專利名稱：用于測(cè)量丙酮的基于酶的系統(tǒng)和傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙酮檢測(cè)的領(lǐng)域。可以定性和/或定量測(cè)定丙酮的丙酮特異性酶系統(tǒng)和傳感器已經(jīng)得到發(fā)展。這些酶系統(tǒng)可以引入相對(duì)廉價(jià)的、簡(jiǎn)單的和/或便攜式的基于酶的傳感器，特別是適用于檢測(cè)環(huán)境或生物樣品中的丙酮，例如，哺乳動(dòng)物呼吸樣品。
2.相關(guān)技術(shù)的描述A.丙酮來(lái)源從生物有機(jī)體和各種環(huán)境中得到或存在于其中的液體或氣體中可以檢測(cè)到丙酮。例如，丙酮可以在這樣的環(huán)境中檢測(cè)到如自然環(huán)境，包括土壤、沉積物，河流，或者濕地；室內(nèi)和室外的工作以及家庭環(huán)境；以及廢物環(huán)境，包括廢料貯存的池塘和污物堆放場(chǎng)。由于從外部來(lái)源將丙酮引入了環(huán)境或生物體，因此可以在環(huán)境和生物液體和氣體中發(fā)現(xiàn)丙酮。因此，環(huán)境中的丙酮可以因?yàn)樾孤⒔?、廢物排放或溶液蒸發(fā)而產(chǎn)生，或通過(guò)燃燒木材或塑料的燃燒氣體的散發(fā)或操作石油內(nèi)燃機(jī)而產(chǎn)生。同樣，在活的有機(jī)體中，丙酮因?yàn)閺耐獠縼?lái)源攝取、吸入或吸收而存在。
由于丙酮的內(nèi)部產(chǎn)生，通過(guò)環(huán)境檢測(cè)(通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或生物產(chǎn)生)或通過(guò)有機(jī)體檢測(cè)(例如，微生物、動(dòng)物等)還可以在這樣的環(huán)境和生物液體和氣體中發(fā)現(xiàn)丙酮。因此，公開(kāi)的文獻(xiàn)中報(bào)道如下，丙酮作為污水、固體廢物和醇類的生物降解產(chǎn)物，腐殖物質(zhì)的氧化產(chǎn)物而存在。丙酮已經(jīng)在各種植物和食品中檢測(cè)到，包括洋蔥、葡萄、花菜、番茄、牽?；ā⑻锝娌?、牛奶、大豆、豌豆、干酪和雞胸。從各種樹(shù)種的天然散發(fā)物中包括丙酮?dú)怏w。
JD Reisman，用于丙酮的環(huán)境健康標(biāo)準(zhǔn)(手稿)，環(huán)境健康標(biāo)準(zhǔn)No.207，化學(xué)安全國(guó)際程序(INCHEM)(1998)(參見(jiàn)1.4部分，“環(huán)境等級(jí)和人體輻射”http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc207.htm。例如，丙酮可以通過(guò)植物萜烯的大氣氧化作用在環(huán)境中化學(xué)合成(Fruekilde等(1998))。
活的有機(jī)體可以通過(guò)多種酶途徑內(nèi)部產(chǎn)生丙酮。在微生物中，可以合成丙酮，例如通過(guò)異丙醇的氧化，如可以通過(guò)分枝桿菌spp.進(jìn)行，包括母牛分枝桿菌；通過(guò)2-丙烷磺酸鹽的脫磺酸基作用，如可以通過(guò)紅球菌spp.和叢毛單胞菌spp.進(jìn)行，包括食酸叢毛單胞菌；和通過(guò)乙酰乙酸鹽的脫羧作用，如通過(guò)梭菌spp.進(jìn)行，包括丙酮丁酸梭菌，丁酸梭菌，和C.Saccharoperbutylacetonium。
在脊椎動(dòng)物中，包括人類，丙酮合成的最普通路線是通過(guò)酮體形成。酮體是通過(guò)肝臟的類脂氧化作用產(chǎn)生的成分，當(dāng)葡萄糖不可用時(shí)作為能源。歸類為酮體的主要成分包括乙酰醋酸，β-羥基丁酸和丙酮。酮體通常存在于體內(nèi)，當(dāng)快速和持久鍛煉過(guò)程中，它們的含量會(huì)上升。肝臟線粒體中脂肪酸的氧化作用產(chǎn)生乙酰輔酶A，其可以通過(guò)檸檬酸循環(huán)或者通過(guò)一個(gè)稱為生酮作用的過(guò)程得到進(jìn)一步氧化。生酮作用主要是在葡萄糖不能作為能源時(shí)發(fā)生，將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酰醋酸鹽，β-羥基丁酸鹽。肝臟將乙酰醋酸鹽和β-羥基丁酸鹽釋放到血流中，可以將其運(yùn)至外周組織作為替換的能源。乙酰醋酸是一種β-酮酸，通過(guò)緩慢的自發(fā)的非酶的脫羧作用生成丙酮和CO2(圖解1)圖解I 在四蹄脊椎動(dòng)物中，包括哺乳動(dòng)物，可以檢測(cè)到呼吸作用作為肺中氣血交換結(jié)果形成的丙酮。
呼吸丙酮的含量和血液丙酮含量相關(guān)，因此可以作為血液丙酮含量的準(zhǔn)確指標(biāo)。因此，在其他是健康的患者臨床研究中，已經(jīng)證實(shí)升高的呼吸丙酮含量是脂肪代謝和程序性體重丟失的一個(gè)可靠指標(biāo)。存在于人呼吸中丙酮的內(nèi)源代謝水平約為0.2-0.5ppm(v/v)，而在長(zhǎng)期低碳水化合物膳食的健康個(gè)體中提高至以及超過(guò)5-25ppm。同樣地，在高脂肪膳食的個(gè)體中，呼吸丙酮的濃度提高。每個(gè)這些食譜的情況被稱為“良性食譜酮病”。呼吸丙酮含量通過(guò)短期禁食提高的，這種情況成為“禁食酮病”，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)后的情況成為“過(guò)度運(yùn)動(dòng)酮病”。在饑餓的情況下(或長(zhǎng)期禁食)或食譜中胰島素水平太低的情況下，呼吸丙酮的濃度可以變得異常高(高達(dá)70ppm或更高)，分別地，這樣的情況稱為“代謝酮酸中毒”或“糖尿病性的酮酸中毒”，糖尿病性的酮酸中毒是潛在的致命情況。在每個(gè)這樣的情況下，在青少年或成人呼吸中可以檢測(cè)到升高的丙酮含量。
除了通過(guò)良性食譜、禁食、和過(guò)度運(yùn)動(dòng)酮病，以及通過(guò)糖尿病性的和代謝酮酸中毒提高丙酮以外，其他情況和疾病也可以產(chǎn)生升高的血液丙酮，因此提高呼吸丙酮的含量。例如，血液丙酮提高可以在以下情況中觀察到，例如1)女性的生殖周期(例如，在懷孕期間或在分娩后恢復(fù)排卵之前的間隔期間)；2)新生兒的發(fā)育期；3)低血糖(例如，兒童期的低血糖或不當(dāng)飲食或延長(zhǎng)嘔吐導(dǎo)致的低血糖)；4)先天代謝疾病(例如，槭糖尿病)；5)肝機(jī)能障礙(例如，末期肝疾病或肝缺血)；6)糖皮質(zhì)激素缺乏；7)生長(zhǎng)激素缺乏；8)病毒感染引起的急性胰炎(例如，系統(tǒng)細(xì)胞巨化病毒感染)；9)用核苷類似物處理(例如，HIV的抗逆轉(zhuǎn)錄治療)；10)異丙醇攝取或中毒；11)乙醇中毒；以及12)水楊酸鹽中毒。在這些情況中，丙酮也可以通過(guò)例如兒童或成人的呼吸分析檢測(cè)得到。
因此，丙酮的檢測(cè)在許多醫(yī)藥上重要的應(yīng)用中是有用的。例如，醫(yī)學(xué)報(bào)告中已經(jīng)證實(shí)肥胖是糖尿病、高血壓、冠心病、高膽固醇血癥和中風(fēng)的主要關(guān)鍵因素。在許多肥胖的情況中，控制體重減少的過(guò)程可以逆轉(zhuǎn)這些危急生命的嚴(yán)重疾病。丙酮是一種可以檢測(cè)到的代謝物，來(lái)監(jiān)控在這樣減輕體重過(guò)程并與其一致的進(jìn)展。同樣，丙酮的檢測(cè)可以用于警告糖尿病患者酮酸中毒發(fā)作或者用于得到診斷患者其他任何發(fā)現(xiàn)丙酮升高的醫(yī)學(xué)情況或疾病所需的預(yù)指示。因此，丙酮是可以作為監(jiān)控所有年齡患者的膳食適應(yīng)度、體重減輕過(guò)程、藥物治療方式適應(yīng)度、糖尿病、健康狀況的手段的關(guān)鍵診斷代謝物。
B.丙酮檢測(cè)的領(lǐng)域在上述任何一種情況中都可以檢測(cè)到丙酮，通過(guò)使用各種方式。在現(xiàn)有技術(shù)中有許多種測(cè)量丙酮的方法，包括檢測(cè)液體溶液中的丙酮(例如，血液和血漿分析，尿檢測(cè))和檢測(cè)那些氣體混合物中的丙酮(例如，呼吸樣本、室內(nèi)氣體監(jiān)控)。許多種類的不同方法已經(jīng)用于丙酮檢測(cè)、監(jiān)控和分析。這些方法包括那些依靠，例如顏色指示劑、光學(xué)反射、燃燒熱、電阻、氣態(tài)色譜(GC)、液態(tài)色譜(LC)、光度測(cè)定法、比色法、紫外分光法(UV)、紅外光譜學(xué)和光譜學(xué)(IR)、微波光譜分析和質(zhì)譜分析(MS)技術(shù)。
這些技術(shù)和運(yùn)用它們的方法在專一性方面有不同一些檢測(cè)各種揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)；一些單獨(dú)檢測(cè)酮(和酮酸)或檢測(cè)酮(和酮酸)和醛；以及一些特地來(lái)測(cè)量丙酮。
在第一組丙酮檢測(cè)的方法中，通過(guò)使用任何一種檢測(cè)各種VOCs的技術(shù)來(lái)監(jiān)控丙酮，這樣的技術(shù)實(shí)例包括以下的。檢測(cè)各種VOCs的周圍氣體檢測(cè)儀包括例如，Drager Polytron SE Ex檢測(cè)儀，其使用催化的、燃燒熱“pellistor”型傳感器(目錄no.6809760；0.6公斤)；以及DragerPolytron IR SE氣體檢測(cè)儀，其使用了紅外線傳感器(目錄no.8312550；1.9公斤)(都可以從Drager SicherheitstechnikGmbH，Lubeck購(gòu)得，德國(guó))。
基于液固反應(yīng)的VOCs檢測(cè)依靠氣體或液體吸收到固相上(通常包括化學(xué)衍生反應(yīng))，接著通過(guò)吸收的和/或衍生成分的比色或光度的檢測(cè)。英國(guó)專利No.1082525中描述了這樣的液固反應(yīng)技術(shù)，其中披露了含有活性或活化氫原子的有機(jī)物成分的檢測(cè)，其中金屬沸石用作固體。在美國(guó)專利No.4,882,499中披露了包括液體吸收到固體上和使用光度檢測(cè)的VOC檢測(cè)。該專利教導(dǎo)了使用纖維光學(xué)的液體檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)通過(guò)毛細(xì)管作用吸收的液體樣品反射光學(xué)系數(shù)的變化；為了這一目的，疏水纖維或燒結(jié)的基質(zhì)被用作吸附的固體。
在另一種VOC檢測(cè)的方法中，在美國(guó)專利No.5.382.341中描述了通過(guò)電阻/導(dǎo)電性檢測(cè)來(lái)感知吸收到固體上的氣體。該專利描述了煙霧檢測(cè)元件的制造過(guò)程，其中鉍氧化物膜沉積在基底層上，和，然后電學(xué)連接到測(cè)量電阻的裝置上。在這種情況下，固體可以包括鉍氧化物、鉍-鐵-氧化物、鉍-釩-氧化物，或鉍-鉬-氧化物。同樣，德國(guó)專利No.028062描述了氣體吸收方法，其中固體包括半導(dǎo)體裝置的吸收層。
在VOC檢測(cè)的另一種方法中，依靠氣態(tài)化學(xué)衍生(鹵化作用)反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的鹵化產(chǎn)物。在美國(guó)專利No.4,198,208和德國(guó)專利No.4007375中教導(dǎo)了這樣用于VOC檢測(cè)的氣態(tài)衍生方法的實(shí)例(描述了用氯反應(yīng)以及氯化物質(zhì)的檢測(cè))。第一組所有這些技術(shù)都可以和教導(dǎo)用于測(cè)量丙酮，盡管沒(méi)有特別VOCs的種類。
用于丙酮檢測(cè)的第二組方法通常是檢測(cè)酮/酮酸或同時(shí)檢測(cè)酮/酮酸和醛的。這些方法采用的技術(shù)依賴如丙酮的化學(xué)衍生作用，產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物。然后有顏色的產(chǎn)物在視覺(jué)上可以觀察出來(lái)，得到定性的結(jié)果。類似地，有顏色的產(chǎn)物可以用顏色標(biāo)準(zhǔn)圖表進(jìn)行視覺(jué)上的對(duì)比得到準(zhǔn)定量的數(shù)據(jù)。另外，通過(guò)比色或光度的手段，顏色的程度可以被定量地估計(jì)。這些技術(shù)中使用的最普遍的衍生反應(yīng)是基于1)和水楊醛反應(yīng)；2)和聯(lián)氨(或苯肼，例如，2，4-二硝基苯肼)反應(yīng)；以及3)和硝普鹽反應(yīng)。許多其他化學(xué)衍生反應(yīng)用于檢測(cè)醛和酮/酮酸(包括丙酮)是已知的，但不是常用的，因?yàn)檫@些反應(yīng)使用高溫或腐蝕性的，不耐久的，或昂貴的試劑，使得廣泛應(yīng)用不實(shí)際。
在基于水楊醛的試驗(yàn)中，將酮或酮酸引入含有水楊醛的堿性溶液中，因此產(chǎn)生了橙色或紅色的衍生物。例如，如在美國(guó)專利No.2,283,262中描述的，通過(guò)這個(gè)途徑，尿中的丙酮和乙酰醋酸鹽都可以檢測(cè)到。
在基于聯(lián)氨和基于苯肼的試驗(yàn)中，醛、酮和酮酸衍生成一種或多種腙或苯腙成分。例如，在美國(guó)專利No.4.931,404中描述了通過(guò)這條途徑，氣態(tài)丙酮吸收進(jìn)入液體溶液進(jìn)行化學(xué)衍生作用，其中披露了通過(guò)和聯(lián)氨-或苯肼耦合的陽(yáng)離子交換基質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的衍生作用，接著通過(guò)比色檢測(cè)如黃色的衍生物；在英國(guó)專利No2253910中，披露了通過(guò)和聯(lián)氨溶液反應(yīng)的衍生作用，接著通過(guò)電阻進(jìn)行衍生物的檢測(cè)。
在基于硝普鹽的試驗(yàn)中，醛、酮以及酮酸和硝普鹽反應(yīng)，即硝普酸的鹽(例如，硝普酸鈉，即亞硝基鐵氰化鈉)，形成衍生物，在胺的存在下，形成粉紅色或紫色絡(luò)合物。在一些方法中，硝普鹽反應(yīng)中存在的胺于是用于立即著色的，而在另一些中，是后來(lái)加入含有胺的溶液來(lái)產(chǎn)生顏色的。在個(gè)人健康監(jiān)控范圍中，硝普鹽反應(yīng)是一種最常用于測(cè)量丙酮的反應(yīng)，例如，在糖尿病或體重減輕中。這樣的硝普鹽方法通常為三種不同形式中的一種氣體采樣管、液體檢測(cè)條和液體檢測(cè)板。
通常使用多種的硝普鹽管試驗(yàn)設(shè)備。最普遍的一種是德雷格管(即Drger管)，例如，德雷格丙酮檢測(cè)儀管(目錄no.DRAG CH22901從SAFECO，Inc.購(gòu)得，諾克斯維爾，田納西)。德雷格丙酮檢測(cè)儀管可用于呼吸分析，但是主要用于周圍氣體樣品，其中泵將空氣樣品通過(guò)管子引入。相同試驗(yàn)中使用了德雷格芯片測(cè)量系統(tǒng)(目錄no.540βCMS從SafetyFirst of Middleton購(gòu)得，威斯康星；0.74公斤)，其中使用了“芯片”，即毛細(xì)管大小的德雷格管平面的、平行的基質(zhì)。該手提式設(shè)備將氣體樣品泵入毛細(xì)管，設(shè)備中的光學(xué)和電學(xué)進(jìn)行比色，將管中衍生物著色的程度轉(zhuǎn)化為定量的數(shù)據(jù)信號(hào)。同樣地，通過(guò)光度檢測(cè)有顏色的衍生物來(lái)定量監(jiān)控氣體樣品中的丙酮(以及其他酮)的方法，在MSA丙酮檢測(cè)管制造者可得到的信息中有教導(dǎo)(目錄no.226620，從Ben Meadows Co.，購(gòu)得，Lab Safety Supply Inc.的分支，郵箱5277，簡(jiǎn)斯維爾，威斯康星53547)。同樣，美國(guó)專利No.5,174,959中披露了包含兩個(gè)固體基質(zhì)的硝普鹽管試驗(yàn)設(shè)備一個(gè)硝普鹽偶聯(lián)基質(zhì)和一個(gè)胺偶聯(lián)基質(zhì)。該設(shè)備可以用于氣體樣品，其中加入溶劑如甲醇，或用于液體樣品如尿。
硝普鹽流體檢測(cè)條和板通常作為尿酮檢測(cè)條帶和板銷售。這樣的酮檢測(cè)條的例子是CHEMSTRIP K(Roche Diagnostics公司生產(chǎn)，印第安納波利斯，印第安納)和KETOSTIX(Bayer公司生產(chǎn)，塔利頓，紐約)。典型的酮檢測(cè)條帶包括AMES ACETEST試劑板(產(chǎn)品目錄號(hào)AM-2381，得自Analytical Scientific有限公司，圣安東尼奧，德克薩斯)。
第三組方法是丙酮特異性的。這些丙酮特異檢測(cè)方法使用了分析設(shè)備和技術(shù)。例如，丙酮特異性檢測(cè)方法包括氣態(tài)色譜分析檢測(cè)，A Amirav等在“用于醫(yī)學(xué)診斷的人類呼吸分析器”中描述，http://tau.ac.il/chemistry/amirav/breath.shtml(2000年11月)；用微型柱進(jìn)行液態(tài)色譜分析，如美國(guó)專利No.6,063,283中描述的；質(zhì)譜分析檢測(cè)，如美國(guó)專利No.5,999,886中描述的，用于在半導(dǎo)體晶片處理的容器中測(cè)量丙酮蒸汽絡(luò)合物。
在美國(guó)專利No.5,355,425(用于液體)和美國(guó)專利No.4,587,427(用于氣體)中描述了通過(guò)IR光譜學(xué)進(jìn)行流體中丙酮特異性檢測(cè)。RTKrouti1等披露了通過(guò)FTIP光譜學(xué)進(jìn)行氣體中丙酮特異性檢測(cè)“通過(guò)傅里葉變換紅外線干涉圖直接分析的丙酮、甲基乙基酮以及六氟化硫的自動(dòng)化檢測(cè)，”Applied Spectroscopy 48(6)724-32(1994年6月)。在Medical Technology Co-Operation Offer131.C的摘要中描述了通過(guò)微波光譜進(jìn)行氣體中的丙酮特異性檢測(cè)，題目為“用于呼出氣體的微波氣體光譜”，從Nizhny Novgorod Region Cooperation of the East-WestAgency (OWA) of the Association for Innovation Research andConsultation mbH of the Innovation Consulting Institute獲得(Innovations Beratungs Institut，Dusseldorf，DE)(參見(jiàn)″醫(yī)學(xué)技術(shù)″連接網(wǎng)址http://www.owa-ibi.com/owa-deutsch/index.html)。
此外，許多采用連接分析技術(shù)的丙酮特異性檢測(cè)方法也是本領(lǐng)域公知的。例如，這樣方法的選擇包括，那些依靠GC-HPLC，GC-FID(“火焰離子化鑒定器”)，GC-MS，GC-RGD(“還原氣體檢測(cè)儀”)，以及HPLC-UV技術(shù)，在JD Reisman，用于丙酮的環(huán)境健康標(biāo)準(zhǔn)(手稿)環(huán)境健康標(biāo)準(zhǔn)No.207，化學(xué)安全國(guó)際程序(INCHEM)(1998)(參見(jiàn)2部分，“同一性、物理和化學(xué)特性，以及分析方法”http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc207.htm。
因此，氣體吸收(進(jìn)入液體)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，氣體吸收(到固體上)通過(guò)和不通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，液體吸收(到固體上)通過(guò)和不通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，氣態(tài)化學(xué)反應(yīng)、液態(tài)化學(xué)反應(yīng)、UV、IR、GC、LC、MS、以及其他技術(shù)都已經(jīng)用于丙酮檢測(cè)。然而，所有這些技術(shù)都存在缺陷。
例如，由于環(huán)境、健康以及安全因素，期望選擇一種對(duì)丙酮特異的丙酮檢測(cè)方法。這在患者半監(jiān)控的領(lǐng)域中尤為重要，例如，對(duì)于糖尿病和對(duì)于節(jié)食。因此，廣泛的VOC檢測(cè)技術(shù)對(duì)于這些目的就不是很理想了。而目前所用特別針對(duì)丙酮的丙酮特異性方法，它們需要不能輕易移動(dòng)的龐大設(shè)備，而且其獲得和維持也是相對(duì)昂貴的，以及通過(guò)缺乏醫(yī)學(xué)或科學(xué)訓(xùn)練的個(gè)體來(lái)使用它們也是不切實(shí)際的。期望丙酮檢測(cè)技術(shù)能成為重量輕，易移動(dòng)，低成本，和易操作的。這些特征在患者半監(jiān)控的領(lǐng)域中同樣特別重要。因此，由于這些目的和原因，目前可用的丙酮特異性檢測(cè)技術(shù)是不理想的。
與這些丙酮特異性技術(shù)相比，目前可用的檢測(cè)酮/酮酸或同時(shí)檢測(cè)酮/酮酸和醛的大多數(shù)方法，通常相對(duì)低廉、重量輕、易移動(dòng)以及易操作。然而不使用第二個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)，如比色或光度，這些測(cè)試產(chǎn)物只是定性或半定量的結(jié)果可視的顏色數(shù)據(jù)。其次，這些測(cè)試對(duì)丙酮不是特異性的乙酰乙酸鹽、其它酮，以及醛的存在可能造成錯(cuò)誤放大的顏色數(shù)據(jù)。最后，這些測(cè)試會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果；假陽(yáng)性表示存在丙酮增加，假陰性表示不存字丙酮增加。例如，在最常用的試驗(yàn)(硝普鹽試驗(yàn))中假陽(yáng)性結(jié)果通常發(fā)生在患者服用了如硫氫藥物如卡托普利，或當(dāng)其他酮或醛存在時(shí)；假陰性結(jié)果經(jīng)常發(fā)生在當(dāng)測(cè)試高酸性樣品時(shí)，如服用大劑量維生素C(抗壞血酸)患者的尿樣。理想的丙酮檢測(cè)技術(shù)是可靠的、對(duì)丙酮是特異性、以及可以產(chǎn)生直接定量結(jié)果的。這些特征在患者半監(jiān)控的領(lǐng)域中同樣特別重要。因此，對(duì)于這些目的，現(xiàn)有的酮/酮酸和醛檢測(cè)技術(shù)不理想因此，在丙酮檢測(cè)領(lǐng)域中需要一種丙酮檢測(cè)技術(shù)，其是丙酮特異性的、重量輕、易移動(dòng)、低成本、易操作，可靠和可以直接產(chǎn)生定量結(jié)果。這樣的技術(shù)可以產(chǎn)生電學(xué)效果如，數(shù)字結(jié)果(或光型計(jì)算機(jī)或其他設(shè)備的情況下，可以產(chǎn)生光結(jié)果)，也使十分有用的。如待在家中的患者用來(lái)監(jiān)控生物樣品中丙酮含量的可提供的、易處理的、特異性、單獨(dú)使用的設(shè)備還是不容易獲得的。
其他如乙醇檢測(cè)領(lǐng)域，利用基于酶的技術(shù)?；诿傅募夹g(shù)可以是分析特異性的，可以得到重量輕、易移動(dòng)、低成本、易操作和定量的設(shè)備形式。例如，在生物樣品乙醇檢測(cè)的領(lǐng)域中，氣態(tài)乙醇檢測(cè)已經(jīng)通過(guò)酶聯(lián)電化學(xué)傳感器的手段來(lái)進(jìn)行，使用乙醇氧化酶(AOX)或伯醇脫氫酶(ADH)作為酶。在一個(gè)典型的乙醇檢測(cè)系統(tǒng)中，薄膜的、使用固定于羥乙基纖維素中ADH/NAD+的絲網(wǎng)印刷酶電極用于監(jiān)控乙醇蒸汽。這種乙醇檢測(cè)酶電極通過(guò)將其浸入緩沖液來(lái)活化，使用含有乙醇的樣品，在650mV(比照Ag/AgCl)電流下監(jiān)控通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的NADH。已經(jīng)描述了用于測(cè)量乙醇蒸汽的同樣的電極，其中ADH固定于相反膠束介質(zhì)中。將乙醇轉(zhuǎn)化成液態(tài)，其可以在介質(zhì)中有效地被濃縮，ADH可以作用于它。這些技術(shù)容易應(yīng)用于可以在家中、工作中，以及在其他遠(yuǎn)離診所和測(cè)試實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境用于監(jiān)控或自我監(jiān)控呼吸乙醇的易移動(dòng)、低成本的檢測(cè)儀。然而，這些設(shè)備沒(méi)有被設(shè)計(jì)用于丙酮檢測(cè)，以及所用酶(例如，伯醇脫氫酶)也不能用于丙酮檢測(cè)。因此，如果可以發(fā)明，基于酶技術(shù)可以提供許多在丙酮檢測(cè)領(lǐng)域所需的益處。
盡管如此，上述所有的丙酮檢測(cè)方法和設(shè)備依靠非酶技術(shù)。到目前為止，環(huán)境和生物樣品中丙酮的酶促測(cè)量還沒(méi)有被描述。因此，似乎除了需要具有上述優(yōu)點(diǎn)的丙酮檢測(cè)技術(shù)外，丙酮檢測(cè)領(lǐng)域還缺乏有基于酶的技術(shù)的應(yīng)用及益處。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及丙酮特異性的基于酶的檢測(cè)系統(tǒng)，包括重量輕、易移動(dòng)、低成本、易操作、可靠、能直接產(chǎn)生定量結(jié)果以及能產(chǎn)生電子結(jié)果的丙酮特異性基于酶的檢測(cè)系統(tǒng)。產(chǎn)生電子結(jié)果的能力，例如數(shù)據(jù)，可以使這樣的設(shè)備易于計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)收集和通過(guò)交流網(wǎng)絡(luò)如國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)傳輸(通過(guò)硬件或軟件的方式)，包括通過(guò)WO01/63277中描述的方法。這樣計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)的收集和傳輸可以使使用本發(fā)明丙酮特異性檢測(cè)儀的方法對(duì)一致性監(jiān)控、培訓(xùn)和指導(dǎo)尤為有效。
與目前可用的重量輕、易移動(dòng)、低成本、易操作的丙酮檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明的丙酮特異性基于酶的檢測(cè)系統(tǒng)還提高了丙酮檢測(cè)的靈敏度。上述參考文獻(xiàn)中沒(méi)有一個(gè)提示了通過(guò)酶促的方法來(lái)提高丙酮檢測(cè)的靈敏度。迄今還沒(méi)有報(bào)道過(guò)哺乳動(dòng)物樣品中丙酮的基于酶的測(cè)定。然而，如前所述，丙酮的特異性測(cè)定在許多醫(yī)學(xué)情況下十分重要，在患者半監(jiān)控的范圍內(nèi)尤為有用。然而，這樣的丙酮特異性檢測(cè)技術(shù)通常在實(shí)驗(yàn)室或診所外就不能進(jìn)行了，對(duì)普通患者的半監(jiān)控也不實(shí)用。由于這些原因，就存在這樣的需要提供改進(jìn)的、比較不笨重的和易操作的專門(mén)檢測(cè)生物樣品中丙酮的方法和設(shè)備。因此，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性基于酶的方法的丙酮檢測(cè)，在許多醫(yī)學(xué)上的重要應(yīng)用中尤為有用。
已經(jīng)創(chuàng)造了用于定量測(cè)定生物樣品中丙酮含量的丙酮特異性酶系統(tǒng)來(lái)解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。本發(fā)明的酶系統(tǒng)和檢測(cè)儀特異性地作用于底物丙酮。術(shù)語(yǔ)“特異性地”用于表征酶、系統(tǒng)或設(shè)備，其充分地表現(xiàn)出對(duì)丙酮比其他潛在可用底物更高的親合力或活性，即，相對(duì)于通常存在于樣品例如人呼吸中的其他化學(xué)物質(zhì)，對(duì)丙酮是優(yōu)先的酶，和/或(在本發(fā)明的丙酮檢測(cè)儀的范圍內(nèi))不能相當(dāng)?shù)嘏c丙酮競(jìng)爭(zhēng)的其他重要底物接觸的酶。因此，在本發(fā)明的設(shè)備和系統(tǒng)中，酶和丙酮或活性丙酮衍生物以外的底物相互作用是可忽略的。
可以將一種或多種酶和設(shè)備，如生物傳感器，結(jié)合以方便樣品測(cè)定。酶和丙酮的反應(yīng)可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中公知的各種檢測(cè)方法來(lái)直接或間接地檢測(cè)。這些酶系統(tǒng)可用于，例如，檢測(cè)人生物樣品如呼吸、唾液或尿中丙酮含量的家用設(shè)備中，因此，提供了一種用于監(jiān)控患者健康和/或用于監(jiān)控患者對(duì)體重減輕膳食的適應(yīng)性、健康控制過(guò)程，以及治療狀況的非入侵方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是丙酮特異性酶系統(tǒng)，將丙酮的酶介代謝和通過(guò)一種或多種在上文所述的信號(hào)介質(zhì)產(chǎn)生的電化學(xué)可檢信號(hào)偶聯(lián)。特別地，將丙酮特異性酶系統(tǒng)，包括選擇丙酮作為目標(biāo)底物的酶，和檢測(cè)信號(hào)的介質(zhì)偶聯(lián)是本發(fā)明優(yōu)選的一方面，尤其是通過(guò)使用電化學(xué)或光度的方法進(jìn)行檢測(cè)。任何可以和電化學(xué)可檢測(cè)協(xié)同因子或副產(chǎn)物偶聯(lián)的丙酮特異性酶都適用于本發(fā)明的酶系統(tǒng)。
丙酮特異性酶系統(tǒng)以凍干的形式存在直至接觸生物樣品。此外，電化學(xué)生物傳感器，根據(jù)發(fā)明前面所述的，可以包括通過(guò)雙糖如海藻糖的存在，穩(wěn)定地保存丙酮特異性酶系統(tǒng)。生物樣品可以是液體或蒸汽的形式，但是優(yōu)選為蒸汽形式。
樣品如人呼吸中丙酮的酶介量化的一個(gè)重要特征是使用了對(duì)丙酮具有高靈敏度的酶系統(tǒng)(例如，檢測(cè)下限約為0.2-0.5ppm(v/v))，可以將其并入設(shè)備中。此外，酶系統(tǒng)必須是堅(jiān)固的、穩(wěn)定的和相對(duì)廉價(jià)的。通常，設(shè)備必須是可以計(jì)算機(jī)連接的、高選擇性，輕便的以及呼吸中存在的其他代謝物如乙醇是低干擾的。由于檢測(cè)的靈敏度和設(shè)備的需要相對(duì)簡(jiǎn)單，酶電極技術(shù)(生物傳感器)尤其適合于這些需要，其中包括特異性酶促反應(yīng)。電化學(xué)檢測(cè)依賴于通過(guò)電極待測(cè)樣品反應(yīng)產(chǎn)生的電流的直接測(cè)定。將氧化還原酶(氧化還原作用)酶反應(yīng)和電極偶聯(lián)已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)生物傳感器的有吸引力的方法。尤其是，對(duì)于一定范圍的底物，即葡萄糖(即葡萄糖脫氫酶和葡萄糖氧化酶分別反應(yīng))，還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NADH)或過(guò)氧化氫的電化學(xué)檢測(cè)已經(jīng)用于電流計(jì)生物傳感器中。
優(yōu)選的丙酮特異性酶系統(tǒng)包括選自丙酮單加氧酶、丙酮羧化酶以及仲醇脫氫酶的丙酮特異性酶。尤其是，本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)優(yōu)選包括選自與NAD(P)H氧化偶聯(lián)的丙酮羧化酶產(chǎn)物形成，與NAD(P)H氧化偶聯(lián)的丙酮羧化酶ATP水解，與H2O2生成偶聯(lián)的丙酮羧化酶ATP水解，仲醇脫氫酶(S-ADH)偶聯(lián)NAD(P)H氧化，S-ADH催化NAD(P)+生成偶聯(lián)H2O2生成，以及丙酮單加氧酶偶聯(lián)NAD(P)H氧化的丙酮特異性酶系統(tǒng)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)包括信號(hào)介質(zhì)選自有機(jī)協(xié)同因子、無(wú)機(jī)協(xié)同因子、多電子傳遞介質(zhì)及酶反應(yīng)副產(chǎn)物。優(yōu)選，通過(guò)再循環(huán)酶底物放大電化學(xué)信號(hào)輸出，電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)介質(zhì)發(fā)出的信號(hào)是線性或指數(shù)放大。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，丙酮特異性酶系統(tǒng)包括從脊椎動(dòng)物或微生物中獲得的丙酮利用酶，更優(yōu)選為從哺乳動(dòng)物、真菌、細(xì)菌或熱古菌(Archaeon)中獲得。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，丙酮特異性酶系統(tǒng)包括從脊椎動(dòng)物或從選自需氧的和厭氧的細(xì)菌、酵母、真菌和產(chǎn)甲烷的古生菌中獲得的仲醇脫氫酶。優(yōu)選，從熱厭氧桿菌屬、黃色桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬(Rhodococcus)，或分枝桿菌屬的菌種中分離獲得的仲醇脫氫酶；尤其是優(yōu)選從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株中分離獲得的仲醇脫氫酶。
在本發(fā)明的再一優(yōu)選實(shí)施例中，丙酮特異性酶系統(tǒng)包括從需氧或厭氧細(xì)菌中分離獲得的丙酮羧化酶，優(yōu)選從黃色桿菌屬、紅球菌屬(Rhodococcus)，或紅球菌屬(Rhodobacter)的菌種中獲得。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，用于檢測(cè)生物樣品中丙酮的電化學(xué)生物傳感器包括至少一種如前面所述的丙酮特異性酶系統(tǒng)，以及用于檢測(cè)至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)和生物樣品中的丙酮之間反應(yīng)得到的產(chǎn)物的方法。生物傳感器的丙酮特異性酶系統(tǒng)優(yōu)選包括選自丙酮羧化酶、仲醇脫氫酶和丙酮單加氧酶的酶。尤其是，丙酮特異性酶系統(tǒng)可以包括至少一種選自1)仲醇脫氫酶(S-ADH)催化的丙酮還原，伴隨NAD(P)H(氧化)；2)丙酮羧化酶偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶反應(yīng)消耗NAD(P)H；3)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)NAD(P)H消耗；4)S-ADH反應(yīng)NAD(P)+生成偶聯(lián)H2O2生成；5)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)H2O2生成；6)丙酮羧化酶偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶NAD(P)+生成偶聯(lián)H2O2生成；7)丙酮單加氧酶偶聯(lián)NAD(P)H氧化；8)丙酮單加氧酶偶聯(lián)H2O2生成；以及9)丙酮單加氧酶催化NAD(P)+生成偶聯(lián)H2O2生成。
在制造包含一種或多種丙酮特異性酶系統(tǒng)的生物傳感器中，各種酶促的副產(chǎn)物和/或因子用于產(chǎn)生檢測(cè)酶反應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)。可以使用有機(jī)協(xié)同因子，如NAD，NADH，NADP，NADPH，F(xiàn)AD，F(xiàn)ADH，F(xiàn)MNH，輔酶A，輔酶Q，TTQ(色氨酸色氨酰醌)以及PQQ(吡咯并喹啉醌)。電子傳遞介質(zhì)可以用于提高電子傳遞的動(dòng)力學(xué)，因?yàn)橛袡C(jī)協(xié)同因子有時(shí)候易于污濁檢測(cè)儀。用于協(xié)同因子還原形式的對(duì)多電子傳遞有用的介質(zhì)可以包括入本發(fā)明的酶系統(tǒng)。同樣地，無(wú)機(jī)的協(xié)同因子或指示劑可以用于產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。酶促反應(yīng)的副產(chǎn)物，如過(guò)氧化物或氨基化合物，以及高能粒子也可以用于本發(fā)明用來(lái)將丙酮代謝和電化學(xué)測(cè)量信號(hào)偶聯(lián)?？梢允褂眠@些協(xié)同因子和系統(tǒng)的結(jié)合。
在優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)生物傳感器可以進(jìn)一步包括連接分析設(shè)備的裝置，如連接互聯(lián)網(wǎng)的計(jì)算機(jī)。
在優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)生物傳感器可以以存在兩種或多種丙酮特異性酶系統(tǒng)為特征。在這樣的生物傳感器中，兩種或多種丙酮特異性酶系統(tǒng)可以安置在分離的電極上，例如，電極沿著樣品檢測(cè)的路徑按順序集中排列成組，形成電極排列。換句話說(shuō)，用于和含有單個(gè)丙酮樣品接觸的電極可以集中在常見(jiàn)的樣品路徑中。具有相同或不同丙酮特異性酶系統(tǒng)的若干組可以沿著路徑按順序排列來(lái)提高丙酮檢測(cè)的靈敏度。
本發(fā)明電化學(xué)生物傳感器的可替換優(yōu)選實(shí)施例中，矩陣中一個(gè)或多個(gè)這樣分開(kāi)的電極可以是丙酮特異性的，而矩陣中一個(gè)或多個(gè)其他分開(kāi)的電極可以檢測(cè)非丙酮分析物。例如，在乙醇檢測(cè)儀中，如果存在丙酮，可以通過(guò)設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)乙醇的電極第二個(gè)檢測(cè)出來(lái)，分離的雜質(zhì)，丙酮特異性電極可以提供用語(yǔ)糾正這樣的丙酮干擾的基礎(chǔ)。另一個(gè)實(shí)施例中，為了測(cè)定分析物濃度的有用比率，期望能同時(shí)測(cè)量丙酮和至少一種其他的分析物，其比例是合乎用于檢測(cè)的需要的，例如，醫(yī)學(xué)情況或疾病狀態(tài)，如糖尿病在糖尿病和其他情況中，丙酮與，如β-羥基丁酸鹽的比率，對(duì)提供患者代謝狀態(tài)更完整的情況是有用的。設(shè)備中的電極矩陣是可以設(shè)備和連接的一部分或一個(gè)裝置，每個(gè)電極可以產(chǎn)生單獨(dú)的電學(xué)結(jié)果或每個(gè)分析物的單獨(dú)結(jié)果?？商鎿Q的是，可以產(chǎn)生綜合結(jié)果的一些類型，如，總合，差別，比例等等。可以和電極連接的設(shè)備中電子的，或計(jì)算機(jī)中電子的或其他電子裝置，可以利用丙酮電極的結(jié)果，例如計(jì)算丙酮和其他測(cè)定的分析物(如β-羥基丁酸鹽)之間的比例；或計(jì)算影響從為非丙酮分析物(如，乙醇)設(shè)計(jì)的其他矩陣電極得到的丙酮結(jié)果的干擾負(fù)修正因素，然后計(jì)算修正的數(shù)據(jù)。這樣基于矩陣的電子(或電連接的)設(shè)備的一個(gè)實(shí)例是“電子鼻”，其可以用于，例如從呼吸分析得到的醫(yī)學(xué)情況的診斷；從通過(guò)受染的流體樣品，如細(xì)菌感染的尿，的氣體或蒸氣得到的醫(yī)學(xué)情況的診斷；鐵路油槽車以及其他工業(yè)容器氣體泄漏的診斷；通過(guò)檢測(cè)散發(fā)的蒸汽進(jìn)行發(fā)酵和食品加工系統(tǒng)的質(zhì)量控制監(jiān)控；封閉氣室質(zhì)量的監(jiān)控。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，檢測(cè)生物樣品中丙酮的方法包括將含有丙酮的生物樣品引入包括至少一種利用丙酮作為底物的丙酮特異性酶系統(tǒng)的生物傳感器，然后測(cè)量丙酮和丙酮特異性酶系統(tǒng)之間的反應(yīng)。生物樣品優(yōu)選為蒸汽生物樣品。檢測(cè)可以通過(guò)光度的、測(cè)熱的，或電化學(xué)的方式來(lái)完成。該方法可以進(jìn)一步包括通過(guò)電化學(xué)處理的電極促進(jìn)至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)和蒸汽樣品中丙酮的電化學(xué)轉(zhuǎn)換，以及電化學(xué)檢測(cè)至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)和蒸汽樣品中丙酮反應(yīng)得到的產(chǎn)物。
本方法中所用的至少一種酶系統(tǒng)包括選自丙酮單加氧酶，丙酮羧化酶和仲醇脫氫酶。尤其是，酶系統(tǒng)可以包括任何一種或多種1)仲醇脫氫酶(S-ADH)催化的丙酮還原，伴隨NAD(P)H的消耗(氧化)；2)丙酮羧化酶偶聯(lián)(例如β-羥基丁酸鹽脫氫酶)反應(yīng)形成產(chǎn)物伴隨NAD(P)H的消耗；3)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)NAD(P)H的消耗；4)S-ADH反應(yīng)生成NAD(P)+偶聯(lián)H2O2生成；5)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)H2O2生成；6)丙酮羧化酶偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶反應(yīng)生成NAD(P)+偶聯(lián)H2O2生成；7)丙酮單加氧酶偶聯(lián)NAD(P)H氧化；8)丙酮單加氧酶偶聯(lián)H2O2生成；以及9)丙酮單加氧酶催化生成NAD(P)+偶聯(lián)H2O2生成。該方法優(yōu)選包括蒸汽樣品中丙酮含量為0.5ppm至10ppm的電化學(xué)檢測(cè)。
通過(guò)使用用于監(jiān)控丙酮含量的丙酮特異性酶系統(tǒng)，患者護(hù)理的若干范圍可以擴(kuò)大。在這方面，可以酶介檢測(cè)生物樣品中丙酮的家用生物傳感器使患者、護(hù)理人員和支持群體可以嚴(yán)密地控制體重減輕過(guò)程。同樣，本發(fā)明的生物傳感器可以使患者在遭受有關(guān)丙酮的情況下，如糖尿病，可以監(jiān)控體重減輕和/或酮酸中毒的發(fā)作，以及非入侵的控制他們的飲食和藥物，因此控制丙酮的產(chǎn)生。傳感器中丙酮特異性酶系統(tǒng)的另一個(gè)用途是通過(guò)用丙酮或產(chǎn)生丙酮成分標(biāo)記藥方來(lái)遠(yuǎn)程規(guī)劃藥物控制。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的電化學(xué)生物傳感器設(shè)備使用了對(duì)作為底物的丙酮特異性的酶，其中丙酮酶系統(tǒng)反應(yīng)結(jié)合了電化學(xué)檢測(cè)方法。這樣的丙酮特異性監(jiān)控設(shè)備的使用需要生物傳感器能夠檢測(cè)低含量的丙酮，尤其是當(dāng)監(jiān)控蒸汽樣品中的丙酮時(shí)。例如，根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)丙酮傳感器可以通過(guò)測(cè)定生物樣品中的丙酮含量來(lái)幫助糖尿病治療中的患者?；颊咴诩抑芯涂梢院芸炀偷玫酵嶂卸镜臄?shù)據(jù)和警告，通過(guò)將任何為了產(chǎn)生(在丙酮檢測(cè)中存在的電化學(xué)反應(yīng))定性或定量結(jié)果的方式并入設(shè)備，或?yàn)榱藢ㄟ@樣產(chǎn)生方式的設(shè)備和計(jì)算機(jī)、儀器，或裝置連接的方式。為產(chǎn)生這樣定性或定量結(jié)果的方式的一個(gè)實(shí)例就是電子電路。電子電路可以并入根據(jù)本發(fā)明的丙酮檢測(cè)生物傳感器設(shè)備中，或通過(guò)將傳感器設(shè)計(jì)成能和計(jì)算機(jī)或其他含有這樣電路的電子儀器連接。這樣一方面通過(guò)循環(huán)酶底物放大電化學(xué)信號(hào)輸出，使用了從所應(yīng)用的電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)介質(zhì)發(fā)出的信號(hào)。這樣的電路是可選擇的，例如，能夠產(chǎn)生和/或用圖象表示/用文字表示/用信號(hào)表示來(lái)顯示定性(例如，“低”、“中等”、“高”、“安全”，或“危險(xiǎn)”)或定量結(jié)果(例如，“超過(guò)指標(biāo)10％”、“低于平均6％”、“12ppm”或“40mg/dL”)。該設(shè)備或裝置還可以包括記錄一種或多種檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)貯存方式。如WO01/63277中描述的，為了將通過(guò)設(shè)備產(chǎn)生的數(shù)據(jù)傳輸至如診所、實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)生辦公室或支持組，該設(shè)備還可以和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)，如互聯(lián)網(wǎng)連接。進(jìn)一步，設(shè)法監(jiān)控體重減輕的肥胖患者可以在他們自己家中隱密地使用根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性傳感器，或獲得醫(yī)學(xué)專家、護(hù)理者或支持組的遠(yuǎn)程幫助。通過(guò)酮癥被認(rèn)為是成功飲食的最佳指標(biāo)以及丙酮含量與由于脂肪體重減輕磅數(shù)的成分相關(guān)這一事實(shí)來(lái)促進(jìn)本發(fā)明的這個(gè)方面。
本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)和傳感器/電極可以利用監(jiān)控生酮飲食來(lái)用于控制患者疾病的發(fā)作，用于檢測(cè)妊娠期的糖尿病，用于幫助I型糖尿病監(jiān)控或II型糖尿病控制，用于監(jiān)控體重減輕和不當(dāng)飲食咨詢以及高性能健康訓(xùn)練的患者進(jìn)展，以及用于幫助家畜管理。
除了監(jiān)控體重減輕和控制丙酮有關(guān)的疾病，根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)的另一個(gè)醫(yī)學(xué)應(yīng)用就是監(jiān)控給患者使用的藥物組分的可用性。用丙酮或產(chǎn)生丙酮標(biāo)記的釋放到患者血流中的治療組分可以使用包括在此所述的丙酮特異性酶系統(tǒng)的傳感器進(jìn)行追蹤。例如，口服活性藥物可以配制成包括丙酮，或乙酰乙酸，或，例如，乙酰乙酸鹽，酯，或氨基化合物標(biāo)記的。乙酰醋酸鹽自發(fā)地脫羧基釋放出丙酮?？梢酝ㄟ^(guò)包括丙酮特異性酶系統(tǒng)的生物傳感器來(lái)監(jiān)控“標(biāo)記的”藥物的攝取，從配方到患者血流中丙酮的釋放。然后用光度或電化學(xué)的方式通過(guò)由連接在丙酮特異性酶系統(tǒng)的氧化還原酶反應(yīng)來(lái)檢測(cè)患者呼吸中的丙酮含量。優(yōu)選，定量的組分是非腸胃給藥，例如，通過(guò)注射或定位灌輸，但是其他非腸胃的給藥途徑，如，口服給藥，也是合適的。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，使用丙酮特異性酶系統(tǒng)的方法包括將乙酰乙酸鹽或制藥學(xué)上可接受的鹽、酯、氨基化合物，或其他合適的其衍生物與藥物化合物結(jié)合，然后標(biāo)記該組分；將標(biāo)記的組分給施用給患者；然后，使用本發(fā)明丙酮特異性酶系統(tǒng)的方法通過(guò)患者生物樣品中丙酮的檢測(cè)來(lái)監(jiān)控標(biāo)記組分至患者血流的釋放。尤其是，測(cè)量乙酰乙酸鹽分解的丙酮結(jié)果是跟隨著標(biāo)記組分的釋放的，其中通過(guò)丙酮和本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)生物樣品中的丙酮。通過(guò)本發(fā)明的酶系統(tǒng)，然后放大的數(shù)據(jù)可以用于監(jiān)控乙酰乙酸鹽釋放的比例，以及由此得出給藥組分的分解比例，其與藥物活性組分釋放到生物系統(tǒng)中的比例(即其生物利用率)有關(guān)。藥物傳送以及患者對(duì)藥物治療方案適應(yīng)性可以通過(guò)這種方式進(jìn)行確認(rèn)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，材料生物降解測(cè)定的方法包括標(biāo)記生物相容的植入物或設(shè)備，通過(guò)將乙酰乙酸鹽或藥學(xué)上可接受的鹽、酯或胺以及其衍生物與生物相容組分結(jié)合形成生物相容的植入物或設(shè)備；將生物相容的植入物或設(shè)備放入生物系統(tǒng)中(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物、生物環(huán)境、動(dòng)物或人患者)；測(cè)定通過(guò)生物相容植入物或設(shè)備腐蝕或分解釋放的乙酰乙酸鹽的分解產(chǎn)生的丙酮的釋放。生物相容植入物或設(shè)備可以是為了在生物系統(tǒng)中腐蝕或分解的待檢測(cè)的單一材料樣品，或者可以是手術(shù)探查的植入物或設(shè)備，例如，包括藥物活性成分的植入物或設(shè)備，所期望的是其的釋放是受控制的。與本發(fā)明的丙酮特異性酶反應(yīng)的乙酰乙酸鹽的釋放可以通過(guò)其分解成丙酮來(lái)檢測(cè)。所測(cè)得的丙酮的量可以與植入物釋放的乙酰乙酸鹽的量相關(guān)聯(lián)，其的轉(zhuǎn)變就是體內(nèi)生物相容植入物分解的象征。通過(guò)本發(fā)明酶系統(tǒng)放大的數(shù)據(jù)然后可以用于監(jiān)控乙酰乙酸鹽釋放的比例，因此，以及所組成的植入物或設(shè)備的材料腐蝕或分解的比例。
生物相容的材料是那些不損傷正常生物功能的材料。因此，材料是生物相容的而不是如生物化學(xué)抑制劑或有毒的、致突變的，或致癌的組分，以及不會(huì)導(dǎo)致如免疫反應(yīng)、致敏反應(yīng)，或血液凝固活性。生物相容材料的種類包括生物降解和非生物降解材料。生物降解材料和生物有機(jī)體接觸降解，外部地(如，微生物降解的情況)或內(nèi)部地(如，在人體內(nèi))。典型的生物相容、生物降解的聚合物包括如蛋白質(zhì)(如，膠原蛋白)、多糖及衍生物(如殼聚糖)、聚乙惡酮、聚羥基鏈烷酸(PHAs，如PHA聚合物如聚乙醇酸、聚乳酸、聚羥基丁酸、聚羥基戊酸；及PHA共聚物)。其他典型的生物相容聚合物包括聚乙二醇、聚己酸丙酯、纖維素聚合物、聚乙烯醇、聚羥乙基異丁烯酸，以及聚乙烯吡咯烷酮。更多的生物相容材料包括羥磷灰石、陶瓷、玻璃，各種金屬，以及合成材料。新的生物相容材料正在持續(xù)發(fā)展，包括那些在生物環(huán)境中短期(如，幾周)，長(zhǎng)期(如，幾個(gè)月或幾年)，以及非常長(zhǎng)期(如，幾年或幾十年)使用的。新的組分用作生物相容材料必須通過(guò)測(cè)試來(lái)測(cè)定它們是否真的是生物相容以及為了分類測(cè)定組分的半衰期，如用作短期或長(zhǎng)期的生物降解材料，或非生物降解材料。本發(fā)明的酶系統(tǒng)可以用于測(cè)定這樣材料的半衰期。
另外，為了幫助細(xì)菌感染的鑒定或測(cè)定氧化應(yīng)力或早期癌癥診斷，根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)和傳感器/電極可以和其他生物組分的檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)使用(如，結(jié)合檢測(cè)氧化亞氮、3-羥基丁酮，和/或其他生物組分的方法)。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，檢測(cè)樣品中丙酮的試劑盒包括丙酮特異性酶系統(tǒng)以及丙酮特異性酶系統(tǒng)的容器，其中容器具有將樣品引入丙酮特異性酶系統(tǒng)的入口。丙酮特異性酶系統(tǒng)固定容器內(nèi)的一次性檢測(cè)條上，或?qū)⒈禺愋悦赶到y(tǒng)構(gòu)造到容器中形成試劑盒的單一的、一次性裝置。
本發(fā)明還提供了仲醇脫氫酶，其是從自養(yǎng)黃色桿菌Py2(ATAAPTA-4779)獲得的蛋白，具有NAD+依賴性仲醇脫氫酶活性，具有將丙酮還原成異丙醇的能力，對(duì)酮和仲醇具有特異性活性；對(duì)于將異丙醇氧化為丙酮，具有(1)最佳pH約為7.8，以及對(duì)于乙醇的氧化，具有(2)當(dāng)pH為7.8時(shí)在相同條件下分別用C3-C5直鏈仲醇和C2-C5直鏈伯醇測(cè)得對(duì)仲醇與對(duì)伯醇的平均選擇活性比例至少為50∶1；對(duì)于丙酮還原成異丙醇，具有(3)最佳pH約為6.2，(4)表觀Km約為144±18μM，(5)約43.4±1.2μmol還原丙酮·min-1·mg-1蛋白的表觀Vmax，(6)約30.4sec-1的表觀kcat，(7)約2.1×105的表觀kcat/Km，和(8)約5.1±0.4μM的NADH的Km；以及包括至少一種多肽分子具有(a)通過(guò)質(zhì)譜分析測(cè)定的分子量約為37.1kDa，(b)通過(guò)變焦電泳測(cè)定的pI約為7.4，以及(c)如SEQ ID NO7所示的N-末端氨基酸序列，以及其可以被降解形成具有SEQ ID NO8至SEQ ID NO19所示序列的氨基酸片段。還提供了其多肽。


圖1圖示了通過(guò)P-450單加氧酶催化丙酮依賴性NADH氧化的電化學(xué)檢測(cè)。
圖2圖示了從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株純化得到的S-ADH的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
圖3顯示了從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株得到的S-ADH在酮還原中的底物特異性。
圖4顯示了從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株得到的S-ADH在乙醇氧化中的底物特異性(NA顯示檢測(cè)沒(méi)有活性)。
圖5圖表表示了室溫下保存的從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株得到的凍干S-ADH穩(wěn)定性，單獨(dú)以及與各種添加劑(10％重量的海藻糖、檸檬酸鹽或蔗糖)。
圖6是使用了S-ADH的丙酮電化學(xué)傳感器的示意圖。
圖7用圖表顯示了S-ADH催化反應(yīng)的電化學(xué)響應(yīng)(□)和UV分光光度響應(yīng)(●)數(shù)據(jù)的相關(guān)性。
圖8圖示了通過(guò)從自養(yǎng)黃色桿菌Py2得到的S-ADH催化丙酮依賴性NADH氧化的電化學(xué)檢測(cè)。
圖9圖示了通過(guò)從自養(yǎng)黃色桿菌Py2得到的S-ADH催化丙酮依賴性NADH氧化的電化學(xué)檢測(cè)，使用了用Melaola藍(lán)(MB)介質(zhì)改進(jìn)的碳電極。
圖10圖示了NADH濃度試驗(yàn)的電化學(xué)結(jié)果，使用了用Melaola藍(lán)修飾的玻璃碳電極。
圖11圖示了通過(guò)S-ADH催化的丙酮依賴性NADH消耗的電化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，使用了Melaola藍(lán)改進(jìn)的絲網(wǎng)印刷碳電極MB-SPCE。
圖12圖示了通過(guò)S-ADH催化的丙酮依賴性NADH消耗的電化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，使用了葡萄糖商業(yè)檢測(cè)條和監(jiān)視器。
圖13是與H2O2生成偶聯(lián)的S-ADH反應(yīng)的電化學(xué)檢測(cè)圖表，尤其顯示了S-ADH偶聯(lián)乳酸脫氫酶(LDH)和丙酮酸氧化酶(PO)。
圖14圖示了使用S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)的丙酮依賴性H2O2生成。
圖15是偶聯(lián)S-ADH反應(yīng)生成H2O2概括圖表的示意圖。
圖16圖示了丙酮依賴性H2O2生成的反射光度測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果，使用了S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)以及葡萄糖檢測(cè)條和監(jiān)視器。
圖17圖示了丙酮依賴性H2O2生成的電化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，使用了S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)以及圓盤(pán)狀鉑電極。
圖18圖示了丙酮依賴性H2O2生成的電化學(xué)化學(xué)計(jì)量的試驗(yàn)結(jié)果，使用了S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)。
圖19圖示了丙酮依賴性H2O2生成的電化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，使用了S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)以及可置換的鍍鉑碳電極。
圖20圖示了丙酮依賴性H2O2生成的電化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，使用了S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)以及一次性鍍鉑碳電極。
圖21圖示了丙酮依賴性H2O2生成的電化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，使用了S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)以及用嵌入了鈷phtalolocyanine的一次性碳電極。
圖22圖示了用于分析合成呼吸中丙酮的測(cè)試氣體樣品系統(tǒng)。
圖23圖示了將丙酮從氣態(tài)轉(zhuǎn)化到濕潤(rùn)泡沫中后的電化學(xué)檢測(cè)，使用了S-AND偶聯(lián)酶系統(tǒng)。
圖24圖示了將丙酮從氣態(tài)轉(zhuǎn)化形成含水薄膜后的電化學(xué)檢測(cè)，使用了S-AND偶聯(lián)酶系統(tǒng)。
圖25圖示了丙酮羧化酶活性偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶活性的電化學(xué)測(cè)定。
圖26圖示了使用了AC/HBDH偶聯(lián)酶系統(tǒng)的丙酮依賴性NADH消耗的分光光度測(cè)定的結(jié)果。
圖27圖示了丙酮羧化酶(AC)偶聯(lián)丙酮酸激酶(PK)、肌激酶(MK)，以及乳酸脫氫酶(LDH)活性反應(yīng)的電化學(xué)測(cè)定。
圖28圖示了丙酮羧化酶(AC)偶聯(lián)丙酮酸激酶(PK)、肌激酶(MK)，以及丙酮酸氧化酶(PO)活性反應(yīng)的電化學(xué)測(cè)定。
圖29顯示了對(duì)丙酮響應(yīng)而產(chǎn)生的H2O2分光光度吸收的測(cè)定曲線，通過(guò)包括從黃色桿菌Py2得到的丙酮羧化酶、肌激酶、丙酮酸激酶，以及丙酮酸氧化酶的偶聯(lián)酶系統(tǒng)，在辣根過(guò)氧物酶(HRP)和電子受體染料存在下；HRP和染料使H2O2的光度測(cè)定能夠進(jìn)行。
圖30圖示了使用了丙酮羧化酶偶聯(lián)系統(tǒng)的丙酮依賴性H2O2的生成；使用了丙酮羧化酶(AC)偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶(HBDH)、乳酸脫氫酶(LDH)以及丙酮酸氧化酶(PO)活性反應(yīng)的丙酮電化學(xué)測(cè)定的結(jié)果。
圖31圖示了P450單加氧酶偶聯(lián)半乳糖氧化酶活性的電化學(xué)檢測(cè)。
圖32圖示了信號(hào)放大策略，使用了丙酮羧化酶(AC)偶聯(lián)酶系統(tǒng)包括乙酰乙酸脫羧酶(ACD)、肌激酶(MK)、丙酮酸激酶(PK)以及丙酮酸氧化酶(PO)圖33圖示了信號(hào)放大策略，使用了丙酮羧化酶(AC)偶聯(lián)酶系統(tǒng)包括肌激酶(MK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)以及乳酸氧化酶(LO)。
圖34圖示了線性信號(hào)放大策略，使用了仲醇脫氫酶以及吡咯并喹啉醌(PPQ)依賴性乙醇脫氫酶。
圖35圖示了線性信號(hào)放大策略，使用了S-ADH和仲醇氧化酶(SAO)。
圖36圖示了指數(shù)信號(hào)放大，使用了S-ADH偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶(HBDH)、乙酰乙酸脫羧酶(ACD)，以及SAO。
圖37圖示了線性信號(hào)放大策略，使用了兩種不同的吡啶核苷酸依賴性的仲醇脫氫酶S-ADH-1(NADPH特異性仲醇脫氫酶)，S-ADH-2(NADH特異性仲醇脫氫酶)，以及D(NADH特異性心肌黃酶)和MED(電子介質(zhì))。
優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述定義在此所用的NAD(P)+是指“NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式)和NADP+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，氧化形式)中的一種或兩種?！痹诖怂玫腘AD(P)H是指“NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原形式)和(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原形式)中的一種或兩種?！睙燉０废汆堰识塑账嵋卜Q為3-氨甲?；?1-β-D-呋喃核糖-吡啶嗡氫氧根5’-酯和腺苷5’-焦磷酸鹽，內(nèi)鹽。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽也稱為3-氨甲酰基-1-β-D-呋喃核糖-吡啶嗡氫氧根5’，5’-酯和腺苷2’-(磷酸二氫鹽)5’-(焦磷酸三氫鹽)，內(nèi)鹽。
在此所用的，“ANNN”指“在NNN納米波長(zhǎng)測(cè)得的吸收值?！痹诖怂玫?，“εNNN”指“在NNN納米波長(zhǎng)測(cè)得的消光系數(shù)?！痹诖怂玫摹懊浮笔侵浮按呋δ艿纳锓肿?；”因此任何可以進(jìn)行稱為催化功能作為其主要催化活性的生物分子被命名為酶，與其他因素如來(lái)源、天然或加工后的結(jié)構(gòu)，大小等等無(wú)關(guān)。
在此所用的“鍍鉑的碳”，指用鉑披覆的碳，例如至少部分鉑披覆的碳納粒子。
在此所用的“光度的”指其中使用了光子的任何檢測(cè)方式，以及包括，但是不限制于，比色的、光譜測(cè)定的、分光光度的、發(fā)光為基礎(chǔ)的、化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的、電解制備的化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的、生物發(fā)光為基礎(chǔ)的，以及熒光為基礎(chǔ)的方法。
為了解決一些與患者健康維持相關(guān)的問(wèn)題，基于酶的生物傳感器已經(jīng)得到了發(fā)展，其可以將酶介導(dǎo)的丙酮新陳代謝與通過(guò)一種或多種信號(hào)介質(zhì)產(chǎn)生的電化學(xué)可檢測(cè)信號(hào)偶聯(lián)起來(lái)。任何可以與電化學(xué)檢測(cè)協(xié)同因子或副產(chǎn)物偶聯(lián)的丙酮特異性酶都適用于本發(fā)明的酶系統(tǒng)。在優(yōu)選實(shí)施例中，檢測(cè)生物樣品中丙酮的電化學(xué)生物傳感器包括至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)，以及該至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)和生物樣品中丙酮反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)方法。檢測(cè)方法可以是電化學(xué)的或非電化學(xué)的。丙酮特異性酶已經(jīng)描述了特異性地利用丙酮作為底物的許多主要來(lái)源于細(xì)菌的酶。這些酶已經(jīng)從以丙酮作為生長(zhǎng)唯一碳源和能源的需氧和/或厭氧細(xì)菌中獲得。
丙酮可以通過(guò)仲醇脫氫酶(S-ADH)作用在細(xì)菌中形成，仲醇脫氫酶是與兩條不同的丙酮代謝途徑中的一條有關(guān)的酶一種O2依賴性(利用氧氣)途徑，其中丙酮被氧化產(chǎn)生丙酮醇，一種是CO2依賴性(利用二氧化碳)途徑，其中丙酮轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸鹽。通過(guò)S-ADH催化的丙酮生成反應(yīng)是自由可逆的，并且通常需要輔酶，通常是NAD(H)或NADP(H)。通過(guò)氧化NAD(P)H還原丙酮為異丙醇(S-ADH催化的逆反應(yīng))的涉及氧化還原化學(xué)，通過(guò)其可以監(jiān)控丙酮的濃度(例如，通過(guò)NAD(P)H消耗的電化學(xué)檢測(cè)方法)。各種仲醇脫氫酶已經(jīng)得到純化和表征。被透徹研究的是從烴氧化(即利用丙烷)細(xì)菌獲得的那些S-ADH，其采用O2依賴性的丙酮代謝途徑。S-ADH酶還從與烴氧化(即丙烷衍生物代謝)不相關(guān)的微生物中分離得到或被描述。這些包括甲基細(xì)菌和酵母、產(chǎn)甲烷Archaea和發(fā)酵Archaea。在這些酶中，得自Thermonoanaerobiumbrockii的S-ADH可以熱處理粗制備物或純化形式購(gòu)買得的(可從Sigma Chemical Co.購(gòu)得，圣路易斯，密蘇里)。該酶已經(jīng)被充分表征，是NADPH特異性脫氫酶。
在一些異丙醇氧化細(xì)菌中，丙酮作為介質(zhì)形成，然后在O2依賴性單加氧酶催化反應(yīng)中經(jīng)過(guò)羥基化形成丙酮醇(羥基丙酮)。然后丙酮醇通過(guò)丙酮醇脫氫酶進(jìn)一步氧化成丙酮醛，或進(jìn)行碳-碳裂解反應(yīng)產(chǎn)生C1和C2片段。丙酮單加氧酶，是吡啶核苷酸依賴性酶，為丙酮傳感器(如前所述的)中的電化學(xué)檢測(cè)提供了必要條件。以丙酮醇作為介質(zhì)的丙酮代謝已經(jīng)在丙酮利用細(xì)菌的體外研究中得到了證實(shí)。此外，已經(jīng)確定P450單加氧酶在哺乳動(dòng)物中采用相同的機(jī)理(將丙酮氧化成丙酮醇)。適合用于丙酮特異性酶系統(tǒng)的丙酮單加氧酶是從小鼠(Musmusculus)分離到的細(xì)胞色素P450丙酮單加氧酶。丙酮單加氧酶已經(jīng)被報(bào)道為利用丙酮作為底物產(chǎn)生丙酮醇，可從Pan Vera公司(麥迪遜，威斯康星)購(gòu)得。參見(jiàn)F.Y.Bondoc等，通過(guò)細(xì)胞色素P450 2E1的丙酮分解代謝CYP2E1-null mice的研究。生化藥理學(xué)，58461-63(1999)。在細(xì)菌中響應(yīng)此活性的酶還沒(méi)有完全被表征。此外，通過(guò)將半乳糖氧化酶加入酶系統(tǒng)中，丙酮單加氧酶可以偶聯(lián)H2O2的生成；半乳糖氧化酶將丙酮醇氧化形成H2O2，其可以通過(guò)電化學(xué)或非電化學(xué)檢測(cè)。
包含丙酮單加氧酶活性的哺乳動(dòng)物P450細(xì)胞色素和P450還原酶可以從肝微粒體中制備得到。P450丙酮單加氧酶催化下列羥基化反應(yīng)P450單加氧酶通常由兩種酶組分組成，包括吡啶核苷酸依賴性還原酶和含有活性位點(diǎn)的氧化酶組分。NAD(P)H提供了必要還原劑用于O2活化以及將一個(gè)氧原子并入脂肪族烴底物中。用一些P-450單加氧酶，第三電子傳遞成分，細(xì)胞色素b5，將激活活性。通過(guò)丙酮單加氧酶反應(yīng)的丙酮依賴性NAD(P)H消耗可以進(jìn)行如下所述的電化學(xué)監(jiān)控，用于仲醇脫氫酶偶聯(lián)丙酮羧化酶的偶聯(lián)酶系統(tǒng)，如圖1所示。另外，可以通過(guò)伴隨的O2消耗來(lái)進(jìn)行反應(yīng)的電化學(xué)監(jiān)控，或通過(guò)如下所示的測(cè)量吸收值或NAD(P)H消耗的熒光來(lái)進(jìn)行光學(xué)監(jiān)控。
對(duì)于其他細(xì)菌，包括需氧的和厭氧的，丙酮代謝已經(jīng)被確定為產(chǎn)生乙酰乙酸鹽的CO2依賴性羧化反應(yīng)的過(guò)程。催化該反應(yīng)的酶丙酮羧化酶，最近已經(jīng)從兩種細(xì)菌來(lái)源純化為同系物。盡管丙酮羧化酶不是催化易于電化學(xué)檢測(cè)的反應(yīng)，但是該酶對(duì)丙酮具有高度特異性并且，根據(jù)本發(fā)明，可以和其他催化氧化還原反應(yīng)的酶(例如脫氫酶、氧化酶)偶聯(lián)。使用丙酮羧化酶偶聯(lián)酶用于電化學(xué)檢測(cè)的可行性在此公開(kāi)之前沒(méi)有報(bào)道過(guò)。
用于丙酮特異性酶系統(tǒng)的合適的丙酮羧化酶包括，但不限制于，從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株獲得的(在此作為X.autotrophicus Py2或X.autotrophicus st.Py2提及)(參見(jiàn)Sluis，M.K.和Ensign，S.A.，從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株獲得的丙酮單加氧酶的純化和鑒定，PNASUSA，948456-8462(1997))；從莢膜紅細(xì)菌B10獲得的(參見(jiàn)Sluis，M.K.等，從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株和莢膜紅細(xì)菌B10菌株獲得的丙酮單加氧酶的生物化學(xué)、分子，以及遺傳分析，細(xì)菌學(xué)雜志，184(11)2969-77(2002))；以及從胭脂紅分枝桿菌B276獲得的丙酮單加氧酶(參見(jiàn)Clark，D.D.和Ensign，S.A.，胭脂紅分枝桿菌B276中誘發(fā)的核苷酸依賴性丙酮單加氧酶的證明，細(xì)菌學(xué)雜志，181(9)2752-58(1999))。自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株已經(jīng)于2002年10月29日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏，ATCC編號(hào)為No.PTA-4799。ATCC位于大學(xué)路10801，馬納薩斯，弗吉尼亞20110-2209美國(guó)。以及可以通過(guò)馬納薩斯，弗吉尼亞20108美國(guó)1549郵箱聯(lián)系。該保藏是根據(jù)布達(dá)佩斯條約的要求進(jìn)行的。自養(yǎng)黃色桿菌Py2丙酮單加氧酶亞基的氨基酸序列如SEQ IDNO1、2和3所示；編碼這些亞基的核苷酸序列在基因庫(kù)中可以得到(參見(jiàn)編號(hào)AY055852)。莢膜紅細(xì)菌B10丙酮單加氧酶基因的氨基酸序列如SEQ IN NO4、5和6所示；編碼這些亞基的基因核苷酸序列可以在“莢膜紅細(xì)菌”測(cè)序方案的網(wǎng)站得到(參見(jiàn)http://rhodol.uchicago.edu)。自養(yǎng)黃色桿菌Py2和莢膜紅細(xì)菌B10的丙酮單加氧酶都是α/β/γ異三聚體，彼此間具有約80％的全序列同源性，以及顯示了催化丙酮相同反應(yīng)的功能同一性。
丙酮特異性酶系統(tǒng)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，提供了包含一種或多種丙酮特異性酶系統(tǒng)的呼吸丙酮診斷設(shè)備。這樣的設(shè)備優(yōu)選用于監(jiān)控哺乳動(dòng)物中的酮生成。為了發(fā)展本發(fā)明，存在丙酮時(shí)，氧化的嘧啶核苷酸作為協(xié)同因子或產(chǎn)生了過(guò)氧化氫作為副產(chǎn)物，使反應(yīng)可以電化學(xué)檢測(cè)的情況下，研究了許多氧化還原酶系統(tǒng)。這些氧化還原酶系統(tǒng)包括，例如1)仲醇脫氫酶(S-ADH)催化丙酮還原伴隨NADPH消耗；2)仲醇脫氫酶(S-ADH)催化丙酮還原伴隨NADH消耗；3)丙酮羧化酶偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶消耗NADPH；4)丙酮羧化酶偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶消耗NADH；5)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)NADPH消耗；6)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)NADH消耗；7)S-ADH反應(yīng)NADP+生成偶聯(lián)H2O2生成；8)S-ADH反應(yīng)NAD+生成偶聯(lián)H2O2生成；9)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)H2O2生成；10)丙酮羧化酶偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶反應(yīng)NADP+生成偶聯(lián)H2O2生成；11)丙酮羧化酶偶聯(lián)β-羥基丁酸鹽脫氫酶反應(yīng)NAD+生成偶聯(lián)H2O2生成；12)丙酮單加氧酶偶聯(lián)NADPH氧化；13)丙酮單加氧酶偶聯(lián)NADH氧化；14)丙酮單加氧酶偶聯(lián)H2O2生成；以及15)丙酮單加氧酶催化的NAD(P)+生成偶聯(lián)H2O2生成。
在所有這些酶系統(tǒng)中，嘧啶核苷酸或過(guò)氧化氫是可電化學(xué)檢測(cè)的，然而也可以使用本領(lǐng)域公知的其他檢測(cè)方法。
酶作為生物活性界面的用途是本領(lǐng)域公知的，而且這樣的界面用于檢測(cè)酶-底物反應(yīng)電子傳遞的分析方法中。酶如氧化還原酶的直接電活化可以刺激酶底物的生物電催化的氧化或還原。電極和特定氧化還原酶之間的電子快速傳遞導(dǎo)致電流產(chǎn)生，對(duì)應(yīng)于底物和生物催化劑之間電子交換的轉(zhuǎn)換率。換句話說(shuō)，系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換電流與酶底物濃度相關(guān)聯(lián)。生物傳感器中氧化還原蛋白和其中所含電極支柱的電接觸可以通過(guò)電極表面的直接電轉(zhuǎn)換來(lái)傳遞。氧化還原酶和電極之間缺乏直接電交流的可以通過(guò)活性電荷載體介質(zhì)的電子傳遞來(lái)實(shí)現(xiàn)電接觸。電子繼電器在電極表面可以被氧化或還原，氧化的或還原的繼電器擴(kuò)散進(jìn)入酶產(chǎn)生了對(duì)于作為電子傳遞媒介的活性氧化還原中心而言的短電子傳遞距離，因此，生物催化劑電活化。
檢測(cè)手段丙酮特異性酶系統(tǒng)，作用于丙酮底物，直接產(chǎn)生了可電化學(xué)或非電化學(xué)檢測(cè)的產(chǎn)物或副產(chǎn)物，或酶系統(tǒng)還包括至少一種其他的成分。其他的成分包括利用原始酶催化丙酮反應(yīng)的產(chǎn)物或副產(chǎn)物形成酶途徑的一種或多種其他酶，因此產(chǎn)生光度或電化學(xué)可檢測(cè)的產(chǎn)物或副產(chǎn)物；或至少一種信號(hào)介質(zhì)；或其他酶和信號(hào)介質(zhì)都有。信號(hào)介質(zhì)可以選自，例如，指示劑，如pH變化指示劑；電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)；光度測(cè)定介質(zhì)，以及其他成分。
在本發(fā)明的電化學(xué)實(shí)施例中，在酶促反應(yīng)的過(guò)程中，丙酮特異性氧化還原酶或酶系統(tǒng)選自那些利用了可電化學(xué)檢測(cè)協(xié)同因子的，如NADH，或產(chǎn)生了副產(chǎn)物的，如H2O2。這些酶系統(tǒng)可以特異性地檢測(cè)生物樣品中的丙酮，如呼吸或生物流體。然而，丙酮的檢測(cè)不受限于電化學(xué)方法，而且本發(fā)明的酶系統(tǒng)可以用于其他類型的設(shè)備，例如采用公知的UV、熒光，或測(cè)量丙酮特異性酶-底物相互作用的其他合適方法的設(shè)備。
非電化學(xué)檢測(cè)手段非電化學(xué)檢測(cè)包括，例如，本領(lǐng)域公知的任何測(cè)熱的或測(cè)定光度的檢測(cè)方式(例如，任何測(cè)熱的、光譜測(cè)定的、分光光度法的、發(fā)光為基礎(chǔ)的、化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的，或熒光為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。)熒光檢測(cè)設(shè)備具有以下最低要求必須是不透光的以消除環(huán)境發(fā)出的干擾光，為了防止光褪色其螢石必須保存在暗處(即增加保存壽命)，以及其光學(xué)器件必須是90°角放置。二極管發(fā)射所期望的激發(fā)波長(zhǎng)可以起光源的作用，以及PMT可以起檢測(cè)儀的作用。這些要求不需要闡述，因?yàn)槲炇募ぐl(fā)和發(fā)射的λmax是公知的，而且這些僅僅是對(duì)波長(zhǎng)的要求。與用于酶電化學(xué)設(shè)備相同的呼吸收集和丙酮轉(zhuǎn)化儀器可用于熒光設(shè)備中。用于黃曲霉毒素的便攜式熒光檢測(cè)儀已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述(MACarlson等，用于黃曲霉毒素的自動(dòng)化手提式生物傳感器，Biosens.Bioelectr.14841(2000))，所以存在便攜式熒光檢測(cè)儀的先例。
直接的和間接的熒光對(duì)呼吸和體液中的丙酮都能檢測(cè)。丙酮特異性酶和它們的協(xié)同因子可以使用常規(guī)的捕集技術(shù)將其固定在一次性檢測(cè)條上。當(dāng)丙酮通過(guò)固定化的介質(zhì)擴(kuò)散至酶時(shí)，丙酮將發(fā)生化學(xué)變化。不幸地，丙酮本身不是熒光的，不能在檢測(cè)設(shè)備內(nèi)部進(jìn)行衍生。因此需要衍生另一反應(yīng)物和需要將熒光團(tuán)或螢石加入系統(tǒng)中來(lái)監(jiān)控檢測(cè)。對(duì)于仲醇脫氫酶系統(tǒng)，可以監(jiān)控NADH消耗，而丙酮羧化酶系統(tǒng)可以使用ATP-類似物。隨著NADH或ATP-類似物被消耗，熒光強(qiáng)度應(yīng)該減弱。因?yàn)楸磻?yīng)是化學(xué)計(jì)量的，熒光強(qiáng)度與丙酮濃度成比例。H2O2生成系統(tǒng)可以利用H2O2和添加的螢石。在這些系統(tǒng)中，H2O2的產(chǎn)生導(dǎo)致了與丙酮濃度成比例的熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)。
我們已經(jīng)證實(shí)用342nm光激發(fā)時(shí)NADH在pH7.6，100mM磷酸緩沖液中直接發(fā)射約為470nm的光；這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的相一致(MACarlson等，2000)。此外，NADH直接熒光具有0.1-10μM的線性工作范圍，不依賴于pH6-13，每攝氏度強(qiáng)度減弱1.6％，pH低于10時(shí)在陽(yáng)離子和酶存在下，顯示稍微改變的熒光強(qiáng)度(參見(jiàn)PW Carr & LD Bowers，分析和臨床化學(xué)中的固定化酶，在化學(xué)分析。關(guān)于分析化學(xué)及其應(yīng)用的一系列專題論文(PJ Elving & JD Winefordner，編輯；vol56，p.122(Wiley-Interscience，紐約，1980)，以及其中所包括的參考文獻(xiàn))。利用直接HADH熒光來(lái)監(jiān)控酶活性在若干組中都有描述(AKWillians & JT Hupp，溶膠凝膠包裹乙醇脫氫酶作為多用的、環(huán)境穩(wěn)定的傳感器用于乙醇和醛，J.Am.Chem.Soc.1988，1204366；以及VPIordanov等，用于NADH熒光分析的硅薄膜UV濾光器，Sens.Actuat.A，2002，97-98161)。
NADH的間接熒光可以使用染料若丹明123檢測(cè)。在激發(fā)態(tài)NADH和若丹明123之間發(fā)生了非輻射能量傳遞(也稱為熒光共振能量傳遞，F(xiàn)RET)。FRET是用于檢測(cè)兩種物質(zhì)之間接近性的公知技術(shù)，即利用FRET作為在體外和體內(nèi)的“分子衡量標(biāo)準(zhǔn)”。在丙酮特異性酶系統(tǒng)的范圍內(nèi)，供體熒光團(tuán)，如NADH，將其激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移至受體熒光團(tuán)，若丹明123。(RP Haugland，熒光探針和研究產(chǎn)物手冊(cè)，2002(第9版；MolecularProbes，Inc.；尤金，俄勒岡)；K Van Dyke等編輯。發(fā)光生物工藝學(xué)。設(shè)備和應(yīng)用，2002(CRC出版社；伯克萊屯，佛羅里達(dá))以及其中所包括的參考文獻(xiàn))。NADH-若丹明123FRET方法已經(jīng)成功地運(yùn)用于其他酶試驗(yàn)中(MH Gschwend等，完整的人類肌管中線粒體NADH含量的光學(xué)檢測(cè)，Cell.Mol.Biol.47OL95(2001)；H.Schneckenberger等，在醫(yī)學(xué)診斷和光生物學(xué)中的時(shí)間閘門(mén)顯微鏡成像和光譜學(xué)，Opt.Eng.332600(1994))。生物發(fā)光共振能量傳遞，或BRET，也可以和根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)偶聯(lián)使用。在BRET中，受體熒光團(tuán)由熒光素酶替代。在底物存在的情況下，熒光素酶的生物發(fā)光激發(fā)受體熒光團(tuán)。BRET也已經(jīng)應(yīng)用于體外和體內(nèi)(K Van Dyke等，2002)。
ATP可以用熒光團(tuán)衍生用于間接熒光。若干可購(gòu)得的染料包括BODIPY ATP和三硝基苯基ATP(Haugland，2002)。當(dāng)結(jié)合到酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，這些類似物改變其熒光強(qiáng)度或成為熒光團(tuán)。
H2O2的間接熒光檢測(cè)已經(jīng)報(bào)道過(guò)(Carr & Bowers，1980)。這些方法利用將過(guò)氧化物還原成H2O以及自身被氧化的染料。高香草酸(4-羥基-3-苯乙酸)和p-羥基苯乙酸最常用于臨床化學(xué)(Carr & Bowers，1980)?？少?gòu)得的試劑盒使用了Amplex紅來(lái)熒光檢測(cè)H2O2(Haugland，2002)。
任何熒光染料和熒光可檢測(cè)的酶底物或協(xié)同因子類似物可以用于熒光設(shè)備中來(lái)檢測(cè)呼吸或體液中的丙酮。
化學(xué)發(fā)光(CL)和電解制備的化學(xué)發(fā)光(ECL)(在此都稱作“(E)CL”)廣泛地用于醫(yī)學(xué)診斷和分析化學(xué)(C Dodeigne等，化學(xué)發(fā)光作為診斷工具回顧，Talanta 2000，51415；KA Fahnrich等，電解制備的化學(xué)發(fā)光在化學(xué)分析中的最新應(yīng)用，Talanta 2001，54531)?；诿傅?E)CL系統(tǒng)是靈敏的和特異性的，許多CL系統(tǒng)通過(guò)酶循環(huán)來(lái)檢測(cè)H2O2(Dodeigne等，2000)。(E)CL可以在很大的線性范圍內(nèi)檢測(cè)皮摩爾(pM；10-12M)濃度的分析物(Dodeigne等，2000，F(xiàn)ahnrich等，2001)。(E)CL設(shè)備可以根據(jù)以下的原理來(lái)構(gòu)造。因?yàn)榉磻?yīng)自身發(fā)射光，(E)CL設(shè)備不需要光源。光電倍增管(PTM)可以起檢測(cè)器的作用；(E)CL是暗適應(yīng)的肉眼可見(jiàn)的。電池可以作為ECL的電源。ECL需要電極和應(yīng)用電壓的來(lái)源。如熒光檢測(cè)設(shè)備，(E)CL設(shè)備需要是不透光的以及其反應(yīng)物需要避光保存直至使用。還有如熒光，(E)CL需要衍生的反應(yīng)物或另外的酶以及測(cè)量丙酮的試劑。(E)CL設(shè)備可以和一次性檢測(cè)條一起使用(BD Leca等，絲網(wǎng)印刷電極作為一次性的或可重復(fù)利用的光學(xué)設(shè)備用于氨基苯二酰肼的電致化學(xué)發(fā)光，Sens.Actuat.B.2001，74190)，以及可以小型化(Y Lv等，使用載體氣流的基于微型反應(yīng)器的化學(xué)發(fā)光生物傳感器芯片用于人尿中尿酸的檢測(cè)，Analyst 2002，1271176)。
光學(xué)電極(或光電極)可以使用根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)來(lái)制造。例如，可以使用光電極，如使用了ECL的用于葡萄糖的光電極(參見(jiàn)CH Wang等，聚合的氨基苯二酰肼，鐵(II)tris(5-氨基鄰二氮雜菲)和電極表面的葡萄糖氧化酶的共固定化，以及其作為葡萄糖光電極的應(yīng)用，Analyst 2002，1271507))。
最常用的CL系統(tǒng)涉及H2O2或其他活性氧物質(zhì)的檢測(cè)(Carr & Bowers，1980；Haugland，2002；Dodeigne等，2000；K Van Dyke等，2002，以及其中包括的參考文獻(xiàn))。典型的系統(tǒng)是氨基苯二酰肼-過(guò)氧化物酶。在基礎(chǔ)溶液中，H2O2氧化氨基苯二酰肼成激發(fā)態(tài)的氨基鄰苯二甲酸鹽離子；激發(fā)態(tài)的氨基鄰苯二甲酸鹽離子發(fā)射425nm光子回到其基態(tài)。當(dāng)用于醫(yī)學(xué)診斷時(shí)，該反應(yīng)用辣根過(guò)氧物酶(HRP)催化(Carr & Browers，1980；Dodeigne等，2000)。因此任何產(chǎn)生H2O2或需要可以和另外的試劑反應(yīng)生成H2O2的協(xié)同因子的酶系統(tǒng)可以用于CL設(shè)備。在此所描述的H2O2產(chǎn)生系統(tǒng)可以直接使用氨基苯二酰肼-HRP用于丙酮檢測(cè)。這些酶循環(huán)運(yùn)行，隨著時(shí)間過(guò)去增加了光發(fā)射，因?yàn)榈孜锸沁B續(xù)循環(huán)的(Dodeigne等，2000)。由于氨基苯二酰肼本身是經(jīng)常用于CL，為了提高靈敏度，其改進(jìn)的類似物也可用于根據(jù)本發(fā)明的CL基底的檢測(cè)儀，替代氨基苯二酰肼。這樣的類似物實(shí)例是那些在Carr & Browers，1980；Dodeigne等，2000中描述的。
使用CL的NADH檢測(cè)是常用技術(shù)(Dodeigne等，2000)。例如，在1-甲氧基-5-甲硫酸-甲基吩嗪嗡存在下，使用氨基苯二酰肼-過(guò)氧化物酶系統(tǒng)，NADH將O2還原成H2O2，其產(chǎn)生了光(Dodeigne等，2000)。對(duì)于丙酮監(jiān)測(cè)儀，使用這種系統(tǒng)，周圍氣體中的O2是足夠測(cè)量丙酮的。NADH還可以和氧化的亞甲基藍(lán)反應(yīng)形成和氨基苯二酰肼反應(yīng)的H2O2(Carr & Browers，1980)。NADH還可以作為CL猝滅劑。在NADH和HRP存在下，底物ALPDO的熒光強(qiáng)度減弱(Van Dyke等，2002)。NADH還可以和Ru(bpy)32+一起用于ECL(ES Jin等，用于NADH的電致化學(xué)發(fā)光成像纖維電極化學(xué)傳感器，Electroanal，2001，13(15)1287)。若丹明B異硫氰酸鹽也可以用于ECL的H2O2檢測(cè)(Fahnrich等，2001)。ECL還具有另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)，通過(guò)使用合適的抗氧化還原的電極，電活化粒種可以在電極表面再生。再生可以保存反應(yīng)物以及使傳感器經(jīng)久耐用和/或“無(wú)試劑”。所有這些酶系統(tǒng)可以用于和根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)連接的(E)CL設(shè)備。
CL可以廣泛地用于簡(jiǎn)單而靈敏地量化ATP(Carr & Browers，1980)。熒光素酶催化ATP和熒光素反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，其通過(guò)發(fā)射562nm光子恢復(fù)到基態(tài)(Carr & Browers，1980；Haugland，2002)。該反應(yīng)的量子產(chǎn)量非常高；可以檢測(cè)10-14mol的ATP。用于該反應(yīng)的試劑盒可購(gòu)得的(Haugland，2002)。因?yàn)闊晒馑孛甘且鹞灮鹣x(chóng)“發(fā)光”的酶，因此該反應(yīng)歸為生物發(fā)光。天然的和重組的熒光素酶都是可購(gòu)得的，一些研究小組已經(jīng)報(bào)道使用生物發(fā)光ATP試驗(yàn)來(lái)量化生物分析物(P Willemsen等，特異的生物發(fā)光細(xì)胞系用于檢測(cè)動(dòng)物肉中產(chǎn)生的甾類激素促效藥的用途(螞蟻)，Anal.Chem.Acta2002，473119；S JDexter等，生物發(fā)光ATP試驗(yàn)來(lái)定量混合種群中哺乳動(dòng)物和細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的發(fā)展，Biomat.2003，24nb27)。除了氨基苯二酰肼-HRP系統(tǒng)，H2O2還可以使用過(guò)氧草酸衍生物來(lái)檢測(cè)(Dodeigne等，2000)。H2O2還可以用鐵氰化物作為催化劑的CL非酶促檢測(cè)(Dodeigne等，2000)。在這些(E)CL系統(tǒng)中，在此所描述的丙酮特異性酶可以產(chǎn)生H2O2或需要可以被利用生成H2O2的協(xié)同因子。
光學(xué)生物傳感器使用光度檢測(cè)(即，吸收值，熒光)通過(guò)并入傳感器的酶系統(tǒng)催化反應(yīng)所消耗的底物或形成的產(chǎn)物。所描述的丙酮特異性酶反應(yīng)可以通過(guò)若干光度方法來(lái)監(jiān)控，即通過(guò)測(cè)量對(duì)于嘧啶核苷酸依賴性酶在340nm的NAD(P)H吸收值或?qū)τ贖2O2生成酶系統(tǒng)的醌亞胺染料的吸收值。對(duì)于后者，通過(guò)添加過(guò)氧化物酶催化伴隨染料化合物氧化的H2O2還原，在特定的波長(zhǎng)氧化吸收，可以檢測(cè)H2O2。過(guò)氧化物酶(例如，可購(gòu)得的辣根過(guò)氧化物酶)通常具有寬的底物特異性，因此可以使用多種不同的電子供體化合物?？梢酝ㄟ^(guò)熒光檢測(cè)來(lái)測(cè)定NAD(P)H的消耗(在305nm激發(fā)，450nm發(fā)射)。
熱量測(cè)定法可以作為檢測(cè)手段用于根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性傳感器?；瘜W(xué)反應(yīng)通常是放熱或吸熱的；即當(dāng)它們發(fā)生時(shí)釋放或吸收熱。熱量計(jì)通過(guò)測(cè)量反應(yīng)介質(zhì)溫度的變化來(lái)檢測(cè)和測(cè)量這種熱(KRammanathan & B Danielsson，熱生物傳感器的原理和應(yīng)用，BiosensBioelectr.16417，(2001)；B Danielsson，酶熱敏電阻設(shè)備。在生物傳感器原理和應(yīng)用。Vol.15，pp.83-105，LJ Blim & PR Coulet編輯；生物工藝技術(shù)系列，15卷；Marcel Dekker，Inc紐約，1991，pp.83-105，以及其中所包括的參考文獻(xiàn))。因此，丙酮特異性酶或酶系統(tǒng)的作用可以用通過(guò)熱量監(jiān)測(cè)。已經(jīng)設(shè)計(jì)了對(duì)檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化足夠靈敏的熱量計(jì)，以及熱量測(cè)定法已經(jīng)用于詳細(xì)地研究許多酶促反應(yīng)(M.J.Todd & JGomez，使用熱量測(cè)定法的酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定用于酶活性的常規(guī)試驗(yàn)？Anal.Biochem.2001，296179(2001))。
熱量測(cè)定法的主要優(yōu)勢(shì)是不需要分析所需要的衍生作用(Danielesson，1991)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)反應(yīng)涉及熱交換，以及這種熱是可檢測(cè)的，不需要發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、“介質(zhì)”，或其他分析物的修飾。試劑和分析物可以“按原樣”使用。這就能夠分析缺少發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，和/或，衍生或結(jié)合電活化粒種困難或不可能的反應(yīng)。
小型化的或基于芯片的熱傳感器已經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道(Ramanathan & Danieleeon，2001；B Xie & B Danielsson，在硅芯片上制造的熱微型生物傳感器的發(fā)展。Sens.Actuat.B 6127(1992)；PBataillard等，集成的硅熱電堆作為生物傳感器用于葡萄糖、尿素，和青霉素的熱監(jiān)控。Biosen.Bioelect.889(1993))。這些設(shè)備的范圍從獨(dú)立式膜上完全排列的熱電堆到造在硅/玻璃微通道上的成組熱電堆。這些設(shè)備已經(jīng)用于檢測(cè)特異的，單一的酶促反應(yīng)(Danielsson，1991；Xie & Danielsson，1992；Bataillard等，1993)。此外，已經(jīng)報(bào)道了用于葡萄糖的兩組熱傳感器(B Xie等，用測(cè)熱的微型生物傳感器進(jìn)行全血糖的快速檢測(cè)，Sens.Actuat.B 15-16141(1993)；MJMuehlbauer等，熱電酶葡萄糖傳感器的模型，Anal.Chem.6177(1989)；BC Towe & EJ Guibeau，醫(yī)學(xué)設(shè)備設(shè)計(jì)，1998，http//lsvl.la.asu.edu/asubiotech/slideshow/slide19.html(2002年1月訪問(wèn))。使用常規(guī)熱量計(jì)的初步實(shí)驗(yàn)表明了仲醇脫氫酶丙酮反應(yīng)是放熱的(數(shù)據(jù)未顯示)。
對(duì)于在此描述的丙酮監(jiān)測(cè)儀，丙酮特異性酶及其協(xié)同因子可以通過(guò)常規(guī)捕集方法將其固定在熱電堆上。對(duì)于熱量測(cè)定法，和酶以及反應(yīng)物結(jié)合的電化學(xué)檢測(cè)、電化學(xué)介質(zhì)，以及“光學(xué)的”介質(zhì)(發(fā)光團(tuán))是不需要的。反應(yīng)包括不需要修飾或衍生可以直接監(jiān)測(cè)丙酮。當(dāng)呼吸或流體樣品中丙酮通過(guò)固定化介質(zhì)散發(fā)和酶接觸時(shí)，丙酮將發(fā)生化學(xué)變化。該反應(yīng)將產(chǎn)生或吸收熱，導(dǎo)致溫度變化。該溫度和參照熱電堆的溫度相比可以量化該熱量；測(cè)量是有差別的。釋放或吸收的熱量與分析物的濃度成比例。
對(duì)于呼吸收集，將丙酮從氣態(tài)轉(zhuǎn)化為液態(tài)，即，凝聚，是放熱的。參照或雙熱電堆可以補(bǔ)償這個(gè)熱量。因此酶測(cè)熱丙酮監(jiān)測(cè)儀可以使用如酶電化學(xué)丙酮監(jiān)測(cè)儀的相同呼吸收集裝置除了額外的雙熱電堆。
完整的酶測(cè)熱設(shè)備需要足夠的絕緣以防止和周圍的環(huán)境熱交換。除了電化學(xué)檢測(cè)，該設(shè)備的其他方面，如酶穩(wěn)定性、特異性、設(shè)備輕便性等等，與此文件中所描述的酶電化學(xué)設(shè)備是相同的。
因此，根據(jù)本發(fā)明的用于生物傳感器中得到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的有用方法不僅包括電化學(xué)(測(cè)量電流的或測(cè)定電勢(shì)的)，而且包括光學(xué)的或光度的(包括熱量測(cè)定法、熒光為基礎(chǔ)的技術(shù)，或化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的技術(shù))，以及測(cè)熱的方法，所有這些可應(yīng)用于丙酮傳感器信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
因此，盡管已經(jīng)在此詳細(xì)地描述和舉例說(shuō)明了電化學(xué)檢測(cè)方式，本發(fā)明的酶系統(tǒng)不受限于用于使用了電化學(xué)檢測(cè)策略的生物傳感器中。其他檢測(cè)策略可以合適地并入對(duì)于生物樣品中的丙酮是特異性的生物傳感器中。光度試驗(yàn)，如可以使用反應(yīng)溶液中吸收光數(shù)量隨著時(shí)間改變的試驗(yàn)。同樣，熒光改變或樣品濁度改變的試驗(yàn)也可用于測(cè)量丙酮特異性酶-底物反應(yīng)。如下文所描述的光度試驗(yàn)。Bergmeyer已經(jīng)描述了H2O2的氧化還原電位和輔酶測(cè)熱的/測(cè)光度的檢測(cè)。John在“光度試驗(yàn)”中已經(jīng)對(duì)用于酶活性的光度試驗(yàn)進(jìn)行了概述。Hart等1999年在電分析上公開(kāi)的文獻(xiàn)中披露了NADH消耗測(cè)量電極。Vanysek概述了氧化還原電勢(shì)，以及Voet & Voet披露了適合用于生化應(yīng)用的各種化合物的氧化還原電勢(shì)。
使用S-ADH偶聯(lián)丙氨酸脫氫酶的酶系統(tǒng)成功地用分光光度監(jiān)測(cè)NADH生成。此外，因?yàn)榉磻?yīng)還產(chǎn)生了銨離子，用于NH4+的光學(xué)傳感器可以作為檢測(cè)手段用于這樣的酶系統(tǒng)。TD Rhines和MA Arnold描述了這樣的一種光學(xué)手段，基于檢測(cè)氨氣的用于尿素的纖維-光學(xué)生物傳感器，Anal Chem.Acta，1989，227387；若干基于酶的測(cè)量電流的NH4+傳感器是可購(gòu)得的。對(duì)于丙酮檢測(cè)，氨的產(chǎn)生可以與如上的仲醇脫氫酶系統(tǒng)偶聯(lián)；然后氨濃度與丙酮濃度成比例。另外一種偶聯(lián)丙酮與氨產(chǎn)生的酶反應(yīng)式如下
第二個(gè)反應(yīng)式可以用于光學(xué)地或電流地測(cè)量丙酮。此外，NADH是再循環(huán)的。同樣，丙酮羧化酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶的酶系統(tǒng)產(chǎn)生NH4+，因此可以光學(xué)地或電流地檢測(cè)，以及與丙酮濃度相關(guān)聯(lián)。
電化學(xué)檢測(cè)手段電流生物傳感器通過(guò)酶促產(chǎn)生或消耗氧化還原活性化合物在兩個(gè)電極之間產(chǎn)生電流來(lái)工作。已經(jīng)描述了電流丙酮生物傳感器反應(yīng)式的若干實(shí)例，其中對(duì)丙酮存在的酶催化消耗或產(chǎn)生NAD(P)H或H2O2。在轉(zhuǎn)換器是H2O2的實(shí)例中，一種通過(guò)電流監(jiān)控反應(yīng)的可替代手段需要使用Clark型氧電極并檢測(cè)O2濃度下降。例如，在仲醇脫氫酶(S-ADH)偶聯(lián)H2O2生成的情況下，酶系統(tǒng)催化下列反應(yīng)
然后在陰極氧被還原/消耗，產(chǎn)生電極和主體溶液(bulk solution)之間濃度梯度。電化學(xué)反應(yīng)的速度依賴于溶液中氧的濃度。
電勢(shì)生物傳感器使用了離子特異性電極，其中所測(cè)的酶反應(yīng)過(guò)程中釋放或消耗離子(例如，H+、CN-、NH4+)(1、2、3)。例如，可以使用用于測(cè)量丙酮濃度的電勢(shì)傳感器，其中NH4+生成與由S-ADH和丙氨酸脫氫酶催化的反應(yīng)偶聯(lián)，如下所示
(已經(jīng)得到該系統(tǒng)的光度數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)其用于丙酮特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)用性參見(jiàn)以下“結(jié)果”部分的討論)。
一個(gè)可以利用丙酮羧化酶的非常相似的系統(tǒng)(“β-OH-butyratedehydr.”即“β-羥基丁酸鹽脫氫酶”)
可以使用的電化學(xué)生物傳感器的另一類型是光可尋址的電勢(shì)傳感器。在這樣設(shè)備的一個(gè)實(shí)例中，丙酮特異性酶系統(tǒng)可以用于(如，將其固定在表面)所述的電勢(shì)傳感方式，用于感知葡萄糖，在A Seki等，用于尿素、青霉素和葡萄糖的基于光可尋址的電勢(shì)傳感器的生物傳感器，Anal.Chem.Acta373(1)9-13(1998年11月2日)。
在設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的丙酮特異性生物傳感器中，可以使用各種酶促副產(chǎn)物和/或因子用于產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。一組包括有機(jī)協(xié)同因子，如NAD、NADH、NADP、NADPH、FAD、FADH、FMN、FMNH、輔酶A、輔酶Q、TTQ(色氨酸色氨酰醌)以及PQQ(吡咯并喹啉醌)。例如，PQQ依賴性脫氫酶可以氧化異丙醇。該反應(yīng)的電子可以通過(guò)PQQ傳遞，其被還原，在電極被氧化或通過(guò)中介的酶。也可以使用其他維生素。
本發(fā)明中有用的酶促反應(yīng)副產(chǎn)物包括過(guò)氧化氫和銨。
高能分子也可以用于本發(fā)明，偶聯(lián)丙酮代謝產(chǎn)生電化學(xué)測(cè)量信號(hào)，包括ATP、ADP、AMP、GTP、GDP以及GMP。這些分子或磷酸鹽都不能直接檢測(cè)，但是可以通過(guò)偶聯(lián)酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧化還原副產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)。
這些副產(chǎn)物、協(xié)同因子以及高能分子還可以通過(guò)上述的非電化學(xué)手段來(lái)檢測(cè)。
信號(hào)介質(zhì)電子傳遞介質(zhì)是氧化還原可逆的物質(zhì)，可以用于酶催化反應(yīng)中的(即從或到)電極電勢(shì)表面和有機(jī)物質(zhì)(如協(xié)同因子)之間的電子傳遞。電子傳遞介質(zhì)的實(shí)例包括二茂鐵及衍生物、鐵氰化物、對(duì)苯二酚、苯醌以衍生物、2，6-二氯靛酚、亞甲基藍(lán)、苯二胺及衍生物、吩惡嗪及衍生物(例如，Meldola藍(lán)，即8-二甲氨基-2，3-苯并吩惡嗪)，以及吩嗪烷基硫酸鹽(例如，吩嗪甲基硫酸鹽、吩嗪乙基硫酸鹽)。在所給的實(shí)施例中，可以使用電子傳遞介質(zhì)中的一種或一種以上物質(zhì)。
電子傳遞介質(zhì)可以用于提高所給酶偶聯(lián)電極系統(tǒng)中電子傳遞的動(dòng)力學(xué)，因?yàn)橛袡C(jī)協(xié)同因子可以輕易地削弱檢測(cè)儀的功能。這種削弱是由于在有機(jī)物質(zhì)和電極電勢(shì)表面之間單獨(dú)地傳遞多電子產(chǎn)生自由基而導(dǎo)致的。這些自由基然后在電勢(shì)表面呈現(xiàn)二聚體和/或多聚體形式，污濁了電極的表面，因此抑制了有效的電子傳遞?？梢允褂秒娮觽鬟f介質(zhì)來(lái)避免這種電極的污濁。電子傳遞介質(zhì)可以用于期望電極電壓變換的情況中，例如，用于沒(méi)有這種介質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)選電壓恰好在該電勢(shì)下產(chǎn)生了太多電子干擾“噪聲”?？梢约尤腚娮觽鬟f介質(zhì)為了使所使用的電壓移位至不同的電壓范圍，在其發(fā)生較少的噪聲?？捎糜诠潭ɑ?，如葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶等等，的擴(kuò)散電子傳遞介質(zhì)實(shí)例在Willner和Katz的表5中列出。
多電子傳遞中用于其還原形式，例如，NADH、NADPH、FADH、FMNH、輔酶Q、PQQ，的優(yōu)選介質(zhì)包括，例如二茂鐵及衍生物鐵氰化物、對(duì)苯二酚、苯醌以衍生物、2，6-二氯靛酚、亞甲基藍(lán)、苯二胺及衍生物、吩惡嗪及衍生物(例如，Meldola藍(lán)，即8-二甲氨基-2，3-苯并吩惡嗪)，以及吩嗪烷基硫酸鹽(例如，吩嗪甲基硫酸鹽、吩嗪乙基硫酸鹽)。
可以用于產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)的第二組介質(zhì)因子包括有機(jī)協(xié)同因子，例如Pt、Os、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Mo，以及W(參見(jiàn)Holm等，生物學(xué)中金屬位點(diǎn)的特征，Chem.Rev.1996.96，p.2239-2314)。一些有用的酶含有血紅素中心，因此含有鐵(例如，細(xì)胞色素P450單加氧酶)。其他有用的是胺氧化酶，其中含有Cu。
在可替換的實(shí)施例中，為了和酶促反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物或副產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，可以將“光度介質(zhì)”加入酶系統(tǒng)，然后產(chǎn)生可以，例如，光度、比色、熒光，或(UV或IR)光譜檢測(cè)的衍生物。因此，添加這樣的“光度介質(zhì)”可以使酶反應(yīng)結(jié)果的轉(zhuǎn)換可以表征，即產(chǎn)物或副產(chǎn)物至光度信號(hào)。例如，在酶促催化的氧化還原反應(yīng)中，顯色的氧化還原指示劑如，例如，四唑鹽，可以用作光度指示劑。許多這樣顯色的氧化還原指示劑是本領(lǐng)域公知的。四唑鹽的實(shí)例包括，但不限制于，3-(4，5-二甲噻唑-2-某基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT溴化物)；3-(4，5-二甲噻唑-2-某基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，內(nèi)鹽(MTS；可從Promega Corp.，購(gòu)得，麥迪遜，威斯康星)；以及 (5-氰基-2，3-二甲苯基四唑氯化物)(CTC)。這樣的光度介質(zhì)可用于，例如，將電子傳遞介質(zhì)的氧化還原“信號(hào)”轉(zhuǎn)移至光度檢測(cè)信號(hào)。
酶系統(tǒng)的酶和其他成分可以固定于安置于電極上的凝膠層中。任何各種本領(lǐng)域公知的凝膠可用于電極上生物制劑的固定化。例如，如PCT/US02/16140中所述的方法(2002年5月21日申請(qǐng))可以用于將丙酮特異性酶系統(tǒng)中的生物制劑固定于電極上的聚氨酯水凝膠中。
酶檢測(cè)和多酶系統(tǒng)除了監(jiān)控樣品中的丙酮本身，具有用于檢測(cè)特定生物樣品中多底物的多于一種酶系統(tǒng)的丙酮特異性酶系統(tǒng)可以用于生物傳感器。例如，連接丙酮特異性酶系統(tǒng)的電極可以使乙醇檢測(cè)儀中出來(lái)的丙酮信號(hào)減少。這樣的設(shè)置可以安置在矩陣中，其中至少兩種不同檢測(cè)方式或至少兩種不同檢測(cè)儀可以用于檢測(cè)乙醇和丙酮。這樣的陣列對(duì)于校正乙醇呼氣測(cè)醉器分析中的丙酮干擾是有用的。
熒光檢測(cè)同樣可以使用陣列來(lái)完成。熒光傳感器陣列已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述。它們已經(jīng)可以用于復(fù)雜樣品如葡萄酒香味、香料，以及基因。熒光傳感器排列使用共價(jià)連接至光學(xué)纖維遠(yuǎn)極面上孔中聚苯乙烯小珠的熒光或發(fā)色染料或底物(D.R.Walt，成像光學(xué)傳感器排列。Curr.Opin.Chem.Biol.6689(2002))。高密度光學(xué)排列可以包括若干類型的用于不同分析物的染料或底物。排列分別地暴露于每個(gè)可能的成分，然后至樣品。使用模式識(shí)別來(lái)推斷樣品的組成。在呼吸或體液組分中，可以將丙酮特異性酶，協(xié)同因子，以及顯色或熒光染料共價(jià)連接至小珠一個(gè)部分，而對(duì)其他分析物具有特異性的酶，如乙醇，可以連接至其他小珠。每個(gè)小珠將“點(diǎn)燃”暴露于其目標(biāo)分析物。
基于酶的熒光或顯色排列從未應(yīng)用于丙酮的檢測(cè)。
丙酮特異性酶?jìng)鞲衅鞯挠猛緦?duì)于監(jiān)控的有效性和患者對(duì)體重減輕膳食的適應(yīng)性，呼吸丙酮監(jiān)控是一種有用的工具。酮病可以通過(guò)鍛煉和膳食選擇來(lái)控制，甚至在兩種相等能量平衡的膳食中。在呼吸中丙酮水平中反饋膳食和鍛煉選擇的反應(yīng)時(shí)間在2-3小時(shí)，是比尿酮分析更好的脂肪減少指標(biāo)。
家用丙酮診斷生物傳感器對(duì)于幫助患者控制1型和2型糖尿病是有效的。尤其是1型糖尿病中，這樣的生物傳感器能使患者監(jiān)控體重減輕，檢測(cè)酮酸中毒發(fā)作的信號(hào)，以及控制相對(duì)于胰島素利用的糖攝入。如果患者每日可以通過(guò)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)與健康護(hù)理專家及同年齡人共享丙酮測(cè)定值和周支持小組會(huì)議，指標(biāo)顯示可以提高體重減輕的成功率。使用本發(fā)明的丙酮特異性檢測(cè)系統(tǒng)不受限于控制肥胖和糖尿病?？梢灶A(yù)期的是在此所描述的丙酮特異性生物傳感器對(duì)于控制任何病理學(xué)指標(biāo)是丙酮產(chǎn)量的疾病都是有效的。
此外，丙酮特異性酶系統(tǒng)被證實(shí)是監(jiān)控患者對(duì)指定治療方案的適應(yīng)性的高效手段，用乙酰乙酸鹽或其衍生物標(biāo)記的藥物。乙酰乙酸鹽降解為丙酮可以通過(guò)包括本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)的生物傳感器來(lái)測(cè)定，因此提高了健康護(hù)理專家對(duì)于追蹤相應(yīng)標(biāo)記藥物的劑量和生物利用率的能力。
實(shí)施例利用這些系統(tǒng)的丙酮特異性酶系統(tǒng)和丙酮傳感器已經(jīng)得到發(fā)展。在下文優(yōu)選實(shí)施例中描述了酶鑒定和/或純化、酶表征和選擇，酶-加-協(xié)同因子系統(tǒng)、多酶-加-協(xié)同因子系統(tǒng)、提供了線性(按化學(xué)計(jì)量)丙酮檢測(cè)的偶聯(lián)酶系統(tǒng)，提供了放大(例如，指數(shù))丙酮檢測(cè)的偶聯(lián)酶系統(tǒng)、酶和酶系統(tǒng)穩(wěn)定性測(cè)試、丙酮蒸汽到液體轉(zhuǎn)化的研究，以及利用這樣系統(tǒng)傳感器的酶介質(zhì)丙酮傳感器設(shè)備(電化學(xué)和非電化學(xué)設(shè)備)。這些實(shí)施例提供了例證但不是限制本發(fā)明。以下描述了在基于酶的電化學(xué)和非電化學(xué)傳感器中使用了丙酮特異性酶系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施例。
材料和方法材料。從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株獲得的丙酮羧化酶和在異丙醇中生長(zhǎng)的自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株細(xì)胞團(tuán)從Scott A.Ensign教授處獲得，猶他州大學(xué)，洛根，猶他州。從莢膜紅細(xì)菌B10(ATCC33303)獲得的丙酮羧化酶、在丙酮中生長(zhǎng)的莢膜紅細(xì)菌B10細(xì)胞團(tuán)、在丙醇中生長(zhǎng)的母牛分枝桿菌JOB5(ATCC29678)無(wú)細(xì)胞提取物，以及在丙醇中生長(zhǎng)的胭脂紅分枝桿菌B276(ATCC31338)細(xì)胞團(tuán)也從Ensign教授處獲得，所有這些細(xì)菌菌株是公眾可得的。從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株和在異丙醇中生長(zhǎng)的自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株獲得的仲醇脫氫酶從細(xì)胞團(tuán)中分離；典型的、公眾可得的仲醇脫氫酶如表1所示。丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)、肌激酶(EC 2.7.4.3)、丙酮酸氧化酶(EC 1.2.3.3)、辣根過(guò)氧化物酶(EC 1.11.1.7)、乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.28)、蘋(píng)果酸酶(EC 1.1.1.40)、乙醇脫氫酶(EC 1.1.1.2)、丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.1)、乙醇脫氫酶(EC 1.1.1.1)、乙醇氧化酶(EC 1.1.3.13)，以及β-羥基丁酸鹽脫氫酶(EC 1.1.1.30)從Sigma購(gòu)得(圣路易，密蘇里)。所有其他所用的化學(xué)制品和試劑是分析純的。所有溶液在18MΩ水中制備(Millipore)。
表1公眾可得的一些S-ADH酶的信息


利用丙酮、異丙醇以及丙醇微生物的富集和分離。
富集培養(yǎng)物在用丁基橡膠塞子卷曲密封的160Ml血清瓶中進(jìn)行。瓶中含有10mL礦物鹽培養(yǎng)基包括(g/L)NaNH4HPO4(1.74)；NaH2PO4×H2O(0.54)；KCl(0.04)；MgSO4×7H2O(0.2)以及1ml/L微量元素母液(母液g/LFeCl2×4H2O(5.4)；MnCl2×4H2O(1.0)；ZnSO4×7H2O(1.45)；CuSO4×5H2O(0.25)；濃HCl(13ML/L)；(NH4)6Mo7O24×4H2O(0.1)；H3BO3(0.1)；CoCl2×6H2O(0.19))。將培養(yǎng)液的pH調(diào)至7.2。利用丙醇微生物的富集用從當(dāng)?shù)乇硗凉?yīng)商購(gòu)買的約0.5克土培植，或用約0.5克從當(dāng)?shù)爻?jí)市場(chǎng)購(gòu)買的無(wú)菌制陶土或有機(jī)堆肥。
20％(v/v)濃度的氣態(tài)丙醇用注射器加入血清瓶的預(yù)留空間。利用丙酮和異丙醇的微生物的富集用同樣的方法進(jìn)行，除了將底物加入1M母液變?yōu)榻K濃度為25mM丙酮，或10mM異丙醇。富集培養(yǎng)物在振蕩器上28℃培養(yǎng)。為了分離單個(gè)菌落，富集培養(yǎng)物在含有1.5％w/v瓊脂的礦物鹽培養(yǎng)基(如上所述)中培養(yǎng)(以下稱為“礦物鹽瓊脂”)在不同的裝置中，可以在CO2捕集器存在下生長(zhǎng)的丙酮利用微生物開(kāi)始富集培養(yǎng)物。將20mL礦物鹽培養(yǎng)基和微量元素(參見(jiàn)上面)裝入250mL帶障板的錐形燒瓶中。錐形燒瓶用已經(jīng)修改成能抓住玻璃瓶的橡膠塞塞住。玻璃瓶中含有約0.5mL50％(w/v)KOH。KOH從錐形燒瓶預(yù)留空間捕獲CO2。這些裝置設(shè)計(jì)用來(lái)富集丙酮利用和涉及丙酮羧化酶依賴性途徑的微生物。富集培養(yǎng)物在振蕩器上28℃培養(yǎng)。
濁度顯示細(xì)菌生長(zhǎng)兩到三倍后將富集培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移(通常3至5天后)。為了分離單個(gè)菌落，將富集培養(yǎng)物涂布在礦物鹽瓊脂平板上。為了分離利用丙醇的細(xì)菌，將瓊脂平板放入3.5L的厭氧瓶中。將丙醇加入瓶中直至瓶?jī)?nèi)的正壓達(dá)到0.3-0.5巴。然后將瓶放入振蕩器28℃培養(yǎng)。為了丙酮利用微生物的分離，將瓊脂平板放入1.4L的干燥器中。該干燥器包括兩個(gè)開(kāi)口的細(xì)頸瓶，每個(gè)含有3-4mL純丙酮。在將其放入28℃培養(yǎng)箱之前，干燥器用若干層PARAFILM(蠟基的密封薄膜，從American National Can獲得，芝加哥伊利諾斯)密封。為了可以在CO2捕集器存在下生長(zhǎng)的丙酮利用微生物的分離，將瓊脂平板放入如上所述的干燥器中。細(xì)頸瓶中除了丙酮，將還含有50％KOH(約4Ml)的細(xì)頸瓶放入干燥器。另外，為了分離利用丙酮和異丙醇的細(xì)菌，將富集培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有加了丙酮或異丙醇的礦物鹽培養(yǎng)基的瓊脂平板。將添加的丙酮或異丙醇加在放入培養(yǎng)皿的小泡沫塞上。培養(yǎng)皿用若干層parafilm密封來(lái)減少培養(yǎng)過(guò)程中底物的蒸發(fā)。
5至10天后瓊脂平板上可觀察到菌落。將分離物轉(zhuǎn)移至新鮮的瓊脂平板以及如上所述的培養(yǎng)。分離的菌株也可以在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線培養(yǎng)來(lái)檢查純度。在瓊脂平板上若干次轉(zhuǎn)移之后，分離到31個(gè)菌株以及通過(guò)菌落形態(tài)學(xué)鑒定是不同的。從丙醇富集物中分離到8個(gè)菌株(在此命名為T(mén)DCC Prop 1-8)，從異丙醇富集物中分離到8個(gè)菌株(在此命名為T(mén)DCC IP 1-8)，以及從丙酮富集物中分離到15個(gè)菌株(在此命名為T(mén)DCC Ac 1-8)。這些沒(méi)有一個(gè)是從丙酮加KOH捕獲富集物得到的。篩選分離物以及培養(yǎng)依賴丙酮、丙醇，或異丙醇生長(zhǎng)的收集菌株。
依賴丙酮、丙醇，或異丙醇生長(zhǎng)的分離物和收集菌株的篩選在含有5mL添加了0.005％(w/v)酵母提取物的上述培養(yǎng)基的60mL血清細(xì)頸瓶中進(jìn)行。培養(yǎng)基從單個(gè)菌落培養(yǎng)。將異丙醇加入形成終濃度為8mM的母液。有底物的培養(yǎng)物與沒(méi)有底物(培養(yǎng)基空白實(shí)驗(yàn))的培養(yǎng)物相比顯示了更高的濁度認(rèn)為是采樣。然后篩選采樣得到如上所述的在CO2捕集器存在下依賴丙酮生長(zhǎng)的。
分離物/菌株的培養(yǎng)、收集，以及無(wú)細(xì)胞提取物的制備。
為了仲醇脫氫酶的初始純化以及無(wú)細(xì)胞提取物的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)較大批量的若干異丙醇利用菌株。胭脂紅分枝桿菌B276菌株(ATCC31338)(之前為珊瑚諾卡氏菌B276)以及TDCC IP-1菌株(以及兩個(gè)其他的菌株數(shù)據(jù)未顯示)，在2500mL批量的添加了0.005％酵母提取物的天然鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。初始加入異丙醇(8Mm)作為碳源和能源。培養(yǎng)物在振蕩器(200rpm)上30℃培養(yǎng)。然后通過(guò)600nm下的光密度來(lái)監(jiān)控隨后的生長(zhǎng)。在由于缺乏底物生長(zhǎng)速率降低時(shí)的若干時(shí)間點(diǎn)，將更多的異丙醇加入。總共加入培養(yǎng)物的異丙醇約為96mM。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)，通過(guò)在4℃離心將細(xì)胞沉淀(GSA rotor，8,500rpm，20min.)。細(xì)胞用50mM Tris-HCl緩沖液洗滌一次，pH7.5。將細(xì)胞球稱重，用少量的TRIS(2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇)緩沖液重懸(約2mL每克細(xì)胞(濕重))。細(xì)胞在-20℃下冰凍直至進(jìn)一步使用。為了無(wú)細(xì)胞提取物的制備，將細(xì)胞解凍，通過(guò)超聲波破碎(4×20s，脈沖，50％強(qiáng)度)。細(xì)胞碎片和沒(méi)破碎的細(xì)胞通過(guò)離心沉淀，5分鐘，14,000rpm(在Eppendorf benchtop centrifuge中進(jìn)行，Model5417C，Brinkmann，Instruments，Inc.，Westbury，NY)?？商鎿Q的是，為了更大量的準(zhǔn)備，將細(xì)胞懸浮液三次通過(guò)小型-Frech壓力池，20,000psi(137，895.2kPa)，溶解產(chǎn)物通過(guò)在4℃以6,000×g離心40min來(lái)凈化。
蛋白質(zhì)純化從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株中獲得的丙酮羧化酶和從莢膜紅細(xì)菌獲得的丙酮羧化酶如之前所述進(jìn)行純化。從自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株中獲得的仲醇脫氫酶(S-ADH)通過(guò)下列的程序純化。如上所述的制備依賴異丙醇生長(zhǎng)的自養(yǎng)黃色桿菌Py2(150克)的無(wú)細(xì)胞提取物(380mL)，應(yīng)用5×15cm DEAE-瓊脂糖凝膠柱(二乙氨基乙基交叉鏈接瓊脂糖球材料；目錄編號(hào)17-0709-10，Amersham Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韋，新澤西)在A緩沖液(25mM MOPS(3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)，pH7.6，5％丙三醇，1mM二硫蘇糖醇)中高速流動(dòng)平衡，流速為10mL/min。填料以后，用1000mL緩沖液A洗滌柱子，在2400mL緩沖液A中形成90-290mM KCl線性梯度。收集含有S-ADH活性的餾分，用2L含有5％丙三醇的25mM磷酸鉀(pH6.2)(緩沖液B)在4℃下透析16小時(shí)。然后將蛋白質(zhì)用RED SEPHAROSE CL-6B(Procion Red HE-3B染料連接的，交叉鏈接瓊脂糖球材料，用于親和色譜儀的親和基質(zhì)；產(chǎn)品目錄號(hào)17-0528-01，Amersham Pharmacia Biotech)柱(1.5×10cm)，在B緩沖液中平衡，流速為2mL/min。用30mL緩沖液B洗滌柱子后，用20mL含有10mM NAD+的緩沖液A洗脫S-ADH。然后將含有S-ADH的餾分用2L緩沖液A在4℃下透析16小時(shí)，通過(guò)超濾濃縮(使用YM30超濾膜；產(chǎn)品目錄號(hào)13722，從Millipore購(gòu)得，貝德福德，馬薩諸塞)，用液氮冷凍。從細(xì)菌篩選培養(yǎng)物中部分純化的S-ADH如下制備如上所述制備1至5克細(xì)胞團(tuán)的無(wú)細(xì)胞提取物，然后用5mL HI TRAP Q柱(四，四乙銨，使用陰離子交換基質(zhì)的交叉鏈接瓊脂糖球材料；產(chǎn)品目錄號(hào)17-1 153-01，Amersham Pharmacia Biotech)，在100mM MOPS中平衡，pH7.6，含有5％(v/v)丙三醇(緩沖液C)。用10mL緩沖液C洗滌柱子，在100mL緩沖液C中形成0-100mM NaCl線性梯度。收集含有S-ADH活性的餾分，使用30kDa MWCO(“分子量截留”)離心膜(目錄編號(hào)UFV4BTK25，Millipore)濃縮至0.5Ml，-80℃保存。
實(shí)施例1與NADH氧化偶聯(lián)的丙酮羧化酶的分光光度檢測(cè)在2mL(1cm路徑長(zhǎng)度)玻璃管中進(jìn)行檢測(cè)，該管已經(jīng)被融化改造成血清瓶式玻璃上部(開(kāi)口處為7×13mm)，使該管可以用紅色的血清瓶的橡膠塞子密封。在pH7.6總體積1mL的反應(yīng)混合物中含有ATP(10mM)、氯化鎂(11mM)、醋酸鉀(80mM)、MOPS(100mM)、CO2(將50mM(1mol CO2(g)加入到4mol的碳酸氫鉀來(lái)維持pH)和20-40μg純化的丙酮羧化酶。加入β-羥基丁酸脫氫酶(3U)和NADH(0.2mM)使乙酰乙酸形成與NADH氧化偶聯(lián)。檢測(cè)時(shí)，在30℃下預(yù)培養(yǎng)除了丙酮之外的所有檢測(cè)成分的試樣2min。加入丙酮(2mM)來(lái)起始檢測(cè)。30℃下在具有自動(dòng)控溫的細(xì)胞固定器的Agilent Technologies(Palo Alto，CA)的型號(hào)8453UV可視分光系統(tǒng)中通過(guò)測(cè)定340nm下吸收值的逐步下降來(lái)監(jiān)控反應(yīng)(NADH的ε340為6.22mM-1.cm-1)。
與過(guò)氧化氫生成偶聯(lián)的丙酮羧化酶的分光光度檢測(cè)在2mL(1cm路徑長(zhǎng)度)玻璃管中進(jìn)行檢測(cè)，pH7.5的1mL總體積中含有ATP(0.1mM)、硫酸鎂(10mM)、醋酸鉀(80mM)、磷酸鉀(50mM)、CO2(將50mM(1mol CO2(g)加入到4mol的碳酸氫鉀來(lái)維持pH)、40μg純化的丙酮羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸鹽(2mM)、丙酮酸激酶(20U)、肌激酶(15U)、丙酮酸氧化酶(2U)、過(guò)氧化物酶(15U)、黃素腺嘌呤二核苷酸(0.01mM)、脫羧輔酶(0.2mM)、4-氨基安替比林(0.5mM)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(0.02％w/v)。偶聯(lián)的酶或試劑(即磷酸烯醇丙酮酸鹽、丙酮酸激酶、肌激酶、丙酮酸氧化酶、黃素腺嘌呤二核苷酸和脫羧輔酶)使ATP水解與H2O2形成(丙酮酸氧化)偶聯(lián)。加入過(guò)氧化物酶、4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺，30℃下、以550nm(醌亞胺染色產(chǎn)物的ε550為36.88mM-1·cm-1)持續(xù)地分光光度監(jiān)控自動(dòng)控溫的細(xì)胞固定器中H2O2的形成。分析時(shí)，在30℃下預(yù)培養(yǎng)除了丙酮之外的所有檢測(cè)成分的試樣2min。加入丙酮(5mM)來(lái)起始檢測(cè)。
實(shí)施例2仲醇脫氫酶NADH氧化的分光光度檢測(cè)30℃下、在2mL(1cm路徑長(zhǎng)度)玻璃管中進(jìn)行檢測(cè)，在pH6.2(酮還原檢測(cè))或pH7.8(醇氧化檢測(cè))的1mL反應(yīng)體積中含有NAD(H)(0.2mM)、磷酸鉀緩沖液(25mM)和酶源(無(wú)細(xì)胞提取物、柱餾分、或純化的酶)。在30℃下預(yù)培養(yǎng)除了底物之外的所有檢測(cè)成分的試樣1.5min。通過(guò)加入底物(2.5mM)來(lái)起始檢測(cè)并通過(guò)測(cè)定340nm(NADH的ε340為6.22mM-1.cm-1)的吸收值的變化來(lái)持續(xù)監(jiān)控。
與H2O2生成偶聯(lián)的仲醇脫氫酶的分光光度檢測(cè)在2mL(1cm路徑長(zhǎng)度)玻璃管中進(jìn)行檢測(cè)，在pH6.2的1mL總體積中含有磷酸鉀(50mM)、1.5μg純化S-ADH、NADH(50μM)、乳酸鹽(10mM)、乳酸脫氫酶(20U)、丙酮酸氧化酶(2U)、黃素腺嘌呤二核苷酸(0.01mM)、脫羧輔酶(0.2mM)、4-氨基安替比林(0.5mM)、和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(0.02％w/v)。偶聯(lián)的酶或試劑(即乳酸鹽、乳酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、黃素腺嘌呤二核苷酸、脫羧輔酶)使NADH氧化與H2O2形成(丙酮酸氧化)偶聯(lián)。在一些檢測(cè)中(其中特異地)，用丙氨酸(10mM)和丙氨酸脫氫酶(2U)替代乳酸鹽和乳酸脫氫酶。如上所述，在30℃、550nm下(醌亞胺染色產(chǎn)物的ε550為36.88mM-1.cm-1)持續(xù)地分光光度監(jiān)控自動(dòng)控溫的細(xì)胞固定器中的反應(yīng)。檢測(cè)時(shí)，在30℃下預(yù)培養(yǎng)除了丙酮之外的所有檢測(cè)成分的試樣2min。加入丙酮(2.5mM)來(lái)起始檢測(cè)。
伯醇脫氫酶與伯醇氧化酶偶聯(lián)的底物再循環(huán)檢測(cè)在2mL(1cm路徑長(zhǎng)度)玻璃管中進(jìn)行檢測(cè)，在pH6.2的1mL總體積中含有磷酸鉀(25mM)、乙醇脫氫酶(1U)、NADH(100μM)、乙醇氧化酶(2U)、過(guò)氧化物酶(15U)、4-氨基安替比林(0.5mM)、和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(0.02％w/v)。如上所述，30℃時(shí)、在550nm下(醌亞胺染色產(chǎn)物的ε550為36.88mM-1.cm-1)或者在340nm下(NADH的ε340為6.22mM-1.cm-1)持續(xù)地分光光度監(jiān)控自動(dòng)控溫的細(xì)胞固定器中的反應(yīng)。在30℃下預(yù)培養(yǎng)除了乙醇之外的所有檢測(cè)成分的試樣2min。加入乙醇(50μM或5μM)來(lái)起始檢測(cè)。
穩(wěn)定性分析將足量的用于各個(gè)活性檢測(cè)的酶(如，1.5μg S-ADH)等分到具有特定濃度添加劑(如緩沖液(25mM MOPS，pH7.6)中的海藻糖(10％w/v))的1.5mL微型離心機(jī)的離心管中，并在-80℃下凍存1h。然后將樣本放入柜式冷凍干燥機(jī)(Virtis model Advantage ES)中，在-50℃下(柜內(nèi)溫度)放置16h，然后升高到20℃4h。取出冷凍干燥的樣本，使其在室溫下(17-24℃)放置一段時(shí)間。在特定時(shí)間點(diǎn)，重新用水溶解樣本并如上所述進(jìn)行檢測(cè)。
蛋白質(zhì)表征在用12％T、2.7％C的凝膠Laemmli處理(Laemmli，U.K.自然，227680-685(1970))之后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)?！癟％”表示所有單體重量百分比，是對(duì)所有單體濃度的測(cè)定，用％T＝100×((丙烯酰胺克數(shù))+(交聯(lián)劑克數(shù)))/凝膠總體積(mL)計(jì)算得到；“％C”表示交聯(lián)劑的重量百分比，用％C＝100×(交聯(lián)劑克數(shù))/((丙烯酰胺克數(shù))+(交聯(lián)劑克數(shù)))計(jì)算得到；所用交聯(lián)劑是N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺。通過(guò)庫(kù)馬西蘭(PhastGel Blue R，產(chǎn)品目錄號(hào)17-0518-01，Amersham Pharmmacia Biotech)染色來(lái)顯示電泳得到的蛋白。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的Rf值比較來(lái)確定基于SDS-PAGE遷移的多肽表觀分子量。由Commonwealth Biotechnologies有限公司(Richmond，VA)進(jìn)行N末端測(cè)序。通過(guò)改進(jìn)的雙縮脲檢測(cè)(V.J.Chromy等，臨床化學(xué)，201362-63(1974))，以δ-球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定蛋白質(zhì)濃度。
如下進(jìn)行富集S-ADH的質(zhì)譜分析和生成肽氨基酸序列。通過(guò)高溶解性的雙向凝膠電泳表征S-ADH的可溶性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)(30μg)溶解在再水合樣本緩沖液中進(jìn)行等電聚焦(IEF)分析，該緩沖液中由5M尿素、2M硫脲、2％(w/v)CHAPS(3-[(3-膽堿胺基丙基)二甲銨基]-1-丙磺酸鹽)，2％(w/v)SB3-10(2-癸基二甲氨基)丙磺酸鹽)、40mM TRIS、2mM三丁基磷(使用前加入再水合溶液中)和0.2％Bio-Lyte3/10(Bio-Rad，Hercules，CA，產(chǎn)品目錄號(hào)163-2104)組成。蛋白質(zhì)/再水合溶液再用水溶解到11cm IPG ReadyStrippH3-10(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄號(hào)163-2014)，在惰性條件下0伏、20℃、16h。
在Protean IEF池中(Bio-Rad，型號(hào)526BR02142)用IPGReadyStrip(Bio-Rad)以35,000volt-hours進(jìn)行一向等電聚焦。在第一向電泳之后，凝膠在含有20％甘油、0.375M Tris、6M尿素、2％SDS和5M三丁基磷的緩沖液中平衡20min。將IPG ReadyStrip放置在預(yù)澆制了1mm的4-20％梯度Tris-HCl-SDS凝膠(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄號(hào)345-0036)的CriterionTM上，將含有溴酚藍(lán)(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄號(hào)161-0404)的熱的0.5％瓊脂糖加到剩余孔中。室溫下在Criterion小型電泳池中(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄號(hào)165-6001)進(jìn)行電泳。用10×Tris-糖膠-SDS溶液(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄161-0732)制備電泳緩沖液。在裝配凝膠系統(tǒng)和加入電泳緩沖液后，以2mA、3500v、45w的起始電流進(jìn)行電泳1.5h。電流上升到5mA 30min，接著升到10mA 2-3h。一般電泳時(shí)間在4-5h之間。電泳之后，凝膠在由17％硫酸銨、30％甲醇、3％磷酸和0.1％庫(kù)馬西亮藍(lán)G250(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄號(hào)161-0436)的緩沖液中染色至少12h。凝膠用水洗滌并在2％乙酸中存放直到進(jìn)一步處理。
用Bio-Rads熒光-S-多重圖象儀(Bio-Rad，產(chǎn)品目錄號(hào)170-7700)捕獲膠狀庫(kù)馬西染色凝膠的圖像。采用數(shù)字濾波算法來(lái)排除不一致的背景而不會(huì)去除重要的圖像數(shù)據(jù)。最初采用內(nèi)標(biāo)(分子量標(biāo)記)來(lái)確定被標(biāo)記目標(biāo)蛋白的分子量。通過(guò)比較在雙向凝膠上相對(duì)于蛋白標(biāo)準(zhǔn)的位置來(lái)確定S-ADH蛋白的分子量和PI。
從2-D凝膠上手工切下對(duì)應(yīng)于S-ADH的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。凝膠塊在1.5mL微型離心管中通過(guò)猛烈搖晃30min，用25mM碳酸氫銨/50％乙腈來(lái)軟化并脫色。用極細(xì)的移液槍去除和棄去藍(lán)色的脫色溶液。重復(fù)脫色步驟直到從凝膠塊上去除染料。凝膠塊在真空中干燥10-15min。蛋白質(zhì)在37℃下、25μL總體中消化過(guò)夜，其中改進(jìn)的測(cè)序級(jí)(sequence grade)胰島素(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)以25ng/μL的最終蛋白溶解在25mM碳酸氫銨中。肽用50％乙腈和0.5％三氟醋酸洗脫。所有肽樣本被濃縮、脫鹽，并如生產(chǎn)商描述方法用C18反相ZipTipTM移液器槍頭(Millipore，Bedford，MA，產(chǎn)品目錄號(hào)ZTC18S096)去除去垢劑。
生成的胰蛋白酶肽直接通過(guò)質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析試驗(yàn)在裝有N2激光(337nm，3-nsec脈沖寬度、20-Hz重復(fù)率)的PerSeptiveBiosystems(Framingham，MA)Voyager DE-STR上進(jìn)行。在反射模式中用衰變抽提獲得質(zhì)譜光譜。用低分子量肽標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)量校準(zhǔn)，質(zhì)量測(cè)定的精確度一般為±0.1Da。所有肽樣本稀釋在α-氰基-4-羥基苯乙烯酸中，該溶液通過(guò)將10mg α-氰基-4-羥基苯乙烯酸溶解在含有0.1％三氟乙酸的1mL水溶性50％乙腈中。一些得自S-ADH的胰蛋白酶肽的分子量下述方法之一進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜分析測(cè)定(sequence)。
方法1蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化用Keough T.，Lacey M.P.，YoungquistR.S.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯編1996；967131描述的氯磺化乙酰氯試劑實(shí)現(xiàn)?；腔瘶颖居萌宜崴峄苯佑肅18小型柱(ZipTipTM，Millipore)完全清除。將衍生的肽洗脫到α-氰基-4-羥基苯乙烯酸中(Fluka，產(chǎn)品目錄號(hào)28480)并直接加到MALDI板上。在裝有N2激光的AppliedBiosystems Voyager DE-STR時(shí)間飛行質(zhì)譜儀上分析衍生的肽。在反射模式中用衰變抽提獲得質(zhì)譜光譜。用低分子量肽標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)量校準(zhǔn)，質(zhì)量測(cè)定的精確度一般為±0.2Da。在用限時(shí)離子選擇分離適當(dāng)?shù)难苌绑w離子后，獲得PSD片段離子光譜。以如下比率1.0000(前體離子區(qū)段)、0.9000、0.7500、0.5625、0.4218、0.3164和0.2373(片段離子區(qū)段)逐步降低施加于反射器的電壓來(lái)將片段離子重新聚焦到最終檢波器上。用Applied Biosystems開(kāi)發(fā)的軟件將各個(gè)片段接合在一起。所有前體離子區(qū)段在100個(gè)激光脈沖的低激光強(qiáng)度(可變阻尼＝1980)下獲得，以避免檢測(cè)器飽和。增加激光強(qiáng)度(可變阻尼＝2365)來(lái)保留PSD識(shí)別的區(qū)段。在20MHz數(shù)字化比率下獲得PSD數(shù)據(jù)；因此，所有片段離子用化學(xué)平均而不以單一同位素質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。
方法2從S-ADH胰蛋白酶肽獲得序列標(biāo)記。通過(guò)限時(shí)離子選擇分離適當(dāng)前體離子后得到四條肽的源后衰變(PSD)片段離子質(zhì)譜。通過(guò)以如下比率1.0000(前體離子區(qū)段)、0.9000、0.7500、0.5625、0.4218、0.3164和0.2373(片段離子區(qū)段)逐步降低施加于反射器的電壓來(lái)將片段離子重新聚焦到最終檢波器上。用Applied Biosystems開(kāi)發(fā)的軟件將各個(gè)片段接合在一起。所有前體離子區(qū)段在＜256個(gè)激光脈沖的低激光強(qiáng)度(可變阻尼＝1450)獲得，以避免檢測(cè)器飽和。對(duì)于所有剩余PSD識(shí)別區(qū)段，增加激光強(qiáng)度。一般地，對(duì)于各個(gè)片段離子區(qū)段，為200激光脈沖。在20MHz數(shù)字化比率下得到PSD數(shù)據(jù)。用肽標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)譜校準(zhǔn)。在所有PSD質(zhì)譜試驗(yàn)中測(cè)定亞穩(wěn)態(tài)分解。
方法3通過(guò)ESI MS/MS從S-ADH胰蛋白酶肽得到序列標(biāo)記，在Micromass Q-TOF2四極/時(shí)間飛行MS系統(tǒng)中得到質(zhì)譜分析。
實(shí)施例3NADH的起始電化學(xué)測(cè)定及與分光光度數(shù)據(jù)的關(guān)系購(gòu)買10微米圓盤(pán)形碳纖維微電極(得自BioanalyticalSystems(“BAS”)，West Lafayette，Indiana(零件號(hào)碼MF-2007))并用Kuhr等方法(63)預(yù)處理。電極表面用1μm金剛石研膏(Bioanalytical Systems)磨光10min，并用熱甲苯超聲波處理2min。微電極在甲醇和水中各漂洗一次，然后在水中超聲波處理1min兩次來(lái)去除殘余的磨光材料。接著通過(guò)在1M HCl中以100V/s從-200mV升到+1800mV進(jìn)行10個(gè)循環(huán)兩次來(lái)電化學(xué)預(yù)處理被磨光的微電極。然在100mM磷酸鉀緩沖液中以100V/s從0mV升到+1800mV進(jìn)行10個(gè)循環(huán)兩次來(lái)處理微電極。然后從單獨(dú)的磷酸緩沖液中得到背景掃描。所有電壓與Ag/AgCl參比電極(Bioanalytical Systems)比對(duì)。在得到酶(1U/mL)和NAD(P)H(2mM)的基線快速掃描循環(huán)伏特克數(shù)(CVs)后，加入所需體積水溶性丙酮(20mM終濃度)。快速混合溶液，在25min中每隔1min測(cè)定快速掃描CVs。采用BAS 100W的電化學(xué)軟件版本2.3(得自Bioanalytical Systems，West Lafayette，Indiana，下文稱為“BAS”)從每個(gè)CV中扣除緩沖液的背景。
除非另外指出，所有電化學(xué)檢測(cè)采用偶聯(lián)到BAS PA-1前置放大器和法拉第籠的Bioanalytical Systems(BAS)型100A或B電化學(xué)分析儀進(jìn)行，其中通過(guò)BAS 100W電化學(xué)軟件版本2.3得到所有波形和電流。數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 97 SR-2和BOMEM GRAMS/32版本4.04，II級(jí)(Galactic Industries Corporation)處理。電泳池是定制的0.20mL的池，由Plexiglas構(gòu)建(丙烯聚合薄片得自Atofina Corp.，巴黎，法國(guó))，含有一個(gè)Ag/AgCl參比電極、預(yù)處理碳纖維微電極和一個(gè)鉑線輔助電極。
為了建立兩種酶的分光光度數(shù)據(jù)和電化學(xué)數(shù)據(jù)間的關(guān)系，對(duì)兩種分析采用相同的反應(yīng)條件。對(duì)于得自布氏熱厭氧菌的S-ADH，1mL反應(yīng)體積中含有2mM NADPH、20mM丙酮和1U S-ADH的最終濃度。對(duì)于得自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株的S-ADH，1mL反應(yīng)體積中含有2mM NADH、20mM丙酮和1U S-ADH的最終濃度。對(duì)于這兩個(gè)反應(yīng)，得到該酶和NAD(P)H相對(duì)于磷酸緩沖液空白的基線A340。然后從分光光度計(jì)中取出含有反應(yīng)溶液的試管，從試管中取出0.4mL溶液并剩下0.6mL。所需體積的水溶性丙酮加到1.0mL反應(yīng)中?；旌先芤?，往試管中加入0.4mL，將試管再放回分光光度計(jì)中。然后用Shimadzu UV-VIS-NIR掃描分光光度計(jì)(型號(hào)UV-3101PC，哥倫比亞，馬里蘭)監(jiān)控在A340的下降30min。用UVPC專用光譜軟件版本3.9(Shimadzu，哥倫比亞，馬里蘭)提取數(shù)據(jù)并用Microsoft Excel 97 SR-2處理。購(gòu)買具有1mm路徑長(zhǎng)度和0.4mL體積的玻璃管(得自Fisher Scientific，匹茲堡，賓夕法尼亞，零件號(hào)碼14-385-906A)。
用Meldola藍(lán)改進(jìn)的碳電極電化學(xué)測(cè)定丙酮依賴的NADH消耗如下制備用電催化的Meldola藍(lán)改進(jìn)的玻璃態(tài)碳圓盤(pán)電極。首先用1μm金剛石懸液濕潤(rùn)磨光直徑3-mm的玻璃態(tài)碳電極(BAS的零件號(hào)碼MF-2012)，在取離子水中超聲波處理1min，然后進(jìn)一步用0.05μm氧化鋁磨光懸液磨光。剛剛磨光的電極通過(guò)在去離子水中超聲波處理徹底洗滌，然后通過(guò)在5mL脫氧100mM磷酸緩沖液(pH7.2)中以5V/s從-500mV升到+300mV進(jìn)行20個(gè)循環(huán)4次來(lái)電化學(xué)預(yù)處理。循環(huán)之后，施加-0.5V的恒定極化電壓60s。然后室溫下在0.5％Meldola藍(lán)中(Aldrich，密爾沃基，威斯康星，產(chǎn)品目錄號(hào)32，432-9)浸泡電化學(xué)預(yù)處理的電極30min。使用前用去離子水洗滌。
用Meldola藍(lán)介質(zhì)制備的絲網(wǎng)印刷碳電極購(gòu)自Gwent電子材料有限公司(Pontypool，英國(guó))。一次性檢測(cè)條按照Hart等描述的幾何方法構(gòu)建，由兩個(gè)沉積在聚乙烯基底上的絲網(wǎng)印刷電極構(gòu)成。工作電極是含有電催化的Meldola藍(lán)的石墨電極(得自Gwent的零件號(hào)碼C70902D2)，而參比/計(jì)算電極是Ag/AgCl印刷油墨(得自Gwent的零件號(hào)碼C61003D7)。工作電極區(qū)由噴涂其他絕緣包被(得自Gwent的零件號(hào)碼D2000222D2)確定。電極幾何區(qū)域?yàn)?×3mm，或9mm2。使用前電極在磷酸緩沖液中預(yù)浸泡10min來(lái)去除松散結(jié)合的Meldola藍(lán)。
采用分光光度法，用如上制備Meldola藍(lán)-碳電極在含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)、NADH(500μM)、S-ADH(1U)和各種濃度丙酮的1mL反應(yīng)體積中測(cè)定由S-ADH催化的NADH的丙酮依賴性消耗。在兩分鐘溫育期后，電壓從斷路步進(jìn)到68mV(比照Ag/AgCl)并在120s后記錄電流。
用商品一次性血糖測(cè)試條測(cè)定NADH的丙酮依賴性消耗一次性葡萄糖生物傳感器檢測(cè)條和讀出器(精確的超級(jí)糖尿病控制系統(tǒng)(Precision Xtra Advanced Diabetes Management System))可得自MediSense(Abbott實(shí)驗(yàn)室營(yíng)業(yè)部，貝德福德，摩洛哥)。含有25mM磷酸鉀緩沖液(pH6.2)、NADH(2mM)、S-ADH(20U)和丙酮(分別為0.5、1.0、1.5、2.0mM)的1mL反應(yīng)體積在室溫下溫育。5min后，從各個(gè)反應(yīng)混合物中取出20μL等分試樣，并在加入到葡萄糖儀前應(yīng)用于一次性檢測(cè)條。記錄儀表讀出值(mg/dL葡萄糖當(dāng)量)并繪制對(duì)應(yīng)于丙酮加入量的關(guān)系圖。
與H2O2形成偶聯(lián)的二級(jí)醇脫氫酶的電化學(xué)檢測(cè)圓盤(pán)鉑電極(BAS零件號(hào)碼MF-2013)用于監(jiān)控由S-ADH偶聯(lián)的酶反應(yīng)產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)于丙酮濃度的H2O2。測(cè)定前，用氧化鋁研膏磨光電極表面1min，然后用去離子水超聲波處理1min洗滌，再用水洗滌。然后被磨光的Pt電極通過(guò)應(yīng)用以100mV/s從+200mV升到+900mV 10個(gè)循環(huán)電化學(xué)預(yù)處理。所有電壓參比于Ag/AgCl電極(BAS零件號(hào)碼MF-2078)。在0.5mL總體積的試樣中含有磷酸鉀(100mM，pH7.2)、純化的S-ADH(1U/mL)、NADH(20μm)、乳酸(100mM)、乳酸脫氫酶(5U/mL)、丙酮酸氧化酶(4U/ml)、黃素腺嘌呤二核苷酸(0.01mM)、輔羧酶(0.2mM)。加入丙酮來(lái)起始檢測(cè)。在2min溫育期后，電壓從起始電流逐步升高到350mV。在120s后記錄氧化電流并繪制與丙酮濃度的關(guān)系圖。
采用與上述用于圓盤(pán)鉑電極相同酶試劑系統(tǒng)和相似電化學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)一次性電極材料來(lái)監(jiān)控由偶聯(lián)酶反應(yīng)生成的丙酮依賴的H2O2。購(gòu)買絲網(wǎng)印刷披鉑碳/石墨電極和酞菁鈷碳電極(零件號(hào)碼分別為C2000511D1和C40511D8，Gwent電子材料有限公司)，具有與較早描述的Meldola藍(lán)絲網(wǎng)印刷碳電極相同的電極結(jié)構(gòu)(electrode geometry)。使用前絲網(wǎng)印刷披鉑碳電極在磷酸緩沖液中預(yù)浸泡5min。加入丙酮起始檢測(cè)并溫育2min，其間電壓從斷路(open circuit)步進(jìn)到350mV。120s后記錄氧化電流。使用前，酞菁鈷改進(jìn)的絲網(wǎng)印刷碳電極在磷酸緩沖液中預(yù)浸泡5min。在每次加入丙酮后溫育反應(yīng)物3.5min。進(jìn)行分光光度測(cè)定，在150mV下具有5s的起始無(wú)噪時(shí)間(quite time)，然后電壓步進(jìn)到650mV 30s，記錄電流。每個(gè)試驗(yàn)使用一個(gè)酞菁鈷改進(jìn)的絲網(wǎng)印刷電極，然后棄去。
剪切直徑1/8英寸(3.06mm)的Toray碳紙(多孔碳紙)或布的圓片(用手工打孔器)，加載20％(w/w)鉑毫微顆粒(這些鉑顆粒是沉積在碳上的毫微顆粒；加載毫微顆粒的紙或布購(gòu)自ETEK Division of DeNora North America，薩默塞特，新澤西，零件號(hào)碼SLS-SPEC)來(lái)制備一次性披鉑碳電極模板，并用雙面碳帶(也是直徑1/8英寸(3.06mm)圓片)與絲網(wǎng)印刷碳工作電極(得自Gwent電子材料有限公司的零件號(hào)碼為C10903D4)相連。在一些實(shí)施例中，將20μm非離子去垢劑TRITON X-100(t-辛基苯氧基聚乙氧乙醇(t-octylphenoxypolyethoxyethanol)；產(chǎn)品目錄號(hào)T-8787，得自Sigma化學(xué)公司)或BRIJ(四乙烯基甘油單十二烷基酯(tetraethyleneglycol monododecyl ether)；產(chǎn)品目錄號(hào)P-1254，Sigma)應(yīng)用于ETEK材料圓片，并且在使用前干燥。測(cè)量前通過(guò)以100mV/s從+200mV升到+900mV進(jìn)行10個(gè)循環(huán)兩次來(lái)電化學(xué)預(yù)處理電極。加入丙酮起始檢測(cè)并溫育2min。進(jìn)行分光光度檢測(cè)，215mV時(shí)的無(wú)噪時(shí)間為2s，然后將電壓從相對(duì)于Ag/AgCl的215mV步進(jìn)到350mV。30s后記錄氧化電壓。
用葡萄糖一次性檢測(cè)條反射光度測(cè)定丙酮依賴的H2O2形成并與電化學(xué)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)購(gòu)買一次性葡萄糖生物傳感器檢測(cè)條和讀出器(得自Lifescan有限公司，milpitas，加利福尼亞的一次接觸基礎(chǔ)讀出器和檢測(cè)條)。往含有S-ADH偶聯(lián)酶系統(tǒng)(如上述的)的1mL反應(yīng)體積中連續(xù)加入100μM丙酮并在室溫下溫育。每次加入丙酮反應(yīng)4min，然后從反應(yīng)混合物中取出20μL等分試樣，在將其加入葡萄糖儀之前先應(yīng)用于一次性檢測(cè)條。記錄儀器讀出值(mg/dL葡萄糖當(dāng)量)并繪制對(duì)應(yīng)于丙酮總濃度的關(guān)系圖。還用上述圓盤(pán)鉑電極電化學(xué)監(jiān)控H2O2濃度。繪制電化學(xué)檢測(cè)與比色讀數(shù)之間的關(guān)系。
基于酶的電化學(xué)檢測(cè)氣態(tài)丙酮通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)濃度的丙酮注入充灌了7L水飽和空氣的校準(zhǔn)安全氣袋(10L袋，校準(zhǔn)工具有限公司(Calibrated Instrument，Inc)，Ardsley，新澤西)中，并在37℃下蒸發(fā)(約30min)來(lái)制備丙酮的氣態(tài)樣本(0-10ppmv/v)。通過(guò)該方法制備的氣體樣本在溫度和濕度含量方面與人類呼吸極其相近。采用氣態(tài)色譜法用裝有火焰電離檢測(cè)儀和上柱注射器的Hewlett Parkard5890氣態(tài)色譜儀來(lái)校準(zhǔn)氣體取樣系統(tǒng)(即丙酮的氣態(tài)和液相樣本濃度)。將1μL水溶液樣本加到15m長(zhǎng)、卷曲的毛細(xì)管柱中(Nukol，直徑0.53mm，具有0.5-μm液相層，產(chǎn)品目錄號(hào)25326，可得自Supelco有限公司，Bellafonte，賓西法尼亞)。烘干箱溫度在40℃下保持4min，然后以25℃/min升高到200℃。氦的運(yùn)載氣流速度為5mL/min。
兩種取樣技術(shù)用于將丙酮從氣態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐合?；泡沫系統(tǒng)和薄液層系統(tǒng)。至于泡沫系統(tǒng)，將一片聚氨酯泡沫剪切成圓柱狀(19mm長(zhǎng)和10mm直徑)使之體積約1mL。泡沫在水中沸煮20min，然后塞進(jìn)3cc的一次性塑料注射器中。插上注射器活塞并推緊以排出過(guò)量水分，然后去除活塞。在導(dǎo)入氣態(tài)丙酮樣本之前，將50μL水或磷酸緩沖液加入泡沫中。一旦水接觸泡沫時(shí)，表面張力將水吸入泡沫空隙中，水均勻地分布在泡沫的表面。然后將含有濕潤(rùn)泡沫的注射器通過(guò)管道連接到氣體取樣系統(tǒng)，通過(guò)啟動(dòng)隔膜泵或人工擠壓氣袋使氣體樣本以5L/min的流速通過(guò)泡沫12sec。這使氣體樣本總體積等于1L。取樣后，迅速斷開(kāi)裝有泡沫的注射器，重新插入活塞。然后將液體擠到電泳池中用于電化學(xué)分析，或者擠壓到小瓶襯墊(vial insert)中用于氣態(tài)色譜分析。對(duì)于電化學(xué)測(cè)定，丙酮轉(zhuǎn)化的水溶液樣本與濃縮酶溶液(上述的S-ADH和偶聯(lián)酶)混合制備期望的最終酶溶液，并溫育2min。如上述用計(jì)時(shí)安培分析法測(cè)定由酶反應(yīng)生成的丙酮依賴H2O2。
對(duì)于薄液層取樣方法，該氣體以500mL/min流速的極細(xì)氣流從氣袋中釋放2min，使氣體總體積等于1.0L。在本試驗(yàn)中，反轉(zhuǎn)工作電極(電極表面超上)，使少量酶溶液(50μL)形成相對(duì)薄的液層來(lái)覆蓋電極表面。氣體垂直地吹向液體表面。氣流攪動(dòng)液體來(lái)提高從氣態(tài)變?yōu)橐合嗟谋|(zhì)量。在氣體樣本流盡后，使酶溶液反應(yīng)1min。如上述電化學(xué)測(cè)定從酶反應(yīng)中生成的丙酮依賴H2O2。繪制對(duì)應(yīng)于氣袋中氣態(tài)丙酮濃度的電流反應(yīng)關(guān)系圖。
數(shù)據(jù)分析將起始速率數(shù)據(jù)代入Michaelis-Menten方程并使用軟件KaleidaGraph第四版(Synergy Software，Reading，PA)計(jì)算動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km和Vmax)。
結(jié)果純化得自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株的S-ADHS-ADH被認(rèn)為參與包含脂肪族烴分解代謝的細(xì)菌路徑的初始(生長(zhǎng)在異丙醇中)或中間步驟(生長(zhǎng)在丙烷中)。這些酶反應(yīng)是自由可逆的，其中反應(yīng)方向依賴于化學(xué)平衡。該逆反應(yīng)，即還原丙酮為異丙醇伴隨著NADH或NADPH氧化(大部分脫氫酶具有優(yōu)選于其他酶的一種輔酶)，給基于酶的電化學(xué)傳感器提供底物特異性和氧化還原化學(xué)必然性。由于這些原因，通過(guò)檢測(cè)異丙醇、丙烷和丙酮中生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物的細(xì)胞提取物中的S-ADH活性(數(shù)據(jù)未顯示；生長(zhǎng)篩選和分離按試驗(yàn)方法中的描述進(jìn)行)來(lái)更加詳細(xì)地研究這類酶。在其中，異丙醇生長(zhǎng)的自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株的細(xì)胞提取物具有最高S-ADH特異性活性(1.2μmol還原丙酮·min-1·mg-1蛋白)，并且還初步觀察到具有高于一級(jí)醇的二級(jí)醇特異性。為了進(jìn)一步研究這種酶的特性，根據(jù)其在存在NADH時(shí)還原丙酮和在存在NAD+時(shí)氧化異丙醇的能力來(lái)純化S-ADH。用DEAE-瓊脂糖和RED瓊脂糖色譜約40倍純化該酶，具有30-40％的估計(jì)回收率。如附圖2所示，這種兩步純化方法在SDS-PAGE上富集具有42kDa的表觀分子量的單一多肽。在異丙醇中生長(zhǎng)的黃色桿菌屬的細(xì)胞提取物中模糊地觀察到以相同表觀分子量移動(dòng)的多肽條帶，在生長(zhǎng)在葡萄糖黃色桿菌屬的細(xì)胞提取物的相同位置上也不是清晰可見(jiàn)的(附圖2)。與SDS-PAGE分析一致，葡萄糖生長(zhǎng)的細(xì)胞提取物中的S-ADH活性僅為在異丙醇生長(zhǎng)的細(xì)胞提取物的活性的3％，這表明S-ADH由異丙醇存在誘導(dǎo)。質(zhì)譜分析提供更加精確的分子量估計(jì)，純化S-ADH為37.1kDa，這與由SDS-PAGE確定的表觀分子量一致。變焦電泳確定S-ADH的pI為7.4。由Edman降解的S-ADH多肽的N-末端序列確定為MKGLVYRGPGKKALE(SEQ ID NO7)。用胰蛋白酶消化多肽生成“胰蛋白酶片段”并應(yīng)用源后延遲測(cè)序(PSD-MALDI)基質(zhì)輔助激光吸附離子化質(zhì)譜分析來(lái)確定其他氨基酸序列。
通過(guò)衍生片段接著PSD-MALDI序列分析得到六個(gè)肽的氨基酸序列(表2)。
表2.黃色桿菌屬Py2 S-ADH的衍生胰蛋白酶片段的序列


具有所觀察的946.27質(zhì)量電荷比的肽序列與由Edman降解產(chǎn)生的N-末端測(cè)序中存在的九聚物一致。采用PSD MALDI分析，檢測(cè)到其他四氨基酸序列(表3)。
表3.PSD MALDI檢測(cè)的黃色桿菌屬Py2 S-ADH片段的序列

還可以通過(guò)ESI MS/MS(電噴離子化串聯(lián)質(zhì)譜分析/質(zhì)譜分析)獲得S-ADH胰蛋白酶肽片段的氨基酸序列。得到的MS/MS分析在下列氨基酸序列是一致的(表4)。
表4.由MS/MS檢測(cè)的黃色桿菌屬Py2 S-ADH片段的序列

因此，X.anthobacter Py2 S-ADH被表征為具有NAD+依賴的二級(jí)醇脫氫酶活性、能夠?qū)⒈€原為異丙醇、具有酮和二級(jí)醇的特異活性的蛋白質(zhì)；對(duì)于將異丙醇氧化為丙酮，具有(1)pH最佳值為7.8，和(2)當(dāng)pH7.8時(shí)在相同條件下分別用C3-C5直鏈二級(jí)醇和用C2-C5直鏈一級(jí)醇測(cè)定時(shí)，至少50∶1的二級(jí)對(duì)一級(jí)醇的平均比活性；對(duì)于將丙酮還原為異丙醇，具有(3)pH最佳值為6.2，(4)約144±18μM的表觀Km，(5)約43.4±1.2μmol還原丙酮·min-1·mg-1蛋白的表觀Vmax，(6)約30.4sec-1的表觀kcat，(7)約2.1×105的表觀kcat/Km，和(8)約5.1±0.4μM的NADH的Km；和具有至少一個(gè)分子量為(a)由質(zhì)譜分析確定的約37.1kDa的分子量，(b)由變焦電泳確定的約7.4的pI，和(c)SEQ ID NO7的十四個(gè)N末端氨基酸序列，并且其能夠被降解形成具有SEQ ID NO8到SEQ ID NO19的氨基酸序列的片段。
此外，同時(shí)還共純化了該蛋白質(zhì)的末端截去類似物。這種末端截去類似物缺少末端十肽，但是與完整蛋白一樣起作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“酶”是指“催化功能生物分子”，包括完整天然(或天然大小)分子和保留功能的末端截去類似物，即有約10個(gè)氨基酸從至少一端被刪除。特別對(duì)應(yīng)于黃色桿菌屬Py2 S-ADH，上述術(shù)語(yǔ)“酶”包括完整天然分子和末端截去類似物。
得自X.anthobacter Py2 S-ADH的底物特異性和抑制在丙酮還原檢測(cè)中，NADH而非NADPH可以作為電子供體(數(shù)據(jù)未顯示)。用于還原丙酮為異丙醇的pH最佳值是6.2，而逆反應(yīng)的最佳值為7.8(數(shù)據(jù)未顯示)。從檢測(cè)中收集的數(shù)據(jù)中計(jì)算出動(dòng)力學(xué)常數(shù)，在檢測(cè)中，NADH或丙酮的濃度保持在固定的飽和濃度，而在各個(gè)檢測(cè)中丙酮或NADH的濃度是變化的。計(jì)算得到表觀Km、Vmax、kcat和kCAT/Km分別為144±18μM、43.4±1.2μmol還原丙酮·min-1·mg-1蛋白、30.4sec-1和2.1×105。NADH的Km計(jì)算為5.1±0.4μM。在一些作為可選擇的底物被評(píng)價(jià)的化合物中，S-ADH具有酮和二級(jí)醇的特異性(附圖3和4)。在附圖4中，“NA”表示“沒(méi)有活性”，即對(duì)被測(cè)底物“沒(méi)有活性”。如所示，在比較中，一級(jí)醇表現(xiàn)為無(wú)活性或極低的活性。在酮和二級(jí)醇中，2-戊酮和2-戊醇分別具有還原和氧化反應(yīng)的最高特異性活性。
作為結(jié)果，該酶產(chǎn)生活性的唯一被檢測(cè)一級(jí)醇是1-丁醇，并且測(cè)定的特異活性(在pH7.8下)僅為1.7±0.2μmol氧化丁醇·min-1·mg-1蛋白。沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)于乙醇、1-丙醇或1-戊醇的活性。因此對(duì)于C2-C5直鏈一級(jí)醇的平均特異活性至多約0.475氧化醇·min-1·mg-1蛋白。檢測(cè)對(duì)于C3-C5直鏈二級(jí)醇的活性。該酶對(duì)這三種醇都具有活性，并且測(cè)定的特異性活性值(在pH7.8下)為24±1.8μmol氧化2-丙醇·min-1·mg-1蛋白、21±3.6μmol氧化2-丁醇·min-1·mg-1蛋白和37±1.1μmol氧化2-戊醇·min-1·mg-1蛋白。因此，對(duì)于C3-C5直鏈二級(jí)醇的平均特異性活性為至少25氧化醇·min-1·mg-1蛋白。因此，對(duì)于該S-ADH而言，當(dāng)pH7.8時(shí)在相同條件下分別用C3-C5直鏈二級(jí)醇和C2-C5直鏈一級(jí)醇進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，最小平均二級(jí)醇對(duì)一級(jí)醇的特異性活性比可能為25/0.475＝52.6；在這些條件下進(jìn)行檢測(cè)，具有至少約50∶1的二級(jí)醇對(duì)一級(jí)醇的平均比活性。
采用飽和濃度的丙酮，存在濃度為丙酮Km值13倍的甲醇、乙醇、和1-丙醇時(shí)，S-ADH活性并不被抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。由于乙醇是診斷氣酮檢測(cè)中極可能的抑制劑，在存在高濃度乙醇情況下檢測(cè)S-ADH活性。存在41mM乙醇時(shí)，其相當(dāng)于人類呼吸中發(fā)現(xiàn)的乙醇的最高濃度500ppm(v/v)氣態(tài)乙醇，S-ADH為82-85％活性。
用分光光度計(jì)研究S-ADH的丙酮檢測(cè)極限，來(lái)評(píng)價(jià)該酶檢測(cè)人類呼吸中存在的最低水平丙酮的活性。加入大量酶(4U)時(shí)，NADH消耗反應(yīng)時(shí)間少于20s，并且丙酮濃度線性(相關(guān)系數(shù)＝0.99997)范圍在0.058-5.8ppm(w/v)之間。丙酮檢測(cè)范圍的較低端(0.058-0.29ppm(w/v))處在診斷性的呼吸丙酮分析所需的檢測(cè)參數(shù)內(nèi)(空腹個(gè)體的較低的呼吸丙酮水平為0.3-0.8ppm(w/v))。而且，這種檢測(cè)方法的靈敏度受限，因此其他檢測(cè)方法(如電氣化學(xué)方法)利用S-ADH反應(yīng)來(lái)檢測(cè)低濃度丙酮，可能提高靈敏度。
自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株的S-ADH的穩(wěn)定性并入生物傳感器的酶的活性是確定其商業(yè)可用性的主要參數(shù)之一。保持酶的活性會(huì)影響存儲(chǔ)費(fèi)用、操作和加工過(guò)程。因而有必要尋找適合在室溫下長(zhǎng)期穩(wěn)定S-ADH活性的條件，優(yōu)選以干燥形式。在凍干和存儲(chǔ)過(guò)程中，加入維持酶周圍的離子和親水環(huán)境的相容性溶液可以提高酶的穩(wěn)定性。從附圖5中可以看出，純化的S-ADH被凍干，并在凍干后1天內(nèi)重懸和分析，相對(duì)于非凍干的對(duì)照，其保留約60-70％活性。二糖海藻糖的存在對(duì)于保持酶活性十分有益，樣本在室溫下放置65天和213天后，仍分別保留約100％和70％的活性，而不含添加劑的S-ADH樣本在室溫下放置65天后完全失活。在個(gè)別試驗(yàn)中，S-ADH被加入到各種組分的混合物中，這種混合物與最近描述用于制備薄膜、絲網(wǎng)印刷酶電極的配方極其相似。該配方包括添加劑羥乙基纖維素(2％w/v)、DEAE-右旋糖苷(10mg/mL)和乳糖醇(10mg/mL)，該混合物可以風(fēng)干而不必凍干。采用該混合物，S-ADH在室溫下存放23天后仍100％保留其活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
生化比較自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株菌株P(guān)y2的S-ADH與其他S-ADH酶X.autotrophicus菌株P(guān)y2的S-ADH是第一種從CO2依賴性的利用丙酮的生物體中純化的S-ADH酶。這種酶與先前描述的仲醇脫氫酶具有相似分子量和底物特異性。來(lái)自假單胞菌屬sp.6307(ATCC 21439)、母牛分枝桿菌JOB-5(ATCC 29678)、產(chǎn)朊假絲酵母(ATCC 32195)、紅球菌rhodochrous PNKb1(Ashraf & Murrell(1990))的NAD依賴性仲醇脫氫酶和來(lái)自布氏熱厭氧菌的NADP依賴性的S-ADH都具有37-48kDa的亞單位分子量。從M.vaccae菌株JOB-5純化的S-ADH為37kDa分子量(亞基)，受丙烷增加誘導(dǎo)。不同于黃色桿菌屬S-ADH，M.vaccae酶表現(xiàn)具有除了仲醇特異性之外的部分伯醇特異性，雖然伯醇具有相當(dāng)高的Km值(如2-丙醇和1-丙醇分別為Km＝0.05mM和Km＝8.1mM)。相應(yīng)地，丙酮還原的Km計(jì)算為0.3mM。另一個(gè)不同點(diǎn)在于還原和氧化反應(yīng)的最佳pH。M.vaccae JOB-5具有氧化2-丙醇的最佳pH10-10.5和還原丙酮的最佳pH7.5-8.5。另一個(gè)仲醇脫氫酶分離自利用丙烷的細(xì)菌R.rhodochrousPNKb1(Mr＝42kDa)，雖然這種酶具有幾乎相同的仲醇和伯醇特異性(如1-丙醇和2-丙醇分別為Km＝18mM和Km＝12mM)。與利用丙烷的生物中的S-ADH酶不同，來(lái)自甲基營(yíng)養(yǎng)菌假單胞菌屬6307(ATCC21439)(Mr＝48kDa)的S-ADH被證實(shí)具有高仲醇特異性，而對(duì)伯醇無(wú)活性。還表明存在高濃度乙醇時(shí)該酶大部分未被抑制(存在10mM和100mM乙醇時(shí)分別為0％和30％抑制)。得自布氏熱厭氧菌(Mr＝40kDa)的S-ADH具有與得自黃色桿菌屬的S-ADH極其相似的底物特異性，除了其更多利用NADPH而不是NADH。眾所周知，得自布氏熱厭氧菌的S-ADH是少數(shù)已經(jīng)被克隆和測(cè)序的S-ADH酶之一(Genebank登錄號(hào)A32973)。其他可獲得的S-ADH酶(S-ADHs)包括在US5,763,236中描述的得自Candida parapsilos的S-ADH；其序列可以在Genebank登錄號(hào)AB010636中得到；得自產(chǎn)乙醇熱厭氧菌39E(ATCC 33223)的S-ADH(Genebank登錄號(hào)U49975)；和得自Clostridum beijerinckii的S-ADH(Genebank登錄號(hào)M84723)。相應(yīng)地，得自布氏熱厭氧菌和產(chǎn)乙醇熱厭氧菌的S-ADHs(這兩種酶具有相同的N末端序列)的N末端氨基酸序列中前15個(gè)氨基酸殘基中(MKGFAMLSIGKVGWI)的5個(gè)與得自自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株的S-ADH的N末端序列(MKGLVYRGPGKKALE)相匹配。
從文獻(xiàn)可以看出，有許多對(duì)丙酮特異的S-ADH酶。這種S-ADH酶可以被加入到生物傳感器中。除此之外，發(fā)現(xiàn)通過(guò)以丙酮、異丙醇或乙烷作為生長(zhǎng)物質(zhì)富集從土壤中分離得到的培養(yǎng)物收集菌株和一些新菌株具有S-ADH活性(數(shù)據(jù)未顯示)。為了比較和評(píng)價(jià)這些S-ADH活性的相對(duì)特異性，用各種酮或醇底物分析從黃色桿菌屬中純化的S-ADH和從異丙醇中生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株(TDCCIP-1(和兩種其他菌株數(shù)據(jù)未顯示))、丙烷中生長(zhǎng)的M.vaccae JOB-5和布氏熱厭氧菌S-ADH的部分純化制備物或含有S-ADH的細(xì)胞提取物。如表5所示，得自自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株、菌株IP-1、M.vaccae JOB-5和布氏熱厭氧菌的S-ADH酶都具有可忽略和實(shí)質(zhì)上相對(duì)較低的伯醇底物活性。雖然用于丙酮監(jiān)控的S-ADH反應(yīng)平衡會(huì)由于丙酮還原(即NAD(P)H過(guò)量)而發(fā)生變化，伯醇主要是乙醇的低特異性優(yōu)選用于降低可能的抑制作用。長(zhǎng)鏈酮(即2-丁酮、2-戊酮和3-戊酮)會(huì)激活所有酶，但是這意義不大，因?yàn)檫@些化合物一般不存在于人類呼吸中。有趣的是，得自布氏熱厭氧菌的S-ADH對(duì)短鏈酮較有活性，這與對(duì)長(zhǎng)鏈酮較有活性的得自黃色桿菌屬的S-ADH的活性相反。應(yīng)當(dāng)指出，布氏熱厭氧菌的S-ADH是一種商業(yè)上可得的S-ADH(Sigma)。這種酶在本發(fā)明的生物傳感器中的應(yīng)用將會(huì)在下文進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。因此，如上描述分離的自養(yǎng)黃色桿菌的S-ADH酶代表一種能夠通過(guò)本發(fā)明的偶聯(lián)酶系統(tǒng)相對(duì)地選擇檢測(cè)哺乳動(dòng)物樣本中的長(zhǎng)鏈酮的特定酶。
表5.細(xì)菌仲醇脫氫酶的底物特異性。

a在pH6.2時(shí)，以2.5mM底物和0.2mM NADH(NADPH用于布氏熱厭氧菌檢測(cè))雙重計(jì)算酮還原率。
b在pH6.2存在等量乙醇(2.5mM)時(shí)，雙重計(jì)算酮還原率。
c在pH6.2時(shí)，以2.5mM底物和0.2mM NAD+(NADP+用于布氏熱厭氧菌檢測(cè))雙重計(jì)算乙醇氧化率。
dNA，未檢測(cè)到活性e在pH6.2時(shí)，以5mM底物和0.2mM NADH或NAD+計(jì)算的酮還原率和乙醇氧化率。
電化學(xué)監(jiān)控S-ADH反應(yīng)酶-底物相互作用的電化學(xué)傳導(dǎo)提供了一種常規(guī)分析方法來(lái)檢測(cè)各種底物。如前所述，基于脫氫酶的酶反應(yīng)一般需要用于酶促反應(yīng)的化學(xué)計(jì)算量的吡啶核苷酸協(xié)同因子NADH或NADPH。在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多生物傳感器，它們基于這些輔酶的電化學(xué)檢測(cè)。如附圖6所示，以與其他生物傳感器相似的方式工作，NAD(P)H消耗的電化學(xué)檢測(cè)可以偶聯(lián)電極與S-ADH酶促反應(yīng)，產(chǎn)生一種以底物特異性方式量化丙酮的方法。為了評(píng)價(jià)附圖6中所示的方案，用碳微電極實(shí)施快速掃描環(huán)流伏安法(掃描速度＞100V/s)來(lái)測(cè)定由布氏熱厭氧菌的S-ADH催化的NADPH的丙酮依賴性消耗。通過(guò)持續(xù)進(jìn)行伏安法掃描酶反應(yīng)混合物來(lái)測(cè)定由布氏熱厭氧菌的S-ADH催化的NADPH的丙酮依賴性氧化的電化學(xué)檢測(cè)。這些掃描說(shuō)明陽(yáng)極峰區(qū)的持續(xù)變化，這些變化取決于丙酮的加入。陽(yáng)極電流隨時(shí)間過(guò)去而降低，表明當(dāng)S-ADH催化丙酮還原為異丙醇時(shí)，NADPH被消耗(氧化)。從約1200mV到0mV進(jìn)行掃描，并測(cè)定陽(yáng)極電流；在一分鐘內(nèi)獲得19個(gè)掃描數(shù)據(jù)。每次掃描的起始電流(約1200mV)有規(guī)律地變化，在1分鐘時(shí)檢測(cè)為約-6.5nA和在19分鐘時(shí)檢測(cè)為-0.2nA。對(duì)于每次掃描，顯著的截止(ceased)電流約600mV(此后檢測(cè)為約0nA)。為了進(jìn)一步確定NADPH消耗被精確測(cè)定，在相同反應(yīng)條件下用電化學(xué)和分光光度監(jiān)控反應(yīng)。如圖7所示，用兩種檢測(cè)方法獲得的反應(yīng)數(shù)據(jù)之間十分吻合，說(shuō)明丙酮特異的、NADPH依賴性的S-ADH反應(yīng)可以被精確地電化學(xué)監(jiān)控。用于測(cè)試布氏熱厭氧菌的S-ADH的伏安法掃描方法用得自自養(yǎng)黃色桿菌Py2的S-ADH重復(fù)，以確定NADH依賴性S-Adh反應(yīng)可以通過(guò)電化學(xué)監(jiān)控。至于NADPH依賴性的酶，持續(xù)掃描含有得自自養(yǎng)黃色桿菌Py2的S-ADH的反應(yīng)混合物，結(jié)果如本文的附圖8所示，對(duì)應(yīng)于NADH的酶催化氧化，陽(yáng)性電流持續(xù)地丙酮依賴性降低。
如上所述NAD(P)H依賴性S-ADH反應(yīng)的電化學(xué)檢測(cè)提供必要的基本分析方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)一些酶電極結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)?？傊?，本領(lǐng)域所描述的基于脫氫酶的生物傳感器含有覆蓋了催化性酶和介質(zhì)化合物的混合物或?qū)拥膶?dǎo)電電極。當(dāng)包被的電極與含有底物的樣本接觸時(shí)，該酶對(duì)底物起催化作用，介質(zhì)化合物將電荷轉(zhuǎn)移到該電極，產(chǎn)生相對(duì)于參比電極的讀出信號(hào)。這種活性電極優(yōu)選由具有導(dǎo)電性的碳組成，它可以被配制成絲網(wǎng)印刷油墨或者其他可采用低成本生產(chǎn)方法和最終可任意使用的配方/組合物。現(xiàn)有技術(shù)描述的特別適用于NAD(P)H的介質(zhì)化合物包括viologen衍生物、醌衍生物、吩嗪、osmium phendione、硫堇、茜素綠和Meldola藍(lán)(Katakis & Dominguez，Mikrochim.Acta12611-32(1997))。如前提及的介質(zhì)通過(guò)在還原電位中提高NAD(P)H電氧化動(dòng)力速率，提高電極的整體靈敏度。研究使用介質(zhì)Meldola藍(lán)(MB)電化學(xué)地檢測(cè)S-ADH反應(yīng)的可行性(如圖9所示)。
用具有吸收了Meldola藍(lán)的玻璃態(tài)碳電極測(cè)定NADH濃度來(lái)實(shí)施計(jì)時(shí)安培分析法。如附圖10所示，用改進(jìn)的電極測(cè)定的電流反應(yīng)與存在的NADH濃度線性相關(guān)。還檢測(cè)和確定1mM NADH的線性關(guān)系(數(shù)據(jù)未顯示)。由于NADH的消耗與丙酮濃度成比例(即由S-ADH催化的反應(yīng))，這些結(jié)果說(shuō)明Meldola藍(lán)改進(jìn)的碳電極提供一種丙酮量化的介導(dǎo)電極系統(tǒng)。作為進(jìn)一步研究此并構(gòu)建實(shí)用的、一次性的丙酮傳感器的方法，計(jì)時(shí)安培分析試驗(yàn)采用填充了介質(zhì)Meldola藍(lán)的絲網(wǎng)印刷碳電極(下文稱為“MB-SPCE”)來(lái)實(shí)施。在附圖11中所示的是丙酮依賴的S-ADH反應(yīng)數(shù)據(jù)，是采用MB-SPCE一次性電極檢測(cè)條獲得的。丙酮反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.965，電極間的可重復(fù)性近6％。這些數(shù)據(jù)表明丙酮特異酶系統(tǒng)可以用實(shí)用的電極系統(tǒng)通過(guò)電化學(xué)監(jiān)控。
設(shè)計(jì)用于丙酮測(cè)定的實(shí)用裝置，在其中監(jiān)控丙酮依賴的NADH消耗。該裝置采用商業(yè)上可得的、一次性葡萄糖傳感器系統(tǒng)(一種已知能指示NADH濃度的血糖監(jiān)控儀，和用于其中而制備的血糖測(cè)試條，它們都由摩洛哥，貝德福德的Abbott實(shí)驗(yàn)室的MediSense有限公司生產(chǎn))來(lái)測(cè)定由S-ADH催化的對(duì)丙酮響應(yīng)NADH消耗。結(jié)果示于附圖12中，表示由便攜式監(jiān)控儀和一次性測(cè)試條測(cè)定的丙酮依賴的NADH消耗。這說(shuō)明使用批量生產(chǎn)的電極和監(jiān)控儀構(gòu)建測(cè)量丙酮的實(shí)用裝置的可行性，用以指示和/或記錄丙酮特異性酶系統(tǒng)的電流。
與根據(jù)NAD(P)H的消耗來(lái)電化學(xué)監(jiān)控S-ADH反應(yīng)不同，還可能通過(guò)電化學(xué)測(cè)定在一定電壓下陰極電流密度的升高來(lái)監(jiān)控NAD(P)+形成，該電流密度直接與NAD(P)+濃度成比例。該檢測(cè)方案的缺點(diǎn)在于氧氣常常在NAD(P)+電化學(xué)還原所需的負(fù)電壓電位產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾反應(yīng)。此外，電還原NAD(P)+形式二聚體的自由基，導(dǎo)致酶電極積垢。由于這些原因，包括NAD(P)+電化學(xué)再生的電化學(xué)試驗(yàn)常常采用電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)在陽(yáng)極進(jìn)行，使電壓遠(yuǎn)離干擾峰。但是，由于人的呼吸中總存在氧氣，丙酮生物傳感器的這些選擇不進(jìn)一步改進(jìn)不具有實(shí)用性。
另一種監(jiān)控NAD(P)+形成的方法是間接將其他酶的活性與S-ADH酶反應(yīng)偶聯(lián)。如附圖13所示，NAD(P)+形成可以與乳酸脫氫酶催化偶聯(lián)來(lái)生成丙酮酸鹽。然后丙酮酸鹽被丙酮酸氧化酶氧化生成乙酰磷酸鹽和CO2，伴隨著H2O2形成。然后H2O2被電化學(xué)氧化并通過(guò)任何本領(lǐng)域熟知方法在電極處被檢測(cè)。在該方法中，NAD(P)+的丙酮依賴形成(由S-ADH催化)間接地與H2O2生成偶聯(lián)。為了研究這些酶反應(yīng)之間的偶聯(lián)，該反應(yīng)混合物(含有偶聯(lián)酶和試劑)在存在辣根過(guò)氧化酶(HRP)的情況下用NADH依賴的得自自養(yǎng)黃色桿菌Py2的S-ADH制備。HRP催化H2O2還原和電子供體(顯色染劑)的氧化，因此可以通過(guò)分光光度監(jiān)控該反應(yīng)。附圖14說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，其中加入丙酮時(shí)觀察到吸收值增大，這對(duì)應(yīng)H2O2形成。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，將偶聯(lián)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)所需的滯后時(shí)間縮短到少于20s(數(shù)據(jù)未顯示)。用蘋(píng)果酸酶替代乳酸脫氫酶，改進(jìn)NADPH依賴的得自布氏熱厭氧菌的S-ADH的偶聯(lián)反應(yīng)。蘋(píng)果酸酶是NADP+依賴的，催化蘋(píng)果酸鹽氧化和脫羧形成丙酮酸鹽。如上所述，丙酮酸鹽被丙酮酸氧化酶進(jìn)一步氧化形成H2O2。此時(shí)，NADP+形成間接與H2O2生成偶聯(lián)。采用該偶聯(lián)酶系統(tǒng)，觀察到不依賴于丙酮的背景吸收值的增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在加入丙酮后，觀察到H2O2形成比率增加約為背景比率的5倍。(小的H2O2形成背景比率(丙酮依賴的)可能由于蘋(píng)果酸酶催化的NADPH氧化酶(心肌黃酶)活性)。采用位點(diǎn)指導(dǎo)的突變改變偶聯(lián)酶對(duì)NADH和NADPH的特異性(Holmberg等，蛋白質(zhì)工程，12(10)851-6(1999))，乳酸脫氫酶和蘋(píng)果酸酶的吡啶核苷酸在各個(gè)偶聯(lián)的S-ADH反應(yīng)中的依賴性(即得自自養(yǎng)黃色桿菌的S-ADH是NADH依賴的，并與NADH依賴的乳酸鹽脫氫酶偶聯(lián)；而得自布氏熱厭氧菌的S-ADH是NADPH依賴的，并與NADPH依賴蘋(píng)果酸酶偶聯(lián))可以相互變換。另外，可以使用天然存在的乳酸脫氫酶或蘋(píng)果酸酶的同系物，它們對(duì)NADH和NADPH不具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶禺愋?B.I.Lee等，分子生物學(xué)雜志，307(5)1351-62(2001))。
除了上述兩種偶聯(lián)的S-ADH酶系統(tǒng)外，其他偶聯(lián)的酶系統(tǒng)也可以被用于本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)。在附圖15中所示的方案中，S-ADH催化丙酮還原，生成NAD(P)+，然后NAD(P)+通過(guò)適當(dāng)?shù)倪拎ず塑账嵋蕾囆悦摎涿?NADH或NADPH特異性，取決于S-ADH所需的協(xié)同因子)還原成NAD(P)H。然后脫氫酶反應(yīng)的氧化產(chǎn)物作為氧化酶的底物，通過(guò)進(jìn)一步氧化該分子生成H2O2。在該偶聯(lián)方案中使用的其他酶包括但不限于丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1)，其催化丙酮酸鹽的NAD+依賴形成，然后丙酮酸鹽被丙酮酸氧化酶氧化；酵母氨酸脫氫酶(EC 1.5.1.7)，其催化賴氨酸的NAD+依賴形成，然后賴氨酸進(jìn)一步被賴氨酸氧化酶(EC1.4.3.14)氧化形成H2O2；蘋(píng)果酸脫氫酶(EC 1.1.1.37)，其催化草酰乙酸鹽的NAD+依賴形成，然后草酰乙酸鹽被草酰乙酸鹽脫羧酶(EC4.1.1.3)脫羧成丙酮酸鹽，丙酮酸鹽進(jìn)一步被丙酮酸氧化酶氧化形成H2O2；和丙三醇脫氫酶(EC 1.1.1.6)，其催化二羥丙酮的NAD+依賴形成，然后二羥丙酮被半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.9)氧化成甲基乙二醛。在這些酶中，在一個(gè)酶偶聯(lián)方案中檢測(cè)丙氨酸脫氫酶，用丙氨酸脫氫酶替代乳酸脫氫酶，來(lái)證實(shí)這種改變的偶聯(lián)方案在與S-ADH合作中能起作用。采用這種變化的酶系統(tǒng)，在加入丙酮時(shí)觀察到吸收值上升，其對(duì)應(yīng)于H2O2形成(數(shù)據(jù)未顯示)。
與H2O2形成偶聯(lián)的S-ADH反應(yīng)的非電化學(xué)監(jiān)控還可以構(gòu)建用于非電化學(xué)測(cè)定丙酮的實(shí)用裝置。研究是否可以通過(guò)丙酮特異的偶聯(lián)的酶系統(tǒng)制備用于測(cè)定丙酮的實(shí)用的非電化學(xué)裝置，構(gòu)建一個(gè)裝置來(lái)測(cè)定丙酮依賴性的H2O2形成。該裝置組合了血糖監(jiān)控儀和所生產(chǎn)的用于該控制儀的測(cè)試條(都由加利福尼亞的Milpitas的Lifescan有限公司制造)與H2O2生成系統(tǒng)，其中S-ADH催化丙酮與乳酸脫氫酶和丙酮酸氧化酶偶聯(lián)。在該裝置中，酶催化H2O2形成與過(guò)氧化物酶和染料偶聯(lián)，當(dāng)與H2O2接觸時(shí)反應(yīng)產(chǎn)生有色的反應(yīng)產(chǎn)物。然后該裝置通過(guò)反射光度讀取器量化有色產(chǎn)物。附圖16顯示該結(jié)果，表示由便攜式監(jiān)控儀和一次性測(cè)試條測(cè)定的丙酮依賴的H2O2形成。無(wú)論加入丙酮(◆)(數(shù)據(jù)的線性回歸得到y(tǒng)＝0.0457x+1.9048)或者等量H2O2(■)(數(shù)據(jù)的線性回歸得到y(tǒng)＝0.044x+1.3333)，該監(jiān)控儀讀數(shù)是相同的，表明酶系統(tǒng)沒(méi)有對(duì)裝置讀數(shù)產(chǎn)生干擾并且該酶系統(tǒng)能夠精確地催化丙酮轉(zhuǎn)化為H2O2。這說(shuō)明構(gòu)建用于丙酮測(cè)定的實(shí)用非電化學(xué)裝置是可行的，該裝置采用批量生產(chǎn)的電極和監(jiān)控儀來(lái)定量指示和/或記錄丙酮特異性酶系統(tǒng)的反應(yīng)產(chǎn)物濃度。
與H2O2形成偶聯(lián)的S-ADH反應(yīng)的電化學(xué)監(jiān)控電化學(xué)檢測(cè)H2O2被充分研究了多年，并且已經(jīng)被用于一些商業(yè)應(yīng)用。因此上述酶系統(tǒng)(即與H2O2形成偶聯(lián)的S-ADH反應(yīng))代表一種采用已經(jīng)建立的電化學(xué)方法學(xué)酶學(xué)監(jiān)控丙酮的新手段。最后，通過(guò)計(jì)時(shí)安培分析電化學(xué)法，用圓盤(pán)形鉑電極監(jiān)控丙酮依賴的H2O2形成，其由與乳酸脫氫酶和丙酮酸氧化酶偶聯(lián)的S-ADH催化，在此稱之為“3-酶系統(tǒng)”。附圖17表示由3-酶系統(tǒng)催化的丙酮依賴的電流反應(yīng)。電流與丙酮濃度線性相關(guān)，當(dāng)丙酮濃度在0-200μM時(shí)具有相關(guān)系數(shù)0.997。進(jìn)行8組獨(dú)立的測(cè)定，當(dāng)丙酮濃度范圍在10-200μM時(shí)，計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方差(％CV，方差系數(shù))小于4％。定義99％置信限度時(shí)，檢測(cè)方法的極限(MDL)是3.3μM，這對(duì)于檢測(cè)人類呼吸中等量的氣態(tài)丙酮具有足夠靈敏度。用較高丙酮濃度(達(dá)到500μM)重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，保持線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2＝0.922)和可重復(fù)性(所有濃度范圍的CV＝5％，各個(gè)濃度測(cè)定8次)(數(shù)據(jù)未顯示)。
3酶系統(tǒng)的電化學(xué)分析結(jié)果直接與標(biāo)準(zhǔn)濃度H2O2的電流反應(yīng)比較，以確定是否3酶系統(tǒng)能夠精確地將丙酮轉(zhuǎn)化為H2O2。如附圖18所示，由于加入丙酮(◆)或H2O2(■)的電流反應(yīng)幾乎是相同的，丙酮和H2O2數(shù)據(jù)的線性回歸得到幾乎相同的方程，分別為y＝1.1213x+9.8416和y＝1.1161x+13.442。這表明該反應(yīng)已經(jīng)完成，丙酮通過(guò)3-酶系統(tǒng)按化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化成H2O2。
如上所述進(jìn)行分析，但是存在可能的干擾化合物。僅僅測(cè)量丙酮、以及丙酮加10mM乙醇、丙酮加50μM異丙醇、丙酮加50μM異丁醇、丙酮加50μM丁酮、丙酮加50μM戊酮時(shí)的電流反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果說(shuō)明乙醇、異丙醇、異丁醇并不干擾丙酮的測(cè)定。顯著地，乙醇以超過(guò)丙酮1000倍(10mM)存在時(shí)，不起抑制作用。乙醇是存在于人類呼吸中的主要揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。當(dāng)存在其他酮時(shí)，由于在電化學(xué)檢測(cè)中S-ADH并不區(qū)分這些酮底物(例如，50μM丁酮的電流反應(yīng)等價(jià)于50μM丙酮)，丙酮的電流反應(yīng)隨著其他酮的濃度增加而加強(qiáng)。但是，在人類呼吸中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著性水平的其他酮，因此并不妨礙呼吸生物傳感器的應(yīng)用。
如先前提及的電化學(xué)測(cè)量丙酮依賴性NADH消耗，上述的3-酶系統(tǒng)提供實(shí)現(xiàn)特定商業(yè)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)所必需的基本分析方法?；钚噪姌O優(yōu)選由導(dǎo)電性碳構(gòu)成，其可以配制成絲網(wǎng)印刷油墨(即制成條狀電極)或者其他能夠通過(guò)低成本加工方法生產(chǎn)和最終隨意使用的配方或組合物。為了實(shí)現(xiàn)這些最終目的，一些低成本電極材料用3-酶系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以證明該酶系統(tǒng)用于測(cè)量丙酮的商業(yè)可用性。
附圖19表示用絲網(wǎng)印刷鍍鉑碳電極通過(guò)3酶系統(tǒng)測(cè)定的對(duì)應(yīng)于丙酮濃度的電流反應(yīng)。電流反應(yīng)與存在的丙酮的濃度線性相關(guān)。誤差桿根據(jù)由8根電極(單獨(dú)使用)測(cè)定的8個(gè)測(cè)量結(jié)果計(jì)算得到?？芍貜?fù)性由電極與電極的差異決定，主要在于電極表面的濕潤(rùn)度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)預(yù)濕潤(rùn)電極5min可以顯著地提高了可重復(fù)性。其他與絲網(wǎng)印刷鍍鉑碳電極非常相似的被評(píng)價(jià)材料是導(dǎo)電性碳布或紙，其上結(jié)合了高導(dǎo)電性的加載鉑的毫微顆粒的石墨顆粒(加載10-20％(w/w))。這些布或紙被穿孔并粘貼到絲網(wǎng)印刷碳電極上，與3-酶系統(tǒng)合并使用來(lái)測(cè)量丙酮。附圖20表示通過(guò)3酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)化丙酮產(chǎn)生的H2O2的電極電流反應(yīng)(數(shù)據(jù)回歸得到y(tǒng)＝6.1601x+18.889)。為了有助于濕潤(rùn)電極的表面，一些電極在使用前表面活性劑預(yù)處理以降低石墨-鉑表面的疏水性。已經(jīng)證實(shí)這種處理有助于濕潤(rùn)電極的表面而不會(huì)降低電極的靈敏度(數(shù)據(jù)未顯示)。用3酶系統(tǒng)評(píng)價(jià)的第三種電極是含有介質(zhì)鈷酞菁的絲網(wǎng)印刷碳電極。附圖21表示使用該電極的丙酮濃度的電流反應(yīng)曲線。顯示由于3酶系統(tǒng)中存在的NADH的電化學(xué)反應(yīng)的偏移。當(dāng)存在不同的固定濃度的NADH時(shí)，在應(yīng)用相同電壓下記錄電流反應(yīng)來(lái)進(jìn)一步研究該效果(數(shù)據(jù)未顯示)。在此已證明鈷酞菁改進(jìn)的絲網(wǎng)印刷碳電極對(duì)NADH有電活化作用(在H2O2測(cè)定的電壓下)，因此存在高濃度NADH會(huì)干擾丙酮測(cè)定。但是，在3酶系統(tǒng)的試劑條件下，存在的低濃度NADH電流反應(yīng)以確定方式(持續(xù)地)偏離，其中這可以從電流反應(yīng)中被減去而不需要調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)精確度。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明鉑電極或鉑化碳電極不是唯一的在檢測(cè)由3酶系統(tǒng)催化的丙酮依賴的H2O2形成中起作用的電極材料。其他用于檢測(cè)H2O2的介質(zhì)改進(jìn)絲網(wǎng)印刷碳電極包括二茂絡(luò)鐵及其衍生物、醌及其衍生物、與多聚(乙烯基吡啶)偶聯(lián)的二嘧啶鋨、potassiumhexacyanoferrate、二茂鎳、亞甲藍(lán)、亞甲綠和吩嗪硫酸甲酯。
氣態(tài)丙酮的基于酶的電化學(xué)檢測(cè)如先前提及的，基于酶的電化學(xué)傳感器的重要特征在于其能夠量化氣態(tài)丙酮的濃度。由于酶電極僅在液態(tài)下響應(yīng)，兩個(gè)能將丙酮?dú)怏w轉(zhuǎn)化成液態(tài)的取樣系統(tǒng)被研究，從而使樣本被直接或間接導(dǎo)入酶電極系統(tǒng)，其中產(chǎn)生與其對(duì)應(yīng)的電流(與存在的丙酮的濃度成比例)。這兩種取樣系統(tǒng)的原理(在下文更加詳細(xì)描述)遵循用于氣液轉(zhuǎn)化的Henry定律常數(shù)kh=ca·pg-1]]>其中kh是丙酮的Henry定律常數(shù)(24M·atm-1，由NIST(國(guó)家技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì))報(bào)道)，ca是液態(tài)(M)丙酮的濃度，而pg是氣態(tài)丙酮的局部壓強(qiáng)(atm)。作為結(jié)果，當(dāng)氣態(tài)丙酮樣本與液態(tài)接觸時(shí)，氣液丙酮濃度達(dá)到Henry定律所表述的平衡。人類呼吸中的氣態(tài)丙酮的濃度范圍是0.5-10ppm(v/v)，需要通過(guò)生物傳感器量化。因此，在平衡條件下，0.5-10ppm(v/v)的氣態(tài)丙酮等于約10-200μM的液態(tài)丙酮。這種關(guān)系的依據(jù)用氣態(tài)色譜證實(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)濃度氣態(tài)丙酮通過(guò)一塊預(yù)先用確定體積的液體緩沖液濕潤(rùn)的聚氨酯泡沫。附圖22是用于生成氣態(tài)丙酮標(biāo)準(zhǔn)的儀器的圖示。將已知量的丙酮注射到含有濕潤(rùn)空氣的校準(zhǔn)安全氣袋中，并蒸發(fā)。蒸汽以固定速率釋放并通過(guò)濕潤(rùn)的泡沫。然后測(cè)定液體中的丙酮濃度，并確定其與起始丙酮?dú)鈶B(tài)濃度的關(guān)系。采用這種轉(zhuǎn)化策略(即濕潤(rùn)泡沫)，證明了在氣流速度范圍(0.5-5.0L/min)和氣體體積(≥0.5L)時(shí)，氣態(tài)丙酮轉(zhuǎn)化為液態(tài)達(dá)到理論平衡濃度值。不用泡沫而用薄的液膜(50μL)來(lái)重復(fù)該試驗(yàn)，其中丙酮?dú)鈶B(tài)樣本以極細(xì)的氣流噴到液體上。采用這種轉(zhuǎn)化策略，氣態(tài)丙酮轉(zhuǎn)化成薄液膜，獲得接近平衡的濃度值。然后這些數(shù)據(jù)用于設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化和通過(guò)3酶系電化學(xué)量化氣態(tài)丙酮的恰當(dāng)?shù)囊后w體積和條件(模擬人類呼吸)。
附圖23表示對(duì)丙酮?dú)怏w的計(jì)時(shí)安培分析響應(yīng)，用聚氨酯泡沫提取氣體樣本的手段。使用3酶系統(tǒng)作為基本變換器將被轉(zhuǎn)化的丙酮轉(zhuǎn)換為H2O2，然后在350mV(比照Ag/AgCl)下，用圓盤(pán)形鉑電極電化學(xué)分析H2O2。在整個(gè)試驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)氣態(tài)丙酮濃度的電流反應(yīng)具有優(yōu)良的靈敏度和線性特征。數(shù)據(jù)線性回歸得到方程y＝19.181x+18.787，R2值為0.993。通過(guò)將氣態(tài)丙酮轉(zhuǎn)化為含有3酶系統(tǒng)的液膜來(lái)重復(fù)本試驗(yàn)。結(jié)果顯示在附圖24中，其中計(jì)時(shí)安培分析電流反應(yīng)與氣態(tài)丙酮濃度線性相關(guān)。數(shù)據(jù)線性回歸得到方程y＝26.931x+28.789，R2值為0.9966。這些結(jié)果說(shuō)明任何一種氣態(tài)取樣策略(也就是，濕潤(rùn)泡沫或液膜)都很好地作為精確地將丙酮?dú)怏w導(dǎo)入酶電極的系統(tǒng)，其中丙酮可以被電化學(xué)量化。
丙酮羧化酶的生物化學(xué)特性除了S-ADH之外，另一種適合在生物傳感器中使用的丙酮特異性酶為丙酮羧化酶。如上提及的，丙酮羧化酶是唯一能在各種需氧和厭氧細(xì)菌中催化丙酮羧化成β-酮酸乙酰乙酸的酶，這些細(xì)菌能夠以丙酮作為碳和能量來(lái)源生長(zhǎng)。許多這種生物體還能夠在異丙醇中生長(zhǎng)，如先前所述，仲醇脫氫酶催化異丙醇起始氧化為丙酮，然后丙酮接著羧化為乙酰乙酸。丙酮羧化酶可以通過(guò)公開(kāi)的方法從自養(yǎng)黃色桿菌中純化。丙酮羧化酶是一種以α2β2γ2四級(jí)結(jié)構(gòu)排列的包含三種多肽(19.6kDa、78.3kDa和85.3kDa)的復(fù)聚體酶，其羧化活性需要MgATP。該酶具有每毫克蛋白每分鐘消耗0.206μmol丙酮的Vmax值以及7.8μM(丙酮)、122μM(ATP)和4.17mM(CO2加重碳酸鹽)的表觀Km值。丁酮也是一種底物，其羧化率為丙酮羧化率的40％。也已經(jīng)從厭氧、光異養(yǎng)rhodobacter capsulatus菌株B10純化得到丙酮羧化酶，其在四級(jí)結(jié)構(gòu)(由19.5kDa、78.6kDa和85.2kDa的多肽組成的α2β2γ2復(fù)聚體)、動(dòng)力學(xué)參數(shù)(每毫克蛋白每分鐘消耗0.291μmol丙酮的Vmax值以及丙酮的Km為8.2μM)以及氨基酸序列(83％同一性)上與黃色桿菌屬酶幾乎相同。
用于電化學(xué)測(cè)量丙酮羧化酶反應(yīng)的方案丙酮的ATP依賴的羧化來(lái)形成乙酰乙酸，該反應(yīng)由丙酮羧化酶催化，不包括用于電化學(xué)檢測(cè)的完全氧化還原化學(xué)。為了可用于生物傳感器，需要開(kāi)發(fā)具有底物氧化或還原的偶聯(lián)酶反應(yīng)。如附圖25所示，丙酮羧化酶可被偶聯(lián)到β-羥基丁酸鹽脫氫酶，其中通過(guò)羧化反應(yīng)形成的乙酰乙酸隨后被該酶還原，伴隨NADH氧化。然后可以用上述用于S-ADH的方法電化學(xué)監(jiān)控NADH的丙酮依賴消耗。附圖26表示用該酶系統(tǒng)分光光度繪制NADH氧化與時(shí)間的比率。僅在加入丙酮后觀察到NADH的氧化，而加入乙醇(10mM)后沒(méi)有出現(xiàn)比率下降，表明乙醇不抑制該反應(yīng)。該酶系統(tǒng)對(duì)丙酮具有高度特異性，但是其他化合物(如1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇和2-丁醇)不具有活性，也不抑制丙酮羧化活性。丁酮一般作為以丙酮羧化率的40％被羧化的底物，采用偶聯(lián)酶系統(tǒng)時(shí)具有約丙酮的3-4％的比率。這可能是由于β-羥基丁酸鹽脫氫酶的底物特異性。
用得自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株的S-ADH采用與上述方式相似的分光光度法研究與β-羥基丁酸鹽脫氫酶偶聯(lián)的丙酮羧化酶反應(yīng)的丙酮檢測(cè)極限。采用丙酮羧化酶和β-羥基丁酸鹽脫氫酶偶聯(lián)酶系統(tǒng)，NADH消耗反應(yīng)與范圍在0.058-208ppm(w/v)的丙酮濃度線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)＝0.99954)。丙酮檢測(cè)范圍的較低端(0.058-0.29ppm(w/v)在診斷呼吸丙酮分析所需的檢測(cè)參數(shù)內(nèi)。
在附圖27中所示是一種可替代的酶系統(tǒng)，其偶聯(lián)丙酮羧化酶ATP-水解與NADH氧化。該4組分酶系統(tǒng)已經(jīng)被描述用于分光光度測(cè)量丙酮羧化酶活性，可以很容易改變用于電化學(xué)檢測(cè)(附圖27)。采用這種偶聯(lián)分析，當(dāng)丙酮被羧化時(shí)丙酮羧化酶生成AMP，然后形成的AMP在肌激酶催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為兩分子ADP。由該反應(yīng)形成的ADP被丙酮酸激酶磷酸化為ATP，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為丙酮酸。然后形成的丙酮酸被該過(guò)程中消耗NADH的乳酸脫氫酶還原。雖然該酶系統(tǒng)更加復(fù)雜，其采用與上述相同的電化學(xué)檢測(cè)方法。
第三種電化學(xué)監(jiān)控丙酮羧化酶活性的方法包括改進(jìn)在附圖27中給出的策略，使ATP水解與H2O2反應(yīng)偶聯(lián)。如附圖28中所示，在該策略中用丙酮氧化酶替代乳酸脫氫酶；當(dāng)生成丙酮時(shí)，其被氧化，從而形成H2O2。為了研究該酶系統(tǒng)，在存在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和電子受體染料時(shí)，用得自黃色桿菌屬Py2的丙酮羧化酶，以及肌激酶、丙酮酸激酶和丙酮酸氧化酶制備酶反應(yīng)混合物(含有偶聯(lián)的酶或試劑)，可以分光光度地監(jiān)控反應(yīng)系統(tǒng)終產(chǎn)物(H2O2)。附圖29說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，其中加入丙酮時(shí)觀察到吸收值增加，對(duì)應(yīng)于H2O2形成。對(duì)于S-ADH-H2O2生成系統(tǒng)，在加入丙酮后出現(xiàn)滯后，這種滯后可以通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件來(lái)縮短。在附圖30中所示的是第四種電化學(xué)監(jiān)控丙酮羧化酶活性的方法，包括結(jié)合在附圖27和28中圖示的策略的某些方面。采用這種策略，從丙酮羧化酶β-羥基丁酸鹽脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)中產(chǎn)生的NAD+被乳酸脫氫酶利用來(lái)氧化乳酸為丙酮酸。從而生成的丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化以產(chǎn)生H2O2，然后檢測(cè)H2O2；電化學(xué)檢測(cè)生成的H2O2(數(shù)據(jù)未顯示)。
此外，作為另一種監(jiān)控NAD(P)H的丙酮依賴性消耗的策略，如附圖31所示丙酮單加氧酶與半乳糖氧化酶偶聯(lián)來(lái)生成H2O2。另外，利用乳酸脫氫酶和丙酮酸氧化酶可以將丙酮單加氧酶NAD(P)+與H2O2形成偶聯(lián)。
丙酮羧化酶的穩(wěn)定性如上對(duì)S-ADH酶的描述，重要的是設(shè)計(jì)一種用于在室溫下長(zhǎng)期以干燥方式穩(wěn)定丙酮羧化酶活性的配方。純化的丙酮羧化酶被冷凍干燥，并在冷凍干燥一天內(nèi)再用水溶解并分析時(shí)，保留相對(duì)于非冷凍干燥的對(duì)照的約90％的活性(數(shù)據(jù)未顯示)。但是存放在室溫和4℃下時(shí)，數(shù)天中其活性下降。S-ADH的情況為，海藻糖的存在能保持在室溫下放置的樣本的活性(＞90％)至少111天。在個(gè)別試驗(yàn)中，整個(gè)偶聯(lián)分析反應(yīng)混合物(即得自自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株的丙酮羧化酶、β-羥基丁酸鹽脫氫酶、NADH、ATP、緩沖液、醋酸鉀和氯化鎂)被冷凍干燥來(lái)確定檢測(cè)成分對(duì)該處理是否穩(wěn)定。當(dāng)檢測(cè)混合物在一天之內(nèi)再用水溶解并分析，保留了其活性的84％。當(dāng)被冷凍干燥的反應(yīng)混合物中包括了海藻糖，其活性的95％被保存。進(jìn)行第三個(gè)穩(wěn)定性試驗(yàn)，在存在海藻糖(20％w/v)時(shí)不同于冷凍干燥，可以風(fēng)干丙酮羧化酶。在這種情況下，丙酮羧化酶在24h后保留100％活性(數(shù)據(jù)未顯示)。一種酶可以風(fēng)干(替代冷凍干燥)并保持其活性是絲網(wǎng)印刷技術(shù)特別需要的。
將丙酮特異性酶并入用于呼吸丙酮的基于酶的電化學(xué)傳感器的其他前景在一些丙醇氧化細(xì)菌中，丙酮作為中間產(chǎn)物形成，一般認(rèn)為丙酮在O2依賴的單加氧酶催化的反應(yīng)中進(jìn)行羥基化以形成丙酮醇(羥丙酮)。雖然這種細(xì)菌酶尚未被完全表征，但是它以與迄今所述的其他單加氧酶和系統(tǒng)相似的方式起作用。已知的單加氧酶一般由多個(gè)酶成分(2-4個(gè)酶成分)組成，包括吡啶核苷酸依賴的還原酶、電子轉(zhuǎn)移蛋白(如鐵氧化還原蛋白)和含有活性位點(diǎn)的加氧酶成分。NAD(P)H提供O2活化所需還原劑，并將氧原子結(jié)合到脂肪族烴底物上?？梢杂蒙鲜鲇糜谥俅济摎涿负捅然赶嗯悸?lián)的酶系統(tǒng)的方法(附圖1)電化學(xué)監(jiān)控丙酮單加氧酶反應(yīng)的NAD(P)H的丙酮依賴消耗。此外，丙酮P450單加氧酶已經(jīng)在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中被描述。雖然這種酶可能具有不同于細(xì)菌來(lái)源的丙酮單加氧酶的生物物理特性(也就是不同大小亞基分子量、氨基酸序列等)，其催化的反應(yīng)適合于監(jiān)控基于酶的生物傳感器中的丙酮，采用與所述用于細(xì)菌丙酮單加氧酶相似的策略。丙酮單加氧酶反應(yīng)的產(chǎn)物丙酮醇已經(jīng)被報(bào)道是半乳糖氧化酶的底物(J.Tkac等，酶和微生物技術(shù)(2001)28383-88；M.M.Whittaker和J.W.Whittaker，生物化學(xué)(2001)407140-48)。因此，作為監(jiān)控丙酮依賴的NAD(P)H消耗的另一種策略，如附圖31所述丙酮單加氧酶反應(yīng)可以被偶聯(lián)到半乳糖氧化酶來(lái)形成H2O2。
丙酮信號(hào)放大策略當(dāng)被測(cè)樣本中的丙酮濃度很低時(shí)，放大酶電極信號(hào)很重要。例如，呼吸中丙酮的基礎(chǔ)水平(未禁食個(gè)體)相對(duì)較低(0.2-0.5ppmv/v)。通過(guò)酶再生底物(無(wú)效循環(huán))實(shí)現(xiàn)放大，從而放大輸出信號(hào)。因此，不完全飽和的低水平丙酮可以獲得連續(xù)反應(yīng)比率，將持續(xù)穩(wěn)定增大信號(hào)強(qiáng)度。只要該濃度對(duì)于所用酶系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是不完全飽和的，增大比率將依賴于所測(cè)量丙酮的起始含量。因此，生物傳感器可以通過(guò)測(cè)定反應(yīng)比率來(lái)校準(zhǔn)，并將它們與起始丙酮濃度相關(guān)聯(lián)。
在第一個(gè)實(shí)施例中，如附圖32所示，一個(gè)放大方案采用乙酰乙酸脫羧酶。乙酰乙酸脫羧酶存在于發(fā)酵微生物中，催化丙酮羧化的逆反應(yīng)。采用這種方案，乙酰乙酸脫羧酶ATP水解活性與附圖28中所示H2O2形成偶聯(lián)，然而加入乙酰乙酸脫羧酶再生乙酰乙酸為丙酮，從而建立一種不會(huì)耗盡(deplete)丙酮濃度的系統(tǒng)。這種放大系統(tǒng)的另一種變化形式示于附圖33，其中乳糖氧化酶被加入到先前在附圖27中給出的偶聯(lián)酶系統(tǒng)。當(dāng)丙酮酸被還原成乳酸時(shí)，乳酸氧化酶催化乳酸再生為丙酮酸，在該過(guò)程中生成H2O2，然后用電化學(xué)檢測(cè)。
許多不同的丙酮信號(hào)放大策略可以與S-ADH酶一起應(yīng)用。在第一個(gè)實(shí)施例中，在附圖34中說(shuō)明，S-ADH酶被偶聯(lián)到吡咯并喹啉醌(PQQ)依賴的乙醇脫氫酶；這種酶之一分離自假單胞菌屬sp.菌株VM15C(Shimao，1986)。該特定PQQ-脫氫酶已經(jīng)被報(bào)道對(duì)低分子量仲醇而不對(duì)伯醇具有特異性。在這種放大策略中，S-ADH酶將丙酮還原成異丙醇，然后形成的異丙醇由PQQ依賴的乙醇脫氫酶再氧化為丙酮。從該氧化產(chǎn)生的電子通過(guò)PPQ酶輔基直接傳遞給電極。涉及指導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的整合的酶電極已經(jīng)被報(bào)道用于這類酶。一個(gè)相似的例子示于附圖35，其中S-ADH偶聯(lián)到仲醇氧化酶(SAO；EC 1.1.3.18)。SAOs已經(jīng)分離自許多不同生物體中，如假單胞菌屬sp.參見(jiàn)如M.Morita等，假單胞菌的仲醇氧化酶的分離和特性，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)431225-35(1979)。采用這種策略，丙酮被再循環(huán)，其中丙酮最初被S-ADH還原并接著被SAO再氧化，在底物循環(huán)的每次周轉(zhuǎn)中同時(shí)生成H2O2。這種線性放大方案簡(jiǎn)單(僅需要兩種酶)并且具有相對(duì)容易地監(jiān)控H2O2的優(yōu)點(diǎn)，是有利的。
這種用于信號(hào)放大的系統(tǒng)結(jié)合乙醇脫氫酶和乙醇氧化酶活性，通過(guò)將伯醇氧化酶(AO)偶聯(lián)到伯醇脫氫酶來(lái)研究。用乙醇作為底物并在同一反應(yīng)時(shí)間測(cè)定H2O2形成的增加，用雙酶系統(tǒng)觀察到比僅用AO時(shí)增加7-10倍(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)使反應(yīng)時(shí)間延伸到更長(zhǎng)時(shí)期時(shí)，對(duì)于雙酶系統(tǒng)，該信號(hào)可以進(jìn)一步增強(qiáng)。這說(shuō)明用于放大對(duì)丙酮的響應(yīng)的實(shí)用方法是將S-ADH偶聯(lián)到SAO。
附圖36闡述放大策略的第三個(gè)例子，其通過(guò)利用從由S-ADH催化的反應(yīng)中制備NAD+來(lái)增強(qiáng)S-ADH/SAO偶聯(lián)系統(tǒng)。在這種情況下，從將丙酮還原為異丙醇中生成的NAD+被偶聯(lián)到羥基丁酸脫氫酶(HBDH)，其中羥基丁酸鹽(過(guò)量加入)被氧化為乙酰乙酸。然后乙酰乙酸被乙酰乙酸脫羧酶(ACD)脫羧為丙酮，從而增加丙酮的含量(以一分子)，丙酮進(jìn)行后續(xù)的再循環(huán)。與附圖35所述提供丙酮反應(yīng)的線性放大(即對(duì)于各種底物循環(huán)來(lái)說(shuō)，生成的H2O2量加倍)酶系統(tǒng)不同，這種類型的放大系統(tǒng)將指數(shù)性增加H2O2產(chǎn)出量，可以檢測(cè)生物樣本中極其低水平的丙酮。
第四個(gè)例子示于附圖37，其中放大策略對(duì)于NADH或NADPH協(xié)同因子優(yōu)先使用S-ADH酶。在這種情況下，第一個(gè)S-ADH催化丙酮還原為異丙醇，并氧化NADPH。第二個(gè)S-ADH再將異丙醇氧化為丙酮，生成NADH，然后NADH被NADH依賴的心肌黃酶(D)用于還原電子介質(zhì)，然后如通過(guò)在電極處被氧化而被檢測(cè)。雖然這種系統(tǒng)能夠產(chǎn)生放大，其一種商業(yè)應(yīng)用優(yōu)選采用具有真正完全輔酶特異性的的S-ADH酶，以及一種調(diào)控和如實(shí)監(jiān)控輔酶濃度和化學(xué)平衡的底物/產(chǎn)物比的方法。
如本文所述，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中提供一種方法用于將丙酮特異性酶結(jié)合到電化學(xué)或非電化學(xué)的生物傳感器中，從而使這些活性能用于診斷監(jiān)控人類呼吸中的丙酮。如本文所討論，電化學(xué)測(cè)量丙酮的優(yōu)選策略采用結(jié)合形成連鎖酶系統(tǒng)的酶，包括1)仲醇脫氫酶(S-ADH)催化丙酮還原，伴隨著NADPH消耗，和2)S-ADH催化丙酮還原，伴隨著NADH消耗(大體上是S-ADH催化丙酮還原，伴隨著NAD(P)H消耗，電化學(xué)檢測(cè)NAD(P)H)；3)與NADPH消耗偶聯(lián)的丙酮酸羧化酶反應(yīng)(如，β-羥基丁酸脫氫酶)，和4)與NADPH消耗(大體上是與NAD(P)H消耗偶聯(lián)丙酮酸羧化酶反應(yīng)，電化學(xué)檢測(cè)NAD(P)H)偶聯(lián)的丙酮酸羧化酶反應(yīng)(如，β-羥基丁酸脫氫酶)；5)與NADPH消耗偶聯(lián)的丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解，和6)與NADPH消耗(大體上是與NAD(P)H消耗偶聯(lián)丙酮酸羧化酶反應(yīng)，電化學(xué)檢測(cè)NAD(P)H)偶聯(lián)的丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解；7)S-ADH反應(yīng)NADP+形成偶聯(lián)H2O2形成，和8)S-ADH反應(yīng)NAD+形成偶聯(lián)H2O2形成(大體上是S-ADH反應(yīng)NAD+形成偶聯(lián)H2O2形成，電化學(xué)檢測(cè)H2O2)；9)丙酮羧化酶反應(yīng)ATP水解偶聯(lián)H2O2形成，電化學(xué)檢測(cè)H2O2；10)丙酮羧化酶反應(yīng)偶聯(lián)(如β-羥基丁酸脫氫酶)NADP+形成偶聯(lián)H2O2形成，和11)丙酮羧化酶反應(yīng)偶聯(lián)(如β-羥基丁酸脫氫酶)NAD+形成偶聯(lián)H2O2形成(大體上是，丙酮羧化酶反應(yīng)偶聯(lián)，如β-羥基丁酸脫氫酶，NAD(P)+形成偶聯(lián)H2O2形成，電化學(xué)檢測(cè)H2O2)；12)丙酮單加氧酶偶聯(lián)NADH氧化(大體上是，丙酮單加氧酶偶聯(lián)NAD(P)H氧化。本發(fā)明不限于這些酶系統(tǒng)，任何丙酮特異性酶可以被用于本發(fā)明的酶系統(tǒng)。而且，可以使用任何電化學(xué)可檢測(cè)的適合與丙酮特異性酶偶聯(lián)的協(xié)同因子和中間產(chǎn)物。
實(shí)施例5按照本發(fā)明的丙酮生物傳感器可以被用于追蹤由“標(biāo)記”化合物代謝形成的丙酮的釋放，該化合物作為藥物配方或者其他被施用或被植入的組合物的一部分被施用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，乙酰乙酸和/或任何其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的酯或氨基化合物可以用作一個(gè)標(biāo)記來(lái)追蹤組合物的釋放，該組合物被施用或植入一個(gè)或一組活的生物體中，如環(huán)境樣本或細(xì)胞培養(yǎng)物或菌落。乙酰乙酸的藥學(xué)上可接受的堿性加成鹽包括堿金屬如鈉、鉀和鋰鹽；堿土金屬，如鈣和鎂；過(guò)渡金屬，如鋅、鐵和銅；碳酸鹽、碳酸氫鹽、銨、烷基銨、烷基胺、鏈烷醇胺和羥基鏈烷胺鹽。另外適合的有醇酯。優(yōu)選地使用乙酰乙酸的鈉鹽或鉀鹽。優(yōu)選的酯為乙基酯。乙酰乙酸及其鈉鹽或鉀鹽在室溫下為固體，而乙酸乙酯在室溫下為液體。乙酰乙酸鹽用作標(biāo)記目的被施用，以約10mg-約200mg的劑量，優(yōu)選在約10mg-約170mg的范圍。
在脂肪酸β氧化過(guò)程中，在各個(gè)氧化循環(huán)中從脂肪酸鏈上水解兩分子乙酰輔酶A，在這過(guò)程中生成能量所需的ATP。如此生成的乙酰輔酶A被代謝為二氧化碳，或者其可以在哺乳動(dòng)物肝中通過(guò)轉(zhuǎn)化為乙酸乙酯形成酮體過(guò)程中被利用。以這種方式制備的乙酰乙酸可以作為替代葡萄糖的另一種能量來(lái)源，特別在饑餓時(shí)。通過(guò)肝臟生成的乙酰乙酸釋放到血液中作為能量/燃料，特別被大腦和心肌利用。流入動(dòng)物血流中的自由乙酰乙酸已經(jīng)被證明會(huì)引起丙氨酸和谷氨酸水平升高，可能是由于肌肉刺激產(chǎn)出這些氨基酸，而且已知降低血糖水平?？傊ㄟ^(guò)代謝和呼吸和從尿液中排出，丙酮被從哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中迅速清除。乙酰乙酸自發(fā)脫羧生成丙酮和二氧化碳，在高血液水平乙酰乙酸的個(gè)體的呼吸中，丙酮的氣味極顯著。以CO2和未改變的丙酮呼出是丙酮從體內(nèi)除去的基本路徑。呼出的未改變的丙酮量與體內(nèi)丙酮濃度相關(guān)。用丙酮特異性生物傳感器可以檢測(cè)尿中和呼出的丙酮。
因此，丙酮特異性生物傳感器可以被用于檢測(cè)乙酰乙酸標(biāo)記的丙酮釋放，從而追蹤施用的治療性化合物或植入的組合物，或者植入的組合物的生物降解和/或生物侵蝕。
在優(yōu)選實(shí)施例中，施用的配方在具有期望生物釋放的主要物質(zhì)的混合物含有乙酰乙酸、鹽、酯、或氨基化合物。這種主要物質(zhì)例子包括但不限于藥學(xué)上可接受的活性成分、生物藥物(biopharmaceutical)(例如，蛋白質(zhì)如抗體、激素、酶、血清和疫苗；基因治療)和其他生物活性物質(zhì)如食物添加物(例如，維生素、礦物質(zhì)、草藥添加物和nutraceuticals)。
藥學(xué)活性成分包括但不限于止痛劑、麻醉劑、抗酸劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、抗生素、抗凝血?jiǎng)?、抗痙攣藥物、抗抑郁劑、抗嘔吐藥、抗真菌藥、抗高血壓藥、抗感染藥、抗炎癥藥、抗狂躁劑、抗菌劑、抗腫瘤劑、抗寄生蟲(chóng)藥、抗原生動(dòng)物藥物、安定藥、退熱劑、防腐劑、抗病毒劑、自主藥劑(如抗膽堿藥、類交感作用藥、抗交感神經(jīng)藥、擬副交感神經(jīng)功能藥物、副交感神經(jīng)阻斷藥)、氣管擴(kuò)張劑、心臟血管藥、瀉藥、化療劑、凝血?jiǎng)⒈茉兴?、?zhèn)靜劑、利尿劑、除痰劑、生血藥、催眠藥、免疫調(diào)節(jié)劑、精神病藥物、鎮(zhèn)靜劑、刺激物、鎮(zhèn)定劑、血管收縮藥和血管擴(kuò)張藥。
在優(yōu)選實(shí)施例中，植入的組合物為固體物質(zhì)，往其中加入或嵌入乙酰乙酸、鹽、氨基化合物或酯，或者其配方，例如，以粉末的、粒狀的顆?；蛞后w或溶液液滴、分散在成批的固體物質(zhì)和/或其間隙中。顆粒或液滴可以僅由乙酰乙酸、鹽、氨基化合物或酯，或者其溶液組成，或者它們結(jié)合了其他物質(zhì)，包括但不限于上述主要物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的賦形劑、佐劑、稀釋劑和/或載體。這些固體材料可以是堅(jiān)硬的、或者是可塑的、橡膠樣、凝膠狀和/或泡沫狀材料，并且它可以為任何形狀，例如團(tuán)狀、塊狀、條狀、球形、片狀、薄膜、膜、纖維、織物、網(wǎng)篩或基質(zhì)形式。
用乙酰乙酸或其衍生物來(lái)標(biāo)記藥物，可以通過(guò)用按照本發(fā)明的丙酮特異性酶系統(tǒng)檢測(cè)呼吸丙酮容易地檢測(cè)適合于前述治療體系的物質(zhì)。因此，由于年齡或疾病精神受損患者、精神病患者或者任何其他適應(yīng)力極差的患者可以以非侵入方式監(jiān)控藥物劑量。通過(guò)結(jié)合丙酮特異性生物傳感器與相連的分析裝置，例如，互聯(lián)網(wǎng)，可以獲得在家監(jiān)控患者的即時(shí)結(jié)果。通過(guò)這種方式，丙酮特異性生物傳感器可被用于確保對(duì)特定患者進(jìn)行健康護(hù)理服務(wù)，用于在臨床檢驗(yàn)場(chǎng)所檢測(cè)藥物配方的生物釋放，和用于持續(xù)檢測(cè)藥物配方的延遲釋放或控制釋放。
丙酮特異性生物傳感器還可以用在生物環(huán)境中，例如醫(yī)藥裝置、植入物等。這些裝置和植入物包括藥物傳送植入物、美容植入物、假體植入物和生物植入物。
如上指出，乙酰乙酸在室溫下為固體。因此，在室溫下為固體的乙酰乙酸及其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的酯和氨基化合物適合用于，例如，粉末、顆粒、藥丸、片劑、膠囊、植入物和溶液配方。在室溫下為液體的乙酰乙酸的藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的酯和氨基化合物適合用于，例如液體配方(如煉金藥、糖漿、滴劑和液體膠囊)和半液體配方(例如軟膏、面霜和藥膏)。優(yōu)選固體配方包括藥丸、片劑和膠囊配方，更優(yōu)選為非咀嚼藥丸、片劑和膠囊，還包括埋植的配方。優(yōu)選溶液、流體和半流體配方包括可注射和難溶的配方，更優(yōu)選腸胃外可注射和難溶的配方，還包括埋植的配方。
用于涉及藥學(xué)上可接受鹽、酯和氨基化合物的術(shù)語(yǔ)“烷基的”在此定義為“脂肪族的”。優(yōu)選的“烷基的”基團(tuán)包括C1-C10脂肪族基團(tuán)，更優(yōu)選不飽和C1-C10脂肪族基團(tuán)，還更加優(yōu)選C1-C6脂肪族基團(tuán)。甚至更優(yōu)選使用直鏈烷基基團(tuán)，優(yōu)選不飽和C1-C4脂肪族基團(tuán)。
通過(guò)使用丙酮特異性生物傳感器的例子將是監(jiān)控診斷為兩極癥的患者的碳酸鋰攝入。需要及其嚴(yán)格地滴定鋰來(lái)獲得合理的產(chǎn)生效力的例子水平，而不導(dǎo)致過(guò)量。過(guò)量鋰會(huì)致命。因此，300mg碳酸鋰的膠囊可以再配制成含有200mg乙酰乙酸鈉，以標(biāo)準(zhǔn)的方式施用于患者(例如，每天四次)。然后用丙酮特異性生物傳感器檢測(cè)從乙酰乙酸鹽標(biāo)記釋放的丙酮來(lái)監(jiān)控患者的順應(yīng)性。通過(guò)用互聯(lián)網(wǎng)與生物傳感器連接，患者的醫(yī)師可以每天記錄在一段時(shí)間內(nèi)所測(cè)定的丙酮水平?？梢酝瑫r(shí)測(cè)定血液鋰水平來(lái)確定丙酮測(cè)定值與鋰的生物利用度的關(guān)系。因此，本發(fā)明的生物傳感器可被用于減少或消除侵入(如血液)檢測(cè)鋰水平的需要。
另外，丙酮標(biāo)記可與安慰劑形式的藥學(xué)活性化合物共同施用，而不與該化合物配制在一起。將乙酰乙酸鹽灌注人類患者的方法是本領(lǐng)域已知的?；颊呖稍跀?shù)小時(shí)期間如3小時(shí)，以約20μmol/kg/min灌注乙酰乙酸鈉或自由/游離乙酰乙酸。已經(jīng)證明以1.36mmol/min速率持續(xù)灌注乙酰乙酸鈉3小時(shí)會(huì)導(dǎo)致灌注結(jié)束時(shí)血液酮體濃度增加到3μmol/ml。持續(xù)灌注3-14C標(biāo)記的乙酰乙酸、鈉鹽(例如，以0.68-0.88毫微居里每公斤每分鐘(mμCi/kg/min)的速率灌注)，可以追蹤呼吸排出物的14CO2。因此，將標(biāo)記的乙酰乙酸與目標(biāo)藥物一起灌注，能夠提供一種將丙酮生成與目標(biāo)藥物的血液生物利用度相關(guān)聯(lián)的方法。
還期望一種檢測(cè)樣本中丙酮的試劑盒，包括與生物傳感器分離或包含在其中的丙酮特異性酶系統(tǒng)，以及使用說(shuō)明書(shū)。例如，丙酮特異性酶系統(tǒng)可被粘貼或安置在一次性檢測(cè)條上，該檢測(cè)條可被插入容器中，該容器具有導(dǎo)入生物樣本的入口。另外，生物傳感器容器和丙酮特異性酶系統(tǒng)可被做成單一的一次性設(shè)備。
考慮到檢測(cè)生物樣本中丙酮的已有方法的局限性，發(fā)明丙酮特異性酶系統(tǒng)和含有這些酶系統(tǒng)的生物傳感器產(chǎn)生對(duì)低濃度丙酮更靈敏、對(duì)丙酮更特異和更不可能得出由于雜質(zhì)干擾的錯(cuò)誤讀數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。因此，發(fā)明丙酮特異性生物傳感器適于在實(shí)驗(yàn)室外使用，并且可以是便攜式的。便攜式丙酮特異性生物傳感器具有丙酮高靈敏度，方便在各種場(chǎng)所監(jiān)控丙酮水平，而且可期望具有體液丙酮的傳統(tǒng)硝普鹽檢測(cè)的最低水平的精確度。
通過(guò)用能夠產(chǎn)生與丙酮特異性酶相同的協(xié)同因子(如，NAD(P)H或NAD(P)+)或反應(yīng)副產(chǎn)物的不同酶替代丙酮特異性酶，本文公開(kāi)的各種信號(hào)擴(kuò)大方案還可以用在檢測(cè)除了丙酮之外化合物的系統(tǒng)。
本文給出的概念和數(shù)據(jù)提供了開(kāi)發(fā)特異于丙酮檢測(cè)的基于酶的生物傳感器的途徑。雖然本發(fā)明已經(jīng)用在此描述的優(yōu)選實(shí)施例闡明，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉各種其他修改是顯然的，并且容易由這些技術(shù)人員實(shí)施，而不背離本發(fā)明精神和保護(hù)范圍。因此，目的不在于將附加的權(quán)利要求的保護(hù)范圍限定在本文描述的優(yōu)選實(shí)施例中，而是從總體上寬泛地解釋由這些公開(kāi)所支持的完全寬度。引用的所有參考文獻(xiàn)的公開(kāi)在此合并作為參考。
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Ser Ser Arg Trp Gly Trp His Thr Tyr Asn Ala His Gln Val Ser Phe340 345 350Thr Ser Gly Ile Trp Val Met Met Thr Gln Thr Leu Ile Pro Ser Glu355 360 365Met Ile Asn Asp Gly Ala Ala Tyr Gly Thr Glu Phe Arg Leu Pro Lys370 375 380Gly Thr Trp Met Asn Pro Asp Asp Arg Arg Val Ala Phe Ser Tyr Ser385 390 395 400Trp His Phe Leu Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu Trp Arg Gly Leu Ser405 410 415Arg Ser Tyr Phe Gly Arg Gly Tyr Leu Glu Glu Val Asn Ala Gly Asn420 425 430Ala Asn Thr Ser Asn Trp Leu Gln Gly Gly Gly Phe Asn Gln Tyr Asp435 440 445Glu Ile His Ala Val Asn Ser Phe Glu Cys Ala Ala Asn Gly Thr Gly450 455 460Ala Thr Ala Val Gln Asp Gly Leu Ser His Ala Ala Ala Ile Trp Asn465 470 475 480Pro Glu Gly Asp Met Gly Asp Met Glu Ile Trp Glu Leu Ala Glu Pro485 490 495Leu Val Tyr Leu Gly Arg Gln Ile Lys Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly500 505 510Lys Tyr Arg Gly Gly Cys Gly Phe Glu Ser Leu Arg Met Val Trp Asn515 520 525Ala Lys Asp Trp Thr Met Phe Phe Met Gly Asn Gly His Ile Ser Ser530 535 540Asp Trp Gly Leu Met Gly Gly Tyr Pro Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Phe545 550 555 560Ala Ala His Lys Thr Asn Leu Lys Glu Leu Ile Ala Ser Gly Ala Glu
565570 575Ile Pro Leu Gly Gly Asp Thr Asp Pro Glu Asn Pro Thr Trp Asp Ala580 585 590Met Leu Pro Asp Ala Gln Ile Lys Arg Asp Lys Gln Ala Ile Thr Thr595 600 605Glu Glu Met Phe Ser Asp Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Tyr Met Arg Gly610 615 620Gly Pro Gly Phe Gly Asp Pro Leu Asp Arg Glu Pro Gln Ala Val Ala625 630 635 640Asp Asp Ile Asn Gly Gly Tyr Val Leu Glu Arg Phe Ala Gly Glu Val645 650 655Tyr Gly Val Val Val Arg Lys Gly Ala Asp Gly Gln Tyr Gly Val Asp660 665 670Glu Ala Gly Thr Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ile Arg Lys Asp Arg Leu675 680 685Ala Lys Ser Val Pro Val Ser Glu Trp Met Lys Gly Glu Arg Glu Lys690 695 700Ile Leu Ala Lys Asp Ala Gly Thr Gln Val Arg Gln Met Phe Ala Ala705 710 715 720Ser Phe Lys Leu Gly Pro Arg Phe Glu Lys Asp Phe Arg Thr Phe Trp725 730 735Ser Leu Pro Asp Ser Trp Thr Leu Pro Glu Glu Glu Ile Gly Val Pro740 745 750Thr Tyr Gly Ser Arg Tyr Ser Met Asp Ile Ser Glu Leu Pro Asp Val755 760 765His Thr Val Gln Phe Val Glu Glu770 775<210>2<211>717
<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
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420 425 430Val Glu Asp Ala Ala Ala Gly Val Ile Glu Leu Leu Asp Ser Asp Leu435 440 445Arg Asp Tyr Leu Arg Ser Met Ile Ser Gly Lys Gly Tyr Ser Pro Ala450 455 460Ser Phe Val Cys Phe Ser Tyr Gly Gly Ala Gly Pro Val His Thr Tyr465 470 475 480Gly Tyr Thr Glu Gly Leu Gly Phe Glu Asp Val Ile Val Pro Ala Trp485 490 495Ala Ala Gly Phe Ser Ala Phe Gly Cys Ala Ala Ala Asp Phe Glu Tyr500 505 510Arg Tyr Asp Lys Ser Leu Asp Ile Asn Met Pro Thr Glu Thr Pro Asp515 520 525Thr Asp Lys Glu Lys Ala Ala Ala Thr Leu Gln Ala Ala Trp Glu Glu530 535 540Leu Thr Lys Asn Val Leu Glu Glu Phe Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Ala545 550 555 560Asp Gln Val Thr Leu Gln Pro Gly Tyr Arg Met Gln Tyr Arg Gly Gln565 570 575Leu Asn Asp Leu Glu Ile Glu Ser Pro Leu Ala Gln Ala His Thr Ala580 585 590Ala Asp Trp Asp Gln Leu Thr Asp Ala Phe Asn Ala Thr Tyr Gly Arg595 600 605Val Tyr Ala Ala Ser Ala Arg Ser Pro Glu Leu Gly Tyr Ser Val Thr610 615 620Gly Ala Ile Met Arg Gly Met Val Pro Ile Pro Lys Pro Lys Ile Pro625 630 635 640Lys Glu Pro Glu Glu Gly Glu Thr Pro Pro Glu Ser Ala Lys Ile Gly645 650 655
Thr Arg Lys Phe Tyr Arg Lys Lys Arg Trp Val Asp Ala Gln Leu Tyr660 665 670His Met Glu Ser Leu Arg Pro Gly Asn Arg Val Met Gly Pro Ala Val675 680 685Ile Glu Ser Asp Ala Thr Thr Phe Val Val Pro Asp Gly Phe Glu Thr690 695 700Trp Leu Asp Gly His Arg Leu Phe His Leu Arg Glu Val705 710 715<210>3<211>168<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
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Thr Pro Ser Trp Gln Val Ile Arg Glu Tyr Phe Cys Pro Glu Cys Gly115 120 125Thr Leu His Asp Val Glu Ala Pro Thr Pro Trp Tyr Pro Val Ile His130 135 140Asp Phe Ser Pro Asp Ile Glu Gly Phe Tyr Gln Glu Trp Leu Gly Leu145 150 155 160Pro Val Pro Glu Arg Ala Asp Ala165<210>4<211>769<212>PRT<213>莢膜紅細(xì)菌B10<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..769<223>丙酮羧化酶，α-亞單位(Capsulapedia No.RRC02651)<400>4Met Asn Ala Pro Thr Ala Ile Arg Gly Ile Val Arg Gly Gly Asp Thr1 5 10 15Leu Lys Gln His Arg Asp Gly Ile Met Glu Ala Ser Lys Arg Thr Gly20 25 30His Tyr Ala Gly Leu Lys Gln Met Glu Leu Arg Asp Ser Asp Pro Ile35 40 45Met Tyr Asn Lys Leu Phe Ser Arg Leu Arg Ala Gly Val Val Asp Ala50 55 60Arg Glu Thr Ala Lys Lys Ile Ala Ala Ser Pro Ile Val Glu Gln Glu65 70 75 80Gly Glu Leu Cys Phe Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gly Asp Ser Ile Leu85 90 95Thr Ser Thr Gly Ile Ile Ile His Val Gly Thr Met Gly Ala Ala Ile
100 105 110Lys Tyr Met Ile Glu Asn Asp Trp Glu Ser Asn Pro Gly Val Lys Asp115 120 125Arg Asp Ile Phe Cys Asn Asn Asp Ser Leu Ile Gly Ash Val His Pro130 135 140Cys Asp Ile His Thr Ile Val Pro Ile Phe His Glu Gly Glu Leu Ile145 150 155 160Gly Trp Val Gly Gly Val Thr His Val Ile Asp Thr Gly Ala Val Gly165 170 175Pro Gly Ser Met Thr Thr Gly Gln Val Gln Arg Phe Gly Asp Gly Tyr180 185 190Ser Val Thr Cys Arg Lys Val Gly Glu Asn Asp Thr Leu Phe Arg Asp195 200 205Trp Leu His Glu Ser Gln Arg Ser Val Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Met210 215 220Leu Asp Glu Arg Thr Arg Ile Ala Gly Cys His Met Ile Arg Lys Leu225 230 235 240Val Ala Glu Val Ile Ala Glu Glu Gly Ile Glu Ala Tyr Trp Lys Phe245 250 255Ala Tyr Glu Ala Val Glu His Gly Arg Leu Gly Leu Gln Asn Arg Ile260 265 270Lys Ala Met Thr Ile Pro Gly Lys Tyr Arg Gln Val Gly Phe Val Asp275 280 285Val Pro Tyr Ala His Asp Asp Val Arg Val Pro Ser Asp Phe Ala Lys290 295 300Val Asp Thr Ile Met His Thr Pro Ser Glu Met Thr Ile Arg Pro Asp305 310 315 320Gly Thr Trp Arg Leu Asp Phe Glu Gly Ala Ser Arg Trp Gly Trp His325 330 335
Thr Tyr Asn Ala His Ser Val Ser Phe Thr Ser Gly Ile Trp Val Met340 345 350Met Thr Gln Thr Leu Ile Pro Thr Glu Met Ile Asn Asp Gly Ala Ala355 360 365Tyr Gly Thr Glu Phe Arg Leu Pro Lys Gly Thr Trp Met Asn Pro Asp370 375 380Asp Arg Arg Val Ala Phe Ala Tyr Ser Trp His Phe Leu Val Ser Ser385 390 395 400Trp Thr Ala Leu Trp Arg Gly Leu Ser Arg Ser Tyr Phe Gly Arg Gly405 410 415Tyr Leu Glu Glu Val Asn Ala Gly Asn Ala Asn Thr Ser Asn Trp Leu420 425 430Gln Gly Gly Gly Phe Asn Gln Tyr Asp Glu Ile His Ala Val Asn Ser435 440 445Phe Glu Cys Ala Ala Asn Gly Val Gly Ala Ser Ala Ile Gly Asp Gly450 455 460Leu Ser His Ala Ala Ala Ile Trp Asn Pro Glu Gly Asp Met Gly Asp465 470 475 480Met Glu Ile Trp Glu Leu Ala Glu Pro Leu Val Tyr Leu Gly Arg Gln485 490 495Ile Lys Ala Ser Ser Gly Gly Ala Gly Lys Tyr Arg Gly Gly Cys Gly500 505 510Phe Glu Ser Leu Arg Met Val Trp Asn Ala Lys Asp Trp Thr Met Phe515 520 525Phe Met Gly Asn Gly His Ile Ser Ser Asp Trp Gly Leu Met Gly Gly530 535 540Tyr Pro Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Glu Ala His Glu Thr Gly Leu545 550 555 560Lys Glu Ile Ile Ala Gln Gly Gly Asp Ile Pro His Gly Gly Asp Thr565 570 575
Asp Pro Gly Asn Pro Val Trp Asp Gly Leu Leu Lys Gly Ala Arg Ile580 585 590Lys Arg Asp Lys Gln Ala Ile Thr Thr Glu Ala Met Phe Lys Asp Tyr595 600 605Asp Leu Tyr Leu Asn Tyr Met Arg Gly Gly Pro Gly Phe Gly Asp Pro610 615 620Leu Asp Arg Asp Pro Gly Ala Val Ala Ala Asp Val Asn Gly Gly Tyr625 630 635 640Leu Val Glu Arg Phe Ala Gln Ser Val Tyr Gly Val Val Leu Val Lys645 650 655Gly Ala Asp Gly Leu Leu Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr Glu Ala Arg660 665 670Arg Ala Ala Ile Arg Lys Asp Arg Leu Ala Lys Ala Val Pro Thr Ala675 680 685Glu Trp Met Lys Gly Glu Arg Asp Arg Ile Leu Lys Lys Glu Ala Gly690 695 700Val His Val Gln Gln Met Phe Ala Ala Ser Phe Lys Leu Gly Pro Lys705 710 715 720Trp Glu Glu Gly Phe Arg Lys Phe Trp Asp Leu Pro Ile Asp Trp Arg725 730 735Leu Met Glu Ala Asp Leu Pro Ile Pro Ser Tyr Gly Arg Asp Tyr Ser740 745 750Met Asp Leu Ser Glu Leu Pro Asp Val Lys Thr Val Gln Phe Val Glu755 760 765Glu<210>5<211>717<212>PRT<213>莢膜紅細(xì)菌B10
<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..717<223>丙酮羧化酶，β-亞單位(Capsulapedia No.RRC02652)<400>5Met Pro Leu Asp Arg Glu Lys Thr Arg Ser Val Gln Val Leu Gly Ile1 5 10 15Asp Ala Gly Gly Thr Met Thr Asp Thr Phe Phe Val Asp Ala Asn Gly20 25 30Asp Phe Val Val Gly Lys Ala Gln Ser Thr Pro Gln Asn Glu Ala Leu35 40 45Gly Leu Leu Glu Ser Ser Arg Glu Gly Leu Gln His Trp Gly Leu Ser50 55 60Leu Glu Glu Ala Leu Ser Ser Ile Gln Thr Gly Val Tyr Ser Gly Thr65 70 75 80Ala Met Leu Asn Arg Val Val Gln Arg Lys Gly Leu Arg Cys Gly Leu85 90 95Ile Val Asn Ala Gly Met Glu Asp Phe His Arg Met Gly Arg Ala Ile100 105 110Gln Ala Tyr Leu Gly Phe Ala Tyr Glu Asp Arg Ile His Leu Asn Thr115 120 125His Tyr Tyr Asp Glu Pro Leu Val Pro Arg His Leu Thr Arg Gly Val130 135 140Met Glu Arg Ile Asp Met Phe Gly Asp Val Val Ile Pro Leu Arg Glu145 150 155 160Glu Thr Ala Arg Gln Ala Ala Ala Glu Leu Ile Ala Gln Asp Val Glu165 170 175Gly Ile Val Ile Ser Leu Leu His Ser Tyr Lys Asn Pro Ala His Glu180 185 190Arg Arg Val Arg Asp Ile Val Ala Glu Glu Leu Glu Lys Ala Gly Lys
195 200 205Thr Thr Pro Val Phe Ala Ser Thr Asp Tyr Tyr Pro Val Arg Lys Glu210 215 220Thr His Arg Thr Asn Thr Thr Ile Leu Glu Ala Tyr Ala Ala Glu Pro225 230 235 240Ser Arg Gln Thr Leu Arg Lys Ile Thr Gly Ala Phe Lys Glu Asn Gly245 250 255Ser Arg Phe Asp Phe Arg Val Met Ala Thr His Gly Gly Thr Ile Ser260 265 270Trp Lys Ala Lys Glu Leu Ala Arg Thr Ile Val Ser Gly Pro Ile Gly275 280 285Gly Val Ile Gly Ala Lys Tyr Leu Gly Glu Val Leu Gly Tyr Lys Asn290 295 300Ile Ala Cys Ser Asp Ile Gly Gly Thr Ser Phe Asp Val Ala Leu Ile305 310 315 320Thr Gln Asn Glu Leu Thr Ile Arg Asn Asp Pro Asp Met Ala Arg Leu325 330 335Val Leu Ser Leu Pro Leu Val Ala Met Asp Ser Val Gly Ala Gly Ala340 345 350Gly Ser Phe Ile Arg Leu Asp Pro Tyr Thr Lys Ala Ile Lys Leu Gly355 360 365Pro Asp Ser Ala Gly Tyr Arg Val Gly Val Cys Trp Ala Glu Ser Gly370 375 380Ile Glu Thr Val Thr Ile Ser Asp Cys His Val Ile Leu Gly Tyr Leu385 390 395 400Asn Pro Asp Asn Phe Leu Gly Gly Gln Val Lys Leu Asp Arg Gln Arg405 410 415Ala Trp Asp Ala Met Lys Thr Gln Ile Ala Asp Pro Leu Gly Leu Ser420 425 430
Val Glu Asp Ala Ala Ala Gly Val Ile Glu Leu Leu Asp Ser Asp Leu435 440 445Arg Asp Tyr Leu Arg Ser Met Ile Ser Gly Lys Gly Tyr Ser Pro Ser450 455 460Ser Phe Thr Cys Phe Ser Tyr Gly Gly Ala Gly Pro Val His Thr Tyr465 470 475 480Gly Tyr Thr Glu Gly Leu Gly Phe Glu Asp Val Ile Val Pro Ala Trp485 490 495Ala Ala Gly Phe Ser Ala Phe Gly Cys Ala Ala Ala Asp Phe Glu Tyr500 505 510Arg Tyr Asp Lys Ser Leu Asp Leu Asn Ile Ala Arg Asp Gly Ser Asp515 520 525Asp Leu Lys Ala His Glu Ala Arg Thr Leu Asn Asp Ala Trp His Glu530 535 540Leu Thr Glu Arg Val Leu Glu Glu Phe Glu Leu Asn Gly Tyr Thr Arg545 550 555 560Asp Gln Val Lys Leu Gln Pro Gly Phe Arg Met Gln Tyr Arg Gly Gln565 570 575Leu Asn Asp Leu Glu Ile Glu Ser Pro Ile Pro Ala Ala Lys Thr Ala580 585 590Ala Asp Trp Asp Lys Leu Val Ala Ala Phe Asn Asp Thr Tyr Gly Arg595 600 605Val Tyr Ala Ala Ser Ala Arg Ser Pro Glu Leu Gly Tyr Ser Val Thr610 615 620Gly Ala Ile Met Arg Gly Met Val Pro Ile Pro Lys Pro Lys Ile Pro625 630 635 640Lys Glu Pro Glu Thr Gly Ala Thr Pro Pro Glu Ala Ala Lys Leu Gly645 650 655Thr Arg Lys Phe Tyr Arg Lys Lys Lys Trp Val Asp Ala Arg Leu Tyr660 665 670
Arg Met Glu Lys Leu Leu Pro Gly Asn Arg Ile Thr Gly Pro Ala Ile675 680 685Ile Glu Ser Asp Ala Thr Thr Phe Val Val Pro Asp Gly Phe Glu Thr690 695 700Trp Leu Asp Gly His Arg Leu Phe His Leu Lys Glu Val705 710 715<210>6<211>167<212>PRT<213>莢膜紅細(xì)菌B10<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..167<223>丙酮羧化酶，γ-亞單位(Capsulapedia No.RRC04094)<400>6Met Ala Tyr Thr Lys Ala Lys Ile Lys Asp Leu Val Asp Gly Lys Ile1 5 10 15Asp Arg Asp Thr Leu His Thr Met Leu Ala Thr Pro Lys Asp Ala Asp20 25 30Arg Phe Val Met Tyr Leu Glu Val Leu Gln Asp Gln Val Pro Trp Glu35 40 45Asp Arg Ile Ile Leu Pro Leu Gly Pro Lys Leu Tyr Ile Val Gln Arg50 55 60Lys Ser Asp His Lys Trp Val Val Lys Ser His Ala Gly His Glu Phe65 70 75 80Cys Asp Trp Arg Glu Asn Trp Lys Leu His Ala Val Met Arg Val Arg85 90 95Glu Thr Pro Glu Ala Met Glu Glu Ile Tyr Pro Arg Leu Met Ala Pro100 105 110Thr Ala Gly Trp Gln Val Ile Arg Glu Tyr Tyr Cys Pro Leu Ser Gly
115 120 125Asp Leu Leu Asp Val Glu Ala Pro Thr Pro Trp Tyr Pro Val Ile His130 135 140Asp Phe Glu Pro Asp Ile Asp Ala Phe Tyr Ser Glu Trp Leu Gly Leu145 150 155 160Lys Ile Pro Glu Arg Ala Ala165<210>7<211>14<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..14<223>仲醇脫氫酶，N-末端十四肽<400>7Met Lys Gly Leu Val Tyr Arg Gly Pro Gly Lys Lys Ala Leu1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..12<223>仲醇脫氫酶，胰蛋白酶片段<220>
<221>不確定的<222>9..9<223>Phe9可能是Ser9<400>8Pro Val Ala Val Asp His Gly Pro Phe Pro His Lys
1 5 10<210>9<211>8<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..8<223>仲醇脫氫酶，胰蛋白酶片段<220>
<221>不確定的<222>3..3<223>Leu3可能是Ile3<400>9Gly Gly Leu Gly Val Tyr His Gln1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..9<223>仲醇脫氫酶，胰蛋白酶片段<220>
<221>不確定的<222>2..2<223>Leu2可能是Ile2<400>10Ala Leu Glu Glu Val Pro His Pro Arg1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2
<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..7<223>仲醇脫氫酶，胰蛋白酶片段<400>11His Pro Ser Gly Asp Thr Arg1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..9<223>仲醇脫氫酶，胰蛋白酶片段<400>12Gly Leu Val Tyr Arg Gly Pro Gly Lys1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..7<223>仲醇脫氫酶，胰蛋白酶片段<220>
<221>不確定的<222>3..3<223>Ile3可能是Leu3<400>13His Gln Ile Ala Ser Ser Arg1 5<210>14
<211>6<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..6<223>仲醇脫氫酶，片段<400>14Leu Asp Asn Val Pro Glu1 5<210>15<211>6<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..6<223>仲醇脫氫酶，片段<400>15Phe Asp Gln Arg Gln Pro1 5<210>16<211>8<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..8<223>仲醇脫氫酶，片段<400>16Gly Ala Gly Arg Ile Ile Ala Val1 5<210>17<211>7<212>PRT
<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..7<223>仲醇脫氫酶，片段<400>17Gln Val Glu Pro Leu Met Ser5<210>18<211>9<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..6<223>仲醇脫氫酶，片段<400>18Phe Phe Ala Asp Ile Ile Glu Ala Ala1 5<210>19<211>6<212>PRT<213>自養(yǎng)黃色桿菌Py2<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>1..6<223>仲醇脫氫酶，片段<400>19Asp Thr Val Thr Thr His1 權(quán)利要求
1.一種丙酮特異性酶系統(tǒng)，包括選擇性地以丙酮作為底物，并與可檢測(cè)的信號(hào)介質(zhì)偶聯(lián)的酶。
2.按照權(quán)利要求1的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中丙酮特異性酶是丙酮單加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脫氫酶中的任何一種。
3.按照權(quán)利要求1的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中丙酮特異性酶被偶聯(lián)到可通過(guò)電化學(xué)或光度方法檢測(cè)的信號(hào)介質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中丙酮特異性酶系統(tǒng)是與NAD(P)H氧化偶聯(lián)的丙酮羧化酶產(chǎn)物形成、與NAD(P)H氧化偶聯(lián)的丙酮羧化酶ATP-水解、與H2O2形成偶聯(lián)的丙酮羧化酶ATP-水解、仲醇脫氫酶(S-ADH)伴隨NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶偶聯(lián)到β-羥基丁酸鹽脫氫酶催化的NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生、S-ADH催化NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生、丙酮單加氧酶偶聯(lián)到NAD(P)H氧化、或者丙酮單加氧酶偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生、或者丙酮單加氧酶催化NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2形成的任何一種。
5.按照權(quán)利要求4的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中仲醇脫氫酶得自哺乳動(dòng)物或微生物，微生物是需氧菌、厭氧菌、酵母、真菌或產(chǎn)甲烷菌的任何一種。
6.按照權(quán)利要求5的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中仲醇脫氫酶分離自熱厭氧桿菌屬Thermoanaerobium、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)或分枝桿菌屬(MycobacteriumO中任何一種物種。
7.按照權(quán)利要求5的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中仲醇脫氫酶分離自自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus)Py2菌株。
8.按照權(quán)利要求4的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中丙酮羧化酶分離自黃色桿菌屬、紅色桿菌屬或紅球菌屬中任何一種物種。
9.按照權(quán)利要求4的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中信號(hào)介質(zhì)是有機(jī)協(xié)同因子、無(wú)機(jī)協(xié)同因子、指示劑、電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)、光度介質(zhì)、酶反應(yīng)副產(chǎn)物或它們的結(jié)合中的任何一種的成員。
10.按照權(quán)利要求9的丙酮特異性酶系統(tǒng)，其中得自電化學(xué)可檢測(cè)信號(hào)介質(zhì)的信號(hào)通過(guò)再循環(huán)酶底物來(lái)放大電化學(xué)信號(hào)輸出值被線性或指數(shù)地放大。
11.一種應(yīng)用按照權(quán)利要求1的丙酮特異性酶系統(tǒng)的方法，其中所述方法包括a)結(jié)合i)至少一種藥物化合物，與ii)至少一種選自乙酰乙酸和藥學(xué)上可接受的乙酰乙酸鹽、酯和酰胺的標(biāo)記來(lái)形成被標(biāo)記的藥物化合物；b)將該被標(biāo)記的化合物施用給患者；和c)此后，通過(guò)用丙酮特異性酶系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自該患者的生物學(xué)樣本中的丙酮濃度來(lái)檢測(cè)進(jìn)入患者血流的標(biāo)記釋放，其中由于標(biāo)記降解形成丙酮，丙酮存在于患者的生物樣本中；d)使從生物樣本中測(cè)定的丙酮濃度與來(lái)自被施用的標(biāo)記化合物藥物化合物的釋放相聯(lián)系；和e)可選擇地，重復(fù)步驟c)和d)來(lái)確定藥物化合物從被施用標(biāo)記化合物釋放比例。
12.一種應(yīng)用按照權(quán)利要求1的丙酮特異性酶系統(tǒng)的方法，其中所述方法包括a)結(jié)合i)至少一種選自乙酰乙酸和藥學(xué)上可接受的乙酰乙酸鹽、酯和酰胺的標(biāo)記，與ii)一種生物相容組合物來(lái)形成一種生物相容的植入物或裝置；b)將該生物相容的植入物或裝置放入患者中；c)此后，通過(guò)用丙酮特異性酶系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自該患者的生物學(xué)樣本中的丙酮濃度來(lái)檢測(cè)進(jìn)入患者血流的標(biāo)記釋放，其中由于標(biāo)記降解形成丙酮，丙酮存在于患者的生物樣本中；d)使從生物樣本中測(cè)定的丙酮濃度與來(lái)自生物相容植入物或裝置的生物相容組合物的降解或釋放相聯(lián)系；和e)可選擇地，重復(fù)步驟c)和d)來(lái)確定生物相容植入物或裝置的降解或釋放比例。
13.一種應(yīng)用按照權(quán)利要求1的丙酮特異性酶系統(tǒng)的方法，其中所述方法包括通過(guò)結(jié)合至少一種選自乙酰乙酸、乙酰乙酸鹽、酯和氨基化合物的成員與生物相容組合物來(lái)形成生物相容植入物或裝置來(lái)標(biāo)記生物相容性植入物或裝置；將該生物相容植入物或裝置放入患者中；和測(cè)定來(lái)自生物相容植入物或裝置的乙酰乙酸的釋放。
14.一種檢測(cè)生物樣本中的丙酮的方法，所述方法包括將生物含有的丙酮導(dǎo)入包括至少一種利用丙酮作為底物的丙酮特異性酶系統(tǒng)的生物傳感器；和檢測(cè)由丙酮與丙酮特異性酶系統(tǒng)相互作用生成的產(chǎn)物。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其中檢測(cè)是通過(guò)電化學(xué)的、光度的或量熱的裝置實(shí)現(xiàn)的。
16.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述方法還包括通過(guò)電化學(xué)處理電極便于至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)與生物樣本中的丙酮間的電化學(xué)傳導(dǎo)；和電化學(xué)檢測(cè)一種產(chǎn)生自至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)與生物樣本中丙酮間反應(yīng)的產(chǎn)物。
17.按照權(quán)利要求14的方法，其中該至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)包括為丙酮單加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脫氫酶中任意一種的酶。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中該至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)包括為丙酮羧化酶產(chǎn)物形成偶聯(lián)NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶聯(lián)NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶聯(lián)H2O2形成、仲醇脫氫酶(S-ADH)結(jié)合NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶偶聯(lián)到β-羥基丁酸鹽脫氫酶催化NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生、S-ADH催化NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生或丙酮單加氧酶偶聯(lián)到NAD(P)H氧化的任何一種的成員。
19.按照權(quán)利要求17的方法，其中生物樣本為蒸汽形式。
20.按照權(quán)利要求19的方法，其中該方法包括電化學(xué)檢測(cè)0.2ppm到10ppm水平的丙酮蒸汽樣本。
21.一種用于檢測(cè)生物樣本中丙酮的生物傳感器，包含至少一種含有選擇性以丙酮作為底物，偶聯(lián)到可檢測(cè)的信號(hào)介質(zhì)的丙酮特異性酶系統(tǒng)；和一個(gè)用于檢測(cè)從至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)與生物樣本中丙酮間反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物的裝置。
22.按照權(quán)利要求21的生物傳感器，還包括一個(gè)具有用于將生物樣本導(dǎo)入丙酮特異性酶系統(tǒng)的入口的容器。
23.按照權(quán)利要求21的生物傳感器，其中該丙酮特異性酶系統(tǒng)以干燥或凍干形式存在直到與生物樣本接觸。
24.按照權(quán)利要求21的生物傳感器，其中檢測(cè)是通過(guò)電化學(xué)的、光譜的或量熱裝置實(shí)現(xiàn)的。
25.一種按照權(quán)利要求24的電化學(xué)生物傳感器，其中該至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)包括丙酮單加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脫氫酶中任意一種酶。
26.按照權(quán)利要求25的電化學(xué)生物傳感器，其中該至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)為丙酮羧化酶產(chǎn)物形成偶聯(lián)NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶聯(lián)NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶聯(lián)H2O2形成、仲醇脫氫酶(S-ADH)結(jié)合NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶偶聯(lián)到β-羥基丁酸鹽脫氫酶催化NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生、S-ADH催化NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生或丙酮單加氧酶偶聯(lián)到NAD(P)H氧化、丙酮單加氧酶偶聯(lián)到H2O2產(chǎn)生、或者丙酮單加氧酶催化NAD(P)+形成偶聯(lián)到H2O2形成的任何一種的成員。
27.一種按照權(quán)利要求25的電化學(xué)生物傳感器，其中丙酮特異性酶系統(tǒng)通過(guò)存在海藻糖而穩(wěn)定的保藏。
28.一種按照權(quán)利要求25的電化學(xué)生物傳感器，其中生物樣本是液體形式或蒸汽形式。
29.一種按照權(quán)利要求25的電化學(xué)生物傳感器，進(jìn)一步包括用于從在丙酮檢測(cè)中發(fā)生的電化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的定性或定量結(jié)果的裝置或用于連接(interface)所述生物傳感器與所述裝置來(lái)產(chǎn)生定性或定量結(jié)果的裝置。
30.一種按照權(quán)利要求25的電化學(xué)生物傳感器，其中具有至少兩個(gè)分析物檢測(cè)電極，被沿著樣本檢測(cè)路徑以順序排列簇被聚集，其中至少所述分析物檢測(cè)電極之一為可操作地含有丙酮特異性酶系統(tǒng)的丙酮特異性酶電極。
31.一種用按照權(quán)利要求20的生物傳感器來(lái)監(jiān)控患者醫(yī)學(xué)狀況的方法，其中該方法包括a)得到至少一種來(lái)自患者的生物樣本和將生物樣本導(dǎo)入該生物傳感器中；b)通過(guò)檢測(cè)與生物傳感器的丙酮特異性酶系統(tǒng)相互作用的丙酮測(cè)定生物樣本中的丙酮濃度；c)可選擇地，將生物傳感器與計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)連接來(lái)傳送測(cè)定值；和d)將丙酮濃度測(cè)定值與患者醫(yī)學(xué)狀況相聯(lián)系。
32.按照權(quán)利要求31的方法，其中被監(jiān)控的醫(yī)學(xué)狀況是糖尿病或體重下降。
33.一種用于檢測(cè)樣本中丙酮的試劑盒，該試劑盒含有與可檢測(cè)的信號(hào)介質(zhì)偶聯(lián)的至少一種包括選擇性以丙酮作為底物的酶的丙酮特異性酶系統(tǒng)；和用于至少一種丙酮特異性酶系統(tǒng)的容器。
34.按照權(quán)利要求33的試劑盒，進(jìn)一步含有其上放置了丙酮特異性酶系統(tǒng)的一次性檢測(cè)條。
35.按照權(quán)利要求34的試劑盒，其中該檢測(cè)條與該容器相分離使得該檢測(cè)條可被插入到該容器中，該容器具有一個(gè)可導(dǎo)入樣本的孔。
36.按照權(quán)利要求34的試劑盒，其中該檢測(cè)條和該檢測(cè)條的容器構(gòu)造成單一的一次性裝置，該容器具有一個(gè)可導(dǎo)入樣本的孔。
37.一次性檢測(cè)條，其上放置了丙酮特異性酶或丙酮特異性酶系統(tǒng)。
38.按照權(quán)利要求37的檢測(cè)條，其中丙酮特異性酶是丙酮單加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脫氫酶中的任意一種。
39.一種得自自養(yǎng)黃色桿菌Py2菌株(ATCCPTA-4779)的蛋白質(zhì)，具有NAD+依賴的仲醇脫氫酶活性、能夠?qū)⒈€原為異丙醇和具有酮和仲醇的特異活性；(A)所述蛋白質(zhì)(1)具有，對(duì)于將異丙醇氧化為丙酮的pH最佳值為7.8，和(2)對(duì)于氧化醇類，具有pH7.8時(shí)在相當(dāng)條件下分別用C3-C5直鏈仲醇和用C2-C5直鏈伯醇測(cè)定時(shí)，至少50∶1的仲醇對(duì)伯醇的平均比活性；(B)對(duì)于將丙酮還原為異丙醇，所述蛋白質(zhì)具有(1)pH最佳值為6.2，(2)約144±18μM的表觀Km，(3)約43.4±1.2μmol還原丙酮·min-1·mg-1蛋白的表觀Vmax，(4)約30.4sec-1的表觀kcat，(5)約2.1×105的表觀kcat/Km，和(6)約5.1±0.4μM的NADH的Km；和(C)所述蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)多肽分子量，(1)所述多肽分子具有(a)質(zhì)譜分析確定的約37.1kDa的分子，(b)由變焦電泳確定的約7.4的pI，和(c)SEQ ID NO7的十四個(gè)N末端氨基酸序列，和(2)所述多肽分子量能夠被降解形成具有SEQ ID NO8到SEQ ID NO19的氨基酸序列的片段。
40.一種得自按照權(quán)利要求37的蛋白質(zhì)的多肽分子，(1)所述多肽分子具有(a)質(zhì)譜分析確定的約37.1kDa的分子量，(b)由變焦電泳確定的約7.4的pI，和(c)SEQ ID NO7的十四個(gè)N末端氨基酸序列，和(2)所述多肽分子量能夠被降解形成具有SEQ ID NO8到SEQ IDNO19的氨基酸序列的片段。
全文摘要
本發(fā)明描述了特異于丙酮的酶系統(tǒng)和采用這些系統(tǒng)檢測(cè)生物的或環(huán)境的樣本中的丙酮的方法。本發(fā)明公開(kāi)了含有這些酶系統(tǒng)的生物傳感器，其中丙酮的檢測(cè)通過(guò)連接電化學(xué)的、光度測(cè)定的或者其他檢測(cè)方法與一個(gè)或多個(gè)丙酮特異性酶反應(yīng)或路徑。本發(fā)明還涉及應(yīng)用這種丙酮特異性傳感器監(jiān)控包括患者控制體重、疾病檢測(cè)和治療劑的生物利用度的方法。
文檔編號(hào)A61B5/08GK1620502SQ02826929
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者P·E·克蘭利, J·R·艾倫, K·L·達(dá)諾夫斯基, J·A·麥金太爾, T·E·小米勒, B·M·羅斯納, A·D·斯特里克蘭, V·蘇布拉馬尼亞恩, L·孫 申請(qǐng)人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司