專(zhuān)利名稱：人載脂蛋白的多肽及其抗血管增生性疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽，尤其是人的載脂蛋白內(nèi)含的多肽P5及其合成物具有抗血管增生性疾病的功能。
圓餅狀結(jié)構(gòu)體是指含有3對(duì)內(nèi)部二硫鍵形成的具有雙環(huán)的圓餅形狀的構(gòu)造體。它大約含90個(gè)左右的氨基酸，廣泛存在于不同的蛋白分子里。該構(gòu)造最早被發(fā)現(xiàn)于凝血素。圓餅狀結(jié)構(gòu)體所擔(dān)當(dāng)?shù)幕竟δ転榉肿优c分子之間的相互作用。例如組織型纖溶酶激活劑(TPA)含兩個(gè)圓餅狀結(jié)構(gòu)體。距TPA的C末端最近的一個(gè)餅狀結(jié)構(gòu)體對(duì)血栓具有識(shí)別和結(jié)合功能，可引導(dǎo)TPA發(fā)揮定向特異性溶解血栓效果。
人類(lèi)載脂蛋白的38個(gè)餅狀結(jié)構(gòu)體的氨基酸序列及成分有所不同，可分為11個(gè)類(lèi)型。位于餅狀結(jié)構(gòu)串聯(lián)體的最末端，即第38位餅狀結(jié)構(gòu)體，并被命名為AK38，具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)功能，該結(jié)構(gòu)體在基因庫(kù)Gene Bank中的登記號(hào)為AY039748。
在腫瘤組織內(nèi)部沒(méi)有血管存在的情況下，腫瘤不會(huì)對(duì)人體構(gòu)成致命威脅。腫瘤組織的惡性生長(zhǎng)起因于從腫瘤組織周?chē)臉I(yè)已存在的血管產(chǎn)生新的毛細(xì)血管。圍繞腫瘤組織周?chē)拿?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受癌細(xì)胞分泌物質(zhì)的刺激開(kāi)始分裂，它們穿過(guò)基底膜和間質(zhì)就象入侵的癌細(xì)胞一樣去入侵鄰近的癌細(xì)胞組織并在癌細(xì)胞組織內(nèi)部生成新的毛細(xì)血管。癌細(xì)胞在得到新生血管輸送養(yǎng)料的供應(yīng)下快速生長(zhǎng)。因其快速生長(zhǎng)大量消耗氧氣，形成癌細(xì)胞組織內(nèi)部局部的空間性的缺氧狀態(tài)。而缺氧狀態(tài)可刺激癌細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)等。這些生長(zhǎng)因子激發(fā)新一輪的血管增長(zhǎng)。這些新生的毛細(xì)血管向腫瘤組織內(nèi)部侵入并延伸，向腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)所必要的氧氣和養(yǎng)料，導(dǎo)致腫瘤組織的惡性循環(huán)發(fā)展。毛細(xì)血管的異常增生還可引起軟骨組織的損傷和關(guān)節(jié)膜炎。老年斑點(diǎn)性失明和后期糖尿病患者的視網(wǎng)膜鏡疾病也是血管增生的直接后果?？寡茉錾煼ū徽J(rèn)為是醫(yī)治這些疾病的新的有效途徑。
本發(fā)明的目的血管內(nèi)壁組織是由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。血管的延伸是內(nèi)皮細(xì)胞不斷繁殖擴(kuò)張的結(jié)果。打擊支持腫瘤體惡性增長(zhǎng)所需要的新血管，即攻擊為腫瘤提供生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)的輸送系統(tǒng)的有效途徑是控制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的技術(shù)領(lǐng)域是治療癌癥等血管增生性疾病的新希望。生物工程技術(shù)在當(dāng)代制藥工業(yè)中被廣泛應(yīng)用，許多蛋白藥物被規(guī)?；a(chǎn)。但是，如何濃縮高分子蛋白的功能于較小的多肽體，即進(jìn)行多肽體療法，是現(xiàn)代生物醫(yī)藥的一個(gè)重要方向。本發(fā)明是多肽體工藝和抗血管增生技術(shù)的結(jié)合。數(shù)種抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)劑或因子已經(jīng)被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于治療血管增生性疾病。但是有的顯示人體毒性如擦里多米德(Thalidomide是一種鎮(zhèn)靜藥，能引起嬰兒畸形)。有的只有很弱的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性，例如干擾素和抗雌激素。而新發(fā)現(xiàn)的蛋白類(lèi)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子卻不易被基因工程方法生產(chǎn)。所以在保持藥物活性的前提下，簡(jiǎn)便而高效地生產(chǎn)是抗血管生長(zhǎng)藥物的關(guān)健課題。
相對(duì)于工程蛋白，短小的多肽體更容易被合成和大量生產(chǎn)。因此本發(fā)明提供了多肽體抗血管生長(zhǎng)技術(shù)。同時(shí)，我們知道人體同源性的多肽體通常不引起免役反應(yīng)。所以本發(fā)明要注重篩選具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性的人體同源性多肽體。
技術(shù)方案多肽體和蛋白質(zhì)的基本組成單位都是氨基酸。通過(guò)一個(gè)氨基酸分子的羧基(COOH)和另一個(gè)氨基酸分子的氨基(NH2)相縮合形成肽鍵。二肽體是由肽鍵連接兩個(gè)氨基酸分子而成的化合物。多肽體由兩個(gè)以上的氨基酸分子縮合而成的化合物。細(xì)胞中存在眾多的長(zhǎng)短及成分各異的天然多肽體，構(gòu)成多樣的生化反應(yīng)，體現(xiàn)特異的細(xì)胞生命活動(dòng)。較長(zhǎng)而又有立體構(gòu)造的多肽體通常被稱謂蛋白質(zhì)。目前，由程控和生化有機(jī)合成原理構(gòu)成的自動(dòng)化生產(chǎn)技術(shù)可聚合80個(gè)左右的氨基酸。在這里所論述的多肽體是指含28個(gè)氨基酸以下的分子。
以人類(lèi)載脂蛋白的圓餅狀結(jié)構(gòu)體為藍(lán)本篩選具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性的多肽P5及其合成物P51至P57，研究其氨基酸序列和抗血管增生作用。
具體方法本發(fā)明所涉及之多肽體由Fmoc方法合成(3，4)然后通過(guò)逆相C18高壓液相色譜分離儀(HPLC)提純。純化后的多肽體并經(jīng)過(guò)質(zhì)量分析圖譜(MS)進(jìn)行確定。然后，使用BCE細(xì)胞測(cè)量多肽體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制活性(5)。多肽體對(duì)BCE生長(zhǎng)的抑制程度相對(duì)于對(duì)照組生長(zhǎng)的50％時(shí)的濃度被稱為IC50。
多肽體是根據(jù)上述AK38載脂蛋白的氨基酸序列合成(

圖1)。多肽體及氨基酸皆采用國(guó)際常規(guī)IUPAC-IUB命名符號(hào)表示(6)。分子兩端Ac和NH2分別表示醋酸基和氨基，擔(dān)任多肽體N端和C端的保護(hù)使命。
載脂蛋白的多肽體的分子組成如下(其氨基酸序列見(jiàn)圖1)P1Ac-Ile-Val-Pro-Ser-Leu-Gly-Pro-Pro-Ser-Glu-Gln-Asp-NH2P2Ac-Met-Phe-Gly-Gln-Gly-Lys-Tyr-Arg-Gly-Lys-Lys-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Thr-Val-Thr-Pro-NH2P3Ac-Gln-Glu-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Thr-Phe-Ile-Pro-Gly-Thr-Asn-Lys-Trp-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH2P4Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Ile-Asn-Gly-Pro-Trp-NH2P5Ac-Tyr-Thr-Met-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Phe-Asp-Tyr-NH2P6Ac-Asp-Ile-Pro-Leu-NH2P7Ac-Ala-Ser-Ser-Ser-Phe-Asp-NH2這些多肽體的大小長(zhǎng)短不一，并非無(wú)規(guī)則性選擇。它們有個(gè)共同點(diǎn)即它們是圓餅狀結(jié)構(gòu)體的每?jī)蓚€(gè)相鄰的半胱氨酸之間的氨基酸序列。所以它們不含半胱氨酸，可避免在分子間或內(nèi)部形成二硫鍵。
通過(guò)對(duì)這些多肽體的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性分析發(fā)現(xiàn)多肽體P1，P2，P6及P7都幾乎沒(méi)有活性；P3只顯示出微弱的活性；P4有活性；P5多肽體則顯示出最強(qiáng)的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性(圖2)。P5的IC50為0.1微摩爾濃度(圖3)。
活性最強(qiáng)的P5多肽體的理論分子量為1488.66Da。合成的P5多肽體的質(zhì)量圖譜顯示其質(zhì)量為1489.41Da(圖4)。實(shí)際測(cè)量值的精確范圍符合理論計(jì)算的分子量。
P5多肽體含有11個(gè)氨基酸。為了更小地縮小多肽體的分子量，在P5多肽體的基礎(chǔ)上合成了多肽體P51至P57。它們的分子組成相關(guān)性如圖5所示。在這些多肽體中，有的分子結(jié)構(gòu)保持了P5多肽體的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞活性(圖6)。
圖2.多肽體的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞活性示意中X軸為多肽(0.75微摩爾濃度)Y軸為內(nèi)皮細(xì)胞(BCE)增殖(％)圖中所示為7個(gè)多肽體對(duì)BCE細(xì)胞生長(zhǎng)的不同抑制作用。每個(gè)多肽體的濃度為0.75微摩爾濃度。結(jié)果為三組試驗(yàn)的平均值。
圖3.多肽體P5的濃度和活性關(guān)系的示意中X軸為多肽的微摩爾濃度Y軸為內(nèi)皮細(xì)胞(BCE)增殖(％)圖中所示不同濃度的多肽體P5的生物活性。多肽體對(duì)BCE生長(zhǎng)的抑制程度以其相對(duì)于對(duì)照組生長(zhǎng)程度的百分比表示。
圖4.多肽體P5的分子質(zhì)量圖譜X軸為質(zhì)量(m/z)，Y軸為計(jì)數(shù)值(counts)。加速電壓20千伏特。質(zhì)量1489.41Da的波峰為多肽體F5的單體。
圖5.多肽P5及P51至P57的氨基酸序列圖
P51為P5的N端部分，P52為P51的置換體，P53至P56為P51的置換和添減突變體，P57為P5的C端部分。
圖6.P5和P51至P57多肽體的活性比較中X軸為多肽(0.75微摩爾濃度)Y軸為內(nèi)皮細(xì)胞(BCE)增殖(％)圖中所示P5及其置換和添減突變體對(duì)BCE細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。每個(gè)多肽體的濃度為0.75微摩爾濃度(三組試驗(yàn)平均值)。
下面結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明
以上根據(jù)載脂蛋白[Apo(a)]內(nèi)含的多肽具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)功能的餅狀結(jié)構(gòu)體(AK38)的氨基酸序列，合成了一系列多肽體。每個(gè)多肽體成分和結(jié)構(gòu)分別由AK38圓餅狀結(jié)構(gòu)體的兩個(gè)相鄰的半胱氨酸之間的氨基酸序列組成。從這些多肽體中發(fā)現(xiàn)P5具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性。該多肽體含11個(gè)氨基酸Tyr-Thr-Met-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Phe-Asp-Tyr。在P5多肽體的基礎(chǔ)上合成了更小的多肽體P51至P57。P5衍生的多肽體僅含有7-9個(gè)氨基酸，所述的多肽N末端和C末端的聯(lián)結(jié)體，所述的多肽的單個(gè)重復(fù)或多個(gè)不同多肽體的聯(lián)結(jié)體，都繼承了P5多肽體的生物活性。
本發(fā)明的應(yīng)用本發(fā)明所述的多肽具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性的功能，應(yīng)用于治療腫瘤、血管纖維瘤、肉芽腫病、蛛狀痔、遺傳出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管性血友病及預(yù)防和治療后期糖尿病誘發(fā)失明等與血管增生有關(guān)的疾病。所述的多肽分子能制成治療以上疾病的醫(yī)療制品，在所述的多肽的氨基酸被削減、增加或置換所產(chǎn)生的分子仍有治療上述疾病的作用。
參考文獻(xiàn)(1)Mooser V.Seabra MC.Abedin M.LandschulzKT.Marcovina S.Hoobbs H.Apolipoprotein(a)kringle 4-containing fragments in human urine.Journal of Clinic Investigation.1996；97858-864.(2)McLean JW.Tomlinson JE.Kuang WJ.Eaton DL.Chen EY.Fless GM.Scanu AM.Lawn RM.CDNA sequence of humanapolipoprotein(a)is homologous to plasminogen.Nature 1987；330132-137.(3)Meienhofer J.Hormonal Proteins andPeptides.Academic Press，New York.1973.(4)Schroder G.Lupke K.The Peptides.Acacemic Press，New York.1965.(5)Folkman J.Haudenschild CC.Zetter BR.Long-term culture of capillary endothelialcells.Proceedings of the National Academy ofSciences USA.1979；765217-5221.(6)Anonymous.IUPAC-IUB Joint Commission onBiochemical Nomenclature(JCBN).Nomenclatureand symbolism for amino acids and peptides.European Journal of Biochemi stry.1984；1389-37.
參考文獻(xiàn)譯文
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(6)不具名的(集體著作)有關(guān)生物化學(xué)的IUPAC-IUB命名聯(lián)合委員會(huì)用于氨基酸和多肽的命名和符號(hào)生物化學(xué)的歐洲雜志1984；1389-37.
權(quán)利要求
1.一種具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性的多肽P5，其特征是所述的多肽P5及在多肽P5的基礎(chǔ)上合成的多肽P51至P57的氨基酸序列如下P5 Tyr Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp TyrP51Tyr Thr Met Asn Pro Arg LysP52Tyr Thr Thr Asn Pro Arg LysP53His Val Leu Lys Asn Arg LysP54Gly Val Ile Thr Asn Pro Arg Ile LysP55Gly Val Ile Thr Lys Ile LysP56Gly Val Ile Thr Arg Ile LysP57Pro Arg Lys Leyu Phe Asp Tyr
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征是N末端和C末端有聯(lián)結(jié)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征是有單個(gè)重復(fù)或者多個(gè)不同多肽體的聯(lián)結(jié)體。
4.一種具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性的多肽P5，其特征是所述的多肽P5及在多肽P5的基礎(chǔ)上合成的多肽P51至P57，能應(yīng)用于治療抗血管增生性疾病的用途，所述的多肽分子能制成治療上述疾病的醫(yī)療制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽，所屬技術(shù)領(lǐng)域是人載脂蛋白的多肽及其合成物具有抗血管增生性疾病的功能，血管的異常增生可引發(fā)惡性腫瘤。后期糖尿病患者視網(wǎng)膜鏡內(nèi)的血管變化也可引起失明?？寡軆?nèi)皮細(xì)胞增生療法是醫(yī)治這些疾病的新途徑。載脂蛋白[Apo(a)]是一個(gè)巨大的存在于人血液中的糖蛋白。在其龐大的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中高含38個(gè)餅狀結(jié)構(gòu)體。位于最末端，即第38位餅狀結(jié)構(gòu)體(AK38)具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增生功能。根據(jù)AK38的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，合成并篩選研究了具有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增生活性的多肽體P5及其合成物P51至P57的氨基酸序列及其抗血管增生的作用，易于進(jìn)行自動(dòng)化工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1421456SQ02153648
公開(kāi)日2003年6月4日 申請(qǐng)日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者竇德獻(xiàn) 申請(qǐng)人:北京柏歐茵生物工程技術(shù)有限公司