定細胞數目。顯示了回收的ABAE細胞總數目的五分之一，以使和癌細胞的比較標準化。
發(fā)明的詳細說明本發(fā)明提供了抑制血管內皮細胞生長的新的VEGI同種型多核苷酸和多肽，以及通過給藥這些多核苷酸、多肽及其它藥劑治療由血管生成介導的或者與之相關的疾病和過程的方法。本發(fā)明的VEGI多核苷酸或多肽可以從包括但不限于血清、尿液和腹水的體液中分離，或者通過化學或生物學方法(例如，細胞培養(yǎng)、重組基因表達)合成。
重組技術包括利用聚合酶鏈式反應(PCR)自DNA原料的基因擴增，以及利用反轉錄酶/PCR自RNA原料的基因擴增。這些方法是本領域公知的。VEGI抑制血管生長進組織如未血管化或血管化的腫瘤中。本發(fā)明包括分子量大約為22kD的蛋白，以及該蛋白的任何修飾形式，包括但不限于，截短物或翻譯后修飾，例如能夠克服內源生長因子的血管生成活性的該蛋白的糖基化形式。
定義如本文所述，“突變體”或“變體”VEGI多核苷酸或多肽是在核酸或氨基酸序列中包括一個或多個缺失、添加、顛換或改變的多核苷酸或多肽序列。如本文進一步描述的，突變體VEGI序列可造成截短或者改變的VEGI多核苷酸或多肽，VEGI多核苷酸或多肽增加或減小的表達，或者它們的任何組合。突變可以位于編碼、非編碼、5′或3′側翼、基因組或編碼核苷酸中。
“保持功能的”VEGI同種型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或者VEGI同種型多肽變體是保留了至少一個方面的VEGI同種型功能的VEGI序列。保持功能的變體可以由于線性序列的差異而致，例如起因于單堿基突變、添加、缺失和/或堿基修飾。差異也可以起因于堿基之間的糖和/或鏈鍵的改變。關于多肽，保持功能的變體可以因例如保守和/或非保守氨基酸替代、氨基酸類似物以及缺失引起。所保持的功能取決于所考慮的相關功能。例如，如果VEGI同種型多核苷酸被考慮用作為探針，則變體多核苷酸序列與靶雜交的能力就是相關功能。如果考慮多核苷酸編碼VEGI同種型多肽(或其片斷)的能力，則變體序列編碼相同多肽的能力就是相關功能。如果考慮VEGI同種型多肽結合特定實體(例如抗體或另一種蛋白)的能力，則變體序列編碼具有等同結合特征的多肽的能力是相關的。可以，就編碼的基因產物的生物活性(例如作為將基因產物分配到蛋白家族的結果和/或鑒定存在于基因產物中的功能域的結果而歸屬于與VEGI同種型多核苷酸相應的基因產物的生物活性)考慮VEGI同種型多肽。表現出“功能活性”的多肽是指能夠顯示出與完整或成熟VEGI同種型多肽相關的一種或多種已知的功能活性的多肽。此類功能活性包括，但不限于生物活性(例如，抑制血管生成、抑制血管內皮細胞增殖、誘導細胞粘附)、抗原性(結合或者與一種或多種VEGI同種型多肽競爭結合抗-VEGI同種型抗體的能力)、免疫原性(產生與一種或多種VEGI同種型多肽結合的抗體的能力)、與其它VEGI多肽形成聚合物的能力以及與VEGI多肽受體或配體(例如DR3)結合的能力。
如本文所用的，“表達”包括轉錄和/或翻譯。
“異源”是指來源于(即獲自)如下實體，該實體和與之進行比較的其余實體在基因型上不同。例如，可以通過基因工程技術將多核苷酸置于來自不同來源的質?；蜉d體中，從而成為異源多核苷酸。連接于其天然并不連接的編碼序列的啟動子是異源啟動子。
“試劑”多核苷酸、多肽或抗體是為反應提供準備的物質，該物質具有某些已知和期望的反應參數。反應混合物也可以包含“靶”，例如所述試劑能夠與之反應的多核苷酸、抗體、多肽或多肽集合。例如，在某些類型的診斷測試中，樣品中靶的存在和/或量可以通過添加試劑、允許試劑與靶反應、并測量反應產物的量(如果有的話)來確定。在臨床處理環(huán)境中，“靶”也可以是所給藥物質(例如藥物化合物)的對象，即，細胞、細胞集合、組織或器官。
多核苷酸的“穩(wěn)定雙鏈體”或者在生物化學反應中任意兩個或多個組分之間形成的“穩(wěn)定復合物”，是指在所述雙鏈體或復合物的形成與隨后的檢測之間(包括任何任選的洗滌步驟或中間可能發(fā)生的其它操作)足夠長久持續(xù)存在的雙鏈體或復合物。
基因或多核苷酸在測試樣品中“差異性表達”，指與相同類型的對照樣品相比，該多核苷酸以較高或較低的水平被檢測到。典型地，差異性表達的多核苷酸包括多核苷酸被如此表達以至于，例如，發(fā)現mRNA處于高于(如過表達)或者低于(如次表達)至少約25％、至少約50％到75％、至少約90％、至少約2倍、至少約4倍、至少約5倍以及至少約10倍或更多倍的水平上。比較可以在兩個組織間進行，例如，如果利用原位雜交或允許在某種程度上區(qū)別組織中不同細胞類型的另一種測定法的話。比較也可以在自組織來源中取出的細胞之間進行。
藥物、化合物或藥物組合物的“有效量”是足以直接或間接地實現有益或期望結果的量，包括臨床結果例如抑制血管內皮細胞生長、抑制血管生成、促進血管生成、縮小腫瘤大小、阻滯癌細胞生長、減輕因疾病引起的一種或多種癥狀、提高患有此病的患者的生活質量、減小治療該病所需的其它藥物的劑量、增強另一種藥物的效果、延緩疾病的進程和/或延長患者的存活。有效量可以在一次或多次給藥中給予。應當理解，在血管生成相關病的臨床情況下，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以或可以不聯合另一種藥物、化合物或藥物組合物而實現。因而，“有效量”可以在給藥一種或多種治療劑的情況下考慮，而且如果單個治療劑聯合一種或多種其它治療劑實現或可以實現期望的結果的話，則此單個治療劑可以認為是以有效量給藥的。
如本文所用的，“治療”或“處理”是獲得有益或期望結果(包括并且優(yōu)選臨床結果)的方法。對于本發(fā)明的目的，有益或期望的臨床結果包括但不限于，一種或多種如下的結果降低血管內皮細胞增生、抑制血管生成、促進血管生成、減小腫瘤大小、減輕因疾病引起的癥狀、提高患有此病的患者的生活質量、減小治療該病所需的其它藥物的劑量、延緩疾病的進程和/或延長患者的存活。
本文中血管生成相關疾病的“發(fā)展”或“進展”是指所述紊亂的最初顯現和/或繼發(fā)的進展。血管生成相關疾病的發(fā)展可能可以利用標準臨床技術檢測和評價。不過，發(fā)展也指可能不可檢測的疾病進展。對于本發(fā)明的目的，發(fā)展或進展是指疾病狀態(tài)的生物學過程?！鞍l(fā)展”包括發(fā)生、復發(fā)和發(fā)作。如本文所用，血管生成相關疾病的“發(fā)作”或“發(fā)生”包括最初發(fā)作和/或復發(fā)。
如本文所用，血管生成相關疾病的“延遲發(fā)展”是指推遲、阻止、減緩、阻滯、穩(wěn)定和/或延期該病的發(fā)展。這種延遲可以是變化不等的時間長度，取決于病史和/或治療個體的醫(yī)學狀況。對本領域技術人員顯而易見的是，充分或有意義的延遲實際上可以包括就個體不患可檢測的疾病意義而言的預防?！把舆t”疾病發(fā)展的方法是在給定的時間框架下，與不利用此法相比，降低疾病程度的方法。此類比較典型地是基于臨床研究，利用統(tǒng)計學意義數目的受試者進行，盡管該知識可建立在未公開證據的基礎上?！把舆t發(fā)展”可指與不給藥所述治療劑相比，程度和/或不期望的臨床表現被減弱，和/或進展的時間進程被減緩或延長。因而該術語也包括，但不限于癥狀的緩和、疾病程度的減小、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即不惡化)、疾病進程的延遲或減緩以及可檢測或不可檢測的好轉(部分或完全的)。
如本文及所附權利要求書中所用的，單數形式的“一個”、“一種”和“該”包括復數對象，除非上下文中另行明確規(guī)定。因而，例如，提及“一種多核苷酸”包括多數此類多核苷酸，而提及“該藥劑”包括提及一種或多種藥劑及本領域技術人員公知的其等同物等。
一般技術本發(fā)明的實施將使用，除非另行指出，本領域技術范圍之內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術。此類技術在文獻中有充分的說明，例如《分子克隆實驗室指南》(“Molecular CloningA Laboratory Manual”)第2版(Sambrook等，1989)；《寡核苷酸合成》(“Oligonucleotide Synthesis”)(M.J.Gait編輯，1984)；《動物細胞培養(yǎng)》(“Animal Cell Culture”)(R.I.Freshney編輯，1987)；《酶學方法》(“Methods in Enzymology”)(學院出版社有限公司)；《實驗免疫學手冊》(“Handbook of ExperimentalImmunology”)(D.M.Wei和C.C.Blackwell編輯)；《用于哺乳動物細胞的基因轉移載體》(“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”)(J.M.Miller和M.P.Calos編輯，1987)；《當代分子生物學方案》(“Current Protocols in Molecular Biology”)(F.M.Ausubel等編輯，1987)；《PCR聚合酶鏈式反應》(“PCRThe Polymerase ChainReaction”)(Mullis等編輯，1994)；《當代免疫學方案》(“Current Protocolsin Immunology”)(J.E.Coligan等編輯，1991)。
本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明提供了VEGI同種型的多核苷酸，包括編碼VEGI-192a、VEGI-192b和VEGL-251的多核苷酸。與新同種型對應的核苷酸序列在表1、2和3(SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)中給出，并且它們相應的多肽序列在表4、5和6(SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ IDNO6)中給出。
表1.編碼VEGI-192a的多核苷酸序列(SEQ ID NO1)CTCCTATCAT AGGCGCCATG CAACTCACAA AGGGCCGTCT TCATTTCAGT CACCCTTTGTCTCATACAAA GCACATTTCT CCTTTTGTTA CAGATGCACC TCTTAGAGCA GACGGAGATAAGCCAAGGGC ACACCTGACA GTTGTGAGAC AAACTCCCAC ACAGCACTTT AAAAATCAGTTCCCAGCTCT GCACTGGGAA CATGAACTAG GCCTGGCCTT CACCAAGAAC CGAATGAACTATACCAACAA ATTCCTGCTG ATCCCAGAGT CGGGAGACTA CTTCATTTAC TCCCAGGTCACATTCCGTGG GATGACCTCT GAGTGCAGTG AAATCAGACA AGCAGGCCGA CCAAACAAGCCAGACTCCAT CACTGTGGTC ATCACCAAGG TAACAGACAG CTACCCTGAG CCAACCCAGCTCCTCATGGG GACCAAGTCT GTATGCGAAG TAGGTAGCAA CTGGTTCCAG CCCATCTACCTCGGAGCCAT GTTCTCCTTG CAAGAAGGGG ACAAGCTAAT GGTGAACGTC AGTGACATCTCTTTGGTGGA TTACACAAAA GAAGATAAAA CCTTCTTTGG AGCCTTCTTA CTATAG
表2.編碼VEGI-192b的多核苷酸序列(SEQ ID NO2)TTAAACGGGC CCTCTAGACT CGAGCGGCCG CCACTGTGCT GGATATCTGC AGAATTCGGCTTAGCGCGTG AATCAGATCG GGGGGGGGGG TTAAGCAAAG CCATAAAACT GTCAGTTTAATATACCATCA TTTCACTAAC ATGAAGTGTG CCGGCTCTGT CCCCCCCTTT CTTTTCCTCCTTCCAACTCT TTTAAAAAAG AACAGCTCTA CTTACGCCAA GGTGGAATTT TGGCTCTACTAGCCACTATT CTGCGACAGA GTGGCTTTGT TGACGTGAGA AAGGCTCTCT TTGCTTTGCCAGAATTAGTC ATGGAAACTT CACAGGAACA CCAGGGCCCC TCAGATATAC ACAGAATACCATGGAGCTGG GGACAAAGGA ATTCACATGC ACCTCTTAGA GCAGACGGAG ATAAGCCAAGGGCACACCTG ACAGTTGTGA GACAAACTCC CACACAGCAC TTTAAAAATC AGTTCCCAGCTCTGCACTGG GAACATGAAC TAGGCCTGGC CTTCACCAAG AACCGAATGA ACTATACCAACAAATTCCTG CTGATCCCAG AGTCGGGAGA CTACTTCATT TACTCCCAGG TCACATTCCGTGGGATGACC TCTGAGTGCA GTGAAATCAG ACAAGCAGGC CGACCAAACA AGCCAGACTCCATCACTGTG GTCATCACCA AGGTAACAGA CAGCTACCCT GAGCCAACCC AGCTCCTCATGGGGACCAAG TCTGTATGCG AAGTAGGTAG CAACTGGTTC CAGCCCATCT ACCTCGGAGCCATGTTCTCC TTGCAAGAAG GGGACAAGCT AATGGTGAAC GTCAGTGACA TCTCTTTGGTGGATTACACA AAAGAAGATA AAACCTTCTT TGGAGCCTTC TTACTATAGG ATCCGGAGCCGAATTCCACC ACACTGGACT AAGTGGATTC GAGCTCGGTA CCAAAGCTTA AGTTTAAACGCTAGCCAGCT TGGGTCCCCC TATAGTGAGT CNTATTAATT TCGATAAGCC AGTAAGCAGTGGGTT表3.編碼VEGI-251的多核苷酸序列(SEQ ID NO3)TTGTAATACG ACTCACTATA GGGCGGCCGC GAATTCGGCA CGAGATTTAA TGGCCGAGGATCTGGGACTG AGCTTTGGGG AAACAGCCAG TGTGGAAATG CTGCCAGAGC ACGGCAGCTGCAGGCCCAAG GCCAGGAGCA GCAGCGCACG CTGGGCTCTC ACCTGCTGCC TGGTGTTGCTCCCCTTCCTT GCAGGACTCA CCACATACCT GCTTGTCAGC CAGCTCCGGG CCCAGGGAGAGGCCTGTGTG CAGTTCCAGG CTCTAAAAGG ACAGGAGTTT GCACCTTCAC ATCAGCAAGTTTATGCACCT CTTAGAGCAG ACGGAGATAA GCCAAGGGCA CACCTGACAG TTGTGAGACAAACTCCCACA CAGCACTTTA AAAATCAGTT CCCAGCTCTG CACTGGGAAC ATGAACTAGGCCTGGCCTTC ACCAAGAACC GAATGAACTA TACCAACAAA TTCCTGCTGA TCCCAGAGTCGGGAGACTAC TTCATTTACT CCCAGGTCAC ATTCCGTGGG ATGACCTCTG AGTGCAGTGAAATCAGACAA GCAGGCCGAC CAAACAAGCC AGACTCCATC ACTGTGGTCA TCACCAAGGTAACAGACAGC TACCCTGAGC CAACCCAGCT CCTCATGGGG ACCAAGTCTG TATGCGAAGTAGGTAGCAAC TGGTTCCAGC CCATCTACCT CGGAGCCATG TTCTCCTTGC AAGAAGGGGACAAGCTAATG GTGAACGTCA GTGACATCTC TTTGGTGGAT TACACAAAAG AAGATAAAACCTTCTTTGGA GCCTTCTTAC TATAGGAGGA GAGCAAATAT CATTATATGA AAGTCCTCTGCCACCGAGTT CCTAATTTTT TTGTTCAAAT GTAATTATAA CCAGGGGTTT TCTTGGGGCC
GGGAGTAGGG GGCATTCCAC AGGGACAACG GTTTAGCTAT GAAATTTGGG GCCCAAAATTTCACACTTCA TGTGCCTTAC TGATGAGAGT ACTAACTGGA AAAAGGCTGA AGAGAGCAAATATATTATTA AGATGGGTTG GAGGATTGGC GAGTTTCTAA ATATTAAGAC ACTGATCACTAAATGAATGG ATGATCTACT CGGGTCANGA TTGAAAGAGA AATATTTCAA CACCTTCCTGCTATACAATG GTCACCAGTG GTCCAGTTAT TGTTCAATTT GATCATAAAT TGCTTCAATTCANGAGCTTT GAAGGAAGTC CAAGGAAAGC TCTAGAAAAC AGTATAAACT TTCAGAGGCAAAATCCTTCA CCAAATTTTC CACATACTTT CATGCCCTGC CTAAAAAAAA TGAAAAAGAAAAGTTGGTAT GTCTCATGAA TGTTCACACA NAAAGAGTTG GGTTCATGTC ATCCNCAACATATGAGAAAA ANCTACCTTC TTTTGNTTAT GTCACAGATT C表4.VEGI-192a的氨基酸序列(SEQ ID NO4)MQLTKGRLHFSHPLSHTKHISPFVTDAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL表5.VEGI-192b的氨基酸序列(SEQ ID NO5)METSQEHQGPSDIHRIPWSWGQRNSHAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL表6.VEGI-251的氨基酸序列(SEQ ID NO6)MAEDLGLSFGETASVEMLPEHGSCRPKARSSSARWALTCCLVLLPFLAGLTTYLLVSQLRAQGEACVQFQALKGQEFAPSHQQVYAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL表1(SEQ ID NO1)中所示多核苷酸序列通過測序cDNA克隆()獲得，它于＿＿保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209)，保藏號為＿＿。
表2(SEQ ID NO2)中所示多核苷酸序列通過測序cDNA克隆()獲得，它于＿＿保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209)，保藏號為＿＿。
通過比較推斷的SEQ ID NO4、5和6氨基酸序列的序列比對(表7)，由這些SEQ ID編碼的多肽的C-末端區(qū)與VEGI-174中自Val-24到所述蛋白的C-末端完全相同。不過，這4種同種型的N-末端不同。如實施例中證明VEGI-174不抑制血管生成，因為它在表達后不能有效地自細胞中輸出。相反，VEGI-251在表達后被有效地運輸到胞外基質中，由此它可有效地抑制血管生成。VEGI-251的輸出導致前序列的切割；蛋白水解的位置被認為是在VEGI-251的位置61或96；但也可能位于大約定位于VEGI-251的Glu-20和Ser-57之間的另一個位點上?？赡艿奈稽c包括，但不限于E64、K73、E77、S81、R90和K95。純化的VEGI-192a多肽也有效地抑制血管內皮細胞的生長。
表7.4種VEGI同種型氨基酸序列的比對*(SEQ ID NO6、4、5、7)VEGT-251MAEDLGLSFGETASVEMLPEHGSCRPKARSSSARWALTCCLVLLPFLAGLTTYLLVSQL 59VEGI-251RAQGEACVQFQALKGQEFAPSHQQVYAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHW119VEGI-192aMQLTKGRLHFSHPLSHTKHISPFVTDAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHW 60VEGI-192bMETSQEHQGPSDIHRIPWSWGQRNSHAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHW 60VEGI-174MRRFLSKVYSFPMRKLILFLVFPVVRQTPTQHFKNQFPALHW 42**VEGI-251EHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV179VEGI-192aEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV120VEGI-192bEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV120VEGI-174EHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV102VEGI-251VITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT239VEGI-192aVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT180VEGI-192bVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT180VEGI-174VITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT162VEGI-251KEDKTFFGAFLL251VEGI-192aKEDKTFFGAFLL192VEGI-192bKEDKTFFGAFLL192VEGI-174KEDKTFFGAFLL174
*VEGI-174(SEQ ID NO7)以前被稱之為VEGI(GenBank登錄號AF039390)**所有同種型中同源序列始于VEGI-174(SEQ ID NO7)中V24、VEGI-251(SE7Q ID NO6)中V101、VEGI-192a(SEQ ID NO4)中V42以及VEGI-192b(SEQ ID NO5)中V42。
從而，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含與表1、2和3(SEQ IDNO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)所示的新VEGI同種型對應的序列。本發(fā)明的多核苷酸，包括本發(fā)明多核苷酸的片斷，可用作探針、引物、用于表達系統(tǒng)(包括如本文所述的體內和體外表達系統(tǒng)，它也可作為基因治療的基礎)以及篩選系統(tǒng)中。所述多核苷酸尤其有用的應用將在下文討論。
“分離的”核酸分子旨在指已從其天然環(huán)境中取出的核酸分子，DNA或RNA。在有些實施方案中，已除去了至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％與其在天然狀態(tài)下相關的物質。例如，為本發(fā)明的目的，包含在載體中的重組DNA分子被認為是分離的。進一步的分離的DNA分子的實例包括維持在異源宿主細胞中的重組DNA分子或者溶液中純化的(部分地或實質上地)DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體內或體外RNA轉錄本。分離的核酸分子進一步包括合成制備的此類分子。從而，“分離的”多核苷酸或多肽也指重組或其它非天然存在形式的多核苷酸或多肽，它們就來源或操作而言(1)不與其天然狀態(tài)下結合的所有或部分多核苷酸或多肽結合，(2)連接于其在天然狀態(tài)下不發(fā)生連接的多核苷酸或多肽上，或(3)在天然狀態(tài)下不存在，或對于多肽而言，產生自重組多核苷酸的表達。
本發(fā)明也提供了編碼本文所述的多肽蛋白的成熟形式的核酸分子(包括分離的和/或重組形式的，正如本領域技術人員所熟知的以及本文所描述的那樣)。完整VEGI同種型多肽的氨基酸序列包括前導序列和成熟蛋白。根據信號假說，生長的蛋白鏈跨越粗糙內質網的向外輸出一旦起始，由哺乳動物細胞分泌的蛋白的信號序列或分泌前導序列將從完整多肽上切割下來，產生分泌的“成熟”形式的該蛋白。多數哺乳動物細胞甚至是昆蟲細胞以同樣的特異性切割分泌蛋白。不過，在某些情況下，分泌蛋白的切割不非始終如一，這就產生兩種或更多成熟種類的蛋白。此外，長久以來就已知分泌蛋白的切割特異性最終決定于該完整蛋白的初級結構，也就是說，這是多肽氨基酸序列所固有的性質。
本發(fā)明也提供了編碼融合蛋白的多核苷酸。正如本領域眾所周知的，融合蛋白或多肽是包括處于非天然存在位置的區(qū)段的多肽。所述區(qū)段可能正常情況下存在于不同的蛋白中，而在融合多肽中被集合在一起，或者它們可能正常存在于同一個蛋白中，但在融合多肽中被以新的排列方式安置。從而，本發(fā)明提供了多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以以相同的讀框融合于幫助多肽自宿主細胞中表達和分泌的多核苷酸序列(例如，作為分泌序列行使調控多肽從細胞中運輸的功能的前導序列)上。具有前導序列的多肽是前蛋白，且其可由宿主細胞切割前導序列而形成成熟形式的多肽。多核苷酸也可以編碼成熟蛋白加上額外的5′氨基酸殘基的蛋白原。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白為蛋白原，并且是該蛋白的無活性形式。原序列一旦切割則留下活性成熟蛋白。因而，舉例來說，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或者具有原序列及前序列(前導序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸提供了在讀框中與允許純化或鑒定本發(fā)明多肽的標記序列融合的編碼序列。標記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標簽，以便在細菌宿主的情況下允許純化與該標記融合的成熟多肽，或者，舉例來說，當利用哺乳動物宿主如COS-7細胞時，標記序列可以是血凝素(HA)標簽。HA標簽對應于來源于流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson.I.等，Cell，37767(1984))。
因而，術語“編碼多肽的多核苷酸”涵蓋了僅包括所述多肽的編碼序列的多核苷酸，以及包括了額外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。為了本發(fā)明的目的，并且為避免麻煩地提及互補鏈，此類多核苷酸的反義(或互補)鏈也被表述為編碼該序列；也就是說，“編碼”多肽的多核苷酸序列既包括傳統(tǒng)的編碼鏈，又包括互補序列(或鏈)。
多核苷酸的突變體或變體可以是天然存在的該多核苷酸的等位基因變體，或者是非天然存在的該多核苷酸的變體。此類核苷酸突變體或變體包括缺失變體、替代變體以及添加或插入變體。變體序列可造成截短的或改變的多核苷酸或多肽，多核苷酸或多肽增加或減小的表達，或其任何組合。變異可以位于編碼、非編碼、5′或3′側翼、基因組或編碼核苷酸中。
在有些實施方案中，多核苷酸序列包括由于遺傳密碼子簡并性而不同于表1、2或3(SEQ ID NO1、SEQ ID NO2及SEQ ID NO3)中所示的那些序列的序列。遺傳密碼子是本領域眾所周知的。對于本領域技術人員來說產生此類簡并變體是常規(guī)的。從而，在有些實施方案中，本發(fā)明提供了編碼SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明進一步提供了本文所述的分離的核酸分子的片斷或截短形式。具有本文核苷酸序列中的一段核苷酸序列或其互補鏈的分離的核酸分子的片斷是指長度為至少5nt、至少10nt、至少15nt、至少20nt、至少30nt、至少40、50、100、150、200、250、300、400或500nt(連續(xù)核苷酸)的片斷。這些片斷具有眾多的用途，這包括但不限于如本文討論的診斷探針和引物。正如本領域眾所周知的，一般探針用于通過雜交檢測靶。在有些實施方案中，探針可以包括標記或者在雜交反應之前或之后能將標記連接到其上的工具。合適的標記包括，但不限于放射性同位素、熒光染料、化學發(fā)光化合物、染料和酶。此外，本領域技術人員理解，引物在與靶序列雜交后通常通過聚合延伸。當然，根據本發(fā)明，長度50-1500nt的更大片斷也是有用的。舉例來說，長度為至少20nt的片斷，是指包括20個或更多個來自核苷酸序列的連續(xù)堿基的片斷。在有些實施方案中，這些片斷包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸386和387。備選地，片斷長度可以小于1500、1250、1000、750、500、250、200、150、100、50、40nt并且包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸386和387。
本發(fā)明也提供了包括VEGI-192a的序列(表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93)或VEGI-192b的序列(表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386)的多核苷酸。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO1中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個以及至少100個或更多個連續(xù)的核苷酸(其通常也可以被稱之為區(qū)段)的多核苷酸，所述連續(xù)的核苷酸位于表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93之內。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO1中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個以及至少100個或更多個連續(xù)的核苷酸的多核苷酸，所述連續(xù)的核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO2中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個、至少100個、至少150個、至少175個、至少200個、至少250個、至少275個、至少300個、至少350個、至少375個、至少400個或更多個連續(xù)的核苷酸的多核苷酸，所述連續(xù)的核苷酸位于表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386之內。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQID NO2中至少10個、至少15個、至少18個、至少20個、至少25個、至少30個、至少50個、至少100個、至少150個、至少175個、至少200個、至少250個、至少275個、至少300個、至少350個、至少375個、至少400個或更多個連續(xù)的核苷酸的多核苷酸，所述連續(xù)的核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸386和387。
本發(fā)明提供了包括編碼SEQ ID NO4的多肽的序列的分離的多核苷酸。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO4的至少5個、至少8個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的序列的分離的多核苷酸，所述連續(xù)的氨基酸位于表4(SEQ ID NO4)中所示的氨基酸殘基1-26之內。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO4的至少5個、至少8個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的序列的分離的多核苷酸，所述連續(xù)的氨基酸包括表4(SEQ ID NO4)中所示序列的氨基酸26和27。本發(fā)明也提供了包括編碼表4(SEQ ID NO4)中所示序列的氨基酸殘基5-192、10-192、15-192或25-192的序列的分離的多核苷酸。
本發(fā)明提供了包括編碼SEQ ID NO5的多肽的序列的分離的多核苷酸。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO5的至少5個、至少8個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的序列的分離的多核苷酸，所述連續(xù)的氨基酸位于表5(SEQ ID NO5)中所示的氨基酸殘基1-26之內。本發(fā)明也提供了包括編碼SEQ ID NO5的至少5個、至少8個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)的氨基酸的序列的分離的多核苷酸，所述連續(xù)的氨基酸包括表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸26和27。本發(fā)明也提供了包括編碼表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸殘基5-192、10-192、15-192或25-192的序列的分離的多核苷酸。
應當理解，位于給定的氨基酸或核苷酸對之內的連續(xù)氨基酸或核苷酸區(qū)段可以，但不必要，包括所規(guī)定的對的成員。例如，位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93之內的連續(xù)的核苷酸可以包括SEQ ID NO1的核苷酸1和/或核苷酸93。
本發(fā)明的實施方案排除編碼由SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸27-192構成的多肽的多核苷酸，或者此類多核苷酸的任何截短的形式。
本發(fā)明也提供了包括編碼本文所述的任一VEGI多肽的序列的多核苷酸。
在具體的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸片斷編碼表現出功能活性的多肽。表現出“功能活性”的多肽是指能夠顯示出與完整或成熟VEGI多肽相關的一種或多種已知的功能活性的多肽。此類功能活性包括，但不限于生物活性(例如，抑制血管生成、抑制血管內皮細胞增殖、誘導細胞粘附)、抗原性(結合或與VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽競爭結合抗-VEGI-192a和/或抗-VEGI-192b抗體的能力)、免疫原性(產生與VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽結合的抗體的能力)、與其它VEGI多肽形成聚合物的能力以及與VEGI多肽的受體或配體(例如DR3)結合的能力。
同樣地，由本文所述的任一多核苷酸編碼的VEGI多肽可具有如上文和此處所述的VEGI的一種或多種功能活性。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了與本文描述的本發(fā)明多核苷酸具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分離的多核苷酸。一個實施方案提供了與表1或表2(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)中所示的VEGI-192a或VEGI-192b序列具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分離的多核苷酸。在其它實施方案中，分離的多核苷酸還與上述VEGI-192a或VEGI-192b序列具有小于85％、83％、80％、75％、70％的序列同一性。本發(fā)明也包括與表1(SEQ ID NO1)或2(SEQ ID NO2)中所示序列的至少10個連續(xù)核苷酸(或更多個，例如15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100個連續(xù)核苷酸)的片斷具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分離的多核苷酸，其中連續(xù)核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94，或SEQ ID NO2的核苷酸386和387。在有些實施方案中，所述多核苷酸與表1(SEQ ID NO1)中所示序列或表2(SEQ ID NO2)中所示序列的至少10個連續(xù)核苷酸(或更多個，例如15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100個連續(xù)核苷酸)的片斷具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性，其中連續(xù)核苷酸位于SEQ IDNO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之內。
一個多核苷酸或多核苷酸區(qū)段與另一個序列具有一定百分比(例如，80％、85％、90％或95％)“序列同一性”是指，當比對時，兩個序列相比所述百分比的堿基是相同的。這種比對和百分比同源性或序列同一性可利用本領域公知的軟件程序確定，例如《當代分子生物學方案》(F.M.Ausubel等編輯，1987)增刊30，第7.718節(jié)，表4.7.1中所描述的那些程序。百分比同一性可電子測定，例如通過利用MegAlign.TM.程序(DNASTAR，Inc.，Madison Wiss.)。所述MegAlign.TM.程序可根據不同的方法如聚類法(clustal method)(如參見Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244)，在兩個或多個序列之間建立比對。聚類運算法則(clustal algorithm)通過檢查所有對之間的距離將序列分組為簇。簇成對然后成組對齊。兩個氨基酸序列之間的百分比相似性，以序列A和序列B為例，通過序列A的長度，減去序列A中的缺口殘基數目，減去序列B中的缺口殘基數目，再除序列A和序列B之間匹配殘基的總和，然后乘以100計算。在確定百分比相似性時，兩氨基酸序列間低相似性或無相似性的缺口不包括在內。核酸序列間的百分比同一性也可以通過本領域公知的其它方法如Jotun Hein法(如參見Hein，J.(1990)Methods Enzymol.183626-645)計數或計算。
本發(fā)明以提供了在高度嚴謹條件下與具有互補于選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的核苷酸序列的序列的核酸、或者具有互補于編碼SEQID NO4或SEQ ID NO5的核苷酸的序列的核酸雜交的分離的核酸，或者它們的互補物。
就雜交條件而言，所需的序列同一性越高，如果此類序列是由它們與本發(fā)明的多核苷酸序列雜交的能力確定的話，則雜交條件越嚴謹。因此，本發(fā)明也包括能夠與包括如本文所述的本發(fā)明多核苷酸的序列雜交的多核苷酸。嚴謹雜交條件的實例是于42℃在溶液50％甲酰胺，1×SSC(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×denhardt液，10％硫酸葡聚糖和20ug/ml變性剪切的鮭精DNA中過夜溫育，接著于大約65℃在0.1×SSC中洗滌濾膜。有關雜交反應的討論，參見下文。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包括能與包含表1(SEQ ID NO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示序列或如上文所述的其片斷的多核苷酸(例如DNA或RNA)雜交的至少10個連續(xù)核苷酸(或更多個，例如15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100(或更多個)連續(xù)核苷酸)的序列，其中所述雜交的條件是不與來自哺乳動物細胞(優(yōu)選人類細胞)的其它多核苷酸雜交的條件，或者與具有表1(SEQ IDNO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示序列的多核苷酸的雜交相對于與來自哺乳動物細胞的其它多核苷酸的雜交被富集的條件。在有些實施方案中，所述片斷包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94或SEQ ID NO2的核苷酸386和387。在有些實施方案中，所述片斷位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之內。
這些實施方案在診斷(檢測)情況中尤其有用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括包含表1(SEQ ID NO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示非編碼(即側翼區(qū))的至少10個、優(yōu)選15個、優(yōu)選18個、優(yōu)選20個、更優(yōu)選25個、更優(yōu)選35個、更優(yōu)選50個、還更優(yōu)選75、100、125、150、200、250個連續(xù)核苷酸的多核苷酸序列。這些實施方案尤其可用作為診斷探針或作為引物用于擴增VEGI-192a或VEGI-192b基因的非編碼部分。
應當理解(除非另有規(guī)定或者需求)，本文描述的本發(fā)明多核苷酸的任何實施方案既包括雙鏈形式，也包括已知或者預測可構成雙鏈形式的兩互補單鏈形式中的每一個。
雜交反應可在不同的“嚴謹”條件下實施。提高雜交反應嚴謹性的條件在本領域廣為人知且已公開。如參見Sambrook等(1989)。相關條件的實例包括(按提高的嚴謹性的順序)25℃、37℃、50℃及68℃的溫育溫度；10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC的緩沖液濃度(其中SSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)以及利用其它緩沖液系統(tǒng)的其等同物；0％、25％、50％及75％濃度的甲酰胺；從5分鐘到24小時的溫育時間；1步、2步或更多的洗滌步驟；1、2或15分鐘的洗滌溫育時間；以及6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去離子水的洗滌溶液。嚴謹雜交條件的一個實例是于50℃或更高的溫度下在0.1×SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)中雜交。嚴謹雜交條件的另一個實例是于42℃在溶液50％甲酰胺，1×SSC(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×denhardt液，10％硫酸葡聚糖和20ug/ml變性剪切的鮭精DNA中過夜溫育，接著于大約65℃在0.1×SSC中洗滌濾膜。嚴謹雜交條件是至少與上文的代表性條件一樣嚴謹的雜交條件。其它嚴謹雜交條件是本領域公知的，并且也可用來鑒定本發(fā)明該特定實施方案中的核酸。
本發(fā)明也提供了包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的區(qū)段的引物和探針，其中所述區(qū)段位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之內。本發(fā)明也提供了包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的區(qū)段的引物和探針，其中所述區(qū)段包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94或者SEQ ID NO2的核苷酸386和387。
來自本文提供的一個以上多核苷酸序列的探針，如果它們所來源的cDNA對應于一個mRNA的話，能夠與相同核酸雜交。利用探針，尤其是DNA序列的標記探針，人們能夠分離同源或相關基因。同源基因的來源可以是任何物種，例如靈長類物種、犬科動物、貓科動物、牛、綿羊、馬、酵母、線蟲類。可以利用多于10個核苷酸(″nt″)的探針，例如大小在約15nt、18nt、20nt、25nt、75nt或100nt范圍內的探針，但是一般約15nt代表了足夠用于獨特鑒定的序列。
″Tm″是由互補鏈以反平行方向通過Watson-Crick堿基配對而氫鍵鍵合形成的多核苷酸雙鏈體在實驗條件下50％解離為單鏈的攝氏溫度。Tm可以根據標準公式預測，例如Tm＝81.5+16.6log[X+]+0.41(％ G/C)-0.61(％ F)-600/L其中[X+]為mol/L的陽離子濃度(通常為鈉離子Na+)；(％ G/C)為G和C殘基的數目占雙鏈體總殘基的百分比；(％ F)為溶液中甲酰胺的百分比(wt/vol)；而L為雙鏈體中每一鏈的核苷酸數目。
如上文所述，本發(fā)明包括VEGI-192a和VEGI-192b多核苷酸的變體或修飾，例如缺失、替代、添加或任何核酸部分在性質上的改變。變體或修飾是與本文所示的多核苷酸相比的核苷酸序列中的任何差異以編碼VEGI-192a或VEGI-192b多肽，和/或就多核苷酸的核酸部分而言的任何差異。此類改變可用于方便VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸的克隆及促進其表達改變。此類改變也可用來賦予多核苷酸期望的性質如穩(wěn)定性。本文提供的多核苷酸的定義給出了這些修飾的實例。因此，本發(fā)明也包括保持了功能的本文公開的核酸序列的變體，其包括核酸替代、添加和/和缺失。變體包括天然存在的多核苷酸序列變體(例如，簡并變體、等位基因變體等)。一般而言，等位基因變體含有15-25％的堿基對(bp)誤配，并且可以含有少至5-15％或2-5％或1-2％ bp的誤配，以及單堿基對誤配。
如上文所述，本發(fā)明涵蓋VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸，包括全長(未加工的)、加工的、編碼、非編碼的或其部分。VEGI-192a基因組區(qū)段的部分圖譜顯示在圖6中，包括預測的內含子-外顯子邊界。本發(fā)明還可包括見于成熟mRNA中的3′和5′非翻譯區(qū)，特定轉錄和翻譯調控序列，例如啟動子、增強子等(包括大約1kb)，以及可能地更多的位于轉錄區(qū)5′或3′端的側翼基因組DNA?；蚪MDNA可作為100kbp或更小的片斷分離，并且基本上不含側翼染色體序列。3′或5′側接編碼區(qū)的基因組DNA、或者有時見于內含子中的內部調控序列，含有恰當組織、階段特異性或疾病狀態(tài)特異性表達所需的序列。本發(fā)明也包括mRNA和cDNA序列及其片斷，包括含有部分VEGI-192a或VEGI-192b編碼區(qū)段的片斷。正常地，mRNA類物質具有連續(xù)的外顯子，當存在間插內含子時，所述內含子由核RNA剪接除去，產生編碼多肽的連續(xù)的開放讀框。mRNA類物質也可以既存在外顯子也存在內含子，其中內含子可通過可變剪接除去。此外，由同一種基因組編碼的不同種類的mRNA可以以變化不等的水平存在于細胞中，而這些不同水平的mRNA類物質的檢測可指示所編碼的基因產物在細胞中的差異表達。
本發(fā)明也涵蓋編碼全長VEGI-192a或VEGI-192b的功能上等同的變體和衍生物及其功能上等同的片斷(例如缺失VEGI-192a或VEGI-192bN-末端和/或C-末端氨基酸)的多核苷酸，所述多核苷酸可能增強、降低或不顯著影響由此編碼的多肽的性質。例如，不改變編碼的氨基酸序列的DNA序列中的改變，以及那些導致氨基酸殘基保守替代、無害非保守替代、一個或幾個氨基酸缺失或添加、以及氨基酸殘基被氨基酸類似物替代的改變，是不顯著影響編碼的多肽性質的改變。不改變編碼的氨基酸殘基的核苷酸替代可用于在不同系統(tǒng)中優(yōu)化基因表達。合適的替代是本領域技術人員公知的，并且可以實施，例如，以反映特定表達系統(tǒng)中優(yōu)選的密碼子利用。在另一個實例中，可變剪接的多核苷酸可產生功能上等同的VEGI片斷或變體?？勺兗庸さ亩嗪塑账嵝蛄凶凅w被定義為對應于彼此序列不同但來源于同一個基因組區(qū)段的mRNA的多核苷酸序列，所述mRNA為例如，由于1)可變啟動子的使用；2)可變多聚腺苷酸化位點的使用；或3)可變剪接位點的使用而產生的mRNA。
本發(fā)明也提供了包括具有SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補物的核酸的DNA插入物。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包括具有SEQ IDNO2的核苷酸序列或其互補物的核酸的DNA插入物。
正如本領域眾所周知的，“多核苷酸”是指任何長度的核苷酸聚合形式，其包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類似物。術語“多核苷酸”和“核酸”在文中可互換使用，并且是本領域眾所周知的。多核苷酸可以具有三維結構。術語“多核苷酸”包括雙鏈、單鏈和三股螺旋分子。除非另有規(guī)定或者需求，本文描述的本發(fā)明多核苷酸的任何實施方案既包括雙鏈形式，也包括已知或者預測可構成雙鏈形式的兩互補單鏈形式中的每一個。并非多核苷酸中的所有鏈鍵都需要相同。
在有些實施方案中，多核苷酸可以包括修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。當利用尿嘧啶作為脫氧核糖核酸中胸腺嘧啶的取代物時也被認為是嘧啶的類似形式。
正如本領域廣為人知的，核苷酸結構的修飾，如果存在的話，可以在組裝聚合體之前或之后給予。在有些實施方案中，核苷酸序列可以被非核苷酸組分中斷。如本文所述，多核苷酸可在聚合之后再行修飾，例如通過與標記組分偶聯。其它類型的修飾有，例如，“封端(caps)”；用類似物替代一個或多個天然存在的核苷酸；核苷酸間修飾，例如象具有不帶電荷鏈鍵的修飾(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)以及具有帶電荷鏈鍵的修飾(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含附屬部分的那些修飾，例如象蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、多聚-L-賴氨酸等)、具有嵌入劑的那些修飾(例如，吖啶、補骨脂素等)、含螯合劑的那些修飾(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、含烷化劑的那些修飾、具有修飾的鏈鍵的那些修飾(例如，α異頭核酸等)、以及多核苷酸的非修飾形式。所有這些修飾是本領域眾所周知的。
此外，正常存在于糖中的任何羥基基團都可以由膦酸酯基團、磷酸酯基團取代，由標準保護基團保護，或者活化以制備與附加核苷酸的附加鏈鍵，或者可以偶聯于固相支持物上。5′和3′末端OH基團可以被磷酸化或用胺或1-20個碳原子的有機封端基團部分取代。其它羥基也可以衍化為標準保護基團。
多核苷酸也可以含有本領域一般公知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，包括但不限于2′-O-甲基-，2′-O-烯丙基，2′-氟-或2′-疊氮-核糖、碳環(huán)型糖類似物、α端基異構糖、差向立體異構糖例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環(huán)類似物和無堿基核苷類似物例如甲基核苷。
雖然一般利用常規(guī)的糖和堿基，但糖、嘌呤和嘧啶的類似物形式的替代在終產物的設計中可能具有優(yōu)勢，同樣可選擇的主鏈結構如聚酰胺主鏈或硫代磷酸酯主鏈也可能具有優(yōu)勢。
本發(fā)明涵蓋組合物，包括藥物組合物，其包含本文所描述的多核苷酸。這些組合物可進一步包含合適的賦形劑，例如藥學上可接受的賦形劑，包括緩沖液，這是本領域眾所周知的。
本發(fā)明也提供了包括本文所述的任一多核苷酸的試劑盒。在有些實施方案中，試劑盒包括SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸。在有些實施方案中，試劑盒包括編碼SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5的多肽的多核苷酸。在有些實施方案中，試劑盒包括包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的至少15個、至少20個、至少25個、至少30個或者至少50個連續(xù)核苷酸的探針和引物，所述連續(xù)核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之內。這些試劑盒可進一步包括試劑和說明書，用于檢測存在或不存在VEGI-192a和/或VEGI-192b或其表達水平。本發(fā)明的試劑盒被適當包裝，并且可任選地提供其它的組分例如緩沖液和說明書。
本發(fā)明也提供了結合于固相支持物上的本文所述的多核苷酸。將多核苷酸連接到固相支持物例如陣列表面的方法是本領域眾所周知的。固相支持物是任何合適的物質，包括基于聚苯乙烯的珠子和玻璃芯片，例如GeneChip.RTM.產品(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，Calif)。參見國際公開號WO 97/10365、WO 97/29212、WO 97/27317、WO 95/11995、WO90/15070以及美國專利No.5,744,305和5,445,934。
本發(fā)明也提供了包括VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸的陣列。多核苷酸陣列提供了可以測定樣品中大量多核苷酸或多肽的高通量技術。這種技術可用作為工具測試差異表達。許多制備陣列的方法以及這些方法的變形是本領域公知的，并可考慮用于本發(fā)明。例如，陣列可通過將多核苷酸探針點樣到基片(例如玻璃、硝化纖維素等)上產生具有結合的探針的二維矩陣或陣列。探針可以通過共價鍵或者通過非特異性相互作用例如疏水相互作用結合到基片上。多核苷酸樣品可以被可檢測地標記(例如放射性或熒光標記)，然后與探針雜交。一旦洗去樣品的未結合部分，就可以檢測包括與探針多核苷酸結合的標記的樣品多核苷酸的雙鏈多核苷酸。備選地，試驗樣品中的多核苷酸可以固定到陣列上，而探針被可檢測地標記。構建陣列的技術和利用這些陣列的方法描述在，例如，Schena等(1996)ProcNatl Acad Sci U S A.93(20)10614-9；Schena等(1995)Science 270(5235)467-70；Shalon等(1996)Genome Res.6(7)639-45，USPN 5,807,522，EP799 897；WO 97/29212；WO 97/27317；EP 785 280；WO 97/02357；USPN5,593,839；USPN 5,578,832；EP 728 520；USPN 5,599,695；EP 721 016；USPN 5,556,752；WO 95/22058以及USPN 5,631,734中。
陣列可用來檢查基因的差異表達并且可用于測定基因功能。例如，可利用陣列檢測與本文所述的多核苷酸對應的VEGI同種型的差異表達，其中表達在測試細胞和對照細胞之間進行比較。例如，特定VEGI同種型信使RNA在來自患病受試者的細胞中高表達，而在相應的正常細胞中未觀察到，則可表明該VEGI同種型與此病有關聯。陣列的例示性用途進一步描述在，例如，Pappalarado等，Sem.Radiation Oncol.(1998)8217以及Ramsay Nature Biotechnol.(1998)1640中。此外，利用陣列進行檢測的方法的許多變形是本領域技術范圍之內的事，并且落在本發(fā)明的范圍內。例如，不將探針固定到固相支持物上，可將測試樣品固定在固相支持物上，然后與探針接觸。
在來自患病個體的細胞中差異表達的VEGI同種型多核苷酸就該病而言將具有臨床意義。如果與來自未患病個體的相同細胞類型的細胞相比，在患病個體的細胞中檢測到VEGI同種型多核苷酸更高或更低的水平的話，則該多核苷酸在細胞中是差異表達的。典型地，差異表達的多核苷酸的篩選集中于篩選以如下方式表達的多核苷酸，即，該多核苷酸的表達導致例如，患病個體細胞與不是來自此個體的相同細胞類型的細胞相比，其中的mRNA水平高(如過表達)或低(如次表達)至少約25％、至少約50％到約75％、至少約90％、至少約2倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍或者至少約50倍或更高。此比較，例如，如果利用原位雜交或者利用允許在某種程度上區(qū)別組織中的細胞類型的另一種測定法的話，可在兩個組織之間進行。比較也可以在從組織來源中取出的細胞之間進行。
因而，本發(fā)明提供了包括如本文所述的VEGI同種型多核苷酸的陣列。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包括表1(SEQ ID NO1)中所示的多核苷酸序列或者表1(SEQ ID NO1)中所示序列的多核苷酸區(qū)段的陣列，其中所述區(qū)段為至少10個連續(xù)的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100個連續(xù)核苷酸)。在其它實施方案中，該區(qū)段還包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94。在其它實施方案中，該區(qū)段位于表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93之內。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包括表2(SEQ ID NO2)中所示的多核苷酸序列或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的多核苷酸區(qū)段的陣列，其中所述區(qū)段為至少10個連續(xù)的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100個連續(xù)核苷酸)。在其它實施方案中，該區(qū)段還包括表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸386和387。在其它實施方案中，該區(qū)段位于表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386之內。
陣列也可用于檢測突變VEGI同種型多核苷酸。突變VEGI同種型多核苷酸可在基因組DNA中檢測，例如分離自個體血液或另一種組織樣品的基因組DNA。突變VEGI同種型多核苷酸也可以利用來自具有改變的VEGI同種型多核苷酸的個體的cDNA或mRNA檢測，舉例來說，如果該突變VEGI同種型多核苷酸產生大小改變的mRNA的話。突變VEGI同種型基因也可能導致VEGI同種型mRNA的差異表達(增加或減少)，這可以如本文所述檢測。
本發(fā)明也提供了包括能與本文所述的多核苷酸特異性雜交的一種或多種分離的多核苷酸的陣列。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包括能與表1(SEQ ID NO1)中所示多核苷酸或者表1(SEQ ID NO1)中所示序列的多核苷酸區(qū)段特異性雜交的一種或多種分離的多核苷酸的陣列，其中所述區(qū)段為至少10個連續(xù)的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100個連續(xù)核苷酸)。在其它實施方案中，該區(qū)段進一步包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94。在其它實施方案中，該區(qū)段位于表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93之內。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包括與表2(SEQ ID NO2)中所示多核苷酸或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的多核苷酸區(qū)段特異性雜交的一種或多種分離的多核苷酸的陣列，其中所述區(qū)段為至少10個連續(xù)的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100個連續(xù)核苷酸)。在其它實施方案中，該區(qū)段進一步包括表2(SEQ IDNO2)中所示序列的核苷酸386和387。在其它實施方案中，該區(qū)段位于表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386之內。
本發(fā)明的多肽本發(fā)明包括表4(SEQ ID NO4)、5(SEQ ID NO5)和6(SEQ ID NO6)中所示的人類VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251多肽序列。VEGI多肽可以通過包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析在內的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化。蛋白折疊步驟可根據需要使用以完成成熟蛋白的構型。最后，高效液相色譜(HPLC)可用于最后的純化步驟。蛋白折疊和純化方法的實例描述在美國專利申請20010044521和WO 01/55174中。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或者是化學合成操作的產物，或者通過重組技術由原核(例如大腸桿菌)或真核宿主(例如CHO細胞)產生。根據重組生成操作中所使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以被糖基化或者可以不被糖基化。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
如本文所述，本發(fā)明的VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251多肽(如本文所述，其包括各種實施方案，例如全長、突變、融合、片斷等)具有多種用途。所述多肽在用作指示血管生成相關疾病的遺傳或生物化學標記(例如在血液或組織中)和/或用于監(jiān)測各種療法以及預防性干預的功效時將尤其有意義。診斷(即檢測)和篩選方法在下文更加詳細地描述。本發(fā)明的多肽也可用于制備與這些多肽結合的抗體，用作為試劑篩選藥物候選物(體外和體內)、用于合理(即基于結構的)藥物設計中以及包括下文描述的治療用途在內的其它用途(例如，如果全長VEGI-192a或VEGI-192b通過結合另一個蛋白發(fā)揮作用，則競爭性結合VEGI-192a或VEGI-192b的多肽能夠作為競爭性抑制劑損害VEGI-192a或VEGI-192b的功能從而發(fā)揮治療活性)。VEGI-192a或VEGI-192b多肽也可用于鑒定尤其是來自于人類的與VEGI-192a或VEGI-192b結合(或者物理作用)從而自身可作為藥靶的蛋白。
本發(fā)明提供了VEGI-192a和VEGI-192b多肽，截短形式或片斷。本發(fā)明的VEGI多肽具有一種或多種功能，如在前面部分所描述的。在有些實施方案中，VEGI多肽起著結合特異性抗體的作用。在其它實施方案中，VEGI多肽是免疫原。又在其它實施方案中，VEGI多肽抑制血管內皮細胞生長和/或血管生成。測試VEGI多肽(包括截短形式的VEGI)活性的方法是本領域熟知的，并在實施例中詳加描述，例如測試對血管內皮細胞生長、毛細管樣管形成、置于雞胚尿囊絨膜上的膠原凝膠中的毛細管生長、異種移植腫瘤生長的影響的試驗。
多肽片斷的大小可以變化很大。因而，本發(fā)明包括全長VEGI-192a或VEGI-192b的多肽片斷，其包含表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所述的部分氨基酸序列，其中該VEGI-192a和VEGI-192b多肽為表4(SEQID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示序列的至少約5個、約10個、約15、25、50、75、100、150或更多個連續(xù)的氨基酸。應理解該片斷包含位于SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸1-26之內的至少一個氨基酸，優(yōu)選包含SEQ ID NO4或5氨基酸1-26內的區(qū)域。在有些實施方案中，所述的部分氨基酸序列包括表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示的氨基酸26和27。在有些實施方案中，所述的部分氨基酸序列位于SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸1-26之內。對本領域技術人員顯而易見的是，這些多肽，不論其大小如何，也可與其它物質或藥劑結合或偶聯以促進、增強或調節(jié)VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的功能和/或特異性。這些片斷也可用于多種用途，包括作為免疫原(單獨或者聯合合適的藥劑)或者作為抑制血管生成的藥劑。所述片斷(與多肽一樣)應當具有上文所述的VEGI多肽的一種或多種生物學功能。在有些實施方案中，所述片斷抑制血管生成。截短形式可以小于大約如下任何數目的氨基酸185、170、160、150、125、100、80、50、40、25、20、15或10個。
應當理解，位于給定氨基酸或核苷酸對之內的連續(xù)氨基酸或核苷酸區(qū)段可以，但不必要，包括指定對的任一成員。例如，位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26之內的連續(xù)的氨基酸可以包括SEQ ID NO4的氨基酸1和/或氨基酸26。
在本發(fā)明的有些實施方案中，本發(fā)明的多肽包括位于表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示氨基酸殘基1-26之內的至少5個、至少8個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)氨基酸(其一般也稱之為區(qū)段)。本發(fā)明也提供了包括表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQID NO5)中所示序列的大約5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位氨基酸殘基的多肽。
本發(fā)明的實施方案排除由SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸27-192構成的多肽，或者此類多肽的任何截短形式。
本發(fā)明進一步包括與上述多肽具有至少90％相似性、更優(yōu)選至少95％相似性、并且還更優(yōu)選至少96％、97％、98％或99％相似性的多肽。本發(fā)明的多肽也包括那些與本文所述的多肽具有至少80％同一性、更優(yōu)選至少90％或95％同一性、還更優(yōu)選至少96％、97％、98％或99％同一性的多肽，并且也包括具有至少30個氨基酸且更優(yōu)選至少50個氨基酸的此類多肽的部分。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NO4的多肽或者SEQ ID NO5的多肽具有至少90％相似性、更優(yōu)選至少95％相似性、并且還更優(yōu)選至少96％、97％、98％或99％相似性的多肽。本發(fā)明的多肽也包括那些與SEQ ID NO4的多肽或者SEQ ID NO5的多肽具有至少80％同一性、更優(yōu)選至少90％或95％同一性、還更優(yōu)選至少96％、97％、98％或99％同一性的多肽。
本發(fā)明也提供了包含本文所述的多肽的融合蛋白。本文所示的多肽可與序列(例如增強免疫反應性、促進多肽偶聯到支持物或者載體上，或者促進純化(例如，編碼表位如Myc、來源于流感病毒血凝素的HA、His-6或FLAG的序列)的序列)融合。另外，所述蛋白或多核苷酸可以與增強其功能或指導其在細胞中的定位的其它蛋白或多肽融合，例如本文公開的分泌序列。有關上文所述的重組融合蛋白的制備方法是本領域公知的。重組或融合蛋白可通過本領域熟知的方法分離。轉化的宿主細胞可用于分析抑制或激活VEGI功能的藥物和藥劑，例如宿主蛋白或化學來源的藥劑或與VEGI多核苷酸相互作用以下調或改變VEGI多肽的表達或影響其抑制血管生成的能力的其它蛋白的效力。測試抗-VEGI或抗血管生成的藥物或藥劑的效力的方法可以為，例如，對內皮細胞生長抑制劑的封阻。
本發(fā)明涵蓋包括藥物組合物在內的組合物，其包含本文所述的多肽。在有些實施方案中，所述組合物包括SEQ ID NO4的多肽。所述組合物可用于抑制血管生成。這些組合物可以進一步包括本領域熟知的合適的賦形劑，例如藥學上可接受的包括緩沖液在內的賦形劑。
本發(fā)明也提供了包括本文所述的多肽的試劑盒。在有些實施方案中，該組合物包括SEQ ID NO4的多肽。在有些方面，試劑盒可用于治療病理性血管生成，抑制血管生成，或者治療癌癥例如減小腫瘤大小。本發(fā)明的試劑盒被適當包裝，并且可任選地提供附加的組分例如緩沖液和說明書。
本發(fā)明也提供了結合于固相支持物上的本文所述的多肽。進行此類結合，例如結合到陣列表面的方法是本領域眾所周知的。結合于固相支持物(例如瓊脂糖顆粒、SEPHADEX等)的本發(fā)明的多肽可用于篩選選擇性結合本文所述的多肽的分子。
本發(fā)明也涵蓋包括本文所述的本發(fā)明的VEGI同種型多肽的陣列。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了包括如本文所述的本發(fā)明多核苷酸編碼的VEGI同種型多肽的陣列。在其它方面，本發(fā)明提供了包括含有表4(SEQID NO4)中所示序列或其區(qū)段的多肽的陣列，其中所述區(qū)段長度為至少5個連續(xù)的氨基酸(或更多，例如長度為至少10、15、25、50、75、100、150或更多個氨基酸)。在有些實施方案中，該區(qū)段包括表4(SEQ ID NO4)中所示序列的氨基酸26和27。在其它實施方案中，該區(qū)段位于表4(SEQ IDNO4)中所示序列的氨基酸1-26之內。
在其它方面，本發(fā)明也提供了包括包含表5(SEQ ID NO5)中所示序列或其區(qū)段的多肽的陣列，其中所述區(qū)段長度為至少5個連續(xù)的氨基酸(或更多，例如長度為至少10、15、25、50、75、100、150或更多個氨基酸)。在有些實施方案中，該區(qū)段包括表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸26和27。在其它實施方案中，該區(qū)段位于表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸1-26之內。
術語“多肽”和“蛋白”在文中互換使用，如本領域所熟知的，是指任何長度的氨基酸的聚合物。在各種實施方案中，該聚合物可以是線性的或分枝的，它可以包括修飾氨基酸，它可以被非氨基酸中斷和/或它可以被組裝為具有一個以上多肽鏈的復合物。正如本領域所熟知的，多肽可以被天然地或者通過干預修飾；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或者任何其它操作或修飾，例如偶聯標記組分。在有些實施方案中，多肽含一個或多個氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本領域公知的其它修飾。
本發(fā)明也包括本文所述VEGI多肽的保持了功能的變體。此類變體可利用本領域標準的方法，例如通過保守氨基酸替代制備。在各種實施方案中，保持了功能的變體包括其中包括了(或者在有些實施方案中，組成為)1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個保守氨基酸替代之任一的功能保持變體。
載體和宿主細胞本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明分離的多核苷酸的載體，由所述重組載體遺傳改造的、或者以其他方式改造而產生本發(fā)明的多肽的宿主細胞，以及本發(fā)明的多肽通過重組技術的生產。
術語“載體”是指質粒、病毒或本領域公知的其它運載工具，其已經被操作插入或并入了VEGI-251、VEGI-192a或VEGI-192b基因序列或其片斷。使得載體適于操作的這種多核苷酸(通常為DNA)元件可以是在原核或真核細胞中起作用的復制原點。在原核細胞中工作的復制原點的實例是colElori。重組載體還需要選擇標記以控制含所述載體的這些生物體的生長。合適的選擇標記包括保護生物體免受抗生素(例如，氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素)破壞的基因(抗生素抗性)，或者在細胞中表達為蛋白時在缺乏化合物的環(huán)境條件(營養(yǎng)缺陷型生長條件)下提供生長的基因。在本發(fā)明優(yōu)選的操作重組載體的實施方法中，原核細胞為細菌。在本發(fā)明特別優(yōu)選的形式中，細菌尤其是大腸桿菌(Escherichia coli)或芽孢桿菌種(Bacillussp.)。在本發(fā)明進一步優(yōu)選的操作重組載體的實施方案中，真核細胞為細胞系細胞或酵母細胞。在本發(fā)明特別優(yōu)選的形式中，細胞系細胞為CHO、COS、Hela細胞系或3T3細胞系細胞，而酵母細胞為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞。
本發(fā)明包括許多其中已經克隆了VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的載體(即克隆和/或表達載體，以及用于克隆和/或復制的載體)。這些載體可用于表達重組多肽以及作為VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的來源?？寺≥d體可用于獲得它們所含的VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的復制拷貝，或者作為在保藏單位貯存多核苷酸的工具以備將來回收之用。表達載體(以及含這些表達載體的宿主細胞)可用于獲得由它們所含的多核苷酸產生的多肽。它們也可用于期望可在個體中表達VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多肽的情況下，例如通過表達載體中編碼的多肽引發(fā)免疫應答。合適的克隆和表達載體包括任何本領域已知的載體，例如，可用于細菌、哺乳動物、酵母和昆蟲表達系統(tǒng)的那些載體。具體的載體及合適的宿主細胞是本領域公知的，而無需在文中詳細描述。例如，參見Gacesa和Ramji，Vectors，John Wiley & Sons(1994)。
克隆和表達載體典型地含有選擇標記(例如，編碼轉化有該載體的宿主細胞存活或生長所必需的蛋白的基因)，雖然此種標記基因可以由共引入宿主細胞中的另一個多核苷酸序列攜帶。只有已引入了選擇基因的那些宿主細胞在選擇條件下會存活和/或生長。典型的選擇基因編碼的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素物質(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤等)的抗性；(b)補償營養(yǎng)缺陷型不足；或(c)提供復雜培養(yǎng)基中不可獲得的關鍵營養(yǎng)物。適當標記基因的選擇將取決于宿主細胞，而用于不同宿主的合適的基因是本領域公知的。克隆和表達載體也典型地含有為宿主所識別的復制系統(tǒng)。
合適的克隆載體可以根據標準技術構建，或者可以從本領域現有的大量克隆載體中選擇。盡管選擇的克隆載體可能根據待用的宿主細胞變化，可用的克隆載體一般將具有自我復制的能力，可以具有特定限制性內切酶的單個靶點和/或可以攜帶可用于選擇含所述載體的克隆的標記基因。合適的實例包括質粒和細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(如pBS SK+)及其衍生物mp18、mp19、pBR322、pMB9、C0lEl、pCRl、RP4，噬菌體DNA以及穿梭載體例如pSA3和pAT28。這些及其它克隆載體可由商家BioRad、Strategene和Invitrogen等獲得。
表達載體一般為含有編碼目的VEGI多肽的多核苷酸的可復制多核苷酸構建物。編碼VEGI多肽的多核苷酸可操作地連接于合適的轉錄調控元件，例如啟動子、增強子和終止子。對于表達(即翻譯)，通常也需要一種或多種翻譯調控元件，例如核糖體結合位點、翻譯起始位點和終止密碼子。這些調控元件(轉錄和翻譯的)可來自于VEGI多核苷酸(即VEGI同種型基因之一)，或者它們可以是異源的(即，來自于其它基因和/或其它生物體)。也可以包括編碼信號肽的多核苷酸序列，以允許VEGI多肽穿越和/或停留在細胞膜中或者從細胞中分泌。許多適于在包括酵母、禽類和哺乳動物細胞在內的真核細胞中表達的表達載體是本領域公知的。
含有目的多核苷酸的載體可通過任何一種適當的方法引入到宿主細胞中，包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質的轉染、微粒轟擊、脂轉染以及感染(其中載體為感染因子，例如痘苗病毒)。引入載體或多核苷酸的方式的選擇常取決于宿主細胞。
本發(fā)明進一步包括宿主細胞和由所述宿主細胞構成的細胞培養(yǎng)物。在前面提及了包含至少一種重組多核苷酸(通常為DNA)載體的宿主細胞。“宿主細胞”是指載體在其中能夠繁殖并表達它的DNA的細胞。所述細胞可以是原核或真核細胞。該術語也包括所述宿主細胞的任何子代。應當理解并非所有的子代都與親代細胞相同，因為在復制期間可能發(fā)生突變。不過，當利用術語“宿主細胞”時，此類子代包括在內。穩(wěn)定轉染的方法，即外源DNA持續(xù)維持在宿主中的方法，是本領域公知的。當宿主細胞取自原核細胞時，它優(yōu)選由細菌尤其是大腸桿菌或芽孢桿菌菌種的細胞組成，當宿主細胞由真核細胞組成時，它優(yōu)選是細胞系細胞，尤其是COS細胞系、Hela細胞系或3T3細胞系細胞或者酵母細胞，尤其是釀酒酵母細胞。
本發(fā)明的宿主細胞可用作例如VEGI多核苷酸，和/或產生本文所述的VEGI多核苷酸和/或多肽的運載工具的貯存庫。宿主細胞也可作為突變VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的貯存庫，如本文進一步描述的。此類宿主細胞如本文進一步描述的可用于篩選、生產治療性蛋白或多肽。
抗體及其制備本發(fā)明也提供了選擇性結合如本文所述的VEGI-192a和/或VEGI-192b(包括片斷)蛋白的抗體。術語“抗體”包括，但不限于完整分子、能夠結合表位決定簇的它們的片斷，例如Fab、(Fab′)2、Fv。這些保留了選擇性與其抗原或受體結合的一定能力的抗體片斷定義如下(1)Fab，含抗體分子的單價抗原結合片斷的片斷，可通過用木瓜蛋白酶消化全抗體制備，產生完整的輕鏈和一條重鏈的部分；(2)Fab′，抗體分子的該片斷可通過用胃蛋白酶處理全抗體接著還原獲得，產生完整的輕鏈和重鏈的一部分；每個抗體分子獲得兩個Fab′片斷；(3)(Fab′)2，該抗體片斷可通過用胃蛋白酶處理全抗體而無需后續(xù)還原獲得；(Fab′)2是兩個Fab′片斷通過兩個二硫鍵結合在一起的二聚體；(4)Fv，定義為基因工程片斷，含表達為兩條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)；和(5)單鏈抗體(″SCA″)，定義為基因工程分子，含有由合適的多肽接頭連結的輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)作為基因融合的單鏈分子。
在有些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以是如下任一種或多種多克隆、單克隆、單鏈(ScFv)、這些實施方案的突變體、包括部分抗體(例如一個或多個CDR區(qū))的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、人類抗體或包括具有所需特異性的抗原識別位點的該免疫球蛋白分子的任何修飾構型。
正如本領域所理解的，“單克隆抗體”是指均質抗體群，其中的單克隆抗體由參與抗原選擇性結合的氨基酸(天然存在的及非天然存在的)組成。單克隆抗體具高度特異性，指向單個抗原位點。術語“單克隆抗體”不僅涵蓋完整單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且包括其片斷(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包括部分抗體的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、以及包括具有所需特異性的抗原識別位點和結合抗原的能力的該免疫球蛋白分子的任何其它修飾構型。就抗體的來源和制備它的方式而言(例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)，并不刻意限制。
“人源化”抗體是指這樣一種分子，其具有基本上來源于非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點，而該分子其余的免疫球蛋白結構基于人類免疫球蛋白的結構和/或序列?？乖Y合位點可以包括融合到恒定結構域上的完整可變結構域，或者僅包括移植到可變結構域合適的構架區(qū)上的互補決定區(qū)(CDR)?？乖Y合位點可以是野生型的，或者可以通過一個或多個氨基酸替代修飾，例如，修飾以更接近地類似于人類免疫球蛋白。有些形式的人源化抗體保有全部的CDR序列(例如，含來自小鼠抗體的所有6個CDR的人源化鼠抗體)。其它形式的人源化抗體具有相對于原始抗體改變了的一個或多個CDR(1個、2個、3個、4個、5個、6個)，它們也被稱之為“衍生自”該抗體的一個或多個CDR的一個或多個CDR。
制備抗體和抗體片斷的方法是本領域公知的。(例如參見Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，紐約，1988，特此并入作為參考)。
本發(fā)明也提供了選擇性結合包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或其片斷的多肽的抗體，其中所述片斷位于SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸1-26之內，或者該片斷包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸26和27。本發(fā)明也提供了選擇性結合VEGI-192a和VEGI-192b而非其它VEGI同種型的抗體(不選擇性地結合其它VEGI同種型例如VEGI-251)。本發(fā)明也提供了選擇性結合VEGI-192a或VEGI-192b的抗體。
本發(fā)明進一步提供了選擇性結合由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或其片斷編碼的多肽的抗體。
在有些實施方案中，本發(fā)明提供了與包括SEQ ID NO4或SEQ IDNO5的至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)氨基酸的區(qū)段的多肽選擇性結合的抗體，其中所述區(qū)段位于表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示氨基酸殘基1-26之內。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了與包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或更多個連續(xù)氨基酸的區(qū)段的多肽選擇性結合的抗體，其中所述區(qū)段包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸殘基26和27。
在有些實施方案中，本發(fā)明的抗體抑制VEGI活性；例如，此類抗體可以促進血管生成。篩選此類抗體的方法在下文描述。
在有些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以是激動劑抗體，原因在于它促進VEGI活性。篩選此類抗體的方法在下文描述。
應當理解在存在各種VEGI同種型的本上下文中，選擇性結合(除非早已另行指出)指較之于另一種同種型，偏好地(或者甚至排它地)結合給定的同種型。在有些實施方案中，較之于非人VEGI同種型，所述抗體選擇性地結合本發(fā)明的VEGI多肽。作為實例，本發(fā)明的抗體能夠選擇性地結合人類VEGI-192a而不結合小鼠(非人)VEGI-192a。
本發(fā)明的抗體可連接于(即偶聯于)可檢測的藥劑或半抗原。使用標準免疫化學技術例如由Harlow和Lane(1988)(同前)所描述的免疫組織化學法，該復合物可用于檢測樣品中與該抗體特異性結合的多肽(或多肽片斷)?？衫帽景l(fā)明的單克隆抗體的免疫測定試驗類型的實例有直接或間接形式的競爭性和非競爭性免疫測定法。此類免疫測定法的實例有酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)和夾心(免疫度量)測定法。利用本發(fā)明的單克隆抗體的檢測可在生理學樣品上通過使用或者以正向、反向或者以正向反向同時的模式進行的免疫測定法，包括免疫組織化學測定法來實現。本領域技術人員將知曉，或者能夠無需過度的試驗容易地辨別其它免疫測定形式。
也能產生更大敏感性的另一種技術包括將抗體偶聯于低分子量的半抗原。然后可以通過第二反應特異性地檢測這些半抗原。例如，通常利用諸如與抗生物素蛋白反應的生物素、或者能與特異性抗半抗原抗體反應的二硝基苯、吡哆醛及熒光素等半抗原。參見Harlow和Lane(1988)同前。
本發(fā)明的抗體可以與許多不同的載體結合。因而，本發(fā)明也提供了含有抗體和載體的組合物。載體可以是活性和/或惰性的。眾所周知的載體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。對于本發(fā)明的目的，載體的形式可以是可溶或者不可溶的。本領域技術人員將知曉用于結合單克隆抗體的其它合適的載體，或者利用常規(guī)實驗將能夠辨別此類載體。
有許多不同的標記和標記方法是本領域普通技術人員公知的?？捎糜诒景l(fā)明的標記類型的實例包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠體金屬、化學發(fā)光化合物以及生物發(fā)光化合物。本領域技術人員將知曉用于結合單克隆抗體的其它合適的標記，或者利用常規(guī)實驗將能夠辨別此類標記。此外，這些標記與本發(fā)明單克隆抗體的結合可以利用本領域普通技術人員常見的標準技術實現。
為本發(fā)明的目的，本發(fā)明的多肽存在于樣品如體液和組織中時，可通過本發(fā)明的抗體檢測?？贵w的這種用途在下文更加詳細地討論。
含有所述抗體、其片斷或產生所述抗體的細胞系的組合物涵蓋在本發(fā)明之中。當在藥學上利用這些組合物時，它們與藥學上可接受的賦形劑組合。包括所述抗體或其片斷的陣列涵蓋在本發(fā)明之中?？贵w可固定在表面上，例如，如下文詳述的用于檢測和診斷測定法的陣列?？贵w也可以固定在支持物上，用于純化本文所述的多肽或片斷。
組合物本發(fā)明進一步提供了包括藥物組合物在內的組合物，其包含本發(fā)明的多肽、多核苷酸、抗體、重組載體以及宿主細胞。這些組合物可以包括緩沖液，其根據所述多肽、多核苷酸、抗體、重組載體或宿主細胞的預期用途選擇，并且也可以包括適用于目的用途的其它物質。本領域技術人員能夠容易地選擇適用于目的用途的合適的緩沖液，其中許多是本領域公知的。在一些情況下，所述組合物是藥物組合物并且可以包括藥學上可接受的賦形劑一一其中的許多是本領域公知的，因而無需在本文詳加討論。藥學上可接受的賦形劑在許多出版物中有充分的描述，包括，例如A.Gennaro(2000)″RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy″，第20版，Lippincott，Williams，& Wilkins。
包括本發(fā)明的多核苷酸、多肽和/或抗體的試劑盒如本文所述，本發(fā)明也涵蓋含有本發(fā)明的多核苷酸、多肽和/或抗體的試劑盒，例如用于診斷、用于治療的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括允許人們測定VEGI多核苷酸、多肽和/或抗-VEGI抗體(例如本文所述的任何一種)的存在，從而檢測和/或定量這些分子的那些試劑盒。從而，本發(fā)明包括(a)用于檢測或定量包括本文所述的任何一種VEGI多核苷酸的樣品中的VEGI多核苷酸的試劑盒；(b)包括本文所述的任何一種抗體用以檢測或定-量樣品中VEGI多肽的試劑盒；(c)包括本文所述的任何一種多肽用于檢測或定量樣品中的抗-VEGI抗體的試劑盒。本發(fā)明也提供了包括本發(fā)明的多核苷酸或多肽用于治療的試劑盒。
本發(fā)明試劑盒被適當包裝，并且可任選地提供操作中可用的附加組分。這些任選的組分包括，但不限于緩沖液、捕獲試劑、顯色試劑、標記、反應表面、檢測工具、對照樣品、說明書以及解釋性信息。
利用多核苷酸、多肽和抗體的方法檢測系統(tǒng)本發(fā)明也提供了利用本發(fā)明的VEGI-192a和VEGI-192b多核苷酸、多肽和/或抗體檢測樣品中合適的靶的方法。正如本公開內容所澄清的，檢測方法是指檢測存在、不存在以及定量的任何一種方法。利用多核苷酸、多肽或抗體進行診斷(即檢測)測試的操作是本領域廣為人知的，并且對于普通技術人員是常規(guī)的。一般地，為實施本發(fā)明的診斷方法，提供本發(fā)明的一種組合物作為試劑檢測樣品中與之進行反應的靶。所述靶由從待測量診斷參數的個體中獲得的合適的樣品供應。許多類型的樣品適用于此目的。如果需要，所述靶可以在進行測定前從樣品中部分純化或者擴增。
本發(fā)明涉及檢測樣品中VEGI-192a或VEGI-192b多肽的存在或不存在或者水平的方法，包括使來自人類或動物的樣品與選擇性結合本文所述多肽的抗體接觸，并檢測所述多肽和抗體之間形成的復合物的存在或不存在或者量。此類檢測可用于診斷、預后和/或監(jiān)測血管生成相關疾病的目的。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了診斷病理性血管生成的方法，包括步驟使來自懷疑具有病理性血管生成的人類或動物的樣品與識別本文所述多肽的抗體接觸，并檢測存在或不存在所述肽和抗體之間形成的復合物。
可以使用競爭性測定法，其中，選擇性結合VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的抗體被結合到固相支持物上，使標記的VEGI-192a和/或VEGI-192b以及來自宿主的樣品通過該固相支持物，由例如液體閃爍層析檢測的標記的量能夠與樣品中VEGI-192a和/或VEGI-192b的量相關。
“夾心”測定類似于ELISA測定。在“夾心”測定中，使VEGI-192a和/或VEGI-192b通過固相支持物，并與連接在固相支持物上的抗體結合。然后使二抗與VEGI-192a和/或VEGI-192b結合。然后使二抗特異性的標記三抗通過該固相支持物，并與二抗結合，然后可以進行定量。
利用本領域熟知的標準方法學，可以通過在表面(即固相支持物)，例如，微量滴定板或膜(如硝化纖維素膜)上包被VEGI-192a或VEGI-192b多肽或兩者特異性的或者與之選擇性結合的抗體，然后使包被的表面與取自懷疑患有血管生成相關病的個體的血清、組織或其它生物學或化學樣品接觸來建立診斷測定。所得的在樣品中的VEGI-192a或VEGI-192b多肽與其特異性抗體之間形成的復合物的存在或不存在可通過本領域常見的任何公知方法檢測，例如熒光抗體光譜法或比色法。這種檢測方法可用于例如，癌癥的診斷或預后。
可利用本領域熟知的任何基于抗體的技術測定樣品中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的水平。例如，可利用經典免疫組織化學方法研究組織中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的表達(Jalkanen，M.等，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.等，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。其它可用于檢測VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽基因表達的基于抗體的方法包括免疫測定法，例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。合適的抗體測定標記是本領域公知的，并且包括酶標記，例如葡萄糖氧化酶和放射性同位素，例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99mTc)以及熒光標記，例如熒光素和羅丹明，以及生物素。
除了在取自個體的樣品中測定VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的水平，還可以通過成像在體內檢測VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽。用于VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽體內成像的抗體標記或標志包括可被X-射線照像術、NMR或ESR檢測的那些標記。對于X-射線照像術，合適的標記包括放射性同位素如鋇和銫，它們發(fā)射可檢測的放射線，但對于受試者無明顯害處。用于NMR和ESR的合適標志包括那些具有可檢測的特征性自旋的標志例如氚，它可以通過標記相關雜交瘤的營養(yǎng)物而摻入到抗體中。
選擇性結合VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的抗體或抗體片斷，在用合適的可檢測成像成分，例如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)、不透射線的物質或者可由核磁共振檢測的物質標記后，可以引入(例如，腸胃外、皮下或者腹膜內)到待檢查免疫系統(tǒng)紊亂的哺乳動物中。本領域將會理解受試者的大小和所用的成像系統(tǒng)將決定為產生診斷影像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情況下，對于人類受試者，注射的放射活性量正常地在從大約5到20毫居里99mTc的范圍內。然后標記的抗體或抗體片斷將優(yōu)先地在細胞中含VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的位置上積聚。體內腫瘤成像描述于由Burchiel及其同事(《腫瘤成像》第13章癌癥的放射化學檢測(The Radiochemical Detection of Cancer)，Burchiel，S.W.和Rhodes，B.A.編輯，Masson Publishing Inc.(1982))。
正如本領域所理解的，VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽可利用與這些多肽選擇性結合的任何試劑檢測。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其包括與本發(fā)明的多肽選擇性結合的抗體(例如，與VEGI-192a或VEGI-192b多肽或兩者選擇性結合的抗體)，以及適用于檢測樣品中所述多肽存在的輔助試劑。這些試劑是本領域熟知的，并且適用于檢測血清、組織或其它樣品中存在或不存在VEGI多肽。考慮的組織樣品可獲自猴子或人類或其它哺乳動物。該試劑盒可進一步包括使用說明書、對照以及解釋性信息。
本發(fā)明也提供了檢測本文所述的多核苷酸的存在或不存在或者水平的方法，包括使來自個體的人類或動物的樣品與選擇性結合本文所述多核苷酸的多核苷酸(在有些實施方案中為寡核苷酸)接觸，并檢測所用多核苷酸與樣品中多核苷酸之間形成的雙鏈體的存在或不存在或者量。在有些實施方案中，本發(fā)明可用于診斷病理性血管生成的方法，包括使來自懷疑患有病理性血管生成的人類或動物的樣品與能結合本文所述多核苷酸的多核苷酸(例如寡核苷酸)接觸，并檢測存在或不存在所用多核苷酸與樣品中多核苷酸之間形成的雙鏈體的步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及RNA、DNA或其它核苷酸序列，其可用于由聚合酶鏈式反應(PCR)或反轉錄PCR(RT-PCR)檢測存在或不存在VEGI多核苷酸。可以利用其它基于引物的擴增方法。可利用表1(SEQ ID NO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示的本發(fā)明DNA序列設計引物，所述引物在PCR情況下與VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸序列特異性結合，或者與由編碼VEGI-192a或VEGI-192b多肽的RNA反轉錄產生的VEGI-192a或VEGI-192bcDNA特異性結合，以便通過與標準比較用于檢測存在、不存在或者定量VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸。引物可以是任何長度范圍，例如7-40個核苷酸，優(yōu)選10-15個核苷酸，最優(yōu)選18-25個核苷酸。PCR或RT-PCR反應所必需的試劑和對照是本領域熟知的。然后擴增產物可用于分析存在或不存在VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸序列，例如通過凝膠分級分離(伴有或不伴有雜交)、通過放射化學以及免疫化學技術。這種方法是有利的，因為僅需要小份的樣品就能產生足夠量的模板DNA用于進行PCR或RT-PCR。
在有些實施方案中，所述檢測方法需要使用一個或多個引物來擴增目的VEGI-192a和/或VEGI-192b序列。在其它實施方案中，檢測利用能檢測存在或不存在(或者可量化)目的VEGI-192a和/或VEGI-192b序列的特異性探針(例如標記探針)實現。在有些實施方案中，所述探針包括標記。
在有些實施方案中，所述方法通過檢測編碼本文所述的VEGI-192a或VEGI-192b或其片斷的細胞RNA的存在或不存在或者含量用來檢測VEGI-192a或VEGI-192b的水平?？偧毎鸕NA可利用任何適當的技術從樣品中分離，例如由Chomczynski和Sacchi(Anal.Biochem.162156-159(1987))描述的單步-硫氰酸胍-酚-氯仿法。然后利用任何適當的方法測定編碼VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的mRNA的水平。這些方法包括RNA印跡分析、S1核酸酶圖譜、聚合酶鏈式反應(PCR)、聯合聚合酶鏈式反應的反轉錄(RT-PCR)以及聯合連接酶鏈式反應的反轉錄(RT-LCR)。
在其它實施方案中，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其包含PCR或RT-PCR引物，即一種或多種引物，例如VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸特異性引物和/或其它VEGI同種型如VEGI-251、VEGI-174特異性引物，以及本領域熟知的輔助試劑，這些試劑適用于在PCR或RT-PCR或者一種或多種其它擴增方法中檢測樣品中存在或不存在VEGI同種型多核苷酸、或者定量編碼VEGI同種型多肽的RNA。所考慮的樣品可獲自于人類或動物。
在其它實施方案中，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其包含探針，即一種或多種探針，例如VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸特異性探針和/或其它VEGI同種型如VEGI-251、VEGI-174特異性探針，以及本領域熟知的輔助試劑，這些試劑適用于在諸如RNA印跡法等方法或者一種或多種其它方法中檢測樣品中存在或不存在VEGI同種型多肽、或者定量編碼VEGI同種型多肽的RNA。所考慮的樣品可獲自于人類或動物。
正如本領域所理解的，“樣品”可以是獲自個體(常稱之為“生物樣品”)、體液、細胞系、組織培養(yǎng)物或含有或可能含有VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽或mRNA的其它來源的任何樣品。正如所指出的，生物樣品包括含有游離VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的體液(例如血清、血清、尿、滑液及脊髓液)、免疫和循環(huán)系統(tǒng)組織、以及發(fā)現表達完整或成熟VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽或VEGI-192a和/或VEGI-192b受體的其它組織來源。自哺乳動物獲得活檢組織和體液的方法是本領域熟知的。當生物樣品包括mRNA時，活檢組織為優(yōu)選的來源。
“測定編碼VEGI-192a和/或VEGI-192b蛋白的基因的表達水平”是指定性或定量地直接(例如，通過測量或估計絕對多肽水平或mRNA水平)或者相對地(例如，通過與第二樣品中的VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平進行比較)測量或估計在第一樣品中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的水平或者編碼VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的mRNA的水平。優(yōu)選地，測量或估計第一樣品中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平，并與標準VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平進行比較，標準取自從未患所述紊亂的個體獲得的第二樣品、或者由未患免疫和循環(huán)系統(tǒng)紊亂的個體的群體的平均水平確定。正如本領域將會理解的，一旦知曉標準的VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平，它就可以作為比較標準而重復使用。
如上文所指出的，VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸和多肽可用于診斷涉及VEGI-192a和/或VEGI-192b活性異常高或低表達的疾病。對于表達VEGI-192a和/或VEGI-192b，以及由VEGI-192a和/或VEGI-192b調節(jié)活性的細胞和組織，很顯然與標準或“正?！彼较啾?，個體中VEGI-192a和/或VEGI-192b實質性改變(提高或降低)的表達水平將導致與VEGI-192a和/或VEGI-192b在其中表達和/或具活性的身體系統(tǒng)相關的病理性疾病。
本發(fā)明也提供了輔助診斷VEGI相關紊亂或疾病的方法。這些方法有助于就病理性血管生成的分類或性質或者癌癥的預后作出臨床判定，而且對于確定診斷而言這種臨床判定可以是或可以不是決定性的。因此，輔助診斷病理性血管生成或癌癥或者有關疾病預后的方法，可以包括檢測來自個體的樣品中VEGI同種型(即VEGI-192a、VEGI-192b)的表達水平的步驟。輔助診斷血管生成相關病的方法也可以包括檢測來自個體的樣品中VEGI同種型多核苷酸和/或多肽水平的改變和/或檢測來自個體的樣品中VEGI同種型多核苷酸和/或多肽水平的提高或降低的步驟。
本發(fā)明也提供了在由本文所述的方法治療前檢測處于風險中的個體的方法，所述個體可能或可能未患有可檢測的血管生成相關病和/或與VEGI-192a或VEGI-192b的異常水平相關的疾病，且可能已表現出或可能未表現出可檢測的疾病?！疤幱陲L險中”是指個體根據常規(guī)風險評估方法被確定為更可能出現癥狀或者具有與血管生成相關病發(fā)展有關聯的一個或多個風險因素。具有這些風險因素之一個或多個的個體比沒有這些風險因素的個體具有更高的可能性患上血管生成相關病。風險組的實例(即分類)是本領域熟知的，并在文中討論。
VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸也可作為探針用于檢測存在或不存在VEGI-192a和/或VEGI-192b基因突變或多態(tài)性，以及任何目的VEGI-192a或VEGI-192b序列，而不論是否為突變體。突變VEGI-192a和/或VEGI-192b可能與血管生成或者各種免疫和循環(huán)系統(tǒng)有關的紊亂相關。檢測突變多核苷酸序列的方法是本領域熟知的，并且包括例如，單鏈構象多態(tài)性(SSCP)以及用于檢測序列突變(包括點突變)的各種以序列擴增為基礎的方法，例如LCR、NASBA、PCR、有限引物延伸等。檢測改變的蛋白序列的方法包括蛋白質印跡分析、毛細管電泳、質譜分析和WAVE。一般而言，檢測實驗將與對照VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸或多肽平行進行，或者，在評價改變的表達水平的情況下，與具有正常水平的VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸或多肽正常水平的對照樣品平行進行。
本發(fā)明的序列對于染色體鑒定很有價值。該序列特異性地靶向個體人類染色體上的特定位點并可以與之雜交。而且，目前存在鑒定染色體上特定位點的需要。根據本發(fā)明對染色體進行DNA繪圖是與這些序列建立關聯的重要的第一步。
簡要地，可以通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)對染色體進行序列繪圖。利用序列3′非翻譯區(qū)的計算機分析快速選擇不跨越基因組DNA中多于一個外顯子而使得擴增過程復雜化的引物。然后利用這些引物對含個體人類染色體的體細胞雜合體進行PCR篩選。只有那些含與引物對應的人類基因的雜合體會產生擴增片斷。
體細胞雜合體的PCR繪圖是將特定DNA分配到特定染色體上的快速操作。利用本發(fā)明與相同的寡核苷酸引物，由來自特定染色體的片斷集合或者大基因組克隆庫可以以類似方式實現亞定位。可類似地用來對染色體繪圖的其它繪圖策略包括原位雜交，用標記的流式分選染色體預篩并通過雜交預選以構建染色體特異性cDNA文庫。
可利用cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)一步提供精確的染色體定位。這種技術可使用短至50或60個堿基的cDNA。有關該技術的綜述，參見Verma等，《人類染色體基礎技術手冊》“HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques”，Pergamon Press，紐約(1988)。
一旦序列被繪圖到精確的染色體位置，該序列在染色體上的物理位置能夠與基因圖譜數據關聯。例如，此類數據見于V.McKusick，“人類孟德爾遺傳”中。然后通過連鎖分析(物理學相鄰基因的共遺傳)鑒定被繪圖到同一染色體區(qū)域上的基因和疾病之間的關系。
接下來，有必要確定患病和未患病受試者之間cDNA或基因組序列的差異。如果在有些或所有患病個體中而未在任何正常受試者中觀察到突變，則該突變很可能是所述疾病的病因；定位于和所述疾病相關的染色體區(qū)中的基因可能是50到500個潛在致病基因之一。這假定1兆堿基的繪圖分辨率，且每20kb一個基因。利用上文所述的技術，VEGI的染色體定位被高度可信地確定為9q32。早先的染色體繪圖研究已將數種發(fā)育缺陷與染色體該區(qū)域中的基因座位聯系起來。
本發(fā)明也可用于診斷或治療哺乳動物尤其是人類的各種與免疫和循環(huán)系統(tǒng)有關的紊亂。此類紊亂包括細菌、病毒及其它寄生蟲感染、免疫缺陷、炎癥、淋巴結病、自身免疫病、移植物對抗宿主疾病以及任何免疫和循環(huán)系統(tǒng)細胞功能的失調，包括但不限于自身免疫、白血病、淋巴瘤、免疫抑制、免疫、體液免疫、炎癥性腸病、骨髓抑制等。對于許多紊亂，可在取自患有此類紊亂的個體的多種組織(例如循環(huán)組織)或其它細胞或體液(例如血清、血漿、尿、滑液及脊髓液)中檢測到相對于“標準”VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表達水平，也就是，未患所述紊亂的個體的VEGI-192a和/或VEGI-192b表達水平，VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表達水平的實質性改變(提高或降低)。因而，本發(fā)明提供了在VEGI相關紊亂診斷期間可用的診斷方法，它包括測量個體樣品中編碼VEGI-192a和/或VEGI-192b蛋白的基因的表達水平，并將測得的基因表達水平與標準VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表達水平進行比較，由此與標準相比的基因表達水平的提高或降低可指示所述紊亂。
因而，本發(fā)明提供了在VEGI相關紊亂診斷期間可用的診斷方法，它包括測量個體樣品中編碼VEGI-192a和/或VEGI-192b蛋白的基因的表達水平，并將測得的基因表達水平與標準VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表達水平進行比較，由此與標準相比的基因表達水平的提高或降低可指示所述紊亂。
當已經根據常規(guī)方法作出紊亂診斷時，本發(fā)明可用作預后和/或監(jiān)測指數，由此表現出下降的VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表達的患者和以接近標準水平的水平表達所述基因的患者相比，將經歷更差的臨床結果。
利用多核苷酸、多肽和抗體的方法篩選測定本發(fā)明的多核苷酸和多肽可用作為研究試劑和材料用于發(fā)現人類疾病的治療和診斷法。
本發(fā)明提供了用于鑒定調節(jié)VEGI-192a和/或VEGI-192b的活性的藥劑的方法；用于鑒定調節(jié)VEGI-192a和/或VEGI-192b在細胞中的表達的藥劑的方法。在有些實施方案中，所述測定為無細胞測定。在其它實施方案中，所述測定是以細胞為基礎的測定。
如本文所用，術語“調節(jié)”包括“提高”和“降低”。在有些實施方案中，尤其有意義的是抑制VEGI-192a和/或VEGI-192b活性的藥劑。此類藥劑可用于促進血管生成。在其它實施方案中，目的藥劑是提高VEGI-192a和/或VEGI-192b活性的那些藥劑。此類藥劑對于抑制血管生成和治療血管生成相關病具有意義。
一般地，篩選或測試方法可以使用任何一種來源的藥劑或藥物。藥劑或藥物可以是，例如生物學或化學化合物，例如簡單或復雜的有機或無機分子、肽、蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、碳水化合物或脂蛋白?？梢院铣纱罅康幕衔?，例如寡聚體，例如寡肽和寡核苷酸，以及基于各種核芯結構的合成有機化合物，而且這些物質也包括在術語“藥劑”中。另外，各種天然來源可提供用于篩選的化合物，例如植物或動物提取物等?；衔锟梢詥为毣蛘吲c另一個化合物組合進行測試。
本發(fā)明提供了鑒定與VEGI-192a和/或VEGI-192b結合后調節(jié)VEGI-192a和/或VEGI-192b活性的藥劑的方法。該方法一般包括使選擇性結合VEGI-192a和/或VEGI-192b的測試藥劑與含VEGI-192a和/或VEGI-192b的樣品接觸；并測定VEGI-192a和/或VEGI-192b在存在或不存在所述藥劑時的活性。與不存在所述藥劑時相比，VEGI-192a和/或VEGI-192b在存在所述藥劑時活性的升高或降低表明所述藥劑提高(激動劑)或降低(拮抗劑)VEGI-192a和/或VEGI-192b的活性。潛在的激動劑或拮抗劑包括與本發(fā)明的多肽結合并由此提高或降低它的活性的小有機分子、肽、多肽及抗體。
檢測藥劑選擇性結合本發(fā)明的多肽的能力的測定法是本領域公知的。例如，本發(fā)明的多肽可連接于固相支持物，而選擇性與所述多肽結合的藥劑可利用本領域公知的方法鑒定。備選地，VEGI-192a和/或VEGI-192b激動劑和/或拮抗劑可通過在合適的條件下將VEGI-192a或VEGI-192b以及潛在的激動劑和/或拮抗劑與膜結合的VEGI-192a或VEGI-192b受體(如果已鑒定了此類受體的話)或者重組受體組合進行競爭性抑制測定而檢測。VEGI-192a或VEGI-192b可以，例如通過放射活性標記，從而與受體結合的VEGI-192a或VEGI-192b分子的數目能夠確定潛在的激動劑和/或拮抗劑的效力。
測試VEGI活性的測定法是本領域公知的。此類基于細胞的測定法的實例在實施例中進一步詳細描述，例如測試對血管內皮細胞生長、內皮細胞形成和組織為毛細管樣管狀結構或者內皮細胞組織成雞胚尿囊絨膜中的毛細血管的影響。
選擇性結合VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的抗體可以通過與VEGI-192a和/或VEGI-192b結合并阻止其發(fā)揮活性可用作為拮抗劑。
本發(fā)明也提供了鑒定調節(jié)本文所述的VEGI同種型活性而無需與所述VEGI同種型結合的藥劑的方法。此類藥劑包括，但不限于調節(jié)VEGI的上游或下游活性的藥劑。這些方法包括在存在或不存在待測藥劑時測定VEGI的活性。
本發(fā)明也提供了鑒定調節(jié)本文所述的VEGI mRNA和/或多肽水平的藥劑的方法。
因此，本發(fā)明提供了鑒定調節(jié)細胞中VEGI表達水平的藥劑的方法，所述方法包括使待測試候選藥劑與包括編碼本文所述的VEGI多肽的核酸的細胞接觸，并測定所述藥劑對VEGI多肽表達的效果。在有些實施方案中，所述效果通過利用本文所述的VEGI多核苷酸檢測編碼VEGI多肽的mRNA的水平測量。在其它實施方案中，所述效果通過利用本文所述的抗體檢測VEGI多肽的水平測量。
其它潛在的拮抗劑包括反義分子。反義技術可通過反義DNA或RNA或通過三股螺旋形成用于控制基因表達。反義技術在許多研究中討論(例如，Okano，J.Neurochem.56560(1991)；″Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression.″CRC Press，Boca Raton，Fla.(1988))。三股螺旋形成也在許多研究中討論(例如，Lee等，Nucleic AcidsResearch 63073(1979)；Cooney等，Science 241456(1988)；Dervan等，Science 2511360(1991))。所述方法建立在多核苷酸與互補DNA或RNA的結合的基礎上。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸的5′編碼部分可用于設計長度為約10到40個堿基對的反義RNA寡核苷酸?？梢栽O計DNA寡核苷酸以和所述基因中參與轉錄的區(qū)域互補，從而阻止轉錄和產生VEGI-192a和/或VEGI-192b。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內雜交并封閉所述mRNA分子翻譯成VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽。上文所述的寡核苷酸也可遞送到細胞中，從而所述反義RNA或DNA可在體內表達以抑制產生VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽。
本發(fā)明也提供了鑒定藥劑(例如突變體或變體VEGI-192a和/或VEGI-192b)的方法，其可競爭性結合VEGI-192a和/或VEGI-192b結合的靶，并阻止VEGI-192a和/或VEGI-192b與它們的靶相互作用。此類突變體或變體可能是VEGI-192a和/或VEGI-192b的激動劑或拮抗劑。
本發(fā)明提供了鑒定與VEGI-192a和/或VEGI-192b結合的藥劑的方法，包括使所述藥劑與VEGI-192a和/或VEGI-192b接觸，然后檢測與VEGI-192a和/或VEGI-192b結合的藥劑。
利用多核苷酸、多肽和抗體的方法治療疾病本發(fā)明提供了抑制血管內皮細胞生長、抑制血管生成、治療或緩和由非控制性血管生成介導的疾病和進程、治療癌癥(例如抑制腫瘤生長)的方法。與VEGI-251為膜結合蛋白的教導相反，實施例表明VEGI-251為分泌蛋白，抑制血管內皮細胞生長，并且在表達后具有抗-血管生成效果。另外，實施例還表明VEGI-192a抑制血管內皮細胞生長。
從而，可用于本發(fā)明的方法的組合物包括，但不限于本文所述的多核苷酸，例如編碼SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸；本文所述的多肽，例如SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQID NO6的多肽，或者包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式；以及本文所述的VEGI多肽的激動劑或拮抗劑，例如封閉所述VEGI多肽活性的抗體。
本發(fā)明也包括延遲個體的血管生成相關病的發(fā)展的方法。
本發(fā)明的VEGI同種型多肽(以及編碼VEGI同種型多肽的多核苷酸)可用于在體外降低由內皮細胞形成毛細管樣管狀結構。本發(fā)明的VEGI同種型多肽可用于抑制內皮細胞響應血管生成因子例如FGF-2形成并組織為毛細管樣管狀結構。此外，本文所述的本發(fā)明的分離的VEGI同種型多肽也可用于抑制內皮細胞在改良的雞胚尿囊絨膜(CAM)中生長并組織為毛細血管。因此，本發(fā)明的VEGI同種型多肽可用于在體外抑制由內皮細胞形成毛細管或毛細管樣結構。
應當理解，個體中由于標準或正常VEGI同種型多肽活性水平的下降引起的疾病，尤其是免疫和循環(huán)系統(tǒng)紊亂，可通過給藥本文所述的VEGI同種型多肽(或者編碼VEGI同種型多肽的多核苷酸)治療。因此，本發(fā)明也提供了治療需要提高的VEGI同種型活性水平的個體的方法，包括向此個體給藥包括一定量的本發(fā)明的分離的VEGI同種型多肽(或多核苷酸)，例如成熟形式的本發(fā)明的VEGI同種型多肽的藥物組合物，以有效地提高此個體中VEGI同種型多肽的活性水平。本發(fā)明也提供了治療需要降低的VEGI同種型活性水平的個體的方法，包括向此個體給藥包括一定量的VEGI同種型拮抗劑(例如封閉VEGI同種型活性的VEGI同種型特異性抗體)的藥物組合物，以有效地降低此個體中VEGI同種型多肽的活性水平。
基于多核苷酸的遞送在有些實施方案中，本發(fā)明包括抑制組織或細胞中血管生成的方法，包括使有效量的具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽，或者包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式與所述組織或細胞接觸，或在其附近表達，由此抑制血管生成。在有些實施方案中，本發(fā)明包括抑制血管生成的方法，包括向個體(例如人類或動物)給藥足以抑制血管生成劑量的、包含編碼SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽的核酸分子、或者編碼包括SEQ IDNO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式的核酸分子的組合物。在有些實施方案中，所述核酸分子可操作地結合可控制基因表達的調控序列。此類調控序列是本領域公知的。
當個體為動物時，在有些實施方案中，個體可以是哺乳動物。
本發(fā)明也提供了治療或緩和由非控制性血管生成介導的疾病和進程的方法，包括向個體(例如人類或動物)給藥足以控制血管生成劑量的、包含編碼SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的核酸分子、或者編碼包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式的核酸分子的組合物的步驟。在有些實施方案中，所述核酸分子可操作地結合控制基因表達的調控序列。
本發(fā)明也提供了治療癌癥或抑制腫瘤生長的方法，包括向個體(例如人類或動物)給藥足以抑制腫瘤生長劑量的、包含編碼SEQ ID NO4、SEQID NO5或SEQ ID NO6的核酸分子、或者編碼包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式的核酸分子的組合物的步驟。在有些實施方案中，所述核酸分子可操作地結合控制基因表達的調控序列。
應當理解，如果利用截短形式的VEGI，并且截短發(fā)生在分泌信號序列處，則該截短形式包括同源或異源的分泌信號序列，以指導所述蛋白分泌。異源分泌信號序列是本領域公知的。
遞送多核苷酸用于在個體中(離體及體內)表達的方法是本領域公知的。一般地，制備并給藥合適的多核苷酸載體。
可以利用含多核苷酸、表達載體或亞基因組多核苷酸的治療組合物的靶向遞送。例如，受體介導的DNA遞送技術描述在Findeis等，TrendsBiotechnol.(1993)11202；Chiou等，Gene TherapeuticsMethods AndApplications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff標記)(1994)；Wu等，J.BioL Chem.(1988)263621；Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269542；Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)873655；Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266338。在基因治療方案中，含多核苷酸的治療組合物可以在約100ng到約200mg DNA的范圍內局部給藥。在基因治療方案期間也可以利用約500ng到約50mg、約1μg到約2mg、約5μg到約500μg以及約20μg到約100μg DNA的濃度范圍。本發(fā)明的治療多核苷酸可利用基因遞送工具遞送。基因遞送工具可以是病毒或非病毒起源的(一般參見Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)151；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1185以及Kaplitt，NatureGenetics(1994)6148)。此類編碼序列的表達可利用內源哺乳動物啟動子或異源啟動子誘導。編碼序列的表達可以是組成型的或者是調控型的。
用于遞送目的多核苷酸并在目的細胞中表達的以病毒為基礎的載體是本領域熟知的。例示性的以病毒為基礎的工具包括，但不限于重組反轉錄病毒(例如參見，PCT公開號WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美國專利No.5，219,740和4,777，127；英國專利No.2,200,651以及EP 0 345 242)、以甲病毒為基礎的載體(例如，新培斯病毒載體、塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67；ATCC VR-1247)、羅斯河病毒(Ross River Virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)以及委內瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923；ATCCVR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))以及腺相關病毒(AAV)載體(例如參見PCT公開號WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。也可以使用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147中所述的給藥與殺死的腺病毒連接的DNA。
也可以使用非病毒遞送工具和方法，包括但不限于單獨與殺死的腺病毒連接或不連接的聚陽離子凝聚的DNA(例如參見，Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3147)；配體連接的DNA(例如參見，Wu，J.Biol.Chem.(1989)26416985)；真核細胞遞送工具細胞(例如參見，美國專利No.5,814,482；PCT公開號WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763和WO 97/42338)以及核電荷中和或者與細胞膜融合。也可使用裸DNA。例示性的裸DNA引入方法描述在PCT公開號WO 90/11092和美國專利No.5,580,859中?？勺鳛榛蜻f送工具的脂質體描述在美國專利No.5,422,120；PCT公開號WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445和EP 0524968.中。另外的方法描述在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)142411以及Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)911581中。
因而，例如，來自患者的細胞可由編碼多肽如VEGI-251的多核苷酸(DNA或RNA)離體改造，然后向待用所述多肽治療的患者提供改造的細胞。此類方法是本領域熟知的，并因本文的教導顯而易見。例如，細胞可通過利用含編碼本發(fā)明的多肽的DNA或RNA的病毒或反轉錄病毒顆粒改造。
同樣地，細胞可以通過例如本領域公知的操作在體內改造以在體內表達蛋白。例如，可以向患者給予產生含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉錄病毒顆粒的生產細胞，以在體內改造細胞并在體內表達所述多肽。根據本發(fā)明的教導，通過此類方法給藥本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對本領域技術人員來說應當是顯而易見的。例如，用于改造細胞的表達工具可以是反轉錄病毒以外的工具，例如，腺病毒，其在與合適的遞送工具組合后可用于在體內改造細胞。
上文提及的反轉錄病毒質粒載體可以來源于如下反轉錄病毒，包括，但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾臟壞死病毒、反轉錄病毒例如羅斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷病病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒以及乳腺腫瘤病毒。在一個實施方案中，所述反轉錄病毒質粒載體來自于莫洛尼鼠白血病病毒。
載體通常包括一個或多個啟動子。可使用的合適的啟動子包括，但不限于反轉錄病毒LTR、SV40啟動予以及由Miller及其同事(Biotechniques7980-990(1989))所述的人類巨細胞病毒(CMV)啟動子或者任何其它啟動子(例如細胞啟動子，如真核細胞啟動子，包括但不限于組蛋白啟動子、polIII啟動子以及β-肌動蛋白啟動子)。可使用的其它病毒啟動子包括，但不限于，腺病毒啟動子、胸腺嘧啶激酶(TK)啟動子以及B 19細小病毒啟動子。根據本文所含的教導，合適啟動子的選擇對本領域技術人員將是顯而易見的。
使編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列處于合適的啟動子的控制之下?？墒褂玫暮线m的啟動子包括，但不限于，腺病毒啟動子，例如腺病毒主要晚期啟動子；或者異源啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞體病毒(RSV)啟動子；誘導型啟動子，例如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子；熱激啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸腺嘧啶激酶啟動子，例如單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動；反轉錄病毒LTR(包括本文上述修飾的逆轉錄病毒LTR)；β-肌動蛋白啟動子以及人類生長激素啟動子。啟動子也可以是控制編碼所述多肽的基因的天然啟動子。
如果選擇反轉錄病毒載體系統(tǒng)，可以利用反轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系形成生產細胞系。可被轉染的包裝細胞的實例包括，但不限于如Miller(Human Gene Therapy15-14(1990))所述的PE501、PA317、b-2、b-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、CRE、β-CRIP、GP+E-86，GP+envAm12以及DAN細胞系，特此全文并入作為參考。載體可以通過本領域公知的任何方法轉導包裝細胞。此類方法包括，但不限于，電穿孔、脂質體的使用以及CaPO4沉淀法。在替代方法中，反轉錄病毒質粒載體可以包囊在脂質體中，或者偶聯于脂質，然后向宿主給藥。
生產細胞系產生包含編碼所述多肽的核酸序列的感染性反轉錄病毒載體顆粒。然后可利用此類反轉錄病毒載體顆粒在體外或體內轉導真核細胞。轉導的真核細胞將表達編碼所述多肽的核酸序列?？杀晦D導的真核細胞包括，但不限于胚胎干細胞、胚胎癌細胞以及造血干細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質細胞、內皮細胞和支氣管上皮細胞。
這些一般原理適用于其它以病毒為基礎的遞送系統(tǒng)，例如AAV。
多肽遞送本發(fā)明也提供了抑制血管生成的方法，包括向個體(例如人類或動物)給藥足以抑制血管生成劑量的本文所述的多肽，例如SEQ ID NO4、SEQID NO5或SEQ ID NO6的多肽，或者包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式。
本發(fā)明也提供了治療或緩和由非控制性血管生成介導的疾病和進程的方法，包括向個體(例如人類或動物)給藥足以控制血管生成劑量的包括SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽，或者含有SEQ IDNO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式的組合物的步驟。
本發(fā)明也提供了治療癌癥或抑制腫瘤生長的方法，包括向個體(例如人類或動物)給藥足以抑制腫瘤生長劑量的包括SEQ ID NO4、SEQ IDNO5或SEQ ID NO6的多肽，或者含有SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85區(qū)段中至少一個或多個氨基酸的截短形式的組合物的步驟。
測試VEGI多肽(包括截短形式的VEGI)活性的方法是本領域熟知的，并在實施例中詳加描述，例如用于測試對血管內皮細胞生長、毛細管樣管形成、置于雞胚尿囊絨膜上的膠原凝膠中的毛細管生長、異種移植腫瘤生長的影響的測定法。
如本文所用，“血管生成相關疾病”是與不期望的和/或非調控性的血管生成相關的疾病或狀況，或者抑制血管生成較為有利的疾病或狀況。它包括由不期望的和/或非控制性血管生成介導的疾病或進程。此類血管生成相關病的實例，例如腫瘤生長，在文中描述。
本文所述的VEGI同種型多肽可用于抑制內皮細胞，例如大動脈內皮細胞的增殖。所以，VEGI-192a、VEGI-192b和/或VEGI-152多肽可用于治療其中抑制內皮細胞生長較為有利的疾病或紊亂。
VEGI同種型多肽組合物的配制和劑量將以與優(yōu)良的醫(yī)學實踐協(xié)調的的方式進行，考慮個體患者的臨床狀況(特別是單獨用VEGI同種型多肽治療的副作用)、VEGI同種型多肽組合物的遞送部位、給藥方法、給藥時間安排以及行醫(yī)者公知的其它因素。因此，用于本文目的的VEGI同種型多肽的“有效量”由此類因素確定。
本發(fā)明的VEGI同種型多肽以及激動劑和拮抗劑可與合適的藥學載體組合使用。此類組合物包括治療有效量的所述化合物以及藥學上可接受的載體或賦形劑。此種載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡聚糖、水、甘油、乙醇及其組合。所述制劑應當適合給藥模式。
本發(fā)明也提供了藥物包裝或試劑盒，其包括填充了一種或多種本發(fā)明藥物組合物的成分的一個或多個容器。伴隨此類容器的可以是由管理藥物或生物產品的制造、使用或銷售的政府機構規(guī)定的通告形式，該通告反映了得到所述機構對制造、使用或銷售用于人類給藥的產品的批準。另外，本發(fā)明的藥物組合物可與其它治療化合物聯合使用。
藥物組合物可以通過便利的方式給藥，例如局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或真皮內路徑。藥物組合物以對于治療和/或預防特定適應征有效的量給藥。一般而言，它們以至少約10g/kg體重的量給藥，并且在多數情況下，它們將以不超過約8mg/Kg體重/天的量給藥。在多數情況下，考慮到給藥路徑、癥狀等，日劑量為約10g/kg到約1mg/kg體重。
各種遞送系統(tǒng)是已知的，并且可用于給藥本發(fā)明的VEGI同種型多肽，例如包囊在脂質體中、微顆粒、微囊、受體介導的胞吞作用(如參見Wu和Wu 1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)。引入方法包括但不限于，局部、真皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、眼及口服路徑。化合物可以通過任何便利的路徑給藥，例如通過輸注或者快速注射(bolusinjection)，通過上皮或粘膜皮膚襯里吸收(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)，并且可連同其它生物學活性劑一起給藥。
在具體的實施方案中，可能期望向需要治療的區(qū)域局部給藥本發(fā)明的藥物組合物。這可以通過，例如，但不限于手術期間局部輸注、局部施用(例如由創(chuàng)傷敷料傳導)、通過注射、通過導管、通過栓劑或者通過植入物實現，所述植入物是多孔的、無孔的、或者凝膠物質，包括膜如sialastic膜或纖維。
疾病的評價利用本領域的標準技術進行，例如成像方法并監(jiān)測合適的標志物。
普通技術人員也應當理解，由于本發(fā)明的VEGI同種型多肽是TNF家族成員，成熟分泌形式的蛋白可以通過蛋白酶解切割以可溶形式從表達本文所述的VEGI同種型多肽的細胞中釋放出來。因此，當由外界來源向個體的細胞、組織或身體中添加VEGI同種型多肽的成熟形式或可溶胞外結構域時，所述多肽將對該個體中其靶細胞發(fā)揮其生理學活性。同樣，可以向個體的細胞、組織或身體中添加表達該II類跨膜多肽的細胞，并且這些添加的細胞將與表達本文所述VEGI同種型多肽的受體的細胞結合，由此，表達VEGI同種型多肽的細胞能夠對攜帶受體的靶細胞行使作用(例如，調節(jié)內皮細胞的生長和調控)。
如上所述，VEGI對內皮細胞生長表現出強烈的抗-增殖效果。因此，VEGI也可用于調節(jié)來自造血和循環(huán)內皮前體細胞的內皮細胞的發(fā)育。
因此，本發(fā)明提供了增強血管生成的方法，包括給藥VEGI-192a或VEGI-192b抑制劑，如此血管生成得以增強。此類增強可能，例如，在血管阻塞相關疾病(例如局部缺血情況或者心臟病發(fā)作)的情況下是期望的。所述制劑可利用本領域公知的方法局部或系統(tǒng)給藥。
封阻或抑制VEGI多肽活性的本發(fā)明的抗體可用于促進或增強血管生成。
實施例下文描述的是本發(fā)明的實施例，它們僅提供用于舉例說明的目的，而并非限制本發(fā)明的范圍。在本公開的啟示下，權利要求書范圍之內的眾多實施方案對本領域普通技術人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明將參照下列實施例進一步說明，不過，應當理解本發(fā)明不限于此類實施例。
最近報道了內皮細胞特異性基因產物-血管內皮細胞生長抑制劑(VEGI)的發(fā)現(Zhai Y，等，FASEB J.，13181-189，1999；Zhai，Y，等，Int.J.Cancer，82131-136，1999)。該蛋白由174個氨基酸組成，也就是VEGI-174，其與TNF超家族成員具有20-30％的序列同源性。廣泛種類的細胞系和原代細胞培養(yǎng)物的RNA印跡分析顯示所述VEGI-174基因主要在內皮細胞中表達。另外，所述VEGI-174mRNA在許多成人器官中是可檢測的，提示該基因在正常血管結構中的生理作用。在許多細胞和動物模型中檢查了VEGI-174的功能。重組截短形式的VEGI-174以顯著的力度抑制內皮細胞增殖，但對于所檢查的任何其它類型的細胞沒有作用。該蛋白的截短形式也抑制內皮細胞在膠原凝膠中形成毛細管樣結構以及毛細血管生長進入置于雞尿囊絨膜上的膠原凝膠中。分泌形式的VEGI-174在鼠結腸癌細胞(MC-38)中的過表達幾乎完全阻止了這些細胞在同系基因C57/BL小鼠中生長腫瘤。而且，共接種人類乳腺癌細胞和過表達分泌形式的VEGI-174的中國倉鼠卵巢細胞，導致乳腺癌異種移植腫瘤在裸鼠中生長受到顯著抑制。
實施例1.人類血清的ELISA分析
正常男性和女性成年個體的正常人類血清獲自倫巴第癌癥中心血清庫(Lombardi Cancer Center serum bank)。利用夾心ELISA測量血清VEGI含量。將血清樣品(100μl)或處于3％ BSA中的不等量的重組VEGI蛋白添加到包被有多克隆抗-VEGI抗體并用3％ BSA封閉的96孔板上。添加針對VEGI的單克隆抗體(3-12D)(100μl，2μg/ml)。添加生物素標記的抗-小鼠IgG抗體(2μg/ml，Vector laboratories，Burlingame，CA)，繼之加入抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶，并以3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(Vectorlaboratories)作為底物。樣品于室溫下溫育10分鐘，用50μl 1M H2SO4終止反應，然后由分光光度計板讀數器于450nm處利用標準曲線y＝-0.72+0.409*log(x)進行分析。所用的標準蛋白的范圍為0.32-1000ng/ml。
實施例2.RNA印跡多組織RNA印跡和多組織印跡板(Clontech，Palo Alto，CA)在ExpressHyb溶液(Clontech)中與雙鏈cDNA探針雜交。所用的全長VEGI-174探針為pCDNA3.1(Invtrogen，Carlsbad，CA)中的Hind III-BamHI cDNA片斷(GenBank登錄號#AF03990)。對于同種型特異性探針，通過PCR擴增制備編碼其N-末端99個氨基酸的297-bp VEGI-251模板，并用32P-dCTP通過隨機引物法標記(Life Technologies，Invitrogen，CA)。對應于其N-末端22個氨基酸的VEGI-174特異性探針通過末端標記66-bp的PCR產物制備。斑點于42℃過夜雜交并在洗滌緩沖液1(2×SSC，0.1％十二烷基硫酸鈉)和洗滌緩沖液2(1 X SSC，1％ SDS)中于42℃洗滌，接著用增感屏于-70℃放射自顯影。
實施例3.5′RACE以及VEGI同種型克隆根據制造商的說明，自多組織RACE板(ORIgene，Rockville，MD)中擴增5′VEGI序列。該板含有從24個人類個體組織中制備的cDNA樣品，在所述cDNA的5′端連有銜接物。利用兩對寡核苷酸引物進行兩輪巢式PCR。在第一輪PCR中，利用銜接物引物ADP1，5′CGG AATT CGT CA CTCAGCG 3′(SEQ ID NO8)和VEGI基因特異性引物GSP1，5′CCC GGATCCT ATA GTAAGAA GGCTCC 3′(SEQ ID NO9)。然后用水以1∶10稀釋反應產物。稀釋的PCR樣品隨之與另一個銜接物引物ADP2，5′AGCGCGTGAA TCAGATCG3′(SEQ ID NO10)以及VEGI基因特異性引物GSP2，5′CGGTGGATCC CGAGTTTGTC TCACAACTG3′(SEQID NO11)用于第二輪PCR。將PCR產物于瓊脂糖凝膠中分離，純化并在ABI自動測序儀中測序。
實施例4.VEGI-251和VEGI-192a的分離利用根據RACE產物的測序結果設計的基因特異性引物重復第二輪PCR以證實它們的序列身份。然后將凝膠純化的RACE產物克隆到質粒pCR3.1(Invitrogen，Frederick，MD)中并測序。根據這些序列，設計同種型特異性引物。共用的反向引物Vgl61(161)，5′GTGTAATCCA CC AAAGAG3′(SEQ ID NO12)與表8中所列的正向引物一起使用。
表8.人類VEGI同種型的5′序列*(SEQ ID NO13、14、15)
*表中顯示了分離的VEGI同種型獨特的5′cDNA序列。用于篩選cDNA文庫以分離全長克隆的正向PCR引物以下劃線標出。共用的反向PCR引物序列在方法中給出。
實施例5.細胞培養(yǎng)和TNFα處理人類臍靜脈內皮細胞(HUVE)和胎牛心臟內皮(FBHE)細胞獲自Clonetics(Walkersville，MD)并在EGM-2(Clonetics)中培養(yǎng)。人類皮膚微血管內皮(HMVE)、人類冠狀動脈內皮(HCAE)細胞和NIH3T3細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心并在EGM2-MV(Clonetics)中培養(yǎng)。成年牛大動脈內皮(ABAE)細胞以及小鼠腦內皮細胞瘤bEND.3由ImClone Inc(紐約)的Dr Peter Bohlen饋贈。人類冠狀動脈平滑肌細胞(HCASM)(Clonetics)和ABAE細胞在IMEM(Biofluids，Biosource International，Camarillo，CA)、10％ FBS、1ng/ml成纖維細胞生長因子-2(Promega，Madison，WI)中培養(yǎng)。EA.Hy926，一種人類內皮來源的細胞系，由北卡羅來納大學的Dr Cora-Jean Edgell饋贈。這些細胞連同小鼠腦bEND.3和心臟H5V內皮細胞瘤細胞系維持在具有10％ FBS的IMEM中。在對100-mm板中生長至次匯合的細胞進行RNA分析之前用不同劑量的腫瘤壞死因子α(TNFα)(Biosource International，Camarillo，CA)處理。
實施例6.核糖核酸酶保護試驗對于同種型特異性探針，通過PCR產生來自人類VEGI-174(862-1062bp)、VEGI-251(1-160bp)、VEGI-192a(277-656bp)的cDNA片斷，并以反義方向插入在pcDNA3(Invitrogen)的EcoRI和NotI位點之間。將小鼠β-肌動蛋白(824-942)探針克隆到pSP72(Promega)的HindIII和BamHI位點之間。VEGI和β-肌動蛋白模板分別由HindIII和EcoRI線性化。反義試驗探針用SP6 RNA聚合酶利用Maxiscript轉錄試劑盒(Ambion，Woodward TX)合成。對于利用RPAIII試劑盒(Ambion，TX)的核酸酶保護，15-20μg總RNA與1-3×105cpm的各探針于52℃雜交過夜。RNase消化用1∶100稀釋度的RNase A/Tl混合物(Ambion)于37℃進行30分鐘。沉淀消化產物，于6％聚丙烯酰胺凝膠中解析，并于-70℃進行放射自顯影。
實施例7.基因結構分析人類VEGI基因的組織通過PCR利用細菌人工染色體(BAC)克隆(Genome Systems，Inc，St Louis，MO)分析。設計來自外顯子序列的PCR引物，產生重疊PCR產物。對這些PCR產物測序以確定它們的相對位置。內含子區(qū)段的引物根據9號染色體Contig NT-017568 GenBank條目(其對應于堿基2,643,881和2,694,724之間序列)設計。這些引物列于表9中。利用人類胎盤DNA作為模板，使用來自Perkin Elmer(Foster City，CA)的rTth XL PCR試劑盒以及如下特長PCR條件進行特長PCR95℃，1分鐘，97℃，15秒，60.5℃，10分鐘，17個循環(huán)；97℃，15秒，60.5℃，10分鐘15秒延伸，13個循環(huán)，接著于72℃最后延伸11分鐘。PCR片斷用表9中所示的引物對產生。對PCR產物進行測序。
表9.用于對人類VEGI基因繪圖的PCR引物*(SEQ ID NO16-33)
*在對人類VEGI基因進行PCR分析中所用的寡核苷酸引物的核苷酸序列。PCR產物2b也用引物61、57、51和53進行了測序。
實施例8.表達質粒和瞬時轉染將VEGI-174和VEGI-251的開放讀框插入到pcDNA3.1-myc(InvitrogenMD)中以產生攜帶C-末端myc標簽的肽。將所得的質粒轉染到ABAE和HUVE細胞中用于細胞定位研究。對于細胞轉染，將3×104細胞接種于Lab-Tek帶室的蓋玻片(chambered coverglass)(Nalge，Naperville，IL)上過夜。將處于25μl無血清IMEM中的質粒DNA(400ng)與PLUS試劑(4μl)(GIBCO-BRL)混合。LipofectAMINE(GIBCO)試劑(1μl)為200倍的，并與該DNA溶液混合15分鐘。然后將DNA-lipofectAMINE混合物與200μlIMEM添加到細胞中，并于37℃溫育3小時。在免疫印跡和隨后的熒光顯微鏡檢之前使細胞在含血清生長培養(yǎng)基中恢復36小時。也將VEGI-174或VEGI-251的全長編碼區(qū)插入到pEGFP-C2(Clontech)的EcoRl和BamHl位點之間制備GFP-VEGI融合蛋白。將GFP-VEGI融合構建物如上文所述轉染到ABAE細胞中。轉染后48小時，通過熒光顯微鏡檢查融合蛋白的細胞定位。
實施例9.用于亞細胞定位的免疫染色轉染的成年牛大動脈(ABAE)和HUVE細胞用PBS洗滌，并用3.7％多聚甲醛/0.1％ Triton X-100在PBS中固定10分鐘，用溶于PBS中的0.5％Triton X-100透化處理5分鐘，然后與1∶300稀釋度的抗-myc單克隆抗體9-10E(Sigma)溫育1小時。細胞用PBS洗滌并與1∶60稀釋度的抗-鼠IgG，即德克薩斯紅偶聯的單克隆抗體(Jackson ImmunoResearch Labs，IncWest Grove，PA)溫育，然后用PBS洗滌三次。細胞通過共聚焦熒光顯微鏡(Olympus IX70-SIF)觀察。
實施例10.單克隆抗體的產生六周齡雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)以50μg/鼠經皮下注射處于0.1ml完全弗氏佐劑(Life Technologies)中的純化重組VEGI蛋白(殘基29-174)。在腹膜內加強注射后，具有較高效價的小鼠接受30μg/鼠的末次腹膜內抗原注射。分離脾細胞并利用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)與小鼠骨髓瘤SP2/O細胞融合。雜交瘤由HAT培養(yǎng)基選擇并通過ELISA篩選?？寺￡栃噪s交瘤，并利用小鼠Ig同種型試劑盒(SIGMA，MO)確定單克隆抗體的同種型。雜交瘤培養(yǎng)在INTEGRA CL 350(INTEGRA Biosciences，Inc.，Iiamsville，MD)中，收集上清，并用AffiGel蛋白質A瓊脂糖(Bio-Rad)純化單克隆抗體。
實施例11.多克隆抗體的產生4-6月齡的SPF新西蘭白兔(Charles River)皮下接種與完全弗氏佐劑(Life Technologies)混合的100μg大腸桿菌表達的重組VEGI(如上)。在肌內加強注射后，從表現出實質性免疫應答的兔子中收集血清。血清通過用大腸桿菌(轉化有空表達載體)細胞裂解物、然后用人類冠狀動脈平滑肌細胞裂解物吸附純化。
實施例12.哺乳動物細胞和條件培養(yǎng)基中VEGI的分析將全長VEGI-251編碼區(qū)插入到pcDNA3(Invitrogen)的Hind III和BamHI位點之間。這些pcDNA3質粒，包括載體，通過電穿孔轉染到MDA-MB231乳腺癌細胞中。穩(wěn)定轉染子在2mg/ml G418硫酸鹽(GIBCO)中選擇。條件培養(yǎng)基用Centricon柱(分子量截留10,000)濃縮。細胞裂解物和條件培養(yǎng)基都用蛋白質A/G瓊脂糖(Oncogene，Boston，MA)和針對VEGI的多克隆抗體免疫沉淀。樣品通過蛋白質印跡分析。檢測由1∶1000稀釋度的小鼠單克隆抗體1-8F實現，并用偶聯有辣根過氧化物酶的抗-鼠IgG抗體(ECL試劑盒，Amersham)觀察。
實施例13.慢病毒基因轉移含VEGI-174、sVEGI和VEGI-251的慢病毒載體利用以前描述的方法制備(Dull等J Virol 72，8463-8471，1998；Naldini等Proc Natl Acad Sci(USA)93，11382-11388，1996；Naldini等Science 272，263-267，1996；Stewart等Proc Natl Acad Sci(USA)96，12039-12043.1999)。簡要地，慢病毒載體用3個質粒轉導質粒pHR′CMV-VEGI、包裝質粒pCMVAR8.2Δvpr以及包膜質粒pCMV-VSV-G在293T細胞中產生。從轉染后兩天起每24小時收集病毒上清，由0.45μm過濾器純化，并由p24測定法滴定(Duu等J Virol72，8463-8471，1998；Naldini等Proc Natl Acad Sci(USA)93，11382-11388，1996；Naldini等Science 272，263-267，1996；Stewart等Proc Natl Acad Sci(USA)96，12039-12043.1999)。1pg p24計數定義為1組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID)。對于細胞毒性測定，HUVE細胞以2×104/孔的密度在24孔板中接種，20h后用病毒上清感染。細胞數目預期在接種后20小時加倍。向HUVE細胞中添加增加劑量的病毒載體。感染復數(MOI)以感染時每個細胞的TCID估算。病毒感染后24小時保留在培養(yǎng)物中的貼壁細胞的數目由Coulter計數器測定。
實施例14.體內致瘤性測定將穩(wěn)定轉染的含有空pcDNA3載體、VEGI-174、VEGI-251和sVEGI的MDA-MB-231細胞注射到雌性無胸腺裸鼠的乳房脂墊中(1×106細胞/次注射)。每只動物有2個注射部位，且每組有15只動物接受了VEGI-174、VEGI-251或sVEGI轉染子。利用注射有pcDNA3載體轉染子的5只動物作為對照組。以不知情方式監(jiān)測產生的異種移植腫瘤的大小。微血管密度按照描述(Weidner等N Engl J Med 324，1-8，1991)進行測定。簡要地，腫瘤內微血管用大鼠抗-小鼠CD31(PECAM-1)單克隆抗體(clone MEC13.3，Pharmingen International，San Diego，CA)免疫染色。抗體以1∶100在PBS中稀釋，與5μm石蠟固定的腫瘤切片溫育過夜，并用生物素標記的抗-大鼠IgG抗體(Vector Laboratories)通過Vectastain ABC方法(VectorLaboratories)觀察。在低倍(×10物鏡及×10目鏡)下檢查每個樣品以鑒定腫瘤的大多數血管區(qū)(“熱點”，參考(Weidner等N Engl J Med 324，1-8，1991))。在這些區(qū)域內，以×400放大倍數(×40物鏡及×10目鏡；0.16mm2/視野)檢查最多10個視野，然后計算平均值。排除具有肌肉壁的大血管。無需腔來鑒定血管。任何陽性染色的、清楚地與毗鄰的微血管、腫瘤細胞和結締組織元件分開的內皮細胞或細胞簇，被認為是清晰可計數的微血管。所有測量均以不知情的方式進行。結果由單向方差分析(ANOVA)進行分析。顯著性的演繹水平設為P值小于0.05。
實施例15.人類血清中VEGI蛋白的檢測作為確定VEGI是否以可溶形式存在的初始篩選，我們用單克隆抗體分析了健康成人的血清庫。我們利用針對C-末端的抗體通過ELISA能夠檢測在1和10ng/ml范圍之間的VEGI濃度(圖1)。這表明，除了以前表征的據信是膜結合的VEGI之外，可溶形式的VEGI也具有顯著的生理學相關性。由于以前的研究顯示了重組C-末端肽的細胞凋亡活性，而且全長VEGI-174的過表達對于由轉染的癌細胞形成的異種移植腫瘤無效，我們因此推理存在于人類血清中含C-末端的可溶性肽不可能來源于VEGI-174。這個結論促使我們提出VEGI基因可能在人類組織中表達可變形式。
實施例16.多個VEGI轉錄本的檢測和新VEGI同種型的克隆利用最初發(fā)現的人類VEGI的全長cDNA作為探針，正常人類組織的RNA印跡一致地顯示了以下大小的多個條帶7.5kb、2.0kb和1.5kb(圖2)。這多個VEGI轉錄本表現出幾分重疊的組織分布，并證明了VEGI家族的存在。為了闡明VEGI相關轉錄本的結構，我們通過PCR進行了VEGI同種型的分離。用VEGI特異性3′引物，使用5′RACE自許多人類組織擴增5′端VEGI信息。然后將RACE產物克隆到pCR3.1中并測序(圖3)。序列分析顯示了兩個新的VEGI序列，即VEGI-251和VEGI-192a(表8和圖3)。根據這些5′序列，設計同種型特異性引物，并從陣列cDNA板中分離全長cDNA克隆。如此從胎腦、成人子宮和肺中分離到3種VEGI同種型(圖3A和B)。新cDNA含251及192個氨基酸的開放讀框(圖3B)，計算的分子量分別為28 086和21 952道爾頓。這兩個新的VEGI肽，即VEGI-251和VEGI-192a，與最初VEGI(Zhai等Int J Cancer 82，131-136，1999)，現稱之為VEGI-174，共有羧基端的151個氨基酸殘基。這些蛋白的親水特性顯示了VEGI-251中靠近其N-末端的20個氨基酸殘基的疏水區(qū)(圖3B)，該疏水區(qū)不存在于VEGI-174和VEGI-192a中。這個序列預測包括信號肽。以前在VEGI-174的N-末端鑒定了另一個高度疏水的可能跨膜區(qū)(圖3B)。
實施例17.VEGI同種型的表達進一步通過RNA分析多組織印跡調查了同種型的個體表達模式。在胎盤、腎、肺和肝中檢測到7.5kb VEGI-251轉錄本，而在肝、腎、骨骼肌和心臟中觀察到2kb VEGI-174轉錄本(圖4)。當這些同樣的探針用于多組織RNA印跡時，除了觀察到VEGI251和174之間在前列腺、唾液腺和胎盤中的重疊表達外，VEGI-251與VEGI-174相比在胎腎和胎肺中更豐富，而VEGI-174在心臟、骨骼肌、胰腺、腎上腺和肝中更豐富(表10)。此表達模式的重要性目前對我們來說還不太清楚。VEGI-192amRNA由于它低的豐度，不能夠容易地由RNA印跡檢測到。
也通過RNase保護測定調查了VEGI在體外的表達。與以前有關VEGI-174的觀察結果一致，VEGI-251和VEGI-192a在與VEGI-174相同的細胞類型中檢測到，存在于人類內皮細胞中，包括冠狀動脈內皮(HCAE)、人類臍靜脈內皮(HUVE)和人類微血管內皮(HMVE)細胞中，而且不能在人類冠狀動脈平滑肌(HCASM)、ABAE和小鼠內皮瘤bEND.3中檢測到(圖5)。還應當注意一種以上同種型在同一個細胞類型中表達，而VEGI-251是最豐富的。這表明這些同種型的表達在VEGI的功能中起著調控作用。
表10.人類組織中VEGI-174和VEGI-251RNA的表達*
*利用多組織人類polyA+RNA印跡比較VEGI-174和VEGI-251RNA的表達。-不可檢測；±不顯著高于背景；+很低；++++豐富。VEGI-192a的表達不可檢測。
實施例18.人類VEGI基因組織為了確定這三個VEGI轉錄本的結構關系，分析了人類VEGI基因的組織。這是利用BAC克隆和利用分離自人類胎盤樣品的基因組DNA完成的。發(fā)現人類VEGI基因全距超過17kb，具有4個外顯子和3個內含子(圖6)。內含子-外顯子銜接處符合了GT-AG法則。根據片斷2的大小，內含子1估計為13-15kb，但序列信息不能由該PCR產物獲得。所有三個同種型共有由外顯子IVb(圖6)編碼的438bp區(qū)段，此區(qū)段編碼VEGI-174(表12)的29-174殘基，但是它們的5′區(qū)段是由選擇性的外顯子利用產生的。有趣的是，VEGI-251和VEGI-192a使用外顯子剪接受體位點產生它們各自的產物(表11)。利用基因組探針和HUVE RNA的核糖核酸酶保護和5′RACE研究顯示推斷的VEGI-251轉錄起始位點位于其ATG上游約100bp處(未發(fā)表，Chew LJ)，但是VEGI-174和VEGI-192a的轉錄起始位點尚有待繪圖。由于VEGI-192aRNA極低的豐度，后來的研究集中于VEGI-251。雖然目前尚不清楚是否所有的同種型由相同的啟動子啟動，但我們仍然推論產生多轉錄本的意義可能在于對合成的差異調控，而這又可能指向一種特定VEGI同種型的相對重要性。
表11.人類VEGI基因組織(SEQ ID NO34-41)
人類VEGI基因的組織，顯示每個外顯子的大小和內含子的大概大小。外顯子編號在圖6中給出。大寫字母表示外顯子序列，而小寫表示內含子序列。共有剪接點以下劃線標出。*VEGI-192a和VEGI-174mRNA最5′端尚未鑒定，因而這些區(qū)段的內含子-外顯子銜接點未知。
表12.VEGI多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO42)PTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL(SEQ ID NO42)實施例19.VEGI同種型轉錄本由TNFα并行誘導為測試VEGI同種型轉錄中差異調控的可能性，利用抗-血管生成典范——TNFα處理分析VEGI基因的調控。盡管許多研究描述了促炎細胞因子象TNFα對內皮細胞的抗-增殖作用，但這些細胞因子也可以有血管生成作用，這取決于所用的劑量和系統(tǒng)(參見討論)。對內皮細胞的此種調節(jié)作用可能起著調控內皮細胞特異性細胞因子如VEGI的水平的作用。我們發(fā)現15ng/ml或更高濃度的TNFα在大血管(臍靜脈)和小血管(皮膚微血管)內皮細胞中都能夠誘導VEGI RNA水平的增加(圖7)，而且所有的同種型在這些內皮細胞類型中都被誘導。也清楚VEGI-251仍然是同種型中最豐富的。TNFα對VEGI轉錄本的并行上調不僅表明VEGI介導的活性是TNFα作用的潛在的靶，而且表明通過合成多種肽對VEGI功能進行調節(jié)最可能存在于轉錄后水平上。
實施例20.亞細胞定位由于TNF樣肽常以膜結合及可溶兩種形式存在，故研究了利用重組VEGI轉染的ABAC細胞的可能性。
利用在VEGI編碼區(qū)C-末端攜帶myc標簽的構建物進行定位實驗(圖8)。將pcDNA3.1-myc中的VEGI同種型表達構建物轉染到ABAE細胞中，并利用抗-myc抗體通過免疫細胞化學分析VEGI-myc產物的分布。檢測到VEGI-174在細胞中呈內質網/高爾基體樣分布(圖8A)。然而，VEGI-251表現出更為限制的核周顆粒染色(圖8B)。在兩種情況下，共聚焦熒光顯微鏡檢顯示細胞表面定位不明顯。在HUVE細胞中，發(fā)現含VEGI-251-myc的囊泡不是內皮細胞的懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade bodies)，因為myc信號不與馮·威利布蘭德因子(vWF)染色共分布(圖8C)。因此有可能，與vWF相反，VEGI-251在內皮細胞中的加工不包括被調控的分泌途徑。
為確定是否同種型可能表現出N-末端指導的亞細胞定位差異，用全長VEGI和它們相應的獨特N-末端序列構建了嵌合GFP-VEGI表達構建物。將這些在其N-末端具有GFP標簽的構建物(圖8)瞬時轉染到ABAE細胞中。如圖8E到8J所示，除了8G例外，GFP-VEGI的分布不同于未靶向的GFP。全長VEGI-174表現出ER/高爾基分布，就如之前看到的myc-標記的VEGI-174一樣，然而VEGI-174的頭22個殘基似乎不足以將GFP靶向到特異的胞內細胞器(圖8G)。相反，VEGI-251的頭99個氨基酸足以導致GFP定位在與質膜毗鄰的囊泡中。這種分布作為勾出細胞邊界輪廓的熒光帶觀察到(圖8H到J)。我們的觀察表明VEGI-251可能分布在經歷組成型胞吐作用的分泌囊泡中。
與GFP-VEGI-251不同，VEGI-251-myc質膜定位的缺乏(圖8B)強烈提示C-末端myc標簽自細胞中丟失，這很可能是由于分泌信號的切割和可溶性C-末端片斷的分泌。已知置于N-末端下游的真正的信號序列(例如在GFP-VEGI-251和GFP-VEGI-1-99中的)在處于ER中的合成期間不切割。具有C-末端和N-末端標簽的VEGI-251的這種分布模式的差異與涉及在釋放到胞外環(huán)境之前在N-末端序列之內切割VEGI-251的分泌機制相符。
實施例21.細胞條件培養(yǎng)基中VEGI的證明考慮到VEGI-251N-末端的疏水殘基及觀察到的其亞細胞定位，似乎VEGI-251可能是分泌蛋白。為測試這種假說，建立了在MDA-MB-231乳腺癌細胞中的VEGI-251穩(wěn)定轉染子。作為陰性對照，也制備了pcDNA3載體的轉染子。通過RNase保護測定證實構建物在MDA-MB-231中表達。應當注意，這些細胞在體外的存活和增殖不受載體和VEGI轉染的影響。收集MB-231轉染子的條件培養(yǎng)基，濃縮并利用多克隆VEGI抗體進行免疫沉淀，且利用抗-VEGI單克隆抗體3-12D進行蛋白質分析。我們的結果揭示了分子量約25kD的蛋白(圖9A)。出現的成對物不易解釋，但可能是轉染的MB231細胞中重組肽的可變糖基化或其它翻譯后修飾的結果。在未轉染細胞或攜帶空pcDNA3載體的細胞的培養(yǎng)基中沒有檢測到VEGI蛋白(圖9A)。在類似的實驗條件下不能在條件培養(yǎng)基中檢測到VEGI-174(未顯示)。在不同的實驗中，濃縮的HUVE細胞條件培養(yǎng)基的蛋白質分析也揭示了與VEGI-251轉染子中獲得的相似分子量的條帶，而由多克隆抗體免疫沉淀HUVE細胞條件培養(yǎng)基亦得到相同結果(圖9B)。這些結果表明VEGI-251不是膜結合的而是分泌蛋白。
實施例22.內皮細胞中VEGI-251的過表達導致細胞死亡為了測試VEGI-251對內皮細胞的生物學活性，選擇慢病毒基因遞送系統(tǒng)用VEGI表達構建物轉染HUVE細胞。首先用GFP構建物測試慢病毒基因遞送系統(tǒng)，并證實超過90％的HUVE細胞能夠被轉導(未顯示)。我們利用VEGI-174、VEGI-251以及具有IL-6信號肽的分泌形式的VEGI(即sVEGI)的觀察結果證明只有分泌形式的VEGI，包括VEGI-251和sVEGI，對HUVEC有細胞毒性(圖10A)，而VEGI-174無效。這些結果表明HUVE細胞攜帶能夠通過自分泌機制激活的VEGI膜受體。
實施例23.VEGI-251的抗腫瘤活性先前已經證明攜帶IL-6分泌信號肽的重組形式的VEGI-174，即sVEGI，可有效地在體內抑制MC38結腸癌腫瘤的生長(Zhai等Int JCancer 82，131-136，1999)。由于天然VEGI-251是分泌蛋白，我們測定它是否也能夠在體內抑制人類異種移植腫瘤的生長。針對每個構建物，選擇了穩(wěn)定轉染的MDA-MB-231克隆的15個細胞系，連同載體轉染的對照的5個細胞系。合并每組的細胞，并注射到雌性無胸腺裸鼠的乳房脂墊中。腫瘤尺寸作為注射后時間的函數測定。比較了類似合并的VEGI-174和sVEGI轉染克隆的細胞培養(yǎng)物。合并的載體轉染的克隆用作對照。也測定了未轉染的親代細胞并且發(fā)現其與載體轉染的克隆一致。
我們的結果證明癌細胞中全長VEGI-174的過表達對異種移植腫瘤的生長少有影響(圖10B)。然而，完整VEGI-251以及sVEGI融合蛋白的過表達顯著延緩腫瘤的生長。這些結果與慢病毒體外轉染的效果完全相符(圖10A)，證明了天然VEGI-251的生物學活性。
然后我們測定了癌細胞過表達全長VEGI-251對腫瘤新血管形成的影響。發(fā)現腫瘤相關微血管密度隨著VEGI-251的表達顯著下降。下降程度比得上sVEGI過表達的腫瘤中的下降。由于sVEGI融合蛋白由IL6分泌信號肽與VEGI-174的殘基23-174組成，該結果表明殘基23-174含天然VEGI-251的生物學等同物。綜合考慮，這些發(fā)現證明VEGI-251分泌到胞外基質對于它的抗腫瘤活性是必需的。另外，與sVEGI類似，VEGI-251的這種抗腫瘤活性不是由于對腫瘤細胞的直接作用，而是由于對腫瘤相關血管結構形成的干擾而致。
實施例24.潛在的VEGI同種型的鑒定已觀察到當用VEGI cDNA探針分析人類組織RNA印跡膜時，不同組織中出現多個數目的mRNA條帶(圖11)。由于這些實驗中所用的實驗條件不利于探針的非特異性結合，而且根據mRNA分子的近似大小判斷，至少存在分別與7.5kb、2.0kb和1.5kb相對應的3種同種型。這些同種型在多種組織中的差異分布表明它們起著不同的生理學作用。
實施例25.新VEGI同種型的確認應用cDNA末端快速擴增(RACE)(商業(yè)上可得自OriGene Technology，Rockville，MD)，利用代表多種人類組織的cDNA文庫板尋找VEGI同種型。該板含從24個人類個體組織中制備的cDNA樣品，各cDNA分子的5′端連有銜接物。利用與部分VEGI cDNA對應的基因特異性寡核苷酸引物(GSP)和銜接物引物(ADP)進行聚合酶鏈式反應(PCR)(圖12)。利用兩對寡核苷酸引物進行兩輪巢式PCR。在利用銜接物引物(ADP1，5′-CGGAATTCGT CACTCAGCG-3′)(SEQ ID NO8)和VEGI基因特異性引物(GSP1，5′-CCCGGATCCT ATAGTAAGAA GGCTCC-3′)(SEQ IDNO9)的第一輪PCR(94℃ 3分，4個循環(huán)的94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃2分；16個循環(huán)的94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 2分；然后72℃ 6分)之后，反應產物在水中以1∶10稀釋。稀釋的PCR樣品和另一個銜接物引物(ADP2，5′-AGCGCGTGAA TCAGATCG3′)(SEQ ID NO10)以及VEGI基因特異性引物(GSP2，5′-CGGTGGATCC CGAGTTTGTC TCACAACTG 3′)(SEQ ID NO11)用于第二輪PCR(94℃ 3分，35個循環(huán)的94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 2分；然后72℃ 6分)。PCR產物在瓊脂糖凝膠中分級分離。從凝膠中切下陽性DNA片斷，純化用以測序分析。從不同組織中獲得了不同長度的4個PCR產物(圖13)。這些PCR產物進行了DNA測序，證實這些PCR產物的核苷酸序列彼此不同。根據由這些cDNA分子編碼的蛋白中的氨基酸數目，這些同種型現命名為VEGI-174、VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251。
實施例26.同種型全長cDNA的克隆利用根據由上文所述的RACE實驗中獲得的PCR產物的測序結果設計的基因特異性引物重復第二輪PCR以證實它們序列的特異性。然后將純化的RACE產物克隆到Invitrogene的質粒pCR3.1(San Diego，CA)以制備高質量的DNA樣品用于測序。根據VEGI192a和VEGI192b5′-序列中存在的讀框相符的終止密碼子和起始密碼子，VEGI192a的全長cDNA分子由兩對巢式PCR引物構建Vg3A5′-AATCTCACCT GTCTCTGCCT G-3′(SEQID NO43)和Vg-3′-15′-CTAAACCGTT GTCCCTGTGG-3′(SEQ IDNO44)；Vg3B5′-CCTGTAAAAA TGGTTATAGT AG-3′(SEQ ID NO45)和Vg-3′-25′-GGTGGCAGAG GACTTTC-3′(SEQ ID NO46)。VEGI192b的全長cDNA分子由引物vg4b 5′-CTCTACTTACGCCAAGG-3′(SEQ ID NO47)和引物JY2 5′-CCCGGATCCTATAGTAAGAA GGCTCC-3′(SEQ ID NO48)構建。鑒定到同種型的cDNA文庫被用于PCR。VEGI192a和VEGI192b都被克隆到Invitrogen的pCR3.1(San Diego，CA)中。由于在VEGI251的5′序列中未能發(fā)現讀框相符的翻譯起始密碼子，利用一對基因特異性引物vg5B5′-CACCACATACCTGCTTG-3′(SEQ ID NO49)和vgl615′-GTGTAATCCACCAAAGAG-3′(SEQ ID NO12)從OriGene的陣列cDNA文庫板(Rockville，MD)中分離全長VEGI251cDNA克隆。VEGI192a的cDNA序列示于表13中。
表13.VEGI-192a的cDNA序列(SEQ ID NO50)TTTTTTNTTTTNCTCAACNCCCCCCNATATTTATAACTGNATTTGGACCCNTGCNTAACCCAACATATATNTTTGAGANCCAAAGGGAANTTTTAGGTTTTCTCAAGAANTAATAGACAAACAGAGGCCCNGAGAGGGAAAGGGATTCNCCCAAAGTCATATAGCTAAAGANTAGTTCCCACCCACTCTTCATCCCATTTCTTNTGGCCATCTATTCAGTGAATATAGTTAAAGGGCCCTTGGANGANGGCAAAAAGCCAATTCACTCCTGTGAAAGAATTTTGTGGGAAAGAGCAGTGAGTTGTGCTTTATTGAGCATTGGCCATGTGCAAAATTCATGNTAAGCACCNCCATNTATACTGTGCCCATCTTAGATGAGATGAGAAAACAGGGTCTCAGGCAGGNTAGATAAACTTGCCCAAAGCCATGGGGCCAAGATTCATTTGTGTTCAAGACTCTTTCTTGTGAGTCACCCTGTCCTTGGTGGTGCTTGCTGCGGGTGCCACATTCCAATCCAAAATCCTGCAAGGAGTGGCACTGGACCAAGCTGGAGGAGATCAAGGTTTCTCTCCTATCATAGGCGCCATGCAACTCACAAAGGGCCGTCTTCATTTCAGTCACCCTTTGTCTCATACAAAGCACATTTCTCCTTTTGTTACAGATGCACATCTTAGGGCAGACGGAGATAAGCCAAGGGCACACTTGACAGTTGTGAGACAAACTCCCACACAGCACTTTAAAAATCAGTTCCCAGTTCTGCACTGGGAACATGAACTAGGCCTGGCCTTCACCAAGAACCGAATGAACTATACCAACAAATTCCTGCTGATCCCAGAGTCGGGAGACTACTTCATTTACTCCCGGGTCACATTCCGTGGGATGACCTCTGAGTGCAGTGAAATCAGACAAGCAGGCCGACCAAACAAGCCAGACTCCATCACTGTGGTCATCACCAAGGTAACAGACAGCTACCCTGAGCCAACCCAGCTCCTCATGGGGACCAAGTCTGTGTGCGAAGTAGGTAGCAACTGGTTCCAGCCCATCTACCTCGGAGCCATGTTCTCCTTGCAAGAAGGGGACAAGCTAATGGTGAACGTCAGTGACATCTCTTTGGTGGATTACACAAAAGAAGATAAAACCTTCTTTGGAGCCTTCTTACTATAGGAGGAGAGCAAATATCATTATATGAAAGTCCTCTGCCACCAGCC實施例27.VEGI251的抗血管生成和抗癌活性由截短形式的VEGI174制備的、由氨基酸29-174組成的重組蛋白是有力的腫瘤發(fā)生抑制劑(Zhai Y等FASEB J.，13181-189，1999；Zhai，Y等，Int.J.Cancer，82131-136，1999)。已經證明VEGI對于癌細胞的生長沒有直接影響，而且VEGI抑制腫瘤生長的作用機制是抑制腫瘤中血管的形成。因此將VEGI251的全長cDNA轉染到人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231中，然后植入雌性無胸腺裸鼠的乳房脂墊中，以證明該基因產物能夠抑制這些細胞的腫瘤生長。為了抑制緊靠癌細胞周圍的內皮細胞的生長，VEGI基因產物必需釋放到轉染細胞的外部。已證明a)在培養(yǎng)的轉染細胞的條件培養(yǎng)基中能夠發(fā)現基因產物，和b)轉染細胞能夠在裸鼠中生長腫瘤。
MDA-MB-231乳腺癌細胞用空載體、全長VEGI-174cDNA、全長VEGI-251cDNA或者用其中VEGI蛋白連接了來自白介素-6的分泌信號肽的融和基因(IL6/VEGI)轉染。當利用VEGI的單克隆抗體(13-2D)通過蛋白質印跡分析時，在轉染細胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現VEGI-251的基因產物(圖14)。相反，VEGI-174的基因產物在條件培養(yǎng)基中不可檢測。
將穩(wěn)定轉染的MDA-MB-231克隆注射到無胸腺雌性裸鼠的乳房脂墊中(1×106細胞/注射)。腫瘤大小作為時間的函數測定。也分析了腫瘤中的微血管密度。癌細胞中全長VEGI-174的過表達對異種移植腫瘤的生長少有影響，而過表達分泌形式的推斷的VEGI胞外域和全長VEGI-251顯著抑制腫瘤生長(圖15)。此外，利用VEGI單克隆抗體通過對腫瘤切片進行免疫組織化學分析證明了VEGI蛋白存在于腫瘤中。與由載體轉染的細胞形成的腫瘤(G10-2R)相比，有些腫瘤(G9-1R)具有的癌細胞產生顯著量的VEGI-251，而其它腫瘤具有的癌細胞產生很少VEGI-251(G9-2R)(圖16)。腫瘤產生的VEGI-251越多，腫瘤的生長速率越慢(圖17)。這些發(fā)現表明VEGI-251由轉染的癌細胞分泌，并且分泌的VEGI-251通過抑制周圍內皮細胞的生長而是有力的腫瘤生長的抑制劑。 相反，VEGI-174不被細胞分泌，因此不能抑制內皮細胞的生長。
實施例28.VEGI表達的組織分布與其它TNF家族成員不同，VEGI-174特異性地在內皮細胞中表達。來自23個細胞系和原代細胞培養(yǎng)物的總RNA制備物的RNA印跡分析表明VEGI僅在HUVE和人類靜脈內皮細胞中檢測到(圖18)。在人類動脈內皮細胞中也未見到VEGI-174。利用多組織RNA印跡，在許多成人組織，包括胎盤、肺、骨骼肌、腎、胰腺、脾、前列腺、小腸和結腸中發(fā)現VEGI-174轉錄本(圖18)，表明基因產物可能在正常血管結構的功能中發(fā)揮作用。
實施例29.VEGI對內皮細胞生長的特異性抑制產生截短形式的VEGI-174，其相應于由殘基39-174組成的推斷的胞外域。此蛋白在大腸桿菌中表達，純化至如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所判斷的明顯的均質性，并在多種細胞測定中進行檢測。所述截短的蛋白能夠特異性地抑制成年牛大動脈內皮(ABAE)細胞的增殖(圖19)。在10μg/ml時實現內皮細胞生長幾乎完全的抑制，半數最大抑制濃度值(IC50)約為1μg/ml(約70nM)。相反，在相似的實驗條件下該蛋白對人類乳腺癌細胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)的生長沒有影響(圖19)。VEGI也不抑制人類T細胞白血病細胞(Jurkat)、人類伯基特氏淋巴瘤細胞(Raji)、人類單核細胞白血病細胞(THP-1)、或人類早幼粒細胞白血病細胞(HL60)、通常響應TNF的細胞毒活性的細胞的增殖。VEGI的能力似乎低于可能預期到的細胞因子的能力；然而，它比得上已知的血管生成蛋白抑制劑例如制管張素和內抑素(endostatin)，以及CD40配體(另一個TNF家族成員)。觀察到的截短VEGI相對低的能力也可能部分是由于非優(yōu)化的截短位點或者翻譯后修飾如糖基化的缺乏，因為該重組蛋白是在大腸桿菌中表達的。
實施例30.VEGI基因在匯合的內皮細胞中的上調VEGI的內皮細胞特異性抑制活性顯示該蛋白作為血管生成的負調節(jié)劑發(fā)揮作用。為證明VEGI基因在增殖的內皮細胞中下調、而當細胞靜止時上調，通過RNA印跡檢查了VEGI在培養(yǎng)的HUVE細胞中的表達(圖20)。低水平的VEGI mRNA見于新近接種的HUVE細胞；不過，隨著培養(yǎng)中細胞數目的增加，VEGI mENA水平相應增加，并且在細胞培養(yǎng)物匯合時達到一個平臺。
實施例31.對培養(yǎng)于膠原凝膠上的內皮細胞的毛細管樣管形成的抑制用體外血管生成模型(Montesano，R.和Oorci，L.，Cell 42469，1985))檢查了截短VEGI的抗血管生成活性。培養(yǎng)在三維膠原凝膠表面的內皮細胞在培養(yǎng)物達到匯合時形成靜止單層。不過，在用血管生成因子例如FGF-2刺激所述單層細胞時，細胞侵入凝膠并在凝膠中形成毛細管樣管狀結構。這種管形成可被抗血管生成因子抑制。管形成的程度可利用計算機輔助的成像分析定量評價(Li，L.Y.，Biochemistry 3310999，1994)。截短的VEGI-174能夠抑制ABAE細胞形成毛細管樣管(圖21)。所述抑制的IC50值約為1μg/ml，類似于所觀察到的抑制內皮細胞生長的IC50。
實施例32.對置于雞胚尿囊絨膜上的膠原凝膠中毛細管生長的抑制利用改進的雞胚尿囊絨膜(CAM)測定法進一步證明了VEGI-174的抗血管生成活性(Nguyen，M.等，Microvasc.Res.4731，1994)。該方法以新毛細血管生長進入置于CAM上的膠原凝膠球為基礎。在血管生成因子的存在下(例如包埋在凝膠中的FGF-2或VEGF)，血管被刺激垂直生長進入聚合的膠原凝膠中。將抑制劑摻入到凝膠中以便確定它對毛細管生長的影響。凝膠中血管生成的程度利用注射到CAM循環(huán)中的FITC-葡聚糖評價。重組VEGI-174(5.0μg/ml)抑制約50％由FGF-2(2.0μg/ml)誘導的新生毛細管生長進入膠原凝膠(圖22)。
實施例33.共注射過表達VEGI的CHO細胞對乳腺癌異種移植腫瘤生長的抑制VEGI的抗癌活性由異種移植腫瘤模型，利用在植入雌性無胸腺裸鼠的乳房脂墊中高度致癌的乳腺癌細胞證明。分泌形式的VEGI-174通過用來自人類白介素-6的分泌信號肽取代VEGI-174的N-末端和推斷的跨膜區(qū)段(殘基1-25)構建。分泌的VEGI-174構建物被克隆到真核表達載體中，然后將它轉染到中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中。相應構建物的表達通過RNA印跡分析證實。轉染細胞對修飾VEGI的分泌由條件培養(yǎng)基抑制ABAC細胞生長的能力證實。然后將轉染的CHO細胞與人類乳腺癌細胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)混合，并將細胞混合物注射到裸鼠的乳房脂墊中。注射后監(jiān)測異種移植腫瘤的生長。雖然所用乳腺癌細胞系存在高致癌性，仍觀察到對由MDA-MB-231(圖23A)或MDA-MB-435細胞(圖23B)形成的異種移植腫瘤生長的顯著抑制。在利用MDA-MB-435細胞的重復實驗中，共注射也導致腫瘤形成的完全抑制。載體轉染的CHO細胞在任一種情況下對腫瘤生長均無效。由于VEGI不抑制培養(yǎng)物中這些乳腺癌細胞的生長，該蛋白的抗癌活性是由其抗血管生成活性所致。
實施例34.VEGI-192a對ABAE細胞增殖的抑制全長VEGI-192a在大腸桿菌中表達，且利用美國專利申請20010044521和PCT WO01/55174中描述的方法重折疊和純化。具體地，構建含有編碼全長VEGI-192a多肽的多核苷酸插入物的表達載體(PET11，Novagen)。將該表達載體轉化到大腸桿菌中，并培養(yǎng)轉化的大腸桿菌以表達VEGI-192a多肽。收獲細胞并從破碎細胞中純化包涵體。用8M尿素溶液將含包涵體的溶液的OD280調整到pH5.0。終溶液含如下還原試劑10mMβ-巰基乙醇，10mM DTT(二硫蘇糖醇)，1mM還原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)。溶液的終pH為10.0。將上述溶液迅速稀釋到20倍體積的20mM TRISTM堿中，pH調整至9.0，然后用1M HC1緩慢調整至8.0(通過24小時調整pH至8.8。然后24小時調整至8.6等，直至pH為8.0)。或者，蛋白可以利用透析重折疊。將8M尿素溶液的OD280調整至0.5，并在20倍體積的TRISTM堿中透析。再次將該溶液的pH緩慢調整至8.0。然后通過超濾濃縮重折疊的物質，并通過凝膠過濾分離，例如在由20mMTRISTM，HC1，0.4M尿素，pH8.0平衡的SEPHACRYLTMS-300柱子上。S-300級分可通過在非還原性SDS-PAGE上電泳檢測。錯誤重折疊的蛋白以非常高的分子量跑膠，而正確重折疊的蛋白以正常分子量跑膠。
測試來自S-300級分中的VEGI-192a蛋白抑制內皮細胞生長的能力。將成年牛大動脈內皮(ABAE)細胞以8,000細胞/孔一式三份種在24孔板的IMEM(GIBCO，Gaithersburg，MD)，10％胎牛血清中。向培養(yǎng)基中添加FGF-2(1ng/ml)。培養(yǎng)于37℃、5％ CO2中維持6天。然后用胰蛋白酶作用細胞，并利用Coulter(Hialeah，FL)計數器測定細胞數目。
如圖24所示，來自S-300級分的正確折疊的VEGI-192a而非誤折疊的VEGI-192a能夠抑制ABAE細胞的生長。在1000ng/ml時達到內皮細胞生長的幾乎半數完全抑制，半數最大抑制濃度值(IC50)約為10ng/ml。
權利要求
1.分離的多核苷酸，其包含(a)SEQ ID NO1的序列；(b)SEQ ID NO1中至少約15個連續(xù)的核苷酸，其中所述連續(xù)的核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93之內；(c)SEQ ID NO1中至少15個連續(xù)的核苷酸，其中所述連續(xù)的核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94；(d)編碼SEQ ID NO4的多肽的核苷酸序列；(e)編碼SEQ ID NO4中至少10個連續(xù)氨基酸的核苷酸序列，其中所述連續(xù)氨基酸位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26之內；(f)編碼SEQ ID NO4中至少10個連續(xù)氨基酸的核苷酸序列，其中所述連續(xù)氨基酸包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27；或者(g)上述的互補物。
2.權利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO1的序列。
3.權利要求1的多核苷酸，其中所述(b)或(c)的多核苷酸包含至少約20個連續(xù)的核苷酸。
4.權利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸還包含可檢測標記。
5.權利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸被固定在表面上。
6.權利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有抗-血管生成生物活性的多肽。
7.權利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO4的多肽的融合蛋白。
8.載體，包含根據權利要求1的多核苷酸。
9.權利要求8的載體，其中載體為表達載體。
10.宿主細胞，其包含根據權利要求8的載體。
11.藥物組合物，其包含根據權利要求6的多核苷酸和藥學上可接受的賦形劑。
12.分離的多核苷酸，其包含(a)SEQ ID NO2的序列；(b)SEQ IDNO2中至少約15個連續(xù)的核苷酸，其中所述連續(xù)的核苷酸位于SEQ IDNO2的核苷酸1-386之內；(c)SEQ ID NO2中至少15個連續(xù)的核苷酸，其中所述連續(xù)的核苷酸包含SEQ ID NO2的核苷酸386和387；(d)編碼SEQID NO5的多肽的核苷酸序列；(e)編碼SEQ ID NO5中至少10個連續(xù)氨基酸的核苷酸序列，其中所述連續(xù)氨基酸位于SEQ ID NO5的氨基酸1-26之內；(f)編碼SEQ ID NO5中至少10個連續(xù)氨基酸的核苷酸序列，其中所述連續(xù)氨基酸包含SEQ ID NO5的氨基酸26和27；或者(g)上述的互補物。
13.權利要求12的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO2的序列。
14.權利要求12的多核苷酸，其中所述(b)或(c)的多核苷酸包含至少約20個連續(xù)的核苷酸。
15.權利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸還包含可檢測標記。
16.權利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸被固定在表面上。
17.權利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有抗-血管生成生物活性的多肽。
18.權利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼包含SEQ ID NO5的多肽的融合蛋白。
19.載體，其包含根據權利要求12的多核苷酸。
20.權利要求19的載體，其中載體為表達載體。
21.宿主細胞，其包含根據權利要求19的載體。
22.藥物組合物，其包含根據權利要求17的多核苷酸和藥學上可接受的賦形劑。
23.分離的多肽，其包含(a)SEQ ID NO4的序列；(b)SEQ ID NO4中至少10個連續(xù)的氨基酸，其中所述連續(xù)的氨基酸位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26之內；或者(c)SEQ ID NO4中至少10個連續(xù)的氨基酸，其中所述連續(xù)的氨基酸包含SEQ ID NO4的氨基酸26和27。
24.權利要求23的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO4的序列。
25.權利要求23的多肽，其中多肽抑制血管內皮細胞生長。
26.權利要求23的多肽，其中多肽具有血管生成抑制活性。
27.融合蛋白，其包含根據權利要求23的多肽。
28.權利要求27的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO4的多肽。
29.藥物組合物，其包含權利要求26的多肽和藥學上可接受的賦形劑。
30.分離的多肽，其包含(a)SEQ ID NO5的序列；(b)SEQ ID NO5中至少10個連續(xù)的氨基酸，其中所述連續(xù)的氨基酸位于SEQ ID NO5的氨基酸1-26之內；或者(c)SEQ ID NO5中至少10個連續(xù)的氨基酸，其中所述連續(xù)的氨基酸包含SEQ ID NO5的氨基酸26和27。
31.權利要求30的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO5的序列。
32.權利要求30的多肽，其中多肽抑制血管內皮細胞生長。
33.權利要求30的多肽，其中多肽具有血管生成抑制活性。
34.融合蛋白，其包含根據權利要求30的多肽。
35.權利要求34的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO5的多肽。
36.藥物組合物，其包含權利要求33的多肽和藥學上可接受的賦形劑。
37.抗體，其選擇性地與根據權利要求23的多肽結合。
38.權利要求37的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO4。
39.抗體，其選擇性地與根據權利要求30的多肽結合。
40.權利要求39的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO5。
41.抗體，其選擇性地與SEQ ID NO4的多肽和SEQ ID NO5的多肽結合。
42.抑制組織或細胞中血管生成的方法，包括使有效量的由SEQ IDNO3的多核苷酸編碼的多肽與該組織或細胞進行接觸，或者在該組織或細胞附近表達。
43.抑制血管生成的治療方法，包括向個體給藥劑量足以抑制血管生成的包含編碼SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸的組合物。
44.根據權利要求43的治療方法，其中多核苷酸可操作地連接控制基因表達的調控序列。
45.抑制腫瘤生長的治療方法，包括向個體給藥劑量足以抑制腫瘤生長的、在藥學上可接受的載體中包含編碼SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸的組合物。
46.根據權利要求45的治療方法，其中多核苷酸可操作地連接控制基因表達的調控序列。
47.抑制血管生成的治療方法，包括向個體給藥劑量足以抑制血管生成的權利要求29的組合物。
48.根據權利要求47的治療方法，其中組合物包含SEQ ID NO4的多肽。
49.抑制腫瘤生長的治療方法，包括向個體給藥劑量足以抑制腫瘤生長的權利要求29的組合物。
50.根據權利要求49的治療方法，其中組合物包含SEQ ID NO4的多肽。
51.測試藥劑或藥物的血管生成抑制活性的方法，所述方法包括測量所述藥劑或藥物提高權利要求23的多肽的抗-血管生成活性的能力。
52.測試藥劑或藥物是否促進血管生成的方法，所述方法包括測量所述藥劑或藥物降低或消除權利要求23的多肽的抗-血管生成活性的能力。
53.檢測VEGI-192a的方法，包括使來自個體的樣品與選擇性結合權利要求23的多肽的抗體接觸；并檢測樣品中的多肽與該抗體之間形成的復合物的存在或不存在。
54.檢測VEGI-192a多核苷酸的方法，包括使來自個體的樣品與選擇性結合權利要求1的多核苷酸的寡核苷酸接觸；并檢測該寡核苷酸與樣品中的多核苷酸之間形成的雙鏈體的存在或不存在。
55.檢測VEGI-192b的方法，包括使來自個體的樣品與選擇性結合權利要求30的多肽的抗體接觸；并檢測樣品中的多肽與該抗體之間形成的復合物的存在或不存在。
56.檢測VEGI-192b多核苷酸的方法，包括使來自個體的樣品與選擇性結合權利要求12的多核苷酸的寡核苷酸接觸；并檢測該寡核苷酸與樣品中的多核苷酸之間形成的雙鏈體的存在或不存在。
全文摘要
本申請公開了命名為VEGI
文檔編號A61K39/395GK1668630SQ02826970
公開日2005年9月14日 申請日期2002年11月12日 優(yōu)先權日2001年11月9日
發(fā)明者李魯遠, 潘宏光 申請人:喬治敦大學